ES2528672B1

ES2528672B1 - Neurofilina-1 (NRP-1) urinaria como marcador pronóstico de nefritis y nefritis lúpica

Info

Publication number: ES2528672B1
Application number: ES201331051A
Authority: ES
Inventors: Georgina Hotter Corripio; Ana María SOLA MARTÍNEZ; José Luis VIÑAS MUÑOZ; Josep ORDI ROS; María Teresa TORRES SALIDO
Original assignee: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC; Fundacio Hospital Universitari Vall dHebron Institut de Recerca FIR VHIR
Current assignee: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC; Fundacio Hospital Universitari Vall dHebron Institut de Recerca FIR VHIR
Priority date: 2013-07-10
Filing date: 2013-07-10
Publication date: 2015-11-24
Anticipated expiration: 2033-07-10
Also published as: ES2528672A1; WO2015004302A1; US20160244835A1

Abstract

Neurofilina-1 (NRP-1) urinaria como marcador pronóstico de nefritis y nefritis lúpica.#La presente invención se refiere a los métodos para predecir el progreso de nefritis y nefritis lúpica en un individuo. La presente invención también se refiere a los métodos para evaluar el desarrollo de la nefritis, particularmente la nefritis lúpica, en un individuo y su respuesta a un tratamiento.

Description

DESCRIPCiÓN

Neurofilina-1 (NRP-1) urinaria como marcador pronóstico de nefritis y nefritis lúpica

SECTOR Y OBJETO DE LA INVENCION

La presente invención se encuadra dentro del Área de la Biotecnología en los sectores de la Industria Farmacéutica. Especificamente la presente invención se refiere al uso de la Neuropilina-1 como biomarcador pronóstico de la nefritis y nefritis lúpica en la práctica clínica.

ESTADO DE LA TECNICA

El Lupus Eritematoso Sistémico (SLE, del inglés Systemic Lupus Erythematosus) es una enfermedad autoinmune en la cual la afectación renal es uno de los determinantes de mal pronóstico (1). La nefritis lúpica (NL) aparece aproximadamente del 40-75% de los pacientes con SLE y se asocia a un curso impredecible y a un aumento de la morbilidad precoz y tardía (2). A pesar de la realización de un tratamiento inicial agresivo, hasta un 25% de los pacientes con NL progresará a daño renal (3) siendo esto parcialmente causado por la dificultad para valorar de forma precoz la respuesta al tratamiento. El disponer de un índice predictivo permitiría introducir nuevos tratamientos que podrían modificar el curso de la enfermedad.

En la actualidad, la biopsia renal es el "Gold Standard" para diagnosticar y valorar la respuesta al tratamiento del daño renal, pero debido a su naturaleza invasiva no puede ser realizado de forma seriada. Los biomarcadores serológicos tradicionales como anticuerpos anti-ADN, niveles de complemento así como pruebas de función renal, (proteinuria, sedimento urinario, creatinina y tasa de filtrado glomerular) han demostrado ser insuficientes (4, 5) Y no siempre correlacionan con el daño renal. Hasta ahora estas herramientas diagnósticas no han permitido predecir con fiabilidad la respuesta al tratamiento de estos pacientes hasta finalizar los primeros 6 meses del tratamiento inmunosupresor (6), siendo las secuelas renales (fibrosis renal) que se produce en este periodo lo que determinará el pronóstico a largo-plazo (7).

Por esta razón, en los últimos años ha habido un interés creciente en encontrar marcadores no invasivos de nefritis lúpica que puedan ser usados para predecir el inicio de la enfermedad y también monitorizar su progresión. Entre los biomarcadores, los urinarios, como por ejemplo IL-12, TWEAK, MCP-1 o NGAL, son unos candidatos muy atractivos (8, 9) puesto que además de ser muestras relativamente fáciles de obtener, estas pueden reflejar cambios fisiopatológicos a nivel renal. Sin embargo, hace falta una validación longitudinal en grupos más grandes de pacientes con nefritis lúpica. TWEAK urinario es muy especifico de la nefritis lúpica y se correlaciona con el grado de daño renal, aunque no es suficientemente sensible para predecir los episodios de nefritis. En cambio MCP-1 y NGAL son especificas de la actividad renal y pueden predecir episodios de nefritis, pero no se han descrito como marcadores pronóstico de la evolución del lupus. Ninguno de los tres potenciales marcadores urinarios ha sido relacionado con la regeneración renal, ni con la remisión de la enfermedad en estudios longitudinales (8).

Asi pues, a pesar de los esfuerzos realizados todavia hay una necesidad de encontrar nuevos marcadores cuya muestra sea fácil de obtener y tenga un carácter pronóstico capaz de orientar a los facultativos en el mejor tratamiento.

Las neurofilinas (NRP-1 y NRP-2) son unas proteinas transmembrana que interactúan con semaforinas tipo 3, con miembros de la familia del factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) y ligandos como el factor de crecimiento del hepatocito, factor de crecimiento plaquetar, "transforming growth factor-b1" (TGF-b1), y el factor de crecimiento de los fibroblastos (FGF2) (10). Son pues co-receptores del VEGF y co-receptores de factores angiogénicos como el HGF, pudiendo aumentar la actividad angiogénica de éstos. Las neurofilinas han sido implicadas en diferentes procesos biológicos como el crecimiento tumoral y/o, la vascularización, como mediadores de la respuesta inmune primaria, o como inductores en procesos de regeneración y reparación (10).

Por su parte, el factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) es una importante citoquina implicada en la angiogénesis, quimiotaxis y permeabilidad vascular (11), tiene un papel protector en la preservación de la función de los órganos, probablemente mediante el mantenimiento de la función celular y la integridad de endotelio vascular (12), e induce morfogénesis de las células epiteliales renales de forma NRP-1 dependiente (13).

El papel de NRP-1 y VEGF en la patogénesis de la nefritis lúpica no ha sido aclarado. Se ha sugerido que niveles elevados de VEGF tienen un importante papel protector en la pato logia renal (14, 15) Y particularmente en SLE (12, 16-18) donde niveles bajos de VEGF en orina se han asociado a afectación severa y un mal pronóstico (17, 19); estos trabajos destacan el papel de VEGF como pronóstico de la enfermedad renal, pero no diferencian entre las diferentes patologias renales (20). Otros estudios realizados en pacientes con nefritis lúpica han mostrado también un incremento de NRP-1 a nivel renal en muestras procedentes de biopsias de pacientes con SLE pero no en otras enfermedades (21). Dado que NRP-1 es un receptor funcional del VEGF se cree que su aumento tiene como significado potenciar el efecto protector del VEGF en las células endoteliales glomerulares, ayudando a prevenir el daño y la apoptosis (17) y de forma especifica a SLE ya que se encuentra elevado en tanto en muestras de biopsias renales (17) como en fluido sinovial (22). Sin embargo, hasta la fecha, los estudios realizados sobre NRP-1 no lo identifican como marcador pronóstico de la enfermedad lúpica ni, particularmente, del desarrollo de la enfermedad en riñón; además hasta ahora se han empleado muestras de biopsias renales, una prueba invasiva no exenta de complicaciones a largo plazo, y que dificulta mucho la rápida identificación de los niveles de NRP-1, asi como la posibilidad de hacer un seguimiento de los pacientes y la efectividad de su tratamiento sobre la regeneración renal.

La evaluación de un determinado marcador en orina, capaz de indicar el pronóstico de la enfermedad en el momento del diagnóstico y a lo largo de su tratamiento, permitiria una individualización del tratamiento y una gran mejora en la morbilidad y en la mortalidad de estos pacientes y por lo tanto en su pronóstico y calidad de vida.

EXPLlCACION DE LA INVENCION

EXPLICACiÓN BREVE DE LA INVENCiÓN

Un primer objeto de la invención se refiere al uso del gen Neuropilina 1, NRP1, Y sus productos de expresión como marcador pronóstico de desarrollo de la nefritis, y más preferentemente la nefritis lúpica.

Otro objeto de esta invención se refiere a un método de cuantificación de los niveles de NRP-1 como marcador pronóstico de desarrollo de la nefritis, preferentemente de la nefritis lúpica. Un siguiente objeto de la invención se refiere a un método primero de la invención que permite la cuantificación de los niveles de ácido nucleico en una muestra de orina, preferentemente ARNm. Preferentemente dicho método es la RT-PCR y más preferentemente aún la qRT -PCR.

Otro objeto de la invención se refiere a un método segundo de la invención que permite detectar los niveles de la proteina NRP-1 en una muestra, preferentemente en una muestra de orina.

Un siguiente objeto de la invención se refiere a un inmunoensayo que permite la detección de la proteina NRP-1 en una muestra, y más preferentemente a un ELlSA.

Un siguiente objeto de la invención se refiere a un método de espectrofotometria de masas que permite la cuantificación de NRP-1 en una muestra y más preferentemente el SELOI-TOO, o el MALOI-TOF.

Otro objeto particular de la presente invención se relaciona con un kit para el pronóstico de nefritis, útil para la realización del método primero o segundo de la invención.

Asi, otro objeto de la invención es el uso de los métodos primero y segundo de la invención,

o del kit de la invención, para evaluar el desarrollo en pacientes urológicos de nefritis o de nefritis lúpica, o bien para evaluar el efecto de un fármaco o candidato a fármaco en pacientes urológicos con nefritis o nefritis lúpica.

DESCRIPCiÓN DETALLADA DE LA INVENCiÓN

Los inventores de la presente invención han identificado que los niveles de expresión de NRP-1 en la orina como un biomarcador asociado con la nefritis y, particularmente, con la nefritis lúpica y que es indicador pronóstico de recuperación. El uso de este marcador en orina supone una mejora sustancial del actual estado de la técnica que sólo emplea la biopsia renal, una técnica muy invasiva y con problemas a largo plazo para los pacientes, para monitorizar la afectación del riñón en la nefritis lúpica. Los cambios en NRP-1 también pueden resultar útiles para supervisar los estadios de enfermedad, su progresión asi como la toxicidad o eficacia farmacológica de los tratamientos clinicos para el control de dicha enfermedad.

Asi, un primer objeto de la invención, es el uso de NRP-1 como marcador pronóstico de desarrollo de la nefritis, y más preferentemente la nefritis lúpica.

Otro objeto particular de la presente invención es el método de cuantificación de los niveles de NRP-1 que pueden utilizarse como marcador pronóstico de desarrollo de la nefritis, preferentemente de la nefritis lúpica, de ahora en adelante método de la invención. Asi, por ejemplo, una muestra de orina de un paciente se puede analizar mediante cualquiera de los métodos descritos aqui o por cualquier otro método conocido por los expertos en la técnica, para cuantificar los niveles de expresión de NRP-1 y compararlos con niveles de expresión basales obtenidos en pacientes no afectados de la dolencia, o bien mediante la comparación de los niveles de expresión de dos pacientes deducir el mejor/peor pronóstico de ellos. La comparación de los niveles de NRP-1 se ser realizada por el investigador o por el responsable del diagnóstico o mediante la ayuda de un ordenador y bases de datos.

El término "biomarcador" o "biomarcadores" se refiere a una molécula, como por ejemplo una proteina, que es indicativa de un estado patológico particular. Un biomarcador eficaz de la nefritis lúpica es tipicamente una molécula secretada o excretada, o bien por ejemplo eliminada a la orina por via renal.

El término "pronóstico" tal como se utiliza en la presente invención, se refiere al procedimiento mediante el cual se establece una predicción de los sucesos que ocurrirán en el desarrollo o curso de una enfermedad, preferiblemente de una enfermedad renal con componente inflamatorio, más preferiblemente de la nefritis lúpica, incluyendo aunque sin limitarse, la predisposición a padecer dicha enfermedad o la capacidad de respuesta a un determinado tratamiento.

El término "predicción" se refiere aqui a un método para formar un pronóstico, en el que una persona médicamente entrenada analiza la información de uno o varios biomarcadores.

El término "nefritis" o nefropatia se refiere a una enfermedad de los riñones caracterizada por la inflamación de los mismos. La nefritis es el resultado generalmente de un proceso inflamatorio difuso que tiene como base un proceso inmunológico; dicho proceso se inicia cuando una sustancia extraña (antigeno) entra en la circulación e inicia los mecanismos de defensa del organismo, entre ellos produce anticuerpo. La unión del antigeno con el anticuerpo forma un complejo soluble antigeno-anticuerpo que circula por el organismo, y que si se deposita en los tejidos genera lesiones inflamatorias, que cuando se produce en el riñón genera la nefritis.

El término "nefritis lúpica", se refiere a un trastorno renal que es una complicación de la enfermedad autoinmune: lupus eritematoso sistémico (o SLE), caracterizado por la aparición de lesiones inflamatorias en el riñón lo que conlleva un empeoramiento de actividad de la enfermedad renal, que puede incluir daño a los glomérulos y la pérdida progresiva de la función renal que puede finalmente requerir diálisis o un trasplante de riñón.

El "lupus eritematoso sistémico" (SLE, del inglés Systemic Lupus Erythematosus) es una enfermedad autoinmunitaria, lo que significa que el sistema inmunitario del cuerpo ataca por error al tejido sano. Esto lleva a que se presente inflamación prolongada (crónica). Algunas personas con SLE tienen depósitos anormales en las células de los riñones, lo cual lleva a que se presente una afección llamada nefritis lúpica. Los pacientes con esta afección finalmente pueden sufrir de insuficiencia renal y requerir diálisis o un trasplante de riñón.

El término "muestra biológica" tal y como se utiliza aquí, se refiere a cualquier sustancia derivada de un organismo vivo. Por ejemplo, una muestra puede derivarse de la sangre, como una muestra de orina, una muestra de suero, una muestra de plasma, y o una muestra de sangre entera. Alternativamente, una muestra puede ser derivada de un tejido recogido, por ejemplo, mediante una biopsia. Tal muestra de tejido puede comprender, por ejemplo, tejido renal, tejido vascular y/o tejido del corazón. Una muestra biológica también puede comprender fluidos corporales, incluyendo, pero no limitado a, orina, saliva o sudor.

El término "ensayo" significa generalmente un análisis (incluyendo un análisis por SDS PAGE, ELlSA, Western Blot) realizado sobre una muestra para determinar la presencia de una sustancia y/o la cantidad o el nivel de la sustancia en la muestra. Así, un ensayo puede realizarse, por ejemplo, para determinar el nivel de un biomarcador de la nefritis, y particularmente la nefritis lúpica, en una muestra biológica.

El término "brote" o "brote renal" se refiere a un aumento significativo en la inflamación del riñón orientación de un sujeto ya está experimentando la nefritis lúpica activa, que puede resultar en un aumento significativo y reproducible de la creatinina sérica, proteinuria y/o hematuria, y reducción de la función renal.

Las frases "sujeto normal, sano" o "control sano" significa una persona que no está experimentando la función renal disminuida, tales como la enfermedad renal aguda o crónica, inflamación renal aguda, infección aguda, u otra condición o enfermedad que puede aumentar el nivel de biomarcadores renales como la excreción de proteínas o la creatinina.

La frase "empeoramiento de actividad de la enfermedad renal", se refiere a una disminución de la actividad renal causada por la enfermedad, como el empeoramiento de la nefritis lúpica, un brote renal, una disminución adicional de la función renal, y que por lo general se refiere a un sujeto diagnosticado con SLE u otra enfermedad de base autoinmune o inflamatoria.

El término "Neuropilina-1" o "NRP-1" se refiere a una proteína codificada por el gen "nrp-1" humano con secuencia NG_030328. (NCBI Reference) que codifica para una proteína con secuencia 014786 (UniProtKB Reference) y a, al menos, 5 transcriptos alternativos (NP _001019799.1, NP _001019800.1, NP _001231901.1, NP _001231902.1, NP _003864.4).

La expresión de NRP-1 se manifiesta tanto en el nivel de ácido ribonucleico mensajero (ARNm) como de su producto, que es la proteína NRP-1. Se ha observado que en los pacientes aquejados de nefritis lúpica el aumento de NRP-1 presente en la orina comparado con los niveles detectados de NRP-1 de controles sanos determinado por los niveles de ARNm está asociado con el progreso de la afectación renal en pacientes con nefritis lúpica. Dado que tanto la nefritis lúpica como la nefritis tienen como base subyacente la aparición de un proceso inflamatorio en el riñón, la medición de los niveles de ARNm en pacientes aquejados de nefritis no-Iúpica también será indicativo de su valor pronóstico.

Así, en un objeto particular de la invención, el método de detección de los niveles de NRP-1 en orina emplea la medición de los niveles de ácido nucleico en una muestra, preferentemente en orina, preferiblemente ARNm NRP-1, denominado método primero de la invención. Esto se logra mediante la hibridación del ácido nucleico en la orina con sondas de oligonucleótidos que son específicos para el gen NRP-1. La técnica utilizada, puede ser a título ilustrativo y sin que limite el alcance de la invención, perteneciente al siguiente grupo: análisis Northern blot, reacción en cadena de la polimerasa (PCR), retrotranscripción en combinación con la reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) en tiempo real, retrotranscripción en combinación con la reacción en cadena de la ligasa (RT-LCR), hibridación o microarrays.

Se pueden preparar muestras de ácidos nucleicos utilizando cualquiera de los métodos y ensayos de la presente invención o por cualquier método disponible en el estado de la técnica. Los métodos de aislamiento de ARN son bien conocidos por los expertos en la técnica e incluyen, sin limitarse a, la purificación empleando oligo(dT) (unidos a columnas de sefarosa o partículas magnéticas, por ejemplo), y métodos bioquímicos de extracción líquido-líquido como la extracción con tiocianato de guanidina-fenol-cloroformo o la extracción con fenal-cloroformo. Un experto en la técnica apreciará que es deseable incluir en el tratamiento de aislamiento de ARN compuestos quimicos útiles para inhibir o destruir RNAsas presentes en los homogeneizados antes de que éstos se puedan utilizar (inhibidores de RNAsas). Los ácidos nucleicos aislados incluyen ARNm aislado, pero también ADNc sintetizado a partir de una muestra de ARNm aislado de una célula o tejido de interés. Estas muestras también incluyen ADN amplificado a partir del ADNc, y un ARN transcrito a partir del ADN amplificado.

La síntesis de cADN puede obtenerse mediante el empleo de la retrotranscripción, generalmente combinada con una amplificación de ADN para obtener una mayor cantidad de cADN para el análisis, en una técnica conocida como RT-PCR.

El término "retrotranscripción" o "transcripción inversa" se refiere a la síntesis de un ADN complementario a partir de un ARN molde.

El término "amplificación" se refiere al aumento del número de copias de un ácido nucleico molde, generalmente, la amplificación tiene lugar mediante PCR.

El término "ácido nucleico molde" o "molde" tal y como se utiliza en la presente descripción se refiere a una molécula de ácido nucleico de cadena simple o de doble cadena que va a ser retrotranscrita y/o amplificada.

Un método de retrotranscripción de un ácido nucleico molde, preferiblemente ARNm, comprende de forma general las siguientes etapas:

a) mezclar el ácido nucleico molde con un enzima con actividad retrotranscriptasa, e

b) incubar la mezcla del paso (a) en condiciones que permitan la síntesis de ADN complementario al ácido nucleico molde.

Un método de retrotranscripción y amplificación, RT-PCR, de un ácido nucleico molde, preferiblemente ARNm, comprende de forma general las siguientes etapas: a) mezclar dicho ácido nucleico con un enzima con actividad retrotranscriptasa y con, al menos, una ADN polimerasa dependiente de ADN, e b) incubar la mezcla del paso (a) en condiciones que permitan la amplificación de ADN complementario al ácido nucleico molde.

La expresión "condiciones que permitan la sintesis de ADN complementario" se refiere a las condiciones en las que puede tener lugar la incorporación de los nucleótidos a un ADN naciente mediante complementariedad de bases con el ácido nucleico molde.

Generalmente las condiciones en las que tiene lugar la sintesis de ADN incluyen: (a) poner en contacto dicho ácido nucleico molde con una retrotranscriptasa en una mezcla que además comprende un cebador, un catión bivalente, por ejemplo, Mg2+, y nucleótidos, y (b) someter dicha mezcla a una temperatura suficiente para que una polimerasa de ADN, inicie la incorporación de los nucleótidos al cebador mediante complementariedad de bases con el ácido nucleico molde, y de lugar una población de moléculas de ADN complementario de diferente tamaño. La separación de dicha población de moléculas de ADN complementario permite determinar la secuencia de nucleótidos del ácido nucleico molde.

La detección de los niveles de un ácido nucleico en la muestra puede realizarse por cualquiera de los métodos conocidos en el estado de la técnica. En una realización preferida, el método de detección implica la hibridación de los ácidos nucleicos mediante el contacto entre una sonda y el ácido nucleico diana en condiciones en que la sonda y su diana complementaria puedan formar dúplex híbridos estables mediante emparejamiento de bases complementarias. Los métodos de hibridación de ácidos nucleicos son bien conocidos en la técnica. En una realización preferida, las sondas están marcadas con una molécula fluorescente. Los ácidos nucleicos hibridados se detectan mediante la detección de una o más etiquetas de los ácidos nucleicos de la muestra y las sondas. Las etiquetas se pueden incorporar mediante cualquiera de los métodos conocidos por los expertos en la técnica.

Etiquetas de marcaje comúnmente empleadas incluyen, pero no se limitan a, biotina, moléculas fluorescentes, moléculas radiactivas, sustratos cromogénicos, marcadores quimioluminiscentes, enzimas, y similares. Los métodos para la biotinilación ácidos nucleicos son bien conocidos en la técnica, así como lo son métodos para introducir moléculas fluorescentes y moléculas radiactivas en oligonucleótidos y nucleótidos.

En el estado de la técnica se conocen métodos como la qRT-PCR (también llamada RTPCR cuantitativa o en tiempo real) que permiten retrotranscribir, amplificar y cuantificar mediante hibridación un ácido nucleico en un único paso. De forma general la qRT -PCR comprende los siguientes pasos:

a) mezclar el ácido nucleico aislado, por ejemplo ARNm, con un enzima con actividad retrotranscriptasa y con, al menos, una ADN polimerasa dependiente de ADN,

b) incubar la mezcla del paso (a) en condiciones que permitan la amplificación de ADN complementario al ácido nucleico molde empleando un cebador, y

c) realizar la hibridación en presencia de una molécula fluorescente que permita cuantificar la cantidad de ADNc generado con un detector especifico.

Los métodos de detección de la cantidad de ácido nucleico producido en la qRT -PCR utilizan bien 1) fluorocromos inespecificos, que detectan la generación exponencial de ADN de doble cadena empleando un fluorocromo que se une inespecificamente a aquél, como por ejemplo el SYBR Green; o bien, 2) sondas especificas que utilizan al menos un oligonucleótido marcado fluorescentemente. Tipicamente esta sonda está unida a dos fluorocromos e hibrida en la zona intermedia entre el cebador directo (forward) y el inverso (reverse); esto es, en el amplicón. De este modo, cuando la sonda está intacta, presentan una transferencia energética de fluorescencia por resonancia (FRET). Dicha FRET no se produce cuando los dos fluorocromos están distantes debido a la degradación de la sonda mediante la actividad 5'-3' exonucleasa de la ADN polimerasa, o bien debido a la separación fisica de los fluorocromos por un cambio en la conformación de la sonda. Esto permite monitorizar el cambio del patrón de fluorescencia y deducir el nivel de amplificación del gen.

En una realización particular de la invención, el método de primero de la invención detecta los niveles de ARNm NRP-1 en una muestra, preferentemente orina, mediante la qRT-PCR, y más preferentemente aún el método primero de la invención comprende los siguientes pasos:

a) mezclar los ARNm aislados de una muestra con un enzima con actividad

retrotranscriptasa y con, al menos, una ADN polimerasa dependiente de ADN

b) incubar la mezcla del paso (a) en condiciones que permitan la amplificación de

ADN complementario al ácido nucleico molde empleando un cebador, y

c) realizar la detección en presencia de una molécula fluorescente que permita

cuantificar la cantidad de ADNc generado con un detector especifico.

Aún más preferentemente la molécula fluorescente empleada en el paso c) es SYBR Green

o TaqMan.

En otro objeto particular de la invención, el método de detección de los niveles de NRP-1 en una muestra emplea la medición de los niveles de proteina NRP-1, preferentemente en una muestra de orina, denominado de ahora en adelante método segundo de la invención. Los métodos de detección y cuantificación de una proteina incluyen los inmunoensayos y el análisis de espectrometria de masas. Ambos métodos permiten combinar la detección simultánea de varias proteinas de interés.

En una realización particular el método segundo de la invención comprende detección de los niveles de proteina NRP-1 mediante un inmunoensayo. En general, los inmunoensayos implican la unión de NRP-1 con un anticuerpo anti-NRP-1. La presencia y la cantidad de unión indican la presencia y cantidad de NRP-1 presente en la muestra. Ejemplos de inmunoensayos incluyen, pero no se limitan a, ELlSA, radioinmunoensayos, e immunoblots, que son bien conocidos en la técnica. El anticuerpo puede ser policlonal o monoclonal y está preferiblemente marcado para ser detectado fácilmente. Las etiquetas pueden ser, pero no se limitan a biotina, moléculas fluorescentes, moléculas radiactivas, sustratos cromogénicos, quimioluminiscencia y enzimas. Para poder cuantificar la cantidad de NRP-1 presente en la muestra es necesario que el inmunoensayo permita comparar los niveles de NRP-1 con un estándar o una muestra control, métodos de cuantificación asociados a inmunoensayos son plenamente conocidos por el experto en el estado de la técnica y entre ellos podemos citar, por ejemplo, la densitometría, la espectrofotometría, la fluorometría, o el eBA (BDTM eytometric Bead Array).

En una realización preferida, el método segundo de la invención es un ELlSA (acrónimo del inglés Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, Ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas); una técnica en la que un antígeno inmovilizado se detecta mediante un anticuerpo enlazado a una enzima capaz de generar un producto detectable como cambio de color o algún otro tipo. La aparición de color permite medir indirectamente mediante espectrofotometría el antígeno en la muestra. En el estado de la técnica se conocen varios tipos de estrategias ELlSA como el ELlSA directo, el ELlSA indirecto o el ELlSA Sandwich.

En el ELlSA directo se prepara un soporte recubriéndolo con las soluciones en las que se sospecha se encuentra el antígeno. Se incuban con anticuerpos marcados que indican la presencia de antígeno en la solución analizada. En el ELlSA indirecto, el soporte inicial se prepara igual que en el ELlSA directo. El sistema de detección emplea dos anticuerpos: uno primario contra el antígeno y uno secundario marcado contra el primario. La detección tiene mayor sensibilidad por presentar una amplificación de señal debida a la unión de dos o más anticuerpos secundarios por cada primario. Este ensayo permite además que emplear un mismo secundario marcado y un mismo sistema enzimático por lo que permite cuantificar una gran variedad de antígenos.

El ELlSA "sándwich" se trata de un ensayo empleado en el que se recubre soporte del ELlSA con un primer anticuerpo anti-antigeno. Después se aplica la muestra problema en la que se encuentra el antigeno, que será retenido y capturado por el primer anticuerpo. En una siguiente incubación se emplea con un segundo anticuerpo anti-antigeno marcado con alguna etiqueta de marcaje. Así pues cada molécula de antígeno estará unida a un anticuerpo en la base que lo retiene y un segundo anticuerpo, al menos, que lo marca.

El término "soporte" hace referencia a un material que permite la unión de los anticuerpos y sirve de sostén físico del ensayo. Los tipos de soporte más comúnmente utilizados en ELlSA son placas de pocillos de material plástico, aunque también pueden emplearse nanopartículas.

Etiquetas de marcaje comúnmente empleadas en los anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, biotina, moléculas fluorescentes, moléculas radiactivas, sustratos cromogénicos, marcadores quimioluminiscentes, enzimas, y similares. Los métodos para marcaje de anticuerpos son bien conocidos en la técnica. El método de marcaje empleado determina el modo de detección de la señal, bien sea espectrometría, densitometría, luminometría, fluorometría, etc.

El término "sustrato cromogénico" hace referencia a una molécula que tras sufrir un proceso de alteración enzimática cambia sus propiedades espectrales. En el contexto de la presente invención, se refiere al sustrato que añadido al ELlSA produce una señal colorimétrica medible y cuantificable. Los sustratos cromogénicos dependen en su elección del método de detección empleado, los más conocidos son el ABTS (o ácido 2,2'-azino-bis(3etilbenzotiazolina-6-sulfónico)) o el TMB (3,3',5,5'-tetrametilbenzidina) cuando el enzima acoplado a la reacción es la peroxidasa, o bien el p-nitrofenilfosfato (p-NPP) cuando el enzima acoplado a la reacción es la fosfatasa alcalina.

Un ejemplo concreto puede ser la captura de NRP-1 de la muestra biológica en un ensayo de ELlSA tipo Sandwich, en el que un anticuerpo monoclonal inmovilizado anti-NRP-1 es seguido por la detección con un anticuerpo policlonal marcado con biotina anti-NRP-1. En este sistema, los pocillos de una placa de múltiples pocillos están recubiertos con el anticuerpo monoclonal y se bloquean con tampón de bloqueo adecuado; después se añaden las muestras de orina a los pocillos y se incuban para la captura de NRP-1 por el anticuerpo monoclonal. Después añade a la placa el anticuerpo policlonal de detección, y finalmente un conjugado de estreptavidina-fosfatasa alcalina para la obtención de color por medio del sustrato adecuado. La intensidad del color obtenido puede ser cuantificada mediante el empleo de un espectrofotómetro adecuado al cromógeno empleado.

Asi en una realización aún más preferida, el método segundo de la invención comprende los siguientes pasos:

a) inmovilización de un anticuerpo monoclonal anti-NRP-1 a un soporte,

b) incubación con la muestra y captura de la proteina de interés,

c) incubación con un anticuerpo policlonal marcado con biotina anti-NRP-1,

d) unión de un conjugado de estreptavidina-fosfatasa alcalina

e) Revelado de la reacción enzimática con un sutrato cromogénico, por ejemplo, el p

nitrofenilfosfato (p-NPP)

f) Análisis de la densidad óptica mediante espectrofometría a la longitud de onda

adecuada al sustrato cromogénico empleado.

Alternativamente, tras el paso e) puede ejecutarse un paso adicional con la adición de un componente quimico que detenga la reacción enzimática. Otra posible forma de analizar y cuantificar la cantidad de una determinada proteína en una muestra es mediante el análisis de espectrometría de masas (MS, del inglés Mass Spectrometry); una técnica experimental que permite la medición de iones derivados de moléculas, separando las moléculas o sus fragmentos en función de su relación masa-carga (miz). En el análisis de muestras complejas, como la orina, se haya combinado con métodos como de cromatografía, como la cromatografía de gases (GC/MS) o cromatografía líquida (LC/MS), para permitir una separación entre los diferentes componentes de la muestra. En el caso de mezclas de proteínas las técnicas ya conocidas en el estado de la técnica son, por ejemplo, MALDI-TOF (por sus siglas en inglés Matrix-Assisted Laser Desorption/lonization (desorción/ionización láser asistida por matriz) y TOF por el detector de iones que se acopla al MALDI y cuyo nombre procede también de sus siglas en inglés Time-Of-Flight), SELDI-TOF (del inglés, Surface-enhanced laser desorption/ionization, y TOF por el detector de iones que se acopla al SELDI y cuyo nombre procede también de sus siglas en inglés Time-Of-Flight) o ESI-MS (ionización por electroespray acoplada a espectroscopía de masas, ESI del inglés electrospray ionization).

Así, en otra realización preferida el método segundo de la invención es el SELDI-TOF, o el MALDI-TOF.

Otro objeto particular de la presente invención se relaciona con un kit para el pronóstico de nefritis, preferentemente nefritis lúpica, de ahora en adelante kit de la invención útil para la realización del método de la invención. Preferiblemente el kit pronóstico comprende usar la detección de NRP-1 sólo o en combinación con otros marcadores para una mejor evaluación de estado presente y desarrollo de la enfermedad de un individuo.

Una realización particular de la invención es el kit que permite llevar a cabo el método primero de la invención, denominado kit primero de la invención, y que permite cuantificar la cantidad de ARNm de NRP-1 en una muestra biólogica, preferiblemente, en orina, y que comprende:

a) una retrotranscriptasa, y

b) al menos, un elemento de la lista que comprende:

i) un tampón,

ii) un cebador,

iii) una ADN polimerasa dependiente de ADN, y

iv) un nucleótido.

Otra realización particular de esta invención es el kit que permite llevar a cabo el método segundo de la invención, denominado kit segundo de la invención, y que permite cuantificar la cantidad de la proteina NRP-1 en una muestra biólogica, preferiblemente, en orina, y que comprende:

a) un anticuerpo monoclonal anti-NRP1,

b) un anticuerpo policlonal anti-NRP-1 , preferiblemente conjugado con biotina,

c) un conjugado de estreptavidina-fosfatasa alcalina, y

d) un sustrato cromogénico como el p-NPP.

En este sistema, el soporte es una placa de múltiples pocillos recubiertos con el anticuerpo monoclonal; después se añaden las muestras de orina a los pocillos y se incuban para la captura de NRP-1 por el anticuerpo monoclonal. Posteriormente, se añade a la placa el anticuerpo policlonal de detección, y finalmente un conjugado de estreptavidina-fosfatasa alcalina para la obtención de color por medio del sustrato adecuado. La intensidad del color obtenido puede ser cuantificada mediante el empleo de un espectrofotómetro adecuado al cromógeno empleado.

Asi, de acuerdo con la presente invención, los niveles de NRP-1 también pueden utilizarse como marcadores para evaluar los efectos de un fármaco o de un candidato a fármaco en pacientes urológicos con nefritis lúpica. Además, un experto en la técnica conocerá la aplicación de dichos métodos a muestras de orina de animales mamiferos no humanos que sean modelos de experimentación de nefritis lúpica.

Un paciente se trata con un fármaco candidato mientras la progresión de la enfermedad se controla a lo largo del tiempo. Este procedimiento comprende el tratamiento del paciente con un agente, la obtención de una muestra de orina del paciente, la determinación de los niveles de NRP-1 en la orina y comparar dichos niveles a lo largo del tiempo para determinar el efecto del agente sobre la progresión de la enfermedad.

o del kit de la invención, para evaluar el desarrollo en pacientes urológicos de nefritis o de nefritis lúpica. En una realización particular dicho uso se emplea para evaluar el efecto de un fármaco o candidato a fármaco en pacientes urológicos con nefritis o nefritis lúpica.

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras caracteristicas técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y caracteristicas de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.

DESCRIPCiÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1. Aumento de la expresión de NRP-1 en el momento del diagnóstico en el grupo de pacientes que conseguiria la curación (escala de O a 600000) respecto aquel que no lo conseguiria (escala de Oa 800), siendo la misma estadisticamente significativa (p < 0,0001)

Figura 2. Expresión en orina de NRP-1 en el momento del diagnóstico y después de un año con tratamiento standard (corticoides y tratamiento inmunosupresivo) de lupus nefritico en pacientes que alcanzaron la curación completa. Los resultados indican una disminución en la expresión de NRP-1 al año del tratamiento respecto al valor en el momento del diagnóstico., siendo la misma estadisticamente significativa (p<0,0001)

Figura 3 Expresión en orina de NRP-1 en el momento del diagnóstico y al completar el año de tratamiento en pacientes que no alcanzan la curación. Los resultados indican un aumento significativo en la expresión de NRP-1 al año de tratamiento respecto al valor en el momento del diagnóstico, siendo la misma estadisticamente significativa (p<0,0001)

Figura 4. Curva ROC para calcular la sensibilidad y la especifidad del uso de la expresión urinaria de Neurofilina-1 y de los anticuerpos anti-ADN como biomarcadores pronóstico de curación en el momento de diagnóstico en pacientes con nefropatia lúpica tras la administración de tratamiento

MODO DE REALlZACION DE LA INVENCION

Ejemplo 1:

De una cohorte de pacientes con SLE y afectación renal según se describe en (23) seguidos durante la evolución de su enfermedad, se seleccionaron 24 pacientes que tras el tratamiento consiguieron la curación completa y 24 que no lo consiguieron, y que fueron seguidos durante todo el proceso en el Hospital de la Vall d·Hebrón. En ambos grupos se utilizó el mismo tratamiento de inducción de remisión de la nefritis lúpica (corticoides y micofenolato) .

Se recogió una muestra de orina de cada uno de los pacientes, obtenida el dia del diagnóstico y al año de tratamiento. La muestra se centrifugó a 3.900 rpm (4° C) durante 30 minutos, obteniéndose un pellet del sobrenadante que fue almacenado a -80°C hasta el posterior análisis.

A partir del pellet, y mediante el proceso de retrotranscripción de ácido ribonucleico (ARN) se obtuvo ADN complementario (ADNc), realizándose posteriormente la cuantificación de la expresión de la neurofilina-1 mediante una PCR cuantitativa en tiempo real (RT-Q-PCR). Los cebadores fueron los siguientes:

Fw 5'-CACAGTGGAACAGGTGA TGACTTC-3'

Rv 5'-AACCATATGTTGGAAACTCTGA TTGT -3'

Se observó un aumento de la expresión del gen NRP-1 gen en el ARNm en el momento del diagnóstico en el grupo de pacientes que conseguiria la curación respecto aquel que no lo conseguiria (Figura 1) siendo la misma estadisticamente significativa (p < 0,0001).

Asimismo, se cuantificó el gen NRP-1 en ambos grupos al completar el año de tratamiento, observándose una disminución en su expresión en el grupo que consiguió la curación completa siendo la misma estadisticamente significativa (p<0,0001) (Figura 2) y un aumento significativo (p <0,0005) en el grupo que no consiguió la curación (Figura 3).

Asimismo se realizaron correlaciones entre parámetros utilizados de forma habitual en el seguimiento de estos pacientes (SLEDAI urinario, proteinuria (mg/dL y en 24 horas), sedimento en orina, c/earance de creatinina, y valores de hemoglobina y leucocitos en sangre) utilizando para ello los valores de nuestros pacientes al año del inicio del estudio y los valores de la expresión génica de neurofilina-1 en el momento del diagnóstico. Únicamente se encontró una correlación inversa significativa entre los valores de expresión génica de neurofilina-1 y los valores de proteinuria en mg/dL(r =-0.4351, P =0.0336) Y en 24 horas (r =-0.4955, P =0.0190).

Para calcular la especificidad y sensibilidad de la expresión de la neurofilina-1 para predecir el pronóstico de la nefritis lúpica en el momento del diagnóstico de la misma se realizó una curva ROC que mostró que para valores >244 tiene una sensibilidad del 93,75% y una especificidad del 87,50% siendo claramente superiores a los anticuerpos anti-ADN en la misma situación clinica (Figura 4).

Los resultados obtenidos en nuestra investigación indican que el biomarcador objeto de nuestra patente predice en el momento del diagnóstico el pronóstico de la nefritis lúpica y que lo hace de una forma mucho mejor que los parámetros clínicos que se utilizan en la práctica clínica habitual.

BIBLIOGRAFíA

1. Faurschou M, Starklint H, Halberg P, Jacobsen S. 2006. Prognostic factors in lupus nephritis: diagnostic and therapeutic delay increases the risk of terminal renal failure.

J Rheumato/33: 1563-9.

2.: Rosner S, Ginzler EM, Diamond HS, Weiner M, Schlesinger M, Fries JF, Wasner C, Medsger TA, Jr., Ziegler G, Klippel JH, Hadler NM, Albert DA, Hess EV, SpencerGreen G, Grayzel A, Worth D, Hahn BH, Barnetl EV. 1982. A multicenter study of outcome in systemic lupus erythematosus. 11. Causes of death. Arthritis Rheum 25: 612-7.

3.: Fiehn e. 2006. Early diagnosis and treatment in lupus nephritis: how we can influence the risk for terminal renal failure. J Rheumalo/33: 1464-6.

4.: Swaak AJ, Groenwold J, Bronsveld W. 1986. Predictive value of complement profiles and anti-dsONA in systemic lupus erythematosus. Ann Rheum Dis 45: 359-66.

5.: Zappitelli M, Ouffy CM, Bernard e, Gupta IR. 2008. Evaluation of activity, chronicity and tubulointerstitial indices for childhood lupus nephritis. Pedialr Nephrol23: 83-91

6.: eameron JS. 1999. Lupus nephritis. J Am Soc Nephro/1 o: 413-24.

7.: Austin HA, 3rd, Boumpas OT, Vaughan EM, Balow JE. 1994. Predicting renal outcomes in severe lupus nephritis: contributions of clinical and histologic data. Kidney Inl 45: 544-50.

8.: Mok ce. 2010. Biomarkers for lupus nephritis: a critical appraisal. J Biomed Biolechnol 2010: 638413.

9.: Manoharan A, Madaio MP. 2010. Biomarkers in lupus nephritis. Rheum Dis Clin NorlhAm36: 131-43, ix.

10.: Schramek H, Sarkozi R, Lauterberg e, Kronbichler A, Pirklbauer M, Albrecht R, Noppert SJ, Perco P, Rudnicki M, Strutz FM, Mayer G. 2009. Neuropilin-1 and neuropilin-2 are differentially expressed in human proteinuric nephropathies and cytokine-stimulated proximal tubular cells. Lab Invesl89: 1304-16

11.: Nieves BJ, O'Amore PA, Bryan BA. 2009. The function of vascular endothelial growth factor. Biofaclors 35: 332-7.

12.: Feliers O. 2009. Vascular endothelial growth factor as a prognostic marker of lupus nephritis. Kidney Inl 75: 1251-3.

13.: Karihaloo A, Karumanchi SA, eantley WL, Venkatesha S, eantley LG, Kale S. 2005. Vascular endothelial growth factor induces branching morphogenesis/tubulogenesis in renal epithelial cells in a neuropilin-dependent fashion. Mol Cel! Bio/25: 7441-8.

14.: Shulman K, Rosen S, Tognazzi K, Manseau EJ, Brown LF. 1996. Expression of vascular permeability factor (VPFIVEGF) is altered in many glomerular diseases. J Am Soc Nephrol7: 661-6.

15.: Kang DH, Joly AH, Oh SW, Hugo e, Kerjaschki D, Gordon KL, Mazzali M, Jefferson JA, Hughes J, Madsen KM, Schreiner GF, Johnson RJ. 2001. Impaired angiogenesis in the remnant kidney model: 1. Potential role of vascular endothelial growth factor and thrombospondin-1. J Am Soc Nephro/12: 1434-47.

16.: Frieri M, Samih MA, Dzhindzhikhashvili M, Liu H, Balsam L, Rubinstein S. 2012. TolIlike receptor 9 and vascular endothelial growth factor levels in human kidneys from lupus nephritis patients. J Nephrol25: 1041-6.

17.: Avihingsanon Y, Benjachat T, Tassanarong A, Sodsai P, Kittikovit V, Hirankarn N. 2009. Decreased renal expression of vascular endothelial growth factor in lupus nephritis is associated with worse prognosis. Kidney Inl 75: 1340-8.

18.: Avihingsanon Y, Phumesin P, Benjachat T, Akkasilpa S, Kittikowit V, Praditpornsilpa K, Wongpiyabavorn J, Eiam-Ong S, Hemachudha T, Tungsanga K, Hirankarn N. 2006. Measurement of urinary chemokine and growth factor messenger RNAs: a noninvasive monitoring in lupus nephritis. Kidney Inl 69: 747-53.

19.: Wongpiyabovorn J, Hirankarn N, Ruchusatsawat K, Yooyongsatit S, Benjachat T, Avihingsanon Y. 2011. The association of single nucleotide polymorphism within vascular endothelial growth factor gene with systemic lupus erythematosus and lupus nephritis. Inl J Immunogenel 38: 63-7.

20.: Paydas S, Balal M, Tanriverdi K, Sertdemir Y, Baslamisli F. 2007. The relationship between the VEGF levels and VEGF mRNA express ion and clinical course in different glomerulonephritis. Ren Fai/29: 779-84.

21.: Vadasz Z, Haj T, Halasz K, Rosner 1, Slobodin G, Attias D, Kessel A, Kessler 0, Neufeld G, Toubi E. 2012. Semaphorin 3A is a marker for disease activity and a potential immunoregulator in systemic lupus erythematosus. Arthrilis Res Ther 14: R146.

22.: Takagawa S, Nakamura F, Kumagai K, Nagashima Y, Goshima Y, Saito T. 2013. Decreased Semaphorin3A expression corre lates with disease activity and histological features of rheumatoid arthritis. BMe Musculoskelet Disord 14: 40.

5 23. Balada E, Castro-Marrero J, Pujol AP, Torres-Salido MT, Vilardell-Tarres M, Ordi-Ros

J. 2011. Enhanced transcript levels of CD48 in CD4(+) T cells from systemic lupus erythematosus patients. Immunobiology 216: 1034-7.

Claims

ES 2 528 672 Al

REIVINDICACIONES

1-Uso del gen NRP-1 o sus productos de expresión como biomarcador pronóstico y para la monitorización de la nefritis.

2-Uso del gen NRP-1 o sus productos de expresión según la reivindicación 1 de la nefritis lúpica.

3-Método de cuantificación del biomarcador según las reivindicaciones 1 y 2 útil para el pronóstico o monitorización de la nefritis.

4-Método de cuantificación del biomarcador según la reivindicación 3 útil para el pronóstico o monitorización de la nefritis lúpica.

5-Método según la reivindicaciónes 3 y 4 caracterizado por cuantificar los niveles de ARNm.

6-Método según las reivindicaciones 3 a 5 caracterizado porque la técnica que emplea es la RT-PCR.

7 -Método según la reivindicaciones 3 a 6 caracterizado porque la técnica que emplea es la qRT-PCR.

8-Método según la reivindicación 7 caracterizado porque comprende las siguientes etapas

o pasos:

a)

mezclar los ARNm aislados de una muestra con un enzima con actividad

retrotranscriptasa y con, al menos, una ADN polimerasa dependiente de ADN

b)

incubar la mezcla del paso (a) en condiciones que permitan la amplificación de

ADN complementario al ácido nucleico molde empleando un cebador, y

c)

realizar la detección en presencia de una molécula fluorescente que permita

cuantificar la cantidad de ADNc generado con un detector especifico.

9-Método según la reivindicación 8 en el que la detección fluorescente del paso d) es mediante SYBR Green.

22

ES 2 528 672 Al

10-Método según las reivindicaciones 3 y 4 caracterizado por cuantificar los niveles de proteina NRP-1.

11-Método según la reivindicación 10 caracterizado por ser un inmunoensayo o una espectrometria de masas.

12-Método según la reivindicación 11 caracterizado por ser un ELlSA.

13-Método según la reivindicación 12 caracterizado por comprender los siguientes pasos: a) inmovilización de un anticuerpo monoclonal anti-NRP-1 a un soporte, b) incubación con la muestra y captura de la proteina NRP-1 , c) incubación con un anticuerpo policlonal anti-NRP-1 marcado con biotina, d) unión de un conjugado de estreptavidina-fosfatasa alcalina, e) revelado de la reacción enzimática con un sutrato cromogénico, por ejemplo, el p

nitrofenilfosfato (p-NPP), f) análisis de la densidad óptica mediante espectrofometria a la longitud de onda adecuada al sustrato cromogénico empleado.

14-Método según la reivindicación 11 caracterizado por ser SELDI-TOF o MALDI-TOF.

15-Kit pronóstico de nefritis o nefritis lúpica caracterizado por ser útil para la realización del

método según las reivindicaciones 5 a 9 y caracterizado por comprender: a) una retrotranscriptasa, y b) al menos, un elemento de la lista que comprende:

i) un tampón, ii) un cebador, iii) una ADN polimerasa dependiente de ADN, y iv) un nucleótido.

23

ES 2 528 672 Al

16-Kit pronóstico de nefritis o nefritis lúpica caracterizado por ser útil para la realización del

método según las reivindicaciones 10 a 13 y caracterizado por comprender: a) un anticuerpo monoclonal anti-NRP1, b) un anticuerpo policlonal anti-NRP-1 , preferiblemente conjugado con biotina,

5 c) un conjugado de estreptavidina-fosfatasa alcalina, y d) un sustrato cromogénico.

17 -Método según las reivindicaciones 3 a 14 o kit según las reivindicaciones 15 a 16 caracterizado por que la muestra es orina.

10 18-Uso del método según las reivindicaciones 3 a 14 o del kit según las reivindicaciones 15 a 16 para evaluar el desarrollo en pacientes urológicos de nefritis o de nefritis lúpica.

19-Uso del método según las reivindicaciones 3 a 14 o kit según las reivindicaciones 15 a 15 16 para evaluar el efecto de un fármaco o candidato a fármaco en pacientes urológicos con nefritis o nefritis lúpica.

24