KR101828125B1

KR101828125B1 - 다발성 경화증에서의 진단 miRNA 프로파일

Info

Publication number: KR101828125B1
Application number: KR1020147032848A
Authority: KR
Inventors: 안드레아스 켈러; 엑카르트 메에세; 코르트 프리드리히 슈테엘러; 안드레아스 카펠; 페트라 라이딩거; 크리스티나 바케스
Original assignee: 지멘스 악티엔게젤샤프트
Priority date: 2012-04-27
Filing date: 2013-04-18
Publication date: 2018-02-09
Also published as: US20150111772A1; CN104428426A; WO2013160176A1; EP2657348B1; US10161004B2; EP2657348A1; CN104428426B; KR20150014938A

Abstract

본 발명은 miRNA 마커로 다발성 경화증을 진단하는 방법에 관한 것이다. 다발성 경화증 (MS)의 진단은 비정형 제시를 보이는 환자에서 아마도 염증성 탈수초화에 관련된 1차 신경학적 결손 동안에 곤란이 따를 수 있다. MS의 진단을 위한 바이오마커의 확인에 대하여, miRNA 발현 패턴의 종합적인 분석이 달성되었다. 마이크로RNA 질환 데이터베이스에 따라 이전에는 MS에 관련되지 않았던 유의하게 탈조절된 miRNA가 확인되었다. 이들 miRNA는 잠재적으로는 MS에 대한 미래 진단 바이오마커로서 역할을 할 수 있고 MS 보유 환자에서의 진단, 질환 활성 모니터링 및 치료 반응 평가에 일조할 수 있다.

Description

다발성 경화증에서의 진단 miRNA 프로파일 {DIAGNOSTIC MIRNA PROFILES IN MULTIPLE SCLEROSIS}

본 발명은 다발성 경화증의 진단 방법에 관한 것이다.

최근들어 분자 진단학은 중요성이 갈수록 증가하고 있다. 분자 진단학은 질환의 임상적 진단 (특히, 감염성 병원체의 검출, 게놈의 돌연변이 검출, 이환 세포의 검출 및 질환 소인에 대한 위험 인자의 확인)에의 진출을 모색하였다.

특히, 조직에서의 유전자 발현의 측정을 통해서, 핵산 분석은 질환의 연구와 진단에 있어서 매우 전도유망한 새로운 가능성을 열어준다.

검출하고자 하는 관심 핵산은 게놈 DNA, 발현된 mRNA 및 기타 RNA, 예컨대 마이크로RNA (약칭 miRNA)를 포함한다. miRNA는 다양한 생물학적 기능을 지닌 소형 RNA의 신 부류이다 (문헌 [A. Keller et al., Nat Methods. 2011 8(10):841-3]). 그들은 진핵 세포에서 발견되는 짧은 (평균 20-24 뉴클레오티드) 리보핵산 (RNA) 분자이다. 마이크로RNA의 수백가지 상이한 종 (즉, 수백가지 상이한 서열)이 포유동물에서 확인되었다. 그들은 전사후 유전자 조절에 중요하고 표적 메신저 RNA 전사체 (mRNA)상의 상보 서열에 결합하며, 이는 번역 억제 또는 표적 분해와 유전자 침묵화의 원인이 될 수 있다. 그에 따라 그들은 또한 연구, 진단 및 치료 목적용 생물학적 마커로도 이용될 수 있다.

다발성 경화증 (MS)은 중추신경계의 염증성 자가면역 질환으로, 여기에서는 뇌와 척수의 액손 주변 미엘린 수초가 손상되고, 이는 광범위 스펙트럼의 임상적 징후와 증상뿐만 아니라 탈수초화와 흉터형성을 초래하게 된다. MS는 재발/완화성 MS (RRMS), 속발성 진행성 MS, 원발성 진행성 MS, 진행성 재발성 MS를 포함하여 상이한 질환 하위유형으로 분류될 수 있다. 재발-완화성 하위유형은 예측할 수 없는 재발 후 질환 활성의 새로운 징후가 없는 수개월 내지 수년의 상대적 평온기 (완화)가 뒤따르는 것을 특징으로 한다. 재발-완화성 하위유형은 보통은 임상적 독립 증후군 (CIS)을 동반하여 개시한다. CIS에 있어서, 환자는 탈수초화를 시사하는 공격을 받는다. 종종 CIS는 MS의 발병을 특징짓는다.

다발성 경화증의 진단은 보통 상이한 임상 데이터, 영상화 데이터 및 실험실 데이터의 분석을 수반한다. 일부 환자는 질환의 진단을 받기 전에 MS를 보유한채로 수년을 살아간다.

증상은 다른 질환 및 의학적 문제와 유사할 수 있다. MS 병변의 전파의 임상적, 영상화, 실험실 및 방사선학 데이터가 진단을 위해서 입수될 필요가 있는데, 이는 시간이 걸리고, 비용이 많이 들며, 어려움이 따를 수 있다. 뇌척수액 (CSF)의 검사는 MS 진단에 도움을 주기 위하여 수행될 수 있지만, 이는 CSF를 수득하기 위하여 요추 천자라는 불쾌하고 위험한 절차를 수반한다.

따라서, MS를 위한 효율적이고 간편하며 신뢰할 만한 진단 검사에 대한 미충족 욕구가 존재한다.

정의

별도로 규정하지 않는 한, 본원에 사용되는 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야에서의 통상의 기술을 가진 자에 의하여 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다.

본원에서 사용되는 용어 "다발성 경화증" 또는 "MS"는 신경계의 염증성 질환에 관계되고, MS의 임상적 독립 증상 (CIS), 재발/완화성 MS (RRMS), 속발성 진행성 MS, 원발성 진행성 MS 및 진행성 재발성 MS를 비롯하여 질환의 모든 임상적 단계와 하위유형을 포함하는 것으로 의미된다.

본원에서 사용되는 용어 질환의 "결과를 예측하는"은 소정 요법을 받고있는 환자의 결과의 예측 및 치료를 받고있지 않은 환자의 예후 양쪽 모두를 포함하는 것으로 의미된다.

본 발명의 의미내에서 "결과"는 질환의 경과중에 달성되는 규정된 상태이다. 당해 질환 결과는 예를 들어 "질환의 재발", "질환의 완화", "치료에 대한 반응", 병기 또는 질환 등급 등과 같은 임상 상태일 수 있다.

"위험성"은 특정 질환 결과가 발생하거나 또는 그러한 결과에 도달할 대상체 또는 환자의 확률인 것으로 이해된다. 본 발명의 맥락에서 용어 "위험성"은 환자의 안녕에 관하여 어떤 긍정적 또는 부정적 함의를 갖도록 의미되는게 아니라 단지 소정 사건 또는 상태의 발생 또는 발달의 확률 또는 가능성을 언급한다.

용어 "임상 데이터"는 연령, 성별, 체중, 폐경/호르몬 상태, 병인론 데이터, 병력 데이터, 시험관내 진단 방법, 예컨대 혈액 또는 소변 검사에 의하여 수득된 데이터, 영상화 방법, 예컨대 x-선, 컴퓨터 단층촬영, MRI, PET, spect, 초음파에 의하여 수득된 데이터, 전기생리학적 데이터, 유전자 분석, 유전자 발현 분석, 생검 평가, 수술 소견을 포함하여(이에 한정되지 않음) 환자의 건강 상태에 관한 이용가능한 데이터와 정보의 전부에 관계된다.

본원에서 사용되는 용어 환자의 "샘플의 분류"는 상기 샘플과 적어도 두 카테고리 중 적어도 하나와의 연관에 관계된다. 이들 카테고리는 예를 들어 "고-위험성"과 "저-위험성", 고-, 중- 및 저-위험성일 수 있으며, 여기에서 위험성은 특정 기간에 발생하는 특정 사건, 예를 들어 질환의 발생, 질환의 진행 등의 확률이다. 그것은 질환의 호의적인 또는 비-호의적인 임상 결과, 소정 치료에 대한 반응성 또는 비-반응성 등의 카테고리를 추가로 의미할 수 있다. 분류는 알고리즘, 특히 판별 함수를 이용하여 수행될 수 있다. 알고리즘의 간단한 예는 제1 정량 파라미터, 예를 들어 특정 역치를 상회 또는 하회하는 관심 핵산의 발현 수준에 따른 분류이다. 환자의 샘플의 분류는 질환의 결과 또는 질환이 발병할 위험성의 예측에 이용될 수 있다. 관심 단일 핵산의 발현 수준을 이용하는 대신에, 수개의 관심 핵산의 합계 점수가 이용될 수 있다. 추가로, 부가적인 데이터가 제1 정량 파라미터와 조합하여 이용될 수 있다. 그러한 부가적인 데이터는 환자로부터의 임상 데이터, 예컨대 환자의 성별, 연령, 체중, 질환 등급매기기 등 일 수 있다.

"판별 함수"는 대상 또는 사건 분류에 사용되는 변수의 세트의 함수이다. 판별 함수는 따라서 환자, 샘플 또는 사건을 상기 환자, 샘플 또는 사건으로부터 이용가능한 데이터 또는 파라미터에 따른 카테고리 또는 복수개의 카테고리로 분류가능케 해준다. 그러한 분류는 당업자에게 잘 알려진 통계 분석의 표준 도구이다. 예를 들어 환자는 "고-위험성" 또는 "저-위험성", "치료를 요하는" 또는 "치료를 요하지 않는" 또는 상기 환자, 샘플 또는 사건으로부터 수득된 데이터에 따른 다른 카테고리로서 분류될 수 있다. 분류는 "고- vs. 저-"에 제한되는 것이 아니라 복수개의 카테고리, 등급매기기 등으로 수행될 수 있다. 분류를 가능케 해주는 판별 함수에 대한 예는 서포트 벡터 머신 (SVM), k-최근접 이웃 (kNN), (나이브(naive)) 베이즈(Bayes) 모델에 의하여 정의된 판별 함수, 또는 예를 들어 하위군 발견에서, 의사 결정의 수상도에서, 데이터의 논리 분석 (LAD)에서 등과 같은 구분적(piecewise) 정의 함수를 포함하며 그들에 한정되지 않는다.

용어 "발현 수준"은 예를 들어 관심 핵산의 발현의 측정된 수준을 언급한다. 용어 "발현 수준의 패턴"은 예를 들어 대조군으로부터의 참조 핵산과, 또는 예를 들어 DNA 칩 분석에서의 계산된 평균 발현치와 비교한 발현의 측정된 수준을 언급한다. 패턴은 두 유전자의 비교에 제한되는 것이 아니라 아울러 유전자와 참조 유전자 또는 샘플과의 다중 비교에도 관련된다. 특정한 "발현 수준의 패턴"이 또한 결과로서 나오고 이하에서 개시되는 몇몇 관심 핵산의 비교와 측정에 의하여 측정될 수 있으며 서로에 대한 이들 전사체의 상대적인 풍부성을 나타낼 수 있다. 발현 수준은 또한 상이한 조직, 환자 대 건강한 대조군 등에서의 발현에 관하여 평가될 수 있다.

본 발명의 의미내에서 "발현 수준의 참조 패턴"은 발현 수준의 또 다른 패턴과의 비교에 사용될 수 있는 발현 수준의 임의의 패턴인 것으로 이해하기로 한다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 발현 수준의 참조 패턴은 예를 들어 참조군으로 작용하는 건강한 또는 질환에 걸린 개체 군에서 관찰되는 발현 수준의 평균 패턴이다.

본 발명의 맥락에서 "샘플" 또는 "생물학적 샘플"은 생물학적 유기체로부터 유래되거나 또는 그와 접촉한 샘플이다. 생물학적 샘플의 예는 다음과 같다: 세포, 조직, 체액, 생검 표본, 혈액, 소변, 타액, 객담, 혈장, 혈청, 세포 배양 상청액 등.

"프로브"는 특정 생물학적 분자와 특이적으로 결합하거나 또는 상호작용할 수 있는 분자 또는 물질이다. 용어 "프라이머", "프라이머 쌍" 또는 "프로브"는 분자생물학 분야의 당업자에게 알려져 있는 이들 용어의 통상적인 의미를 갖는다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, "프라이머", "프라이머 쌍" 및 "프로브"는, 그 프라이머, 프라이머 쌍 또는 프로브가 표적 분자, 예를 들어 검출 또는 정량하고자 하는 표적 핵산, RNA, DNA, cDNA, 유전자, 전사체, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질에 특이적으로 결합할 수 있도록, 검출 또는 정량하고자 하는 표적 분자 또는 표적 서열의 영역과 동일하거나, 그에 상보적이거나, 그의 상동체이거나, 또는 그와 상동성인 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 분자를 언급한다. 본원에서 이해되는 바와 같이, 프라이머는 그 자체로 프로브로서 기능할 수 있다. 본원에서 이해되는 "프로브"는 다수의 시판 qPCR 방법에서 통상적인 바와 같이 예를 들어 프라이머 쌍과 내부-표지 프로브의 조합을 또한 포함할 수 있다.

"유전자"는 기능성 RNA 생성물을 제어된 방식으로 생산하는 데 필요한 정보를 함유하는 핵산 절편의 세트이다. "유전자 생성물"은 유전자의 전사 또는 발현을 통해 생산된 생물학적 분자, 예를 들어 mRNA 또는 번역된 단백질이다.

"miRNA"는 짧은 자연 발생 RNA 분자이며 당업자에 의하여 이해되는 통상의 의미를 갖는다. "miRNA에서 유래한 분자"는 miRNA 주형, 예컨대 cDNA로부터 화학적으로 또는 효소적으로 수득되는 분자이다.

용어 "어레이"는 소자, 예를 들어 칩 소자상의 어드레스가능한 위치의 배열을 언급한다. 위치의 개수는 수개 내지 적어도 수백개 또는 수천개 범위일 수 있다. 각각의 위치는 독립된 반응 부위를 나타낸다. 어레이는 핵산 어레이, 단백질 어레이 및 항체 어레이를 포함하며 이들에 한정되지 않는다. "핵산 어레이"는 핵산 프로브, 예컨대 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드 또는 유전자의 보다 큰 부분을 함유하는 어레이를 언급한다. 어레이상의 핵산은 바람직하게는 단일 가닥이다. "마이크로어레이"는 바이오칩 또는 생물학적 칩, 즉 적어도 약 100/cm²의 고정화 프로브를 지닌 불연속 영역의 밀도를 갖는 영역의 어레이를 언급한다.

"PCR-기반 방법"은 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)을 포함하는 방법을 언급한다. 이는 1종, 2종 또는 그 이상의 프라이머를 사용하여 시험관내에서 효소적 복제에 의하여 핵산, 예를 들어 DNA 또는 RNA를 기하급수적으로 증폭시키는 방법이다. RNA 증폭의 경우, 역전사가 제1 단계로서 이용될 수 있다. PCR-기반 방법은 발현 수준의 분석에 특히 적합한 동역학적 또는 정량적 PCR (qPCR)을 포함한다. 발현 수준의 측정에 관해서 말하면, PCR-기반 방법은 예를 들어 (1) 완전한 mRNA 풀 (소위 트랜스크립톰)을 역전사효소의 도움하에 cDNA로 역전사한 다음, (2) 각각의 프라이머의 도움하에 소정 cDNA의 존재를 검출함으로써 소정 mRNA의 존재를 검출하는 데에 이용될 수 있다. 당해 접근법은 역전사효소 PCR (rtPCR)로서 일반적으로 알려져 있다. 용어 "PCR-기반 방법"은 증폭된 표적의 기능으로서 형광 신호를 방출하고 표적의 모니터링과 정량을 가능케 해주는 특수 형광발색단 또는 삽입 염료를 적용하는 동역학적/실시간 PCR 기술뿐만 아니라 양단점 PCR(both end-point PCR)도 포함한다. 정량 방법은 외부 표준 곡선에 의하여 절대적이거나 또는 비교 내부 표준에 대하여 상대적일 수 있다.

용어 "차세대 서열분석" 또는 "고-처리량 서열분석"은 서열분석 과정을 병렬화하여 수천개 또는 수백만개의 서열을 일시에 생성하는 고-처리량 서열분석 기술을 언급한다. 예는 매시블리 패러렐 시그너처 시퀀싱(Massively Parallel Signature Sequencing: MPSS), 폴로니(Polony) 서열분석, 454 파이로시퀀싱(pyrosequencing), 일루미나(Illumina) (솔렉사(Solexa)) 서열분석, 솔리드(SOLiD) 서열분석, 이온 반도체 서열분석, DNA 나노볼 서열분석, 헬리오스코프(TM) 단일 분자 서열분석, 단일 분자 SMRT(TM) 서열분석, 단일 분자 실시간 (RNAP) 서열분석, 나노포어 DNA 서열분석을 포함한다.

용어 "마커" 또는 "바이오마커"는 생물학적 분자, 예를 들어 핵산, 펩티드, 단백질, 호르몬 등을 언급하며, 그들의 존재 또는 농도는 공지의 병태, 예컨대 질환 상태를 가지고서 검출 및 그와 상관지을 수 있거나, 또는 임상 결과, 예컨대 치료에 대한 반응을 가지고서 검출 및 그와 상관지을 수 있다.

발명의 목적

본 발명의 근저에 있는 기술적 과제는 다발성 경화증의 진단, 다발성 경화증이 발병할 위험성의 예측 또는 다발성 경화증의 결과의 예측을 가능케 해주는 생물학적 마커를 제공하는 것이다.

발명의 개요

본 발명을 상세히 기재하기에 앞서, 본 발명은 기재된 방법이 변화할 수 있음에 따라 그러한 방법의 공정 단계의 특정 구성부분에 제한되지 않음을 이해하여야 한다. 본원에서 사용되는 전문 용어는 단지 특정 실시양태의 기재 목적을 위한 것이고, 제한적인 것으로 의도되지 않음을 또한 이해하여야 한다. 명세서와 첨부 특허청구범위에서 사용되고 있는 바와 같이 단수형 "a," "an" 및 "the"는 문맥상 명백히 다른 의미로 지시하지 않는 한 단수 및/또는 복수 지시대상을 포함한다는 것을 유념하여야 한다. 복수형은 문맥상 명백히 다른 의미로 지시하지 않는 한 단수 및/또는 복수 지시대상을 포함한다는 것도 또한 이해하여야 한다. 수치에 의하여 경계가 정해지는 파라미터 범위가 주어지는 경우에, 그 범위는 이들 한계치를 포함하는 것으로 간주됨을 또한 이해하여야 한다.

그의 가장 일상적인 용어로, 본 발명은 특히 CIS/RRMS의 다발성 경화증의 진단, 예후 및 예측에 유용한 miRNA 마커의 콜렉션에 관한 것이다.

본 발명은 다발성 경화증을 진단하거나, 다발성 경화증이 발병할 위험성을 예측하거나 또는 다발성 경화증의 결과를 예측하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은

a) 상기 환자로부터의 샘플에서 hsa-miR-16-2-3p, hsa-miR-22-5p, hsa-miR-125b-5p, hsa-miR-629-5p, hsa-miR-100-5p, hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-151a-3p 및 hsa-miR-7-1-3p로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 miRNA의 발현 수준을 측정하는 단계,

b) 단계 a)에서 측정된 발현 수준(들)의 패턴을 발현 수준의 하나 또는 수개의 참조 패턴(들)과 비교하는 단계, 및

c) 단계 b)에서의 비교 결과로부터 다발성 경화증을 진단하거나, 다발성 경화증이 발병할 위험성을 예측하거나 또는 다발성 경화증의 결과를 예측하는 단계를 포함한다.

추가로, 본 발명은 다발성 경화증을 앓고 있거나 또는 다발성 경화증이 발병할 위험성이 있는 환자의 샘플을 분류하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은

a) 상기 환자로부터의 상기 샘플에서 hsa-miR-16-2-3p, hsa-miR-22-5p, hsa-miR-125b-5p, hsa-miR-629-5p, hsa-miR-100-5p, hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-151a-3p 및 hsa-miR-7-1-3p로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 miRNA의 발현 수준을 측정하는 단계,

c) 단계 b)에서의 비교 결과로부터 상기 환자의 샘플을 적어도 두 부류 중 하나로 분류하는 단계를 포함한다.

그러한 분류는 다발성 경화증의 진단, 다발성 경화증이 발병할 위험성의 예측 또는 다발성 경화증의 결과의 예측을 나타낼 수 있다.

상기 부류는 건강/이환, 저-위험성/고-위험성, 질환이 발병할 저-위험성/고-위험성 등일 수 있다.

바람직하게는, hsa-miR-16-2-3p, hsa-miR-22-5p, hsa-miR-125b-5p, hsa-miR-629-5p, hsa-miR-100-5p, hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-151a-3p 및 hsa-miR-7-1-3p로 이루어진 군으로부터 선택된 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개 miRNA의 발현 수준은 상기 환자로부터의 상기 샘플에서 측정될 수 있다.

발현 수준의 참조 패턴은 적어도 1인의 건강한 대상체에서 hsa-miR-16-2-3p, hsa-miR-22-5p, hsa-miR-125b-5p, hsa-miR-629-5p, hsa-miR-100-5p, hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-151a-3p 및 hsa-miR-7-1-3p로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 miRNA의 발현 수준을 측정함으로써 수득될 수 있다.

단계 a)에서 측정된 적어도 하나의 miRNA의 발현 수준에 수치를 할당하는 것이 본 발명의 범위내에 있다.

추가로, 알고리즘을 적용하여 발현 수준(들)의 참조 패턴에 대하여 정규화한 발현 수준을 수득함으로써 단계 b)를 수행하기 위한 알고리즘을 적용하는 것이 본 발명의 범위내에 있다.

단계 a)에서 측정된 적어도 하나의 miRNA의 발현 수준의 수치에 알고리즘을 적용하여 샘플의 분류 또는 다발성 경화증의 진단, 예후 또는 다발성 경화증이 발병할 위험성의 예측 또는 다발성 경화증의 결과의 예측을 가능케 해주는 질환 스코어를 수득하는 것이 본 발명의 범위내에 있다. 그러한 알고리즘의 비-제한적인 예는 발현 수준의 수치를 역치에 대하여 비교하여 결과를 고-위험성/저-위험성, 이환/건강 등과 같은 두 카테고리중의 하나로 분류하는 것이다. 그러한 알고리즘의 추가의 비-제한적인 예는 예를 들어 합산에 의하여 발현 수준의 복수개의 수치를 합하여 합계 점수를 수득하는 것이다. 개별 가수(summand)는 miRNA의 발현 수준을 나타내는 인수(factor) 또는 수치, 임상 데이터를 나타내는 수치 또는 기타 인수로 곱함으로써 정규화 또는 가중될 수 있다.

판별 함수를 적용하여 결과를 분류하거나, 질환을 진단하거나 또는 결과 또는 위험성을 예측하는 것이 본 발명의 범위내에 있다.

본 발명의 측면에 따르면, 샘플은 혈액 샘플, 혈청 샘플 및 혈장 샘플로 이루어진 군으로부터 선택된다.

본 발명의 추가 측면에 따르면, 샘플은 혈액 샘플이다.

본 발명의 측면에 따르면, 본 발명의 방법은 단계 a)에서 miRNA인 hsa-miR-16-2-3p, hsa-miR-20a-5p 및 hsa-miR-7-1-3p의 발현 수준을 측정하는 것을 포함한다.

본 발명의 측면에 따르면, 본 발명의 방법은 단계 a)에서 miRNA인 hsa-miR-22-5p, hsa-miR-125b-5p, hsa-miR-16-2-3p, hsa-miR-100-5p, hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-151a-3p 및 hsa-miR-7-1-3p의 발현 수준을 측정하는 것을 포함한다.

본 발명의 측면에 따르면, 본 발명의 방법은 단계 a)에서 hsa-miR-22-5p, hsa-miR-125b-5p, hsa-miR-629-5p, hsa-miR-16-2-3p, hsa-miR-100-5p, hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-151a-3p 및 hsa-miR-7-1-3p로 이루어진 군으로부터 선택된 모든 miRNA의 발현 수준을 측정하는 것을 포함한다.

추가로 본 발명은 다발성 경화증을 앓고 있거나 또는 다발성 경화증이 발병할 위험성이 있는 환자에서 다발성 경화증을 진단하거나, 다발성 경화증이 발병할 위험성을 예측하거나 또는 다발성 경화증의 결과를 예측하기 위한 키트에 관한 것으로, 상기 키트는

- 상기 환자로부터의 상기 샘플에서 hsa-miR-22-5p, hsa-miR-125b-5p, hsa-miR-629-5p, hsa-miR-16-2-3p, hsa-miR-100-5p, hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-151a-3p 및 hsa-miR-7-1-3p로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 miRNA의 발현 수준을 측정하는 수단, 및

- 상기 샘플로부터의 적어도 하나의 miRNA의 발현 수준과 비교하기 위한 발현 수준의 적어도 하나의 참조 패턴을 포함한다.

상기 적어도 하나의 miRNA의 발현 수준을 측정하는 수단은 상기 적어도 하나의 miRNA를 검출 또는 증폭하는 올리고뉴클레오티드 프로브, 어레이-기반 방법, PCR-기반 방법, 서열분석-기반 방법에 기초하여 발현 수준을 측정하는 수단 또는 발현 수준을 측정하는 여타 적합한 수단을 포함할 수 있다.

참조 발현 수준 패턴은 수치 정보로서, 특히 임의의 적합한 정보 담체상의 컴퓨터-인코딩 정보로서 공급될 수 있다.

추가로 본 발명은 다발성 경화증을 앓고 있거나 또는 다발성 경화증이 발병할 위험성이 있는 환자에서 다발성 경화증을 진단하거나, 다발성 경화증이 발병할 위험성을 예측하거나 또는 다발성 경화증의 결과를 예측하기 위한 컴퓨터 프로그램 제품에 관한 것으로, 상기 제품은

- 환자 샘플 중 hsa-miR-16-2-3p, hsa-miR-22-5p, hsa-miR-125b-5p, hsa-miR-629-5p, hsa-miR-100-5p, hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-151a-3p 및 hsa-miR-7-1-3p로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 miRNA의 발현 수준을 나타내는 데이터를 수신하는 수단,

- 상기 샘플로부터의 적어도 하나의 miRNA의 발현 수준과 비교하기 위한 발현 수준의 적어도 하나의 참조 패턴을 나타내는 데이터를 수신하는 수단,

- 환자 샘플 중 적어도 하나의 miRNA의 발현 수준을 나타내는 상기 데이터를 비교하는 수단, 및

- 단계 b)에서의 비교 결과로부터 다발성 경화증의 진단, 다발성 경화증이 발병할 위험성의 예측 또는 다발성 경화증의 결과의 예측을 측정하는 수단을 포함한다.

컴퓨터 프로그램 제품은 반도체기억장치, 디스크, CD 등과 같은 저장가능한 전자 매체상에 제공될 수 있다. 컴퓨터 프로그램 제품은 컴퓨터상에 국소적으로 저장될 수 있다. 컴퓨터 프로그램 제품은 웹- 또는 인터넷-기반 적용을 비롯하여 네트워크-기반 프로그램 또는 적용으로서 실행될 수 있다. 컴퓨터 프로그램 제품은 진단 장치, 예컨대 분석 기기에서 실행될 수 있다. 컴퓨터 프로그램 제품은 정보 출력장치, 예컨대 디스플레이, 프린터 등에 작동가능하게 연결될 수 있다.

추가로, 환자에서 질환을 진단하거나, 상기 질환이 발병할 위험성을 예측하거나 또는 상기 질환의 결과를 예측하기 위한 miRNA 바이오마커를 확인하는 방법이 본원에 개시되며, 상기 방법은

a) 고-처리량 서열분석 방법을 사용함으로써 적어도 하나의 참조 샘플과 비교하여 상기 질환을 앓고 있는 환자의 적어도 하나의 샘플에서 차등적으로 발현되는 복수개의 miRNA를 확인하는 단계,

b) 핵산 어레이를 사용함으로써 추가 참조 샘플과 비교하여 상기 질환을 앓고 있는 추가 환자의 추가 샘플에서 차등적으로 발현되는 추가 복수개의 miRNA를 확인하는 단계,

c) 단계 (a)에서 확인된 복수개의 miRNA와 단계 (b)에서 확인된 추가 복수개의 miRNA를 비교하여 (a)와 (b) 양쪽 모두에서 차등적으로 발현되는 적어도 하나의 miRNA를 확인하는 단계, 및 임의로

d) PCR-기반 방법에 의하여 상기 적어도 하나의 miRNA의 차등 발현을 확인하는 단계를 포함한다.

본 발명의 목적의 부가적인 세부사항, 특성, 특징 및 이점은 하기 상세한 설명 및 예시적인 방식으로 본 발명의 바람직한 실시양태를 보여주는 각 실시예의 도면에 좀더 상세히 개시된다. 그러나, 이들 실시예는 결코 본 발명의 범위를 제한하기 위한 것으로 이해되지 않아야 한다.

본 발명은 miRNA 마커로 다발성 경화증을 진단하는 방법에 관한 것이다.

다발성 경화증 (MS)의 진단은 비정형 제시(atypical presentation)를 보이는 환자에서 아마도 염증성 탈수초화에 관련된 1차 신경학적 결손 동안에 곤란이 따를 수 있다. 특히, 종종 질환의 최초기 단계를 제시하는 CIS/RRMS를 진단하기가 어렵다. 그러나, 이러한 초기 병기 동안에는 치료적 개입의 기회가 보다 양호함에 따라 질환의 당해 단계를 위한 신뢰할 만한 진단 검사를 구비하는 것이 특히 바람직할 것이다. RRMS는 그것이 제시할 수 있는 다수의 상이한 신경학적 증상 때문에 진단에 곤란이 따른다. MS의 진단을 위한 바이오마커의 확인에 대하여, 차세대 서열분석, 마이크로어레이 분석 및 qRT-PCR을 이용하여 임상적 독립 증후군 (CIS) 또는 재발-완화성 MS (RRMS)를 보유한 치료 경험이 없는(treatment-naive) 환자 및 매칭 대조군으로부터의 전혈 샘플중 miRNA 발현 패턴의 종합적인 분석을 달성하였다. CIS/RRMS를 보유한 환자에서 마이크로RNA 질환 데이터베이스에 따라 이전에는 MS에 관련되지 않았던 유의하게 탈조절된 miRNA가 확인되었다. 이들 miRNA는 잠재적으로는 MS에 대한 미래 진단 바이오마커로서 역할을 할 수 있고 MS 보유 환자에서의 진단, 질환 활성 모니터링 및 치료 반응의 평가에 일조할 수 있다.

첨부 도면에서,

도 1은 miRNA 마커의 확인에 사용된 방법의 개요를 도시한다;

도 2는 miRNA의 개수와 이들 miRNA가 검출되었던 샘플의 빈도를 도시한다;

도 3은 NGS에 의하여 확인된 8개의 가장 탈조절된 miRNA를 도시한다;

도 4는 마이크로어레이 분석에 의하여 확인된 8개의 가장 탈조절된 miRNA를 도시한다;

도 5는 NGS 및 마이크로어레이에 의하여 확인된 유의하게 탈조절된 miRNA를 보여주는 벤(Venn) 다이어그램을 도시한다;

도 6은 8개 miRNA의 qRT-PCR 검증을 도시한다;

도 7은 NGS, 마이크로어레이 및 qRT-PCR을 사용한 8개 miRNA의 발현 분석 비교를 도시한다;

도 8은 검사된 miRNA 마커의 질환 관련성의 빈도를 도시한다.

도 1: 프로젝트 개관. NGS, 마이크로어레이 및 qRT-PCR을 포함한 3개 실험 방법을 적용하여 CIS/RRMS 보유 환자에서 miRNA 발현을 종합적으로 분석하였다.

도 2: miRNA의 개수와 이들 miRNA가 검출되었던 샘플의 빈도. 청색 곡선은 NGS의 결과를 나타내고, 적색 곡선은 마이크로어레이의 결과를 나타낸다. NGS에 의하여 모든 조사된 샘플의 적어도 절반에서 353개 miRNA가 검출가능하였으며, 마이크로어레이 분석에 의하여 모든 조사된 샘플의 적어도 절반에서 228개 miRNA가 검출가능하였다 (점선 참조).

도 3: NGS에 의하여 확인된 8개의 가장 탈조절된 miRNA (p-값 < 0.01). x-축에서, 대조군 샘플 (흑색)의 중앙값에 대한 막대 및 8개의 상이한 miRNA의 MS 샘플 (연회색)의 중앙값에 대한 막대가 그들의 표준 편차와 함께 표시되어 있으며, y-축은 판독물 카운트를 제시한다.

도 4: 마이크로어레이 분석에 의하여 확인된 8개의 가장 탈조절된 miRNA (p-값 < 0.01). x-축에서, 대조군 샘플 (흑색)의 중앙값에 대한 막대 및 8개의 상이한 miRNA의 MS 샘플 (연회색)의 중앙값에 대한 막대가 그들의 표준 편차와 함께 표시되어 있으며, y-축은 신호 강도를 제시한다.

도 5: NGS 및 마이크로어레이에 의하여 확인된 유의하게 탈조절된 miRNA를 보여주는 벤 다이어그램. 마이크로어레이 분석에 의하여 본 발명자들은 8개 miRNA를 확인하였고 NGS에 의하여 본 발명자들은 MS에서 유의하게 탈조절된 38개 miRNA를 확인하였다. 3개 miRNA, 즉 hsa-miR-16-2-3p, hsa-miR-20a-3p 및 hsa-miR-7-1-3p가 두 접근법 모두로 확인되었다.

도 6: 8개 miRNA의 qRT-PCR 검증. 막대 다이어그램은 8개의 시험된 후보 MS 마커에 대한 ΔCT 값 및 표준 편차를 도시한다.

도 7: NGS, 마이크로어레이 및 qRT-PCR을 사용한 8개 miRNA의 발현 분석의 비교. 막대의 높이는 각각의 miRNA와 각각의 사용된 분석 방법의 로그 배수 변화를 나타낸다 (NGS=흑색 막대, 마이크로어레이=백색 막대, qRT-PCR=빗금친 막대). 본 발명자들은 하나의 miRNA (has-miR-629-5p)를 제외하고는 모두에 대하여 일치하는 결과를 수득하였다.

도 8: 질환 관련성의 빈도. 도면은 HMDD 데이터베이스에 축적된 모든 miRNA에 대하여 질환에 대한 관련의 빈도를 도시한다.

CIS/RRMS 보유 환자에서의 miRNA 프로파일을 종합적으로 분석하기 위하여, 도 1에 상세한 바와 같이 3개 실험 단계를 적용하였다. 우선, NGS를 사용하는 스크리닝을 38인 환자와 대조군의 코호트에서 수행한 다음, 96인 연령 및 성별 매칭 사례와 대조군의 확장된 코호트를 사용하는 마이크로어레이 스크리닝을 수행하였다. 양쪽 고-처리량 데이터 세트 모두의 분석은 qRT-PCR에 의하여 20인 (5인 CIS, 5인 RRMS, 및 10인 연령 및 성별 매칭 대조군)에서 분석되었던 8개 miRNA 후보로 귀결되었다. CIS/RRMS 보유 환자와 건강한 대조군의 상세한 특징을 표 1에 제시하였다. 혼란 인자(confounding factor)로서의 면역조절 또는 면역억제 요법을 배제하기 위하여, 오로지 치료 경험이 없는 환자만을 당해 작업에 포함시켰다.

환자 및 샘플 제조

맥도널드 2005 기준에 따라 CIS (n=25) 또는 RRMS (n=25)의 진단을 받은 50인 환자로부터 팍스젠(PAXgene) 혈액 RNA 튜브 (벡톤 디킨슨(Becton Dickinson), 독일 하이델베르크)에 약 5 ml의 혈액을 채혈하였다. 50인의 연령(±4년) 및 성별-매칭 건강한 성인을 대조군으로서 포함시켰다 (표 1).

제조업자의 권장에 따라 팍스젠 혈액 miRNA 키트 (퀴아젠(Qiagen))를 사용하여 miRNA를 포함한 총 RNA를 단리하였다. 단리된 RNA를 -80℃에서 저장하였다. RNA 완전성은 바이오애널라이저(Bioanalyzer) 2100 (애질런트(Agilent))을 사용하여 분석하였고 농도와 순도는 나노드롭(NanoDrop) 2000 (써모 사이언티픽(Thermo Scientific))을 사용하여 측정하였다. 총 4개 샘플 (3개 대조군 및 1개 RRMS)이 품질 기준에 불합격하였고 연구로부터 배제하였다.

NGS 스크리닝

처음에 16인 CIS/RRMS 보유 환자 및 22인 대조군으로부터의 38개 샘플의 고-처리량 스크리닝을 수행하였다. 종합하여, 적어도 단일 샘플에서 발현되는 총 835개 miRNA가 발견되었다. 도 2는 miRNA의 개수 및 이들 miRNA가 검출되었던 샘플의 빈도를 제시한다 (청색 곡선). 거기에 도시된 바와 같이, 모든 조사된 샘플의 적어도 절반에서 353개 miRNA가 검출가능하였고, 이는 조사된 혈액 샘플중에 각각의 miRNA가 다량이라는 것에 대한 증거를 제공한다. 정규화 뒤에 t-검정은 총 38개의 유의하게 (미조정) 탈조절된 miRNA를 보여주었다. 8개의 가장 탈조절된 miRNA를 도 3에 제시하였다 (p-값 < 0.01). 그러나, 다중 시험에 대한 조정 후, 다수의 특징에 기인하여 어떠한 miRNA도 유의하게 잔류하지 않았다 (최소 p-값은 0.155이었다). 이들 8개 miRNA는 5개의 하향조절된 miRNA, 즉 hsa-miR-361-5p, hsa-miR-7-1-3p, hsa-miR-548o-3p, hsa-miR-151a-3p 및 hsa-miR-548am-3p와 3개의 상향조절된 miRNA, 즉 hsa-miR-22-5p, hsa-miR-27a-5p, hsa-miR-4677-3p를 포함하였다. 종합하면, 38개의 탈조절된 miRNA중 16개가 CIS/RRMS에서 하향조절된 반면에 22개는 상향조절되었다.

TruSeq 소형 RNA 샘플 제조 키트 (일루미나)를 사용하여 다중화(multiplexed) 서열분석 라이브러리를 생성하였고, 그 후 50bp 단편 서열분석 프로토콜을 사용하여 HiSeq2000 시스템 (일루미나)상에서 서열분석하였다. 생성되는 서열분석 판독물을 카사바(CASAVA) 1.8 소프트웨어 패키지 (일루미나)를 사용하여 역다중화하였고, FastQC 툴 (바브라함 인스티튜트(Babraham Inst.))을 사용하여 품질을 체크하였다. miRDeep2-파이프라인을 사용하는 1차 맵핑 분석을 수행하여 상당 비율의 miRNA가 서열분석되도록 보장하였다.

합계하여, n=16 환자 (5 RRMS, 11 CIS) 및 n=22 대조군으로부터의 38개 샘플을 두 다중화 풀에서 분석하였다. 평균하여, 샘플당 1.5 내지 2x10⁶개의 고-품질 서열분석 판독물이 수득되었고 (총 9.5x10⁷개 판독물에서) 이들의 70%까지가 miRNA 정보를 함유하였다.

3' 어댑터 서열을 절단함으로써 미가공 일루미나 판독물을 우선 전처리하였다. 이는 패스트엑스-툴키트(FASTX-Toolkit)로부터의 프로그램 패스트엑스_클립퍼(fastx_clipper)에 의하여 행하였다. 클립핑 후에 18개 뉴클레오티드보다 짧은 판독물은 제거하였다. 나머지 판독물은 붕괴시켰으며, 즉 당해 단계 후에는 오로지 고유한 판독물 및 샘플당 그들의 빈도가 수득되었다. 당해 단계는 판독물 맵핑시간을 엄청나게 감소시킨다. 나머지 단계에 대해서는, miRDeep2 파이프라인을 사용하였다. 이들 단계는 게놈 (hg19)에 대하여 판독물의 맵핑, mirbase 출시 v18로부터의 miRNA 전구체 서열에 대하여 판독물의 맵핑, 샘플에 대한 카운트의 요약 및 신규 miRNA의 예측으로 이루어진다.

마이크로어레이 스크리닝

다음으로, 49인 CIS/RRMS 보유 환자 및 47인 대조군으로부터의 96인 연령 및 성별 매칭 샘플의 확장된 코호트를, miRBase v16의 내용물을 나타내는 1205개 miRNA를 함유하는 마이크로어레이를 사용하여 스크리닝하였다. 서열분석 결과에 관해서는, 검출된 miRNA의 개수를 먼저 평가하였다. 도 2에 적색 곡선으로 도시한 바와 같이, NGS에 의한 것보다 마이크로어레이 연구에서 상당히 더 적은 (p=6.5*10^-7) miRNA가 검출되었다. 적어도 단일 샘플에서, 382개 miRNA가 검출되었고 (NGS에 의하여 적어도 단일 샘플에서 검출된 835개 miRNA의 약 46%) 228개 miRNA가 모든 샘플의 적어도 50%에서 검출되었다 (서열분석 접근법에서의 353개 miRNA에 비하여). 당해 이론에 의하여 구애받는 것을 원함이 없이, 이는 두 가지 상이한 이유, 첫째로 마이크로어레이 실험은 miRBase v16의 내용물에 국한되는 반면에 서열분석은 모든 존재하는 인간 miRNA를 발견해낼 수 있다는 점과, 더불어 서열분석 접근법은 일반적으로 마이크로어레이 실험에 비하여 보다 민감하다는 점에 기인할 수 있는 것으로 생각된다. 이는 또한 서열분석에 의하여 확인된 38개 유의하게 (미조정) 탈조절된 miRNA의 보다 엄격한 분석에 의하여 반영된다. 이들 중에서 7개 (18.4%)는 슈어프린트(SurePrint) 8x60K 인간 v16 miRNA 마이크로어레이에 포함시키지 않았으며, 추가의 14개 (36.8%) miRNA는 마이크로어레이에 포함시켰지만 검출되지는 않았다. 마이크로어레이 실험에서 총 8개의 유의하게 탈조절된 miRNA가 검출되었다. NGS 실험에 관해서는 상이한 접근법들간에 비교할만한 값을 만들기 위하여 다중 시험에 대하여 p-값은 조정되지 않았다. 각각의 마커를 도 4에 도시하였다. 서열분석 접근법에 관해서는, CIS/RRMS 보유 환자에서 5개 miRNA가 하향조절되었고 (hsa-miR-146b-5p, hsa-miR-7-1-3p, hsa-miR-20a, hsa-miR-3653, hsa-miR-20b), 3개는 상향조절되었다 (hsa-miR-16-2-3p, hsa-miR-574-5p, hsa-miR-1202).

miRBase v16 (http://www.mirbase.org/)의 1205개 miRNA의 각각의 40개 복제물을 함유하는 슈어프린트 8x60K 인간 v16 miRNA 마이크로어레이 (애질런트, 카탈로그 No. G4870A)를 사용하여 제조업자의 사용설명서에 따라 마이크로어레이 분석을 수행하였다. 간단히 말해서, 총 100 ng 총 RNA를 miRNA 완전 표지화 및 Hyb 키트를 사용하여 처리하여 형광-표지 miRNA를 생성하였다. 표지화 반응 후, 혼합물을 진공 원심분리기에서 건조시키고 하이브리드화 완충제와 차단 시약을 함유하는 하이브리드화 혼합물에 재현탁시켰다. 이어서 마이크로어레이를 로딩한 다음 인큐베이션하였다. 표지화 및 하이브리드화가 성공적이었는지를 체크하기 위하여, 표지화 및 하이브리드화 스파이크-인(spike-in) 대조군을 적당한 단계에서 첨가하였다. 몇회의 세척 단계 후에 마이크로어레이를 애질런트 마이크로어레이 스캐너로 3 마이크로미터에서 이중 경로 모드로 스캐닝하였다. 마이크로어레이 스캔 데이터는 특징 추출 소프트웨어를 사용하여 추가 처리하였다.

NGS와 마이크로어레이 분석간 유의하게 탈조절된 miRNA에서의 중첩

전술한 바와 같이, 38개의 유의하게 (미조정) 탈조절된 miRNA가 NGS에 의하여 검출되었고 8개의 유의하게 (미조정) 탈조절된 miRNA가 마이크로어레이 분석에 의하여 검출되었다. 이들은 각각 측정된 miRNA의 1.9% 및 0.7%에 해당하며, 따라서 양쪽 세트간의 무작위 중첩은 아주 가능성이 낮다. 그러나, 두드러지게는, hsa-miR-16-2-3p, hsa-miR-20a-5p 및 hsa-miR-7-1-3p를 포함한 3개 miRNA의 중첩이 존재하였다 (도 5 참조). 1x10⁶ 순열 검정은 당해 중첩이 고도로 유의함을 확인시켜주었다 (p=0.004). 또한, NGS에 의하여 확인된 38개 miRNA중 5개는 마이크로어레이 분석에서의 조절의 동일한 경향을 보였다. 그러나, hsa-miR-22-5p, hsa-miR-125b-5p, hsa-miR-629-5p, hsa-miR-100-5p 및 hsa-miR-151a-3p를 포함하는 그들 5개 miRNA의 조절은 통계적으로 유의하지 않았다 (p>0.05). 양쪽 방법 모두에 의하여 확인된 3개의 유의하게 탈조절된 miRNA 및 5개의 추가 miRNA를 표 2에 양쪽 실험에서의 그들의 발현치 및 유의치와 함께 수록하였다.

qRT-PCR에 의한 분석

8개 miRNA를 qRT-PCR을 이용하여 추가 분석하였다. 8개 miRNA중 7개가 확인될 수 있었지만, 4개 miRNA (hsa-miR-22-5p, hsa-miR-629-5p, hsa-miR-20a-5p 및 hsa-miR-151a-3p)는 qRT-PCR 결과에 따르면 유의하게 탈조절되지 않았다. hsa-miR-629-5p는 NGS 및 마이크로어레이 분석과 상반되게 MS 환자와 비교하여 대조군에서 경미하지만 유의하지 않게 (p=0.71) 보다 높은 발현을 보였다. 표 2는 또한 qRT-PCR 검증의 결과를 포함한다. 도 6은 qRT-PCR 검증에 대한 ΔCT 값 및 표준 편차를 도시한다. 도 7은 NGS, 마이크로어레이 및 qRT-PCR을 이용한 8개 miRNA의 발현 분석의 비교를 가시화한다.

마이크로어레이 및 NGS 분석용으로 또한 사용되었던 20인의 연령 및 성별 매칭 환자 및 대조군 샘플의 세트를 구성하였다. 환자의 군은 5인 CIS 및 5인 RRMS 환자를 포함하였다. qRT-PCR 검증을 위해 마이크로어레이와 NGS 양쪽 모두에서 유의하게 탈조절된 3개 miRNA가 선택되었으며, NGS에 의하여 탈조절된 것으로 나타났고 조절의 동일한 경향을 보였지만 마이크로어레이 분석에서는 유의하게 탈조절되지 않은 5개 miRNA가 선택되었다. 택맨(Taqman) qRT-PCR 시스템 (어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems))을 이용하여 qRT-PCR을 수행하였다. 소형 RNA RNU6B 및 RNU48을 내재성 대조군으로 사용하였다.

8개 miRNA의 타당성

8개의 일치하는(concordant) miRNA에 대하여, 공지의 질환 상호작용 (즉, 공개문헌은 고려된 질환에서 각각의 miRNA가 이상조절될 것으로 기술하고 있음)을 HMDD 데이터베이스로부터 추출하였다 (도 8). 8개 miRNA의 각각에 대한 질환 상호작용의 개수를 계산하고 그들을 8개 miRNA 질환 상호작용의 평균과 비교한 결과, 본원에 기재된 miRNA에 대하여 현저히 증가한 개수가 발견되었으며, 즉 검출된 miRNA는 일반적으로 상이한 질환에 상관관계가 있다. 1개 miRNA를 제외한 전부는 8개가 넘는 질환과 상관관계가 있었으며, 이는 상이한 miRNA가 CIS/RRMS에 대하여 특이적이지 않음을 시사한다 (도 8 참조). 그러나, CIS/RRMS miRNA 세트와 동일한 패턴을 갖는 질환은 발견되지 않았으며, 이는 당해 miRNA 세트가 CIS/RRMS에 대하여 증가된 특이성을 가짐을 시사한다.

전구체 분자에 대한 miRNA 농축도(enrichment) 분석을 적용함으로써, 8개 miRNA중 4개, 즉 hsa-miR-20a, hsa-miR-100, hsa-miR-125b 및 hsa-miR-16-2가 면역반응과 관련이 있는 것으로 밝혀졌다. 마찬가지로, 4개 miRNA, 즉 hsa-miR-20a, hsa-miR-7-1, hsa-miR-22 및 hsa-miR-16-2가 호르몬 조절과 상관관계가 있었다. 질환 관련을 고려하면, hsa-miR-100, hsa-miR-125b, hsa-miR-7-1 및 hsa-miR-16-2는 이전에는 부신피질 암종에 관계가 있었다. HMDD에 따르면, 8개 miRNA중 어느 것도 지금까지 CIS/RRMS에서 기재된 바 없다. 그러나, 당해 스크리닝에서의 5개 miRNA중 하나인 hsa-miR-22는 대조군과 비교하여 MS 보유 환자의 혈장 및 CD4+CD25+ 조절성 T 세포에서 상향조절되는 것으로 이전에 보고되었다. 또한, 당해 결과를 다발성 경화증에 관한 본 발명자들 자신의 초기 연구와 비교시, 유의한 중첩이 검출되었다. 상세하게는, 본 발명자들은 hsa-miR-100 (p=0.04)뿐만 아니라 hsa-miR-629 (p=0.0009)도 MS에서 유의하게 상향조절된 것으로 확인하였으며, 반면에 본 발명자들은 hsa-miR-20a는 하향조절된 것을 보여주었다 (p=0.0009). 마찬가지로, 0.05의 유의성 역치 (p=0.06)를 거의 잃지 않음에도 불구하고 hsa-miR-125b는 상향조절되었다. 상이한 실험 셋업이 사용되었고 (상이한 마이크로어레이 플랫폼) 완전히 독립적인 코호트 (모든 환자가 치료 경험이 없는 것은 아니며, 연령 및 성별 비-매칭 대조군)가 연구되었다는 것을 고려하면 초기 연구와 당해 작업간의 중첩은 상당히 주목할 만한 것으로 보인다.

요약하면, 연령 및 성별 매칭 대조군 개체와 비교하여, CIS 환자 및 RRMS 환자를 포함한 치료 경험이 없는 MS 환자의 혈액중 miRNA 발현의 종합적인 분석을 나타낸다. NGS 및 마이크로어레이 분석을 적용하여, MS 환자의 혈액중 상향조절된 5개 miRNA (hsa-miR-22-5p, hsa-miR-125b-5p, hsa-miR-629-5p, hsa-miR-16-2-3p 및 hsa-miR-100-5p) 및 하향조절된 3개 miRNA (hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-151a-3p 및 hsa-miR-7-1-3p)인 8개 miRNA의 세트가 확인되었다. qRT-PCR을 이용하여 본 발명자들은 하나의 miRNA (hsa-miR-629-5p)를 제외한 모두에 대하여 이들 결과를 확인할 수 있었다. HMDD에 따르면 8개 miRNA는 지금까지 MS에 전혀 관련되어 있지 않았다. 그러나, 1개 miRNA는 MS 환자의 혈장 및 조절성 T 세포에서 상향조절되는 것으로 이전에 보고된 바 있다. MS에 관한 본 발명자들의 이전 데이터와의 비교로 본 발명자들은 유의한 중첩을 검출하였다. 농축도 분석은 miRNA의 절반이 각각 면역반응, 호르몬 조절 또는 부신피질 암종과 관련이 있었음을 밝혀주었다. 결과는 MS 보유 환자에서의 진단용, 질환 활성 모니터링용 또는 치료 반응 평가용의 잠재적으로 유용한 바이오마커로서 역할을 할 가능성이 있는 miRNA의 세트를 밝혀주었다. 확인된 마커 조합은 간단하고 직접적이며 신뢰할 만한 진단 검사를 가능케 해준다. 그들 miRNA에 대한 추가의 분자 생물학적 분석은 이러한 다인성 질환의 이해 향상에 일조할 수 있다.

SEQUENCE LISTING <110> Siemens AG <120> Diagnostic miRNA Multiple Sclerosis Signature <130> 201207353 <160> 8 <170> BiSSAP 1.0 <210> 1 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <220> <221> source <222> 1..22 <223> /mol_type="RNA" /note="hsa-miR-22-5p" /organism="Homo sapiens" <400> 1 aguucuucag uggcaagcuu ua 22 <210> 2 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <220> <221> source <222> 1..22 <223> /mol_type="RNA" /note="hsa-miR-125b-5p" /organism="Homo sapiens" <400> 2 ucccugagac ccuaacuugu ga 22 <210> 3 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <220> <221> source <222> 1..21 <223> /mol_type="RNA" /note="hsa-miR-629-5p" /organism="Homo sapiens" <400> 3 uggguuuacg uugggagaac u 21 <210> 4 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <220> <221> source <222> 1..22 <223> /mol_type="RNA" /note="hsa-miR-16-2-3p" /organism="Homo sapiens" <400> 4 ccaauauuac ugugcugcuu ua 22 <210> 5 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <220> <221> source <222> 1..22 <223> /mol_type="RNA" /note="hsa-miR-100-5p" /organism="Homo sapiens" <400> 5 aacccguaga uccgaacuug ug 22 <210> 6 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <220> <221> source <222> 1..23 <223> /mol_type="RNA" /note="hsa-miR-20a-5p" /organism="Homo sapiens" <400> 6 uaaagugcuu auagugcagg uag 23 <210> 7 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <220> <221> source <222> 1..21 <223> /mol_type="RNA" /note="hsa-miR-151a-3p" /organism="Homo sapiens" <400> 7 cuagacugaa gcuccuugag g 21 <210> 8 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <220> <221> source <222> 1..22 <223> /mol_type="RNA" /note="hsa-miR-7-1-3p" /organism="Homo sapiens" <400> 8 caacaaauca cagucugcca ua 22

Claims

a) 다발성 경화증을 앓고 있거나 또는 다발성 경화증이 발병할 위험성이 있는 환자로부터의 샘플에서 hsa-miR-16-2-3p miRNA의 발현 수준을 측정하는 단계,
b) 단계 a)에서 측정된 발현 수준의 패턴을 발현 수준의 하나 또는 수개의 참조 패턴(들)과 비교하는 단계, 및
c) 단계 b)에서의 비교 결과로부터 다발성 경화증을 진단하거나, 다발성 경화증이 발병할 위험성을 예측하거나 또는 다발성 경화증의 결과를 예측하는데 사용하기 위한 정보를 제공하는 단계
를 포함하는, 상기 환자에서 다발성 경화증을 진단하거나, 다발성 경화증이 발병할 위험성을 예측하거나 또는 다발성 경화증의 결과를 예측하는데 사용하기 위한 정보를 제공하는 방법.
a) 다발성 경화증을 앓고 있거나 또는 다발성 경화증이 발병할 위험성이 있는 환자로부터의 샘플에서 hsa-miR-16-2-3p miRNA의 발현 수준을 측정하고, hsa-miR-22-5p, hsa-miR-125b-5p, hsa-miR-629-5p, hsa-miR-100-5p, hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-151a-3p 및 hsa-miR-7-1-3p로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 miRNA의 발현 수준을 추가로 측정하는 단계,
b) 단계 a)에서 측정된 발현 수준(들)의 패턴을 발현 수준의 하나 또는 수개의 참조 패턴(들)과 비교하는 단계, 및
c) 단계 b)에서의 비교 결과로부터 상기 환자의 샘플을, 다발성 경화증의 진단, 다발성 경화증이 발병할 위험성의 예측 또는 다발성 경화증의 결과의 예측을 나타내는 적어도 두 부류 중 하나로 분류하는데 사용하기 위한 정보를 제공하는 단계
를 포함하는, 상기 환자의 샘플을 분류하는데 사용하기 위한 정보를 제공하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 샘플이 혈액 샘플, 혈청 샘플 및 혈장 샘플로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 단계 a)에서 miRNA인 hsa-miR-16-2-3p, hsa-miR-20a-5p 및 hsa-miR-7-1-3p의 발현 수준을 측정하는 것을 포함하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 단계 a)에서 miRNA인 hsa-miR-16-2-3p, hsa-miR-22-5p, hsa-miR-125b-5p, hsa-miR-100-5p, hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-151a-3p 및 hsa-miR-7-1-3p의 발현 수준을 측정하는 것을 포함하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 단계 a)에서 miRNA인 miR-16-2-3p, hsa-miR-22-5p, hsa-miR-125b-5p, hsa-miR-629-5p, hsa-miR-100-5p, hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-151a-3p 및 hsa-miR-7-1-3p의 발현 수준을 측정하는 것을 포함하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 단계 (a)에서의 발현 수준의 측정이 서열분석-기반 방법, 어레이-기반 방법 및 PCR-기반 방법으로 이루어진 군으로부터 선택된 방법을 사용하여 달성되는 것인 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 환자가 임상적 독립 증후군 (CIS) 및/또는 재발/완화성 다발성 경화증 (RRMS) 임상 하위유형의 다발성 경화증을 앓고 있거나 그러한 다발성 경화증이 발병할 위험성이 있는 자인 방법.
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