CN116287180A - 检测标志物的试剂在制备用于诊断哮喘的试剂盒中的应用 - Google Patents

检测标志物的试剂在制备用于诊断哮喘的试剂盒中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提出了一种检测标志物的试剂在制备用于诊断哮喘的试剂盒中的应用。本发明的标志物为PDK4、TM4SF1、WIF1、WNT5A中的任意一种或几种。本发明的检测标志物的试剂是检测样本中标志物的表达水平和/或甲基化水平的试剂，可以用在诊断哮喘的试剂盒中，通过这个试剂盒来诊断哮喘，实现了哮喘的早期准确诊断，具有很好的诊断效能，从而筛选预防或治疗哮喘的药物，解决了传统的依赖于临床表现、肺功能检查或峰流速测量来诊断哮喘的技术存在判断不准确和操作不方便的问题，填补了诊断哮喘的试剂盒的空白，提供了一种快捷方便的哮喘诊断方法。

Description

检测标志物的试剂在制备用于诊断哮喘的试剂盒中的应用
技术领域
本发明涉及生物医药的技术领域，特别是指检测标志物的试剂在制备用于诊断哮喘的试剂盒中的应用。
背景技术
哮喘(Asthma)是由气道上皮细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞等多种细胞以及细胞组分参与的慢性气道炎症性疾病，以气道炎症、气道高反应性、气道重塑为特点。近年来，哮喘患病率呈逐年增长的趋势，已成为严重危害人类健康的慢性气道炎症疾病之一，其反复发作可导致慢性阻塞性肺疾病、支气管扩张、肺源性心脏病等，严重影响患者的生活质量，造成沉重的社会负担。对于大部分哮喘患者，传统疗法如糖皮质激素、支气管扩张剂治疗有效，临床症状得到控制，但是，仍有部分患者病情得不到缓解。因此，必须改进对哮喘的诊断和监测以筛选出易感个体实施早期预防治疗。传统的诊断技术依赖于临床表现、肺功能检查或峰流速测量，而哮喘的临床表现非特异性，肺功能检查不是敏感指标，部分哮喘患者肺功能检查表现为正常或变化不明显。因此，需要一种用于诊断哮喘的试剂盒。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种检测标志物的试剂在制备用于诊断哮喘的试剂盒中的应用，本发明的技术方案是这样实现的：
在一个方面，本发明的一种检测标志物的试剂在制备用于诊断哮喘的试剂盒中的应用，所述标志物为PDK4、TM4SF1、WIF1、WNT5A中的任意一种或几种。
本发明的检测标志物的试剂是检测样本中标志物的表达水平和/或甲基化水平的试剂，可以用在诊断哮喘的试剂盒中，通过这个试剂盒来诊断哮喘，实现了哮喘的早期准确诊断，具有很好的诊断效能，从而筛选预防或治疗哮喘的药物，解决了传统的依赖于临床表现、肺功能检查或峰流速测量来诊断哮喘的技术存在判断不准确和操作不方便的问题，填补了诊断哮喘的试剂盒的空白，提供了一种快捷方便的哮喘诊断方法。其中，组合标志物的诊断效能优于单个标志物。这是一种用于检测样本中标志物的表达水平和/或甲基化水平的试剂在制备用于诊断哮喘的试剂盒中的用途，样本包括组织、体液。
作为一种优选的实施方案，所述试剂盒为qPCR试剂盒、免疫印迹检测试剂盒、免疫层析检测试剂盒、流式细胞分析试剂盒、免疫组化检测试剂盒、ELISA试剂盒、电化学发光检测试剂盒中的任意一种。这是一种用于诊断哮喘的试剂盒，这种试剂盒包含检测样本中标志物的表达水平和/或甲基化水平的试剂，标志物为PDK4、TM4SF1、WIF1、WNT5A中的任意一种或几种，其中，PDK4、TM4SF1、WIF1和WNT5A的多种组合的效果更好。
作为一种优选的实施方案，所述试剂为通过聚合酶链反应、核酸酶保护分析、原位杂交法、核酸微阵列、RNA印迹或DNA芯片检测标志物的表达水平的试剂。
作为一种优选的实施方案，所述聚合酶链反应为实时荧光定量逆转录多聚酶链反应、逆转录聚合酶链反应、竞争性聚合酶链反应中的任意一种。
作为一种优选的实施方案，所述试剂还包括通过甲基化芯片、甲基化特异性PCR、亚硫酸氢盐测序法、联合亚硫酸氢钠的限制性内切酶分析法、荧光定量法、高通量测序、焦磷酸测序定量、DNA印迹法、限制性界标基因组扫描、单核苷酸引物延伸、CpG岛微阵列、单核苷酸引物延伸SNUPE、质谱检测所述标志物的甲基化水平的试剂。
作为一种优选的实施方案，所述试剂包括对所述标志物具有特异性的抗体、对所述标志物具有特异性的探针和/或对所述标志物具有特异性的引物。
在另一个方面，本发明的一种用于诊断哮喘的试剂盒，所述试剂盒包括检测标志物的试剂，所述标志物为PDK4、TM4SF1、WIF1、WNT5A中的任意一种或几种。
这种试剂盒包含检测样本中标志物的表达水平和/或甲基化水平的试剂，标志物为PDK4、TM4SF1、WIF1、WNT5A中的任意一种或几种，通过这个试剂盒来诊断哮喘，实现了哮喘的早期准确诊断，具有很好的诊断效能，从而筛选预防或治疗哮喘的药物，解决了传统的依赖于临床表现、肺功能检查或峰流速测量来诊断哮喘的技术存在判断不准确和操作不方便的问题，填补了诊断哮喘的试剂盒的空白，提供了一种快捷方便的哮喘诊断方法。
在再一个方面，本发明的一种标志物在筛选预防或治疗哮喘的药物中的应用，所述标志物为PDK4、TM4SF1、WIF1、WNT5A中的任意一种或几种。本发明还提供了一种标志物在筛选预防或治疗哮喘的药物中的应用，标志物为PDK4、TM4SF1、WIF1、WNT5A中的任意一种或几种。
作为一种优选的实施方案，所述筛选预防或治疗哮喘的药物的方法包括以下步骤：1)在测试组中，向待测对象施用测试化合物，检测测试组中来源于所述对象的样品中所述标志物的水平V1；在对照组中，向待测对象施用空白对照，检测对照组中来源于所述对象的样品中所述标志物的水平V2；2)比较步骤1)检测得到的水平V1和水平V2，从而确定所述测试化合物是否是预防或治疗哮喘的候选化合物。所述水平包括表达水平和/或甲基化水平，待测对象为体外细胞体系，是脱离生命体的样品。
在还一个方面，本发明还提供了一种标志物在构建哮喘的诊断系统中的应用，所述标志物为PDK4、TM4SF1、WIF1、WNT5A中的任意一种或几种，所述诊断系统包括：(1)检测单元：包括标志物检测模块；(2)分析单元：将检测单元检测得到的标志物的表达水平和/或甲基化水平作为输入变量，输入哮喘的诊断模型进行分析，所述哮喘的诊断模型为XGBoost、随机森林、glmnet、cforest、机器学习的分类与回归树、treebag、K-毗邻、神经网络、支持向量机径向、支持向量机线性、朴素贝叶斯或多层感知中的任意一种或几种；(3)评估单元：输出样本对应的个体患哮喘的风险值。这是一种计算机诊断系统，哮喘的诊断模型使用上述的算法来确定。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明的检测标志物的试剂是检测样本中标志物的表达水平和/或甲基化水平的试剂，可以用在诊断哮喘的试剂盒中，通过这个试剂盒来诊断哮喘，实现了哮喘的早期准确诊断，具有很好的诊断效能，从而筛选预防或治疗哮喘的药物，解决了传统的依赖于临床表现、肺功能检查或峰流速测量来诊断哮喘的技术存在判断不准确和操作不方便的问题，填补了诊断哮喘的试剂盒的空白，提供了一种快捷方便的哮喘诊断方法。
附图说明
图1为GSE64913数据集中PDK4的差异表达的箱线图；
图2为GSE64913数据集中TM4SF1的差异表达的箱线图；
图3为GSE64913数据集中WIF1的差异表达的箱线图；
图4为GSE64913数据集中WNT5A的差异表达的箱线图；
图5为GSE64913数据集中PDK4的ROC曲线分析结果图；
图6为GSE64913数据集中TM4SF1的ROC曲线分析结果图；
图7为GSE64913数据集中WIF1的ROC曲线分析结果图；
图8为GSE64913数据集中WNT5A的ROC曲线分析结果图；
图9为GSE64913数据集中PDK4+WIF1+WNT5A的ROC曲线分析结果图；
图10为GSE64913数据集中PDK4+TM4SF1+WIF1+WNT5A的ROC曲线分析结果图；
图11为内参GAPDH基因的实时扩增曲线图；
图12为内参GAPDH基因产物的溶解曲线图；
图13为内参ACTB基因的实时扩增曲线图；
图14为内参ACTB基因产物的溶解曲线图；
图15为PDK4基因的实时扩增曲线图；
图16为PDK4基因产物的溶解曲线图；
图17为WIF1基因的实时扩增曲线图；
图18为WIF1基因产物的溶解曲线图；
图19为WNT5A基因的实时扩增曲线图；
图20为WNT5A基因产物的溶解曲线图；
图21为Real-time PCR验证PDK4基因差异表达的散点图；
图22为Real-time PCR验证WIF1基因差异表达的散点图；
图23为Real-time PCR验证WNT5A基因差异表达的散点图；
图24为Real-time PCR验证PDK4诊断效能的ROC曲线分析结果图；
图25为Real-time PCR验证WIF1诊断效能的ROC曲线分析结果图；
图26为Real-time PCR验证WNT5A诊断效能的ROC曲线分析结果图。
具体实施方式
定义
除非另外指明，否则本文所使用的以下术语具有归于其的含义。
标志物、差异表达基因
术语“标志物”指与生物学现象的存在定量或定性相关的分子。“标志物”的实例包括多核苷酸，如基因或基因片段，RNA或RNA片段；或多肽如肽、寡肽、蛋白质，或蛋白质片段；或任何代谢产物，副产物，或任何其他鉴定分子，如抗体或抗体片段，不管是否直接或间接与表型的机理相关。本发明的标志物包括如本文所公开的核苷酸序列(即GenBank序列)，特别是全长序列，任何编码序列，任何片段，或其任何互补物。
在本发明中，标志物，例如PDK4(geneID：5166)、TM4SF1(geneID：4071)、WIF1(geneID：11197)、WNT5A(geneID：7474)，包括gene及其编码的蛋白及其同源物，突变，和同等型。该术语涵盖全长，未加工的标志物，以及源自细胞中加工的任何形式的标志物。该术语涵盖标志物的天然发生变体(例如剪接变体或等位变体)。
术语“差异表达的基因”“差异基因表达”及相似短语指相对于在对照受试样品(例如对照样品)中的表达，其表达在受试样品(例如受试样品)，特别是疾病如哮喘中被激活至较高或较低水平的基因。这些术语也包括其表达在如下情况被激活至较高或较低的水平的基因：在相同疾病的不同阶段；在复发或非复发疾病中；或在具有较高或较低水平增生的细胞中。差异表达的基因可在多核苷酸水平或多肽水平被激活或抑制，或可经历可变拼接而导致不同多肽产物。此类区别可例如通过mRNA水平、表面表达、多肽分泌或其他分配上的变化而得到证明。
差异基因表达可包括比较两个或更多基因或其基因产物间的表达；或比较两个或更多个基因或其基因产物间的表达比率；或比较相同基因的不同加工产物，其在正常受试对象和患病对象间不同；或在相同疾病的不同阶段间不同；或在复发和非复发疾病间不同；或在具有较高和较低增生水平的细胞间不同；或在正常组织和患病组织间不同。差异表达包括基因或其表达产物在例如正常和患病细胞中、或在经历不同疾病事件或疾病阶段的细胞中、或在具有不同增生水平的细胞中在时间或细胞表达谱上的定量以及定性差异。
术语“表达”包括多核苷酸和多肽的生产，特别地，从基因或基因的一部分生产RNA(例如mRNA)，且包括RNA或基因或基因的一部分编码的蛋白质的生产，及与表达有关的可检测物质的出现。例如，例如来源于蛋白质-蛋白质相互作用、蛋白质-核苷酸相互作用或类似相互作用的复合物形成也包括在术语“表达”的范围内。其他例子是结合配体如杂交探针或抗体结合到基因或其他寡核苷酸、蛋白质或蛋白质片段及结合配体的可视化。因此，微阵列、杂交印迹(如Northern印迹)、或免疫印迹(如Western印迹)或珠阵列上的斑点强度，或通过PCR分析的强度包括在正在说明的生物分子术语“表达”的范围内。
术语“寡核苷酸”指多核苷酸，一般是探针或引物，包括但不限于：单链脱氧核苷酸，单链或双链核苷酸，RNA：DNA杂化物及双链DNA。寡核苷酸如单链DNA探针寡核苷酸经常利用化学方法合成，例如通过使用可商购的自动寡核苷酸合成仪，或通过多种其他方法，包括体外表达系统，重组技术及在细胞和生物体中的表达。
当以单数或复数形式使用时，术语“多核苷酸”一般指任何多核苷酸或多脱氧核苷酸，其可以是未修饰的RNA或DNA或修饰的RNA或DNA。这包括但不限于单链和双链DNA，包括单链和双链区域的DNA，单链和双链RNA，包括单链和双链区域的RNA，包含可以是单链或更一般地是双链或包括单链和双链区域的DNA和RNA的杂化物分子。也包括包含RNA或DNA或既包含RNA又包含DNA的三链区域。特别包括mRNA、cDNA和基因组DNA。该术语包括包含一个或更多个修饰碱基如氚化碱基或稀有碱基如肌苷的DNA和RNA。本发明的多核苷酸能包括编码或非编码序列，或正义或反义序列。
如本文所用，“多肽”指寡肽、肽或蛋白质序列，或其片段，及天然发生的、重组的、合成的或半合成的分子。其中本文引用的“多肽”指天然发生的蛋白质分子的氨基酸序列，“多肽”及类似术语不意味着限定氨基酸序列为全长分子的完整天然氨基酸序列。应理解，本文每一次引用“多肽”或类似术语时均包括全长序列及其任何片段、衍生物或变体。
本文中使用的术语“甲基化”，是指一种DNA的天然修饰方式，在真核生物中，其主要是指在甲基化CpG结合蛋白(methyl CpG-binding domain，MBD)和DNA甲基转移酶(DNAmethyltransferase，DNMT)的作用下，CpG二核苷酸5’端的胞嘧啶5位碳原子上连接一个甲基转变成为5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine，5-mC)的过程。DNA甲基化是表观遗传学中研究较为深入的一种形式，它具有多方面的生物学意义，DNA甲基化与胚胎的正常发育、基因表达调控、雌性个体X染色体失活、寄生DNA序列的抑制和印记基因及基因组结构稳定等密切相关，在DNA甲基化机制、DNA甲基转移酶、甲基化转录抑制机理、甲基化与肿瘤和疾病的关系及检测方法研究等方面取得了显著进展，DNA甲基化研究正成为疾病和肿瘤研究中的一个重要的前沿领域。
如本文所用，术语“样本”是指从如本文所述的目的来源获得或衍生的生物样本。在一些实施方案中，目的来源包含生物体，诸如动物或人。在一些实施方案中，生物样本包含生物组织或液体。在一些实施方案中，生物样本可以是或包含骨髓；血液；血细胞；腹水；组织或细针活检样本；含有细胞的体液；游离漂浮核酸；痰液；唾液；尿液；脑脊液腹膜液；胸膜液；粪便；淋巴；皮肤拭子；口服拭子；鼻拭子；洗涤物(washings)或灌洗物，诸如导管灌洗物或支气管肺泡灌洗物；吸出物；刮屑；骨髓标本；组织活检标本；手术标本；粪便，其他体液，分泌物和/或排泄物；和/或其中的细胞等。在一些实施方案中，生物样本是或包含从个体获得的细胞。在一些实施方案中，样本是通过任何合适的手段直接从目的来源获得的“初级样本”。例如，在一些实施方案中，通过选自以下的方法获得初级生物样本：活组织检查(例如，细针抽吸或组织活组织检查)、手术组织、体液(例如，血液、淋巴、粪便等)的收集等。在一些实施方案中，如从上下文将显而易见的，术语“样本”是指通过加工(例如，通过去除初级样本的一种或多种组分和/或通过向初级样本添加一种或多种试剂)获得的制剂。例如，使用半透膜过滤。这类“经处理的样本”可以包含例如从样本中提取的或通过对初级样本进行诸如mRNA的扩增或逆转录、某些组分的分离和/或纯化等技术而获得的核酸或蛋白质。在本发明的具体实施例中，所述的样本为血液、或气道上皮组织。
试剂盒
本发明提供了用于诊断受试者中的哮喘的试剂盒，该试剂盒用于确定前面所述标志物的表达水平和/或甲基化水平。试剂盒可以包括适于选择性检测来源于受试者的样品中用于诊断哮喘的标志物或标志物组的存在的材料和试剂。
在进一步的实施方案中，试剂盒可以含有标记或产品插页形式的合适操作参数的说明书。例如，说明书可以包括关于如何收集样品，如何确定样品中一种或多种生物标志物的水平，或如何将样品中一种或多种生物标志物的水平与受试者患哮喘相关联的信息或指导。
在另一个实施方案中，试剂盒可以含有一个或多个容器，其具有标志物样品，以用作参比标准，合适的对照，或用于测定的校准以检测测试样品中的标志物。
术语“受试者”是指任何动物(例如，哺乳动物)，包括，但不限于，人类、非人灵长类、犬、猫、啮齿动物等。进一步，受试者是人类受试者。术语“受试者”、“个体”和“患者”在本文中可互换使用。
除非另有说明，本发明的实施将采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学和生物化学的常规技术，这落入本领域技术范围内。这样的技术在文献中有充分的说明，例如：《分子克隆实验指南》，第2版，Sambrook等人，1989；OligonucleotideSynthesis，MJ Gait编辑，1984；Animal Cell Culture，R.I.Freshney编辑，1987；Methodsin Enzymology，Academic Press，Inc.；Handbook of Experimental Immunology，第4版，D.M.Weir&CC.Blackwell编辑，Blackwell Science Inc.，1987；GeneTransferVectors for Mammalian Cells，J.M.Miller&M.P.Calos编辑，1987；Current Protocolsin Molecular Biology，F.M.Ausubel等人编辑，1987；以及PCR：The Polymerase ChainReaction，Mullis等人编辑，1994。
下面将结合本发明的具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例一异常甲基化修饰差异表达基因分析
一、实验方法
1、NCBI GEO(Gene Expression Omnibus)数据检索分析
GEO(Gene Expression Omnibus)数据库是由NCBI(美国国立生物技术信息中心)开发维护，GEO数据库作为最大的基因表达数据的数据库，该数据库以芯片数据为主，此外亦包含一些非芯片类型的数据，如SAGE(基因表达系列分析)数据、SARST(核糖体序列标签连续分析)数据、MS(质谱)数据、蛋白质组数据和新一代高通量测序数据(MPSS，大规模平行测序技术)等。
(1)检索关键词
(Asthma)AND"Homo sapiens"[porgn:__txid9606]
(2)研究中的样本筛选策略
限制研究类型为“Expression profiling by array”和“Methylation profilingby array”符合以下标准的数据集将纳入研究中：①所选数据集必须为全基因组的mRNA转录组数据及DNA甲基化数据；②这些数据来自于哮喘和对照气道上皮样本；③本研究均考虑经标准化或者原始数据集；经筛选得到1套mRNA数据集，1套甲基化数据集，分别列入表1和表2。
表1 GEO数据库中检索到的mRNA数据集
Figure BDA0003841966980000081
表2 GEO数据库中检索到的甲基化数据集
Figure BDA0003841966980000082
2、基于高通量转录组数据和甲基化数据整合分析结果
(1)mRNA的差异分析
从GEO数据库下载GSE64913数据集，把探针对应到基因上，一个基因对应多个探针的取均值作为该基因的表达量，通过分析软件R-4.0.5的limma包对mRNA数据集进行差异分析。设置的筛选标准为P.Value<0.05&|logFC|>0.5。经分析得到245个差异表达基因，包括113个上调，132个下调。
(2)差异甲基化分析
采用CHAMP包对甲基化数据进行差异甲基化分析。设置的筛选标准是P.Value<0.05&|deltaBeta|>0.1，得到8447个差异甲基化位点，共3494个差异甲基化基因，包括1351个高甲基化基因，2143个低甲基化基因。
(3)异常甲基化修饰差异表达基因
对mRNA差异表达基因和差异甲基化基因取交集以获得异常甲基化调控的差异表达基因，得到10个高甲基化修饰表达下调的基因和14个低甲基化修饰的表达上调基因。
3、诊断效能分析
基于本发明所涉及异常甲基化修饰差异表达基因的表达水平，利用R语言的pROC包绘制ROC曲线。
二、实验结果
(1)本发明的基因(即标志物)的表达情况如表3，由表3和附图1、附图2、附图3以及附图4可以看出，相比正常对照，PDK4、TM4SF1在哮喘患者呈现显著性上调；WIF1、WNT5A呈现显著性下调。
表3标志物的表达情况
基因 logFC AveExpr P.Value up/down
PDK4 0.540 5.376 0.000 up
TM4SF1 0.641 4.106 0.000 up
WIF1 -0.822 3.763 0.012 down
WNT5A -0.672 4.465 0.000 down
(2)本发明的基因(即标志物)的诊断效能如表4，诊断效能的结果中，首先，考虑的因素是AUC值，AUC值越大，诊断效能越好；其次，可以考虑敏感性和特异性；由表4和附图5、附图6、附图7、附图8、附图9以及附图10可以看出，本发明的标志物用于诊断哮喘具有很好的诊断效能，并且，多种标志物组合的诊断效能优于单个标志物的诊断效能。
表4本发明的标志物在GSE64913数据集中的诊断效能
Figure BDA0003841966980000091
Figure BDA0003841966980000101
实施例二Real-time PCR验证
一、实验材料
1、样本清单
实验室提供30份人血液样本，其中17份对照样本(样本名称为1-17)，13份哮喘患者样本(样本名称为18-30)。
2、实验主要试剂
表5使用试剂清单
Figure BDA0003841966980000102
3、实验主要仪器
表6使用仪器清单
仪器名称 仪器型号 厂家
离心机 Centrifuge 5424R Eppendorf
NanoVue Plus 28956057 BIOCHROM LTD
荧光定量PCR仪 ABI7300 Applied Biosystems
二、实验方法
1、引物设计
Real Time PCR检测目的基因引物列入表7，表7中的引物在博迈德公司合成。
表7引物序列
Figure BDA0003841966980000111
2、实验过程
(1)提取样本总RNA
①每0.25mL液体样本加入0.75mL裂解液RLS，采用加样枪吹打液体样品几次，以帮助裂解样品中细胞。每5～10×106个细胞至少加入0.75mL裂解液RLS。裂解液RLS和液体样品的终体积比总是3：1。
②在EP管中加入0.75mL裂解液RLS，再加入0.25mL血液样本，用力连续震摇30s，混匀，在15-30℃条件下孵育10min，以使核蛋白体完全分解。
③每0.75mL裂解液RLS加0.2mL氯仿，剧烈震荡15s并室温下放置5min。
④于4℃12000rpm离心10min，样品分成三层：下层有机相、中间层和上层无色的水相，RNA存在于上层水相中。水相层的容量大约为所加RLS体积的70％，把水相转移到新管中，进行下一步操作。
⑤加入1倍体积70％乙醇，颠倒混匀(此时可能会出现沉淀)；得到的溶液和可能沉淀一起转入吸附柱RA中(吸附柱套在收集管内)，12000rpm离心45s，弃掉废液，将吸附柱重新套回收集管。
⑥加0.5mL去蛋白液RE，12000rpm离心45s，弃掉废液。
⑦加入0.5mL漂洗液RW，12000rpm离心45s，弃掉废液。
⑧加入0.5mL漂洗液RW，12000rpm离心45s，弃掉废液。
⑨将吸附柱RA放回孔收集管中，13000rpm离心2min，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
⑩取出吸附柱RA，放入一个RNase free离心管中，根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加30-50uL RNase free water(事先在65-70℃水浴中加热效果更好)，室温放置2min，12000rpm离心1min。如果需要较多RNA，可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，离心1min，或者另外加入再加30ul RNase free water，离心1min，合并两次洗脱液。
(2)逆转录合成mRNA cDNA
采用FastKing cDNA第一链合成试剂盒(货号：KR116)进行mRNA反转录，首先去除基因组DNA反应，在试管中加入5×gDNA Buffer 2.0uL，TotalRNA 1ug，加Rnase FreeddH2O使总体积至10uL，水浴锅中42℃加热3min，再将10×King RT Buffer 2.0uL，FastKing RT Enzyme Mix 1.0uL，FQ-RT Primer Mix 2.0uL，RNase Free ddH2O 5.0uL，混合后加入上述试管中一起混合共20uL，水浴锅中42℃加热15min，95℃加热3min，合成的cDNA需要长期保存时，请于-20℃或更低温度保存。
(3)Real Time PCR
①mRNA荧光定量检测
A、仪器及分析方法
采用ABI 7300型荧光定量PCR仪，采用2-△△CT法进行数据的相对定量分析。
B、操作过程如下
(一)反应体系
采用SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)(货号：FP205)，进行扩增，实验操作按产品说明书进行。RealTime反应体系列入表8。
表8 RealTime反应体系
Figure BDA0003841966980000121
Figure BDA0003841966980000131
(二)扩增程序
95℃15min，(95℃10sec，55℃30sec，72℃32sec)×40个循环，95℃15sec，60℃60sec，95℃15sec。
(三)引物筛选
将各样本cDNA混合后，以此为模板进行10倍梯度稀释，稀释后样品各取2μL作模板，分别采用目的基因引物和内参基因引物进行扩增，同时在60-95℃进行溶解曲线分析，根据扩增效率高和溶解曲线单峰原则进行引物筛选。
(四)样品RealTime PCR检测
将各样品cDNA 3-10倍稀释后取2μL作模板，分别采用目的基因引物和内参基因引物(见表7)进行扩增。同时，在60-95℃进行溶解曲线分析。样品RealTime PCR检测设计列入表9。
表9样品RealTime PCR检测设计
模板 样品cDNA 样品cDNA
重复检测孔道数 3 3
引物 目的基因引物 内参基因引物
3、实验结果
(1)RNA浓度检测结果及1.5％琼脂糖RNA电泳检测结果列入表10和表11。
表10 RNA浓度及纯度结果
Figure BDA0003841966980000132
Figure BDA0003841966980000141
注：RNA溶于水中会导致A260/280比值偏低；
注：A：浓度未达标准；B：A260/A280不合格；C：电泳图不合格；H：合格；
样本评判标准：
1.浓度>30ng/uL；
2.1.8<A260/A280<2.0；
3.电泳图可以看到较清晰三条带。
通常电泳图检测的是28S、18S、5.8S沉降系数rRNA，所以会存在三条带，但是第三条带因量少可能会看不到，在实际实验的过程中，第一条带或第二条带存在即可认为合格。
表11电泳上样情况
Figure BDA0003841966980000142
Figure BDA0003841966980000151
(2)各样品RealTimePCR检测结果及分析
①由附图11、附图12、附图13、附图14、附图15、附图16、附图17、附图18、附图19和附图20可以看出，本发明的标志物PDK4、WIF1和WNT5A实现了特异性扩增。
②各样品相对定量分析结果
根据RealTimePCR原始检测结果，按照2-△△ct相对定量计算公式，即
Figure BDA0003841966980000152
计算出各样品的目的基因相对定量结果，即其他各个样品相对于对照样品，目的基因mRNA转录水平的差异。
由附图21、附图22和附图23可以看出，经RealTimePCR验证，PDK4、WIF1、WNT5A在哮喘患者中差异表达，这与前面实验证明的趋势一致。
③诊断效能分析
表12 PDK4用于诊断哮喘的ROC曲线下方的区域
Figure BDA0003841966980000161
a、按非参数假定；b、原假设：真区域＝0.5。
表13 WIF1用于诊断哮喘的ROC曲线下方的区域
Figure BDA0003841966980000162
a、按非参数假定；b、原假设：真区域＝0.5。
表14 WNT5A用于诊断哮喘的ROC曲线下方的区域
Figure BDA0003841966980000163
a、按非参数假定；b、原假设：真区域＝0.5。
PDK4、WIF1和WNT5A的诊断效能列入表12、13和14，由表12和附图24可以看出，PDK4的诊断效能中，AUC为0.923，特异性为0.824，敏感性为0.923。由表13和附图25可以看出，WIF1的诊断效能中，AUC为0.756，特异性为0.706，敏感性为0.769。由表14和附图26可以看出，WNT5A的诊断效能中，AUC为0.769，特异性为0.765，敏感性为0.769。这表明PDK4、WIF1、WNT5A用于诊断哮喘具有很好的诊断效能。
因此，与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明的检测标志物的试剂是检测样本中标志物的表达水平和/或甲基化水平的试剂，可以用在诊断哮喘的试剂盒中，通过这个试剂盒来诊断哮喘，实现了哮喘的早期准确诊断，具有很好的诊断效能，从而筛选预防或治疗哮喘的药物，解决了传统的依赖于临床表现、肺功能检查或峰流速测量来诊断哮喘的技术存在判断不准确和操作不方便的问题，填补了诊断哮喘的试剂盒的空白，提供了一种快捷方便的哮喘诊断方法。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种检测标志物的试剂在制备用于诊断哮喘的试剂盒中的应用，其特征在于：
所述标志物为PDK4、TM4SF1、WIF1、WNT5A中的任意一种或几种。
2.根据权利要求1所述的检测标志物的试剂在制备用于诊断哮喘的试剂盒中的应用，其特征在于：
所述试剂盒为qPCR试剂盒、免疫印迹检测试剂盒、免疫层析检测试剂盒、流式细胞分析试剂盒、免疫组化检测试剂盒、ELISA试剂盒、电化学发光检测试剂盒中的任意一种。
3.根据权利要求1所述的检测标志物的试剂在制备用于诊断哮喘的试剂盒中的应用，其特征在于：
所述试剂为通过聚合酶链反应、核酸酶保护分析、原位杂交法、核酸微阵列、RNA印迹或DNA芯片检测标志物的表达水平的试剂。
4.根据权利要求3所述的检测标志物的试剂在制备用于诊断哮喘的试剂盒中的应用，其特征在于：
所述聚合酶链反应为实时荧光定量逆转录多聚酶链反应、逆转录聚合酶链反应、竞争性聚合酶链反应中的任意一种。
5.根据权利要求3所述的检测标志物的试剂在制备用于诊断哮喘的试剂盒中的应用，其特征在于：
所述试剂还包括通过甲基化芯片、甲基化特异性PCR、亚硫酸氢盐测序法、联合亚硫酸氢钠的限制性内切酶分析法、荧光定量法、高通量测序、焦磷酸测序定量、DNA印迹法、限制性界标基因组扫描、单核苷酸引物延伸、CpG岛微阵列、单核苷酸引物延伸SNUPE、质谱检测所述标志物的甲基化水平的试剂。
6.根据权利要求1所述的检测标志物的试剂在制备用于诊断哮喘的试剂盒中的应用，其特征在于：
所述试剂包括对所述标志物具有特异性的抗体、对所述标志物具有特异性的探针和/或对所述标志物具有特异性的引物。
7.一种用于诊断哮喘的试剂盒，其特征在于：
所述试剂盒包括含有标志物的试剂，所述标志物为PDK4、TM4SF1、WIF1、WNT5A中的任意一种或几种。
8.一种标志物在筛选预防或治疗哮喘的药物中的应用，其特征在于：
所述标志物为PDK4、TM4SF1、WIF1、WNT5A中的任意一种或几种。
9.根据权利要求8所述的标志物在筛选预防或治疗哮喘的药物中的应用，其特征在于，所述筛选预防或治疗哮喘的药物的方法包括以下步骤：
1)在测试组中，向待测对象施用测试化合物，检测测试组中来源于所述对象的样品中所述标志物的水平V1；在对照组中，向待测对象施用空白对照，检测对照组中来源于所述对象的样品中所述标志物的水平V2；
2)比较步骤1)检测得到的水平V1和水平V2，从而确定所述测试化合物是否是预防或治疗哮喘的候选化合物。
10.一种标志物在构建哮喘的诊断系统中的应用，其特征在于：
所述标志物为PDK4、TM4SF1、WIF1、WNT5A中的任意一种或几种，所述诊断系统包括：
检测单元，所述检测单元包括标志物检测模块；
分析单元，将检测单元检测得到的标志物的表达水平和/或甲基化水平作为输入变量，输入哮喘的诊断模型进行分析，所述哮喘的诊断模型为XGBoost、随机森林、glmnet、cforest、机器学习的分类与回归树、treebag、K-毗邻、神经网络、支持向量机径向、支持向量机线性、朴素贝叶斯或多层感知中的任意一种或几种；
评估单元，输出样本对应的个体患哮喘的风险值。
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