CN110777199B - 干癣性关节炎的诊断及治疗及其相应的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
用于在需要诊断或预测发展干癣性关节炎风险的受试者中诊断或预测发展干癣性关节炎之风险的方法及试剂盒，其包含在受试者的样品中测量一种或多种本文所公开的miRNA的表达量，并与在无干癣性关节炎样品的测试样品中的至少一种miRNA之表达量比较。亦提供藉由降低至少一种本文所公开的miRNA的表达量来治疗干癣性关节炎的方法。
Description
【技术领域】
本发明主张于2018年7月24申请之美国申请号第62/702,551号的效益，其全文藉由引用的方式并入本文。
【背景技术】
干癣性关节炎(psoriatic arthritis，PsA)为慢性发炎性疾病，涉及与干癣相关之进行性关节病(progressive arthropathy)。大约30％具有干癣的患者估计具有干癣性关节炎。通常，在PsA发病之前约10年为皮肤之表现(manifestations)。Haroon et al.(Annals of the rheumatic diseases 2015；74(6)：1045-50)报导了超过6个月的干癣性关节炎诊断延迟造成PsA的患者之不良放射线影像学结果及不良的功能性结果。早期诊断与及时介入为避免永久性关节变形及破坏的关键。目前，PsA的诊断主要基于临床表现型。至今并没有早期检测PsA之标准且可靠的评估方法，导致许多具有干癣的患者未确诊干癣性关节炎造成不佳治疗结果(Veale DJ et al.,Lancet 2018；391(10136)：2273-84)。
微小RNA(MicroRNAs，miRNAs)为演化上保守的通常长度为21-25个核苷酸之非编码RNA分子，其藉由结合至mRNA的3’-未转译区(3’-UTRs)进行蛋白质转译抑制或促进mRNA降解的作用(参见Griffiths-Jones S(2004).The microRNARegistry.Nucleic acidsresearch 32：D109-111)。miRNAs的大部分的现今研究为基础等级，因此有需要进一步建立其在干癣性关节炎的应用。
因此，有需要非侵入性且方便的方法来诊断及预测干癣性关节炎的风险及/或干癣性关节炎的治疗，本发明满足这些需求与其他需求。
【发明内容】
在一个实施例中，本发明提供用于在受试者中检测干癣性关节炎或预测发展干癣性关节炎之风险的方法，其包含在受试者的测试样品中测量选自由miR-146a-5p(SEQ IDNO：1)及miR-941(SEQ ID NO：2)所组成之群组中的至少一种miRNA的表达量(expressionlevel)的步骤，其中miRNA是在测试样品中经萃取的(extracted)CD14+单核细胞(monocyte)或破骨细胞(osteoclast)表达，且相对于在无干癣性关节炎样品中的至少一种对应的miRNA的表达量，在测试样品中的至少一种miRNA之较高的表达量系代表受试者具有干癣性关节炎或具有发展干癣性关节炎的风险。
在另一实施例中，本发明提供用于在受试者中检测干癣性关节炎及治疗干癣性关节炎的方法，其包含下列步骤：(a)在受试者的测试样品中测量选自由miR-146a-5p(SEQ IDNO：1)及miR-941(SEQ ID NO：2)所组成之群组中的至少一种miRNA的表达量，其中miRNA是在测试样品中经萃取的CD14+单核细胞或破骨细胞表达，且相对于在无干癣性关节炎样品中至少一种对应之miRNA的表达量，在测试样品中的至少一种miRNA之较高的表达量系指示受试者具有干癣性关节炎；以及(b)对受试者施予治疗剂以治疗干癣性关节炎。
本发明亦提供用于在受试者中检测干癣性关节炎或预测发展干癣性关节炎的风险的试剂盒，其包含：(a)用于从受试者的样品中萃取CD14+单核细胞的至少一微珠(microbead)；以及(b)用于测序或测量选自由miR-146a-5p及miR-941所组成之群组中的至少一种miRNA的表达量的试剂。
在一例示性实施例中，所述试剂盒进一步包含培养基，所述培养基包含M-CSF、RANKL及TNF-α。
亦提供的是，用于治疗干癣性关节炎的方法，其包含：对有需要之受试者，施予有效剂量之至少与SEQ ID NO：1有90％相同之miR-146a-5p抑制剂、或者施予有效剂量之至少与SEQ ID NO：2有90％相同之miR-941抑制剂的步骤。
亦揭露治疗干癣性关节炎受试者之治疗效果的方法，所述方法包含：(a)在对受试者提供至少一部份的治疗之前，测量在来自受试者的第一样品中经萃取的CD14+单核细胞之选自由miR-146a-5p及miR-941所组成之群组中的至少一种miRNA的表达量；以及(b)在对受试者提供至少一部份的治疗之后，测量在取得自受试者的第二样品中经萃取的CD14+单核细胞之步骤(a)的至少一种对应miRNA的表达量，其中，相对于在来自第一样品中经萃取的CD14+单核细胞之对应的miRNA之表达量，来自第二样品中经萃取的CD14+单核细胞之至少一种miRNA之下降的表达量代表有效治疗干癣性关节炎的指示。
【图式简单说明】
本发明之说明性实施例参考下列图式在下文中详细描述：
第1A图为显示在正常对照组(normal control，NC)及具有干癣性关节炎(PsA)之患者的经萃取CD14+单核细胞中的miR-146a-5p及miR-941的表达量之柱状图的组合。第1B图为显示miR-146a-5p及miR-941的ΔCt(delta Ct)值之柱状图的组合。第1C图及第1D图为显示来自正常对照组(CD14+NC)及具有干癣性关节炎之患者(PsACD14+)的经萃取的CD14+单核细胞中的miR-146a-5p及miR-941的表达的柱状图、以及在来自正常对照组(CD14-NC)及具有干癣性关节炎之患者(PsACD14-)的周边单核细胞(peripheral mononuclearcells)中的表达的柱状图。
第2图的图面(panels)A及B显示在治疗前及6个月治疗后的11位PsA患者中触痛关节(tender joints)数目及肿胀关节(swollen joints)数目。第2图的图面C及D显示在正常对照(NC)、11位PsA患者治疗前(PsA(0))、以及6个月的治疗后(PsA(28周))的经萃取的CD14+单核细胞中的miR-146a-5p及miR-941的表达。
第3A图及第3B图为显示在正常对照组(NC)、11位PsA患者治疗前(PsA(0))、以及6个月的治疗后(PsA(28周))的衍生自破骨细胞之CD14+单核细胞中的miR-146a-5p及miR-941之表达的柱状图
第4A至第4D图为显示无miR转染(transfection)(第4A图)、以负对照miRNA转染(第4B图)、miR-941抑制剂(第4C图)、或miR-146a-5p抑制剂(第4D图)对衍生自破骨细胞之CD14+单核细胞数量的影响的显微影像之组合。第4E图为显示无miR转染(PsA)、以负对照miRNA转染、miR-941抑制剂、或miR-146a-5p抑制剂对衍生自破骨细胞之CD14+单核细胞数量的影响的柱状图。
第5A图及第5B图显示在来自正常对照组(NC)、具有干癣不具有关节炎的患者(PsO)、及具有干癣性关节炎的患者的经萃取的CD14+单核细胞中的miR-146a-5p及miR-941的表达。
【实施方式】
如本文使用的，冠词「一(a)」及「一(an)」指的是一个或多于一个(亦即，至少一个(at least one))冠词的语法对象。
在申请专利范围中用语「或(or)」的使用意为「及/或(and/or)」。
当本说明书及申请专利范围使用字词「包含」、「具有」、或「含有」为涵盖(inclusive)或开放式的(open-ended)且不排除额外的、未列举的组件或方法步骤。
本文所使用的「患者(patient)」或「受试者(subject)」指的是经诊断具有或疑似具有发展干癣性关节炎之风险的哺乳类受试者。例示性的受试者可为人类、人猿、狗、猪、牛、猫、马、羊、绵羊、啮齿类及其他可发展干癣性关节炎的哺乳类。
如本文中可替换使用的「微小RNA(microRNA)」、「微小RNA(miR)」或「微小RNA(miRNA)」指的是来自miR基因之未经加工的(如：前驱物)、或经加工的(如：成熟的)的RNA转录本(transcript)。微小RNA为在真核生物中负调控基因表达并构成新颖类基因调节子(regulators)的内源非编码单股RNA(Chua,et al.(2009)Curr.Opin.Mol.Ther.11：189-199)。个别的miRNAs在不同生物体中被鉴别与测序，并给予其名称。本文提供miRNAs的名称及其序列。
本文的所有数目应被理解为藉由「大约」修饰，系意于涵盖特定值的±10％的变异，当例如这些变异适合为miRNA量的表达。
「较高(higher)」的miRNA表达为相对的用语，且可藉由在测试样品中与已知为无干癣性关节炎的(亦即，正常对照组)健康受试者之参考池(referenced pool)比较miRNA表达量决定。
本文所使用的用语「样品(sample)」指的是包含miRNA的样品。样品可利用来检测感兴趣miRNA的存在及/或表达量。尽管被预测为含有与正常对照组相较为不同表达的miRNA生物液体与器官最适合，但是经萃取的CD14+单核细胞与本发明主张的申请目标之方法一起使用。在一些实施例中，例如像是血液或其成分的样品相对容易取得。样品的非限制例包含体液(例如，周边血液)、细胞(例如，CD14+单核细胞或破骨细胞)及组织(例如，活检标本或关节液)。
miRNA的表达量的测量指的是量化存在样品中miRNA的数量。特定或任何miRNA的表达量的测量可使用任何本发明技术领域中具有通常知识者所习知或如藉由实时定量荧光PCR(real-time PCR)、北方墨点法(Northern blot)分析之本文所述的方法达成。miRNA的表达量的测量包含测量成熟形式的miRNA或与miRNA的表达相关之前驱物形式的表达。
在一特定的实施例中，至少一种miRNA的表达量系使用北方墨点法分析量化。例如，可藉由在核酸萃取缓冲液的存在下均质化(homogenization)，然后离心，以从细胞中纯化出总细胞RNA。沉淀核酸，且DNA藉由以DNA分解酶(DNase)处理及沉淀来移除。然后，RNA分子根据标准技术藉由在琼脂糖凝胶(agarose gels)上的胶体电泳(gel electrophoresis)分离并转移至硝化纤维素滤纸。之后，RNA藉由加热固定化(immobilized)于滤纸上。特定RNA的检测及量化使用适合的经标定DNA或RNA探针互补至所讨论的RNA而完成。参见，例如Molecular Cloning：ALaboratory Manual,J.Sambrook et al.,eds.,2nd edition,ColdSpring Harbor Laboratory Press,1989,Chapter 7，其揭露的全文与此并入作为参考。
在一些实施例中，微数组(microarray)的使用为可行的。微数组是核酸、蛋白质、小分子、细胞或可对复合生物样品平行分析的其他物质的微观、序化数组。所述技术提供许多具有已知序列信息的寡核苷酸(oligonucleotides)或多核苷酸(polynucleotides)作为探针，以找寻并与样品中的互补股(complementary strands)杂交(hybridize)，因此藉由选择性结合捕获互补股。探针包含对目标miRNA序列的至少一部分互补或实质上互补的寡核苷酸或多核苷酸序列。「互补(complementary)」指的是在两个核酸股的区域之间序列互补的广义概念。已知的是，若残基为胸腺嘧碇(thymine)或脲嘧啶(uracil)，则第一核酸区域的腺嘌呤残基(adenine residue)可与反向平行于第一区域的第二核酸区域的残基形成特定的氢键(「碱基对(base pairing)」)。相似地，已知的是，若残基为鸟嘌呤(guanine)，则第一核酸区域的胞嘧啶残基(cytosine residue)可与反向平行于第一股的第二核酸股的残基碱基配对。当如果两个区域以反向平行形式(fashion)排列，第一区域的至少一核苷酸残基可与第二区域的残基碱基配对时，核酸的第一区域互补于相同或不同核酸的第二区域。较佳地，第一区域包含第一部份且第二区域包含第二部分，因此当第一部份及第二部分以反向平行形式排列，第一部分的核苷酸残基的至少大约50％及较佳为至少大约75％、至少大约90％或至少大约95％可与第二部分中的核苷酸残基碱基配对。更佳地，所有第一部份的核苷酸残基可与第二部分中的核苷酸残基碱基配对。
例如，miRNAs的微数组分析可根据任何所属技术领域习知方法完成。在一个实施例中，RNA从样品的如CD14+单核细胞的细胞进行萃取，使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis)从所有RNA中尺寸选择(size-selected)小的RNA(18～26个核苷酸)。寡核苷酸连接符附着于小的RNA的5’及3’端，且产生的接合产物作为用于10个放大(amplification)循环的RT-PCR反应之范本。有义股(sense strand)PCR引子具有附着其之5’端的荧光团，因而荧光标记PCR产物的有义股。所述PCR产物变性，接着杂交至微数组。PCR产物指的是作为与数组上相应的miRNA捕获探针序列互补的目标核酸，其将经由碱基配对杂交至固定有捕获探针的点。之后，当所述的点使用微数组雷射扫瞄器激发时将发出荧光。然后，各点的荧光强度是使用数个阳性及阴性对照组及数组数据标准化方法来评估特定miRNA的复制数量，其将产生特定miRNA的表达量之评估。关于本文所揭露的miRNA，探针可以与目标miRNA或多核苷酸序列100％互补。然而，由于探针可以特异性结合目标多核苷酸并从样品捕获目标多核苷酸，因而所述探针不需必须沿着目标多核苷酸的全长完全互补至目标多核苷酸。在一些实施例中，探针为与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2至少90％、至少95％或100％相同的多核苷酸互补。
在一些实施例中，定量反转录聚合酶链锁反应(quantitative RT-PCR)的使用为可行的。定量反转录聚合酶链锁反应(qRT-PCR)为用来快速测定聚合酶链锁反应的产物量之聚合酶链锁的修改。qRT-PCR的目的通常为用于测定如miRNA的基因序列是否存在于样品中，以及若其存在时，则在所述样品中的复制量为何。可测定包含miRNA的核酸分子之表达的PCR之任何方法落在本揭露的范围中。在所属技术领域中已知的qRT-PCR方法的数种变化包含但不限制于经由琼酯醣胶体电泳分析(agarose gel electrophoresis)、SYBR Green的使用(双股DNA染剂)以及荧光报导探针(fluorescent reporter probe)的使用。
在干癣性关节炎及无干癣性关节炎的受试者中为不同表达的miRNA的鉴别允许以多种方式使用这些信息。例如，可评估特定的治疗方案(例如，以测定治疗在具有干癣性关节炎的受试者中是否有效)。干癣性关节炎的诊断可藉由比较测试样品的经萃取的CD14+单核细胞或破骨细胞的miRNA表达量与非干癣性关节炎样品的经萃取的CD14+单核细胞或破骨细胞的已知表达miRNA表达量图谱来完成或确认。进一步地，可进行一个或多个诊断或预测miRNA量的多重测定，且在表达量的持续时间变化可被用于测定、诊断、预断(prognosis)或复发(relapse)。例如，可在起始时间测定特定的miRNA量，并在第二时间再次测定。在一些实施例中，从起始时间到第二时间的miRNA量的增加可诊断为干癣性关节炎或给出预断(given prognosis)。相同地，从起始时间到第二时间的miRNA量的减少可指示干癣性关节炎或给出预断。进一步地，一个或多个miRNA量的改变程度可与干癣性关节炎的严重性相关。
在另一实施例中，提供一种决定在受试者中治疗干癣性关节炎之治疗效果的方法，所述方法包含步骤，所述步骤比较：(a)在对受试者提供至少一部份的治疗之前，在来自受试者的第一样品中测量之经萃取的CD14+单核细胞之选自由miR-146a-5p及miR-941所组成之群组中的至少一种miRNA的表达量；以及(b)在对受试者提供至少一部份的治疗之后，在取得自受试者的第二样品中之经萃取的CD14+单核细胞之在步骤(a)的至少一种对应miRNA的表达量，其中，相对于在第一样品之对应的miRNA之表达量，在第二样品之至少一种miRNA之下降的表达量为治疗系有效治疗干癣性关节炎的指示。在一个例示性实施例中，样品为经萃取的CD14+单核细胞，且miRNA为miR-146a-5p、miR-941或其组合。
参见第1C图及第1D图，不受任何特定理论的束缚，miR-146a-5p及miR-941的表达量仅在来自PsA患者的经萃取CD14+单核细胞或破骨细胞中评估，而不在PsA受试者的周边单核细胞中评估。因此，测量在周边单核细胞而非CD14+单核细胞中的miR-146a-5p、miR-941或其组合的表达量不能提供PsA的诊断。一种或多种破骨细胞可为来自一种或多种CD14+单核细胞的分化(differentiated)或来自PsA患者的关节液的破骨细胞。
在一个实施例中，试剂盒包含至少一种用于测序或测量需要诊断或预测发展干癣性关节炎之风险之受试者的样品中选自由miR-146a-5p及miR-941所组成之群组中的至少一种miRNA的表达量的试剂。
在又一个实施例中，试剂盒进一步包含培养基，所述培养基包含M-CSF、RANKL及TNF-α的培养基。培养基系用以分化经萃取的CD14+单核细胞为破骨细胞。
在一例示性实施例中，试剂为RT-PCR。在另一例示性实施例中，试剂盒包含至少一种miRNA-特异性寡聚核苷酸探针(miRNA-specific oligonucleotide probe)，所述探针与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2至少90％、至少95％或100％相同的多核苷酸互补。
本文所使用的“相同(identical)”指的是在相同核酸股的两个区域之间或两个不同核酸股的区域之间的核苷酸序列相似度。当在两个区域的核苷酸残基位置由相同的核苷酸残基占据，则在那个位置的区域为同源(homologous)。若各区域的至少一个核苷酸残基位置由相同的残基占据时，第一区域系同源于第二区域。两个区域之间的同源性系藉由相同核苷酸残基占据之两个区域的核苷酸残基位置的比例来表示。作为实例，具有核苷酸序列5'-ATTGCC-3'的区域与具有核苷酸序列5'-TATGGC-3'的区域共享50％的同源性。较佳地，第一区域包含第一部份且第二区域包含第二部分，因此各部分的核苷酸残基位置的至少大约50％及较佳为至少大约75％、至少大约90％或至少大约95％藉由相同的核苷酸残基占据。更佳地，各部分的所有核苷酸残基位置藉由相同的核苷酸残基占据。
提供用于在受试者中检测干癣性关节炎的方法，其包含下列步骤：测量在受试者的测试样品中至少一种下列miRNA之表达量：miR-146a-5p及miR-941，其中相对于无干癣性关节炎样品中至少一种相应的miRNA的表达量，在测试样品中至少一种miRNA之较高的表达量指示受试者具有干癣性关节炎或具有发展干癣性关节炎之风险。
本发明进一步提供用于在受试者中检测及治疗干癣性关节炎的方法，其包含下列步骤：(a)测量在受试者的测试样品中至少一种下列miRNA之表达量：miR-146a-5p及miR-941，其中相对于在无干癣性关节炎样品中至少一种相应的miRNA的表达量，在测试样品中至少一种miRNA之较高的表达量指示受试者具有干癣性关节炎或具有发展干癣性关节炎之风险；以及(b)施予治疗剂来治疗干癣性关节炎。治疗剂之非限制性实例包含非固醇类抗发炎药物(nonsteroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDs)、疾病修饰抗风湿病药物(disease-modifying anti-rheumatic drugs，DMARDs)、免疫抑制剂(immunosuppressant)、TNF-α抑制剂、阿司匹林(apremilast，Otezla)、优特克单抗(Ustekinumab，Stelara)、塞库金单抗(secukinumab，Cosentyx)、本文所揭露的miR-146a-5p抑制剂或miR-941抑制剂或其组合。
在一些实施例中，提供在有需要之受试者中治疗干癣性关节炎的方法，所述方法包含对受试者施予与SEQ ID NO：1至少90％、至少95％或100％相同的多核苷酸互补的miR-146a-5p抑制剂、及/或与SEQ ID NO：2至少90％、至少95％或100％相同的多核苷酸互补的miR-941抑制剂。
本发明之实施例藉由下列实例说明，其不应以任何方式解释为对其之范围强加限制。相反地，应被清楚理解的是，在不脱离本发明的精神下，所属技术领域中具有通常知识者在阅读本文之后，可采取各种其他实施例、修改及其等效物。除非另有指出，在描述下列实例的研究中，系遵循习知之程序。一些程序将在以下描述以用于说明目的。
实例1
研究参与：进行病例对照研究，以调查在具有干癣性关节炎(病例)的患者及没有PsA的健康正常对照(NC)的患者中各种miRNAs的表达。
招收16个健康正常对照(NC)及31个具有PsA的患者(基于用于干癣性关节炎的分类诊断标准(based on the Classification Criteria for Psoriatic Arthritis)，CASPAR,Taylor W et al.，关节炎及风湿病2006；54(8)：2665-73)到本研究中。
藉由定量PCR(qPCR)分析具有后续验证的次世代测序法(Next-generationsequencing，NGS)用以探索潜在的PsA生物标记。来自2个NC及4个PsA的RNA样品被用作来自NGS研究之候选miRNA的初始验证。
藉由CD14+微珠(MicroBeads)(Miltenyi Biotec,台湾)萃取及分离在经招募的受试者的周边血液中的CD14+单核细胞。RNA样品萃取自经分离的CD14+单核细胞，接着以Agilent Bioanalyzer 2100(Agilent,美国)进行质量检验来选择具有RNA完整数(integrity number value)≧8.0的RNA样品。经选择的RNA样品以TruSeq Small RNA制备流程(Illumina,USA)制备。
来自2个经合并的(pooled)男性NC、2个经合并的女性NC、两个经合并的具有PsA的男性患者及2个经合并的具有PsA的女性患者的RNA库以Illumina NGS平台测序，接着藉由miRSeq8分析来描绘微(mi)-RNA的表达。经制备的扩增子(amplicons)以V3 150-循环的测序试剂在MiSeq facility(Illumina)上测序，以产生51-nt的单端测序(single-endreads)。进行群分析(Clusterd analysis)来检验PsA及NC样品的miRNA表达图谱。
用NGS检验的RNA样品中，共有大约有27.7百万个原始读值(raw reads)，且每个样品总量有平均6.9百万个读值。所产生的NGS数据以用以miRNA定量及测序质量的评估之miRSeq(Pan CT.et al.,Biomed Res Int 2014：462135)分析。miRSeq以百万分之一的转录数(TPM)表示miRNA表达量。如表1所示，13个miRNAs在至少一个样品中具有高于1000的TPM值且平均表达率(正常对疾病或疾病对正常)为至少1.5。
表1、在PsA患者中具有较高表达量的miRNA之列表
在13个miRNAs当中，miR-941的表达在具有PsA的患者中增加。
qPCR在2个NC样品及4个PsA样品中进行以进一步验证NGS数据。相较于来自NCs的那些表达，显示miR-941及miR-146a-5p的表达之qPCR分析在具有PsA的患者中增加(参见第1A图)。
SVM为一种用于解决二元分类问题的机器学习算法(Machine learningalgorithm)，如治疗对于(versus)对照、或疾病对于正常。示于第1B图中，在NC及PsA患者中的miR-941及miR-146a-5p的DCt值，系用于以5倍交叉验证训练SVM分类，以消除过度拟合(overfitting)及低度拟合(underfitting)。
第1C图及第1D图显示在来自具有干癣性关节炎之患者的经萃取的CD14+单核细胞(PsACD14+)中miR-941及miR-146a-5p的表达上升，而在来自具有干癣性关节炎之患者的周边单核细胞(PsACD14-)则没有上升。
表2显示miR-146a-5p及miR-941的组合在PsA诊断中引出在灵敏度、特异性及接收者操作特性(receiver operating characteristic)下的面积(area under the receiveroperating characteristic，auROC)值之无法预期的协同作用。
表2、基于miR-146a-5p及miR-941的组合的PsA诊断的灵敏度、特异性及auROC
测量在PsA治疗(包含阿达木单抗(adalimumab)、依那西普(etanercept)、戈利木单抗(golimumab)、优特克单抗或塞库金单抗)前及治疗6个月后之来自16个NC和11个PsA患者之在经萃取的CD14+单核细胞中的miR-941及miR-146a-5p的表达。
11位PsA患者在治疗28周后具有显著的症状缓解(触痛关节及肿胀关节降低)(参见第2图的图面A及B)。在6个月的治疗之后之11位PsA患者的经萃取CD14+单核细胞中的miR-941和miR-146a-5p的表达显著的降低(第2图的图面C及D)。在经萃取的CD14+单核细胞中的miR-941及miR-146a-5p的表达下降与在PsA患者中症状缓解相关。
在从经萃取的CD14+单核细胞分化之破骨细胞中之miR-941和miR-146a-5p的表达量。
CD14+单核细胞系萃取自2位NC及两位PsA患者在PsA治疗之前及治疗6个月之后的周边血液。经萃取的CD14+单核细胞以M-CSF 50ng/ml培养3天，接着以100ng/ml RANKL及100ng/ml TNF-α培养9天使破骨细胞分化。已知破骨细胞在PsA中造成关节损坏(jointdestruction)。如第3A图及第3B图中所绘示，在成功治疗前后的PsA患者之CD14+单核细胞衍生的破骨细胞中miR-941及miR-146a-5p的表达高于NC(p<0.05及p<0.05)。结果显示，无论疾病活性(diseases activity)，在CD14+单核细胞衍生的破骨细胞中miR-941及miR-146a-5p的表达较高。
实例2
进行miR-941抑制剂及miR-146a-5p抑制剂对来自于具有PsA患者的CD14+单核细胞衍生的破骨细胞的影响之体外(in vitro)评估。
CD14+单核细胞系萃取自PsA患者的周边血液，并以M-CSF培养72小时。经培养的CD14+单核细胞以下列流程处理：
(1)无miRNA转染：每3天以TNF-α及RANKL培养CD14+单核细胞共9天以分化成破骨细胞。
(2)负对照miRNA转染：CD14+单核细胞以负对照miRNA(SEQ ID NO：3)转染6小时，然后每3天以TNF-α及RANKL培养CD14+单核细胞共9天以分化成破骨细胞。
(3)miR-941抑制剂转染：CD14+单核细胞以miR-941抑制剂转染(SEQ ID NO：4)6小时，然后每3天以TNF-α及RANKL培养CD14+单核细胞共9天以分化成破骨细胞。
(4)miR-146a-5p抑制剂转染：CD14+单核细胞以miR-146a-5p抑制剂(SEQ ID NO：5)转染6小时，然后每3天以TNF-α及RANKL培养CD14+单核细胞共9天以分化成破骨细胞。
如第4A至4E图所绘示，相较于负对照miR转染(第4B图)及无miR转染转染组(第4A图)，miR-941抑制剂(第4C图)或miR-941抑制剂(第4D图)显著降低CD14+单核细胞衍生的破骨细胞的数目。因此，miR-146a-5p或miR-941的抑制剂降低在PsA患者中的破骨细胞生成(osteoclastogenesis)，且可被用于治疗PsA。
实例3
被包含的病例对照研究被引导以检验在40位健康正常对照(NC)、40位具有干癣不具有关节炎的患者(PsO)及40位具有干癣性关节炎之患者(PsA)中之miR146a-5p及miR941的表达。
PsA的诊断及miRNAs的表达系根据准则及实例1中的步骤被测量。第5A图及第5B图显示miR146a-5p及miR941的表达显著地高于NC及PsO的表达量。此结果显示miR146a-5p及miR941之增加的表达可预测在具有干癣的患者中发展关节炎的风险。
序列表
<110> 长庚医疗财团法人高雄长庚纪念医院
<120> 干癣性关节炎的诊断及治疗及其相应的试剂盒
<150> US 62/702,551
<151> 2018-07-24
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<223> miR-146a-5p
<400> 1
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<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
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cacccggcug ugugcacaug ugc 23
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<212> RNA
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<223> 负对照miRNA
<400> 3
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<211> 23
<212> RNA
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<223> miR-941抑制剂
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<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<223> miR-146a-5p抑制剂
<400> 5
acucuugacu uaagguaccc aa 22
Claims (10)
1.测量选自由miR-146a-5p及miR-941所组成的群组中的至少一种miRNA的表达量的试剂在制备用于在受试者中检测或预测发展干癣性关节炎的风险的试剂盒中的用途，其中所述检测或预测包含：
在所述受试者的测试样品中测量选自由miR-146a-5p及miR-941所组成的群组中的至少一种miRNA的表达量的步骤，其中所述测试样品为CD14+单核细胞，
当相对于在无干癣性关节炎样品中的至少一种对应的miRNA的表达量，在所述测试样品中的至少一种miRNA具有较高的表达量则指示该受试者具有干癣性关节炎或具有发展干癣性关节炎的风险。
2.如权利要求1所述的用途，其中所述miRNA的表达量是通过实时定量荧光PCR检测。
3.如权利要求1所述的用途，其中所述miRNA的表达量是由与SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：2互补的寡聚核苷酸探针检测。
4.如权利要求1所述的用途，其中所述测试样品为衍生自CD14+单核细胞之破骨细胞。
5.一种用于在受试者中检测干癣性关节炎或预测发展干癣性关节炎的风险的试剂盒，其包含：
至少一种微珠，用以从该受试者的样品中萃取CD14+单核细胞；以及
试剂，其用于测序或测量选自由miR-146a-5p及miR-941所组成的群组中的至少一种miRNA的表达量。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其进一步包含培养基，所述培养基包含M-CSF、RANKL及TNF-α。
7.与SEQ ID NO：2互补的miR-941抑制剂在制备用于在受试者中治疗干癣性关节炎的药物中的用途。
8.如权利要求7所述的用途，其中该miR-941抑制剂为SEQ ID NO：4。
9.测量在取得自受试者的第一样品中选自由miR-146a-5p及miR-941所组成的群组中的至少一种miRNA的表达量的试剂在制备用于在受试者中决定治疗干癣性关节炎的效果的试剂盒中的用途，其中在受试者中决定治疗干癣性关节炎的效果包含下列步骤：
(a)在对所述受试者提供至少一部份的所述治疗之前，测量在取得自所述受试者的第一样品中选自由miR-146a-5p及miR-941所组成的群组中的至少一种miRNA的表达量；以及
(b)在对所述受试者提供至少一部份的所述治疗之后，测量在取得自所述受试者的第二样品中在步骤(a)的至少一种对应miRNA的表达量，其中，相对于在所述第一样品中对应的miRNA，在该第二样品中至少一种miRNA下降的表达量为该治疗是有效治疗干癣性关节炎的指示，其中所述第一样品及第二样品为CD14+单核细胞。
10.如权利要求9所述的用途，其中所述第一样品及第二样品为衍生自CD14+单核细胞之破骨细胞。
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