CN109811051B - 一种血浆外泌体来源的miR-548o-3p分子标记及其结核病检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了血浆外泌体来源的miR‑548o‑3p分子标记及其结核病检测试剂盒，具体提供了选择性地检测miRNA的试剂及在制备快速诊断活动性肺结核的试剂盒中的用途，所述外泌体miRNA为hsa‑miRNA‑548o‑3p。同时，还提供了能够快速检测受试者中是否患有活动性肺结核的试剂盒，所述试剂盒包括血浆样品中总RNA提取相关试剂、所述hsa‑miRNA‑548o‑3p、外参RT‑PCR相关试剂以及定量PCR相关试剂。本发明首次采用hsa‑miRNA‑548o‑3p作为活动性肺结核检测的生物标记物，用于肺结核的临床诊断以及鉴别诊断，为肺结核的临床诊断提供了新的方向。

Description

一种血浆外泌体来源的miR-548o-3p分子标记及其结核病检 测试剂盒

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，更具体地，涉及hsa-miR-548o-3p作为活动性肺结核诊断标志物的应用。

背景技术

肺结核是由结核分枝杆菌感染引起的一种慢性传染性疾病。至今，结核病仍是全球十大死亡原因之一，也是超越HIV/AIDS造成全球死亡人数最多的单一传染病。每年都有成千上万患者因为结核死亡。根据WHO最新的结核病报告，在2017年，全球大约有160万人因结核病死亡，其中约有30万是HIV携带者，且新发结核病患者约为1000万，发病率为133/10万。新发结核患者2/3来源八个结核高负担国家，其中印度占比最高，达到27％，而中国仅次于印度为9％。中国17年新发结核88.9万，发病率为63/10万。以上报告显示，结核病在中国乃至世界的疫情仍十分严峻。由于结核病是一种可通过空气传播的传染性疾病，故早期检测诊断出结核病对控制传染源和防治结核疫情有很大帮助。目前，临床上使用的结核诊断技术虽然有很多，但单一的检测手段往往很难有效地确诊为结核，且目前的检测方法都或多或少存在一定的缺陷。至今，细菌学检测仍是结核病诊断的金标准，但无论是痰涂片还是菌培养，都只有很低的检测率，且由于结核的慢性生长特性，菌培养一般需要花费较长时间，影响报告周期。免疫学检测方法如T-Spot，结核菌素试验等虽都有较高的检测率，但前者不能区分潜伏感染和活动性结核病人，而后者在接受过卡介苗的机体也会呈现阳性反应。最近几年发展的分子检测方法在检出率和耗时等方面都有极大的改善，特别是基因检测方法，如GeneXpert，数小时就能出检测结果且灵敏度和特异性都较高，但该方法不能区分活菌和死菌，且GeneXpert仪器较为昂贵，目前难以在一些欠发达地区普及。因此，发展一种新的快速有效的检测技术对结核病的辅助诊断来说仍十分迫切。

外泌体是一种直径在30-150nm范围的脂质双分子层包裹的囊泡，被机体内几乎所有细胞分泌，它们存在于大多数体液中，包含许多不同的生物分子，如蛋白质、脂质、mRNA和非编码RNA。由于它们可以向邻近细胞和远端细胞释放其内容物，特别是miRNA，故在细胞间通讯中被认为是重要的。外泌体和外泌体miRNA在疾病中的差异表达推动了它们作为疾病生物标志物的前景，使其除了作为治疗工具之外，还可用于非侵入性临床诊断。由于外泌体的包裹，其中miRNA可免受RNA酶的降解，使得相较于循环系统中游离的miRNA，外泌体来源miRNA更加稳定，更加容易去对其就行定量。采用外泌体来源的miRNA作为分子标记物，为活动性肺结核的诊断以及鉴别诊断提供了新的方向。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有活动性结核病诊断标志物特异性不好，灵敏度不高，且检测耗时的问题，提供血浆外泌体hsa-miR-548o-3p作为活动性肺结核诊断标志物的应用，为活动性肺结核的诊断提供新的靶点，并且对活动性肺结核诊断有良好的临床应用价值。

具体地，本发明一方面提供了选择性地检测一种外泌体miRNA的试剂在制备快速诊断活动性肺结核的试剂盒中的用途，所述试剂用于测定得自所述受试者的血浆样品中的hsa-miRNA-548o-3p的水平，其中所述hsa-miRNA-548o-3p的水平相对于正常人受试者的水平的降低指示所述受试者中存在活动性肺结核。

可选择地，所述hsa-miRNA-548o-3p的序列如SQE ID NO:1所示，具体为：CCAAAACUGCAGUUACUUUUGC。

可选择地，其中使用扩增、杂交、和/或测序的方法检测所述外泌体miRNA的水平。

可选择地，使用定量PCR来检测所述外泌体miRNA的水平。

可选择地，所述试剂包括所述外泌体miRNA定量PCR上游引物及下游引物。

可选择地，所述外泌体miRNA定量PCR上游引物序列分别如SQE ID NO:2所示。

具体地，本发明另一方面，还提供了所述试剂盒的用途，

a.测定得自所述受试者血浆样品中hsa-miRNA-548o-3p的水平；

b.将血浆样品中hsa-miRNA-548o-3p的水平与一组数据对比，所述数据为正常受试者中hsa-miRNA-548o-3p的水平；

c.基于步骤b做出的对比结果，确定所述受试者是否患有活动性肺结核。

具体地，本发明另一方面还提供了一种快速检测活动性肺结核的试剂盒，所述试剂盒包括血浆样品中总RNA提取相关试剂、所述外泌体hsa-miRNA-548o-3p RT-PCR相关试剂以及定量PCR相关试剂。

可选择地，所述RT-PCR相关试剂中含有扩增所述所外泌体miRNA的反转录引物，所述外参反转录引物，所述外泌体miRNA、外参定量PCR上游引物及下游引物序列。

具体地，本发明另一方面，还提供了所述外泌体hsa-miRNA-548o-3p在制备快速检测活动性肺结核的试剂盒中应用。

在发明的方法或试剂盒的某些实施方案中，所述受试者可以是哺乳动物，例如，人。

在发明的方法或试剂盒中，通过执行软件分类算法，可以确定至少一种miRNA的水平相对于合适对照的差异。

本发明相对于现有技术而言，具有以下技术效果：

1.本发明首次采用外泌体来源的hsa-miRNA-548o-3p作为活动性肺结核检测的生物标记物，由于外泌体的保护作用，使得外泌体中的miRNA免受RNA酶的降解作用，从而更加稳定存在。用ROC曲线分析，结果显示，血浆外泌体中hsa-miR-548o-3p表达水平对活动性肺结核诊断具有较好的敏感性和特异性。因此，本发明克服了现有活动性肺结核诊断检出率低、耗时长等缺点，具有特异性好、灵敏度高的特点，对活动性肺结核的辅助诊断有良好的临床应用价值。

2.本发明提供了利用外泌体来源的hsa-miRNA-548o-3p作为活动性肺结核检测的生物标记物检测活动性肺结核的检测试剂以及试剂盒，能够准确快速的对活动性肺结核进行检测以及对活动性肺结核的发病阶段进行检测，便于临床应用。

附图说明

图1为活动性肺结核患者、肺癌患者和健康志愿者血浆外泌体中hsa-miR-548o-3p的表达水平。活动性肺结核患者(TB)取24例，肺癌患者(LC)和健康志愿者(HC)各取7例。数据取三次平行试验均值，*表示具有统计学差异，**表示具有显著性差异。

图2为hsa-miR-548o-3p在结核(TB)、肺癌(LC)和健康(HC)血浆外泌体中相对表达水平的ROC分析。活动性肺结核患者取24例，肺癌患者和健康志愿者各取7例，数据取三次平行试验均值。

具体实施方式

下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

1.简介

本发明提供了外泌体miRNA生物标志物hsa-miRNA-548o-3p，其序列如SQE ID NO:1所示，其指示活动性肺结核，且其可以用于准确地诊断受试者中的活动性肺结核。另外，提供了用于诊断活动性肺结核的试剂盒。在某些实施方案中，所述方法需要检测合适的样品(优选血浆)中的miRNA。

2.定义

在详细阐述本发明之前，提供要在本文中使用的某些术语的定义。除非另外定义，否则在本文中使用的所有技术和科学术语具有与本领域技术人员通常理解相同的含义。

术语“受试者”意图包括，能够直接地或间接地涉及活动性肺结核的任意障碍。受试者的例子包括哺乳动物，例如，人类、非人灵长类动物、狗、牛、马、猪、绵羊、山羊、猫、小鼠、兔、大鼠和转基因的非人动物。在某些实施方案中，所述受试者是人，例如，遭受活动性肺结核的人，处于遭受活动性肺结核及其相关的风险中的人，或者潜在地能够遭受活动性肺结核相关的痴呆的人。

术语“治疗”在本文中用于表示解除、减轻或缓解受试者中的疾病的至少一种征状。例如，关于活动性肺结核，术语“治疗”包括：解除、减轻或缓解认知损害(诸如记忆和/或定向的病损)或总体功能(所有功能，包括日常生活活动)的病损，和/或减慢或逆转总体或认知损害的进行性衰退。因此，术语“治疗”也包括：在疾病的临床表现或疾病的征状之前延迟或阻止发作，和/或减少疾病征状的发展或恶化的风险。

术语“约”或“大约”通常是指在给定的值或范围的5％内，或更优选1％内。

3.活动性肺结核的miRNA生物标志物

本发明涉及miRNA生物标志物：与“正常”受试者相比，其被发现在得自患有活动性肺结核的受试者的生物样品中差别地存在。如果在样品中的一种miRNA生物标志物的表达水平之间的差异被确定为统计上显著的，那么一种miRNA生物标志物在样品之间差别地存在。统计显著性的常见试验包括、但不限于：t-检验、ANOVA、Kniskal-Wallis、Wilcoxon、Mann-Whitney和比值比。单独的或组合的miRNA生物标志物可以用于提供受试者患有或没患活动性肺结核的相对风险的量度。

4.测定样品中的miRNA生物标志物的水平

通过任意合适的方法，可以测定生物样品中的miRNA生物标志物的水平。可以使用任意可靠的用于测量样品中的miRNA的水平或量的方法。通常，可以从样品检测和定量miRNA，所述样品例如是通过关于mRNA已知的多种方法分离的RNA的样品，所述方法包括：例如，基于扩增的方法(例如，聚合酶链式反应(PCR)、实时聚合酶链式反应(RT-PCR)、定量聚合酶链式反应(qPCR)、滚环扩增等)、基于杂交的方法(例如，杂交阵列(例如，微阵列)、NanoString分析、RNA印迹分析、支链DNA(bDNA)信号放大、原位杂交等)和基于测序的方法(例如，下一代测序方法，例如，使用Illumina或IonTorrent平台)。其它示例性的技术包括核糖核酸酶保护测定(RPA)和质谱法。

5.使用miRNA生物标志物确定活动性肺结核

本文描述的miRNA生物标志物可以用于诊断试验中以评估受试者的活动性肺结核状态。疾病状态包括活动性肺结核的存在或不存在。疾病状态还可以包括监测活动性肺结核的进程，例如，监测疾病进展。基于受试者的活动性肺结核状态，可以指示其它操作，包括、例如，其它诊断试验或治疗操作。

通常以测定的准确度、测定的灵敏度、测定的特异性或“曲线下面积”(AUC)(例如，在受试者操作特征(ROC)曲线下的面积)的方式，测量诊断试验的正确预测疾病状态的能力。本文中使用的准确度是错误分类的样品的比例的量度。可以将准确度计算为，正确分类的样品的总数除以样品的总数(例如在试验群体中)。灵敏度是通过试验预测为阳性的“真阳性”的量度，且可以计算为正确鉴别的活动性肺结核样品的数目除以活动性肺结核样品的总数。特异性是通过试验预测为阴性的“真阴性”的量度，且可以计算为正确鉴别的正常样品的数目除以正常样品的总数。AUC是受试者操作特征曲线下的面积的量度，所述曲线是灵敏度相对于假阳性率的图(1-特异性)。AUC越大，试验的预测值越有效。试验的实用性的其它有用的量度包括“阳性预测值”(它是试验为阳性的实际阳性的百分比)和“阴性预测值”(它是试验为阴性的实际阴性的百分比)。

6.用于检测miRNA生物标志物的试剂盒

在另一个方面，本发明提供了用于诊断受试者中的活动性肺结核状态的试剂盒，所述试剂盒可用于测定hsa-miRNA-548o-3p的水平。试剂盒可以包括：适合选择性地检测miRNA存在的材料和试剂，所述miRNA指示源自受试者的样品中的活动性肺结核。例如，在一个实施方案中，所述试剂盒可以包括与miRNA特异性地杂交的试剂。这样的试剂可以是适合用于检测miRNA(例如，探针或引物)的形式的核酸分子。所述试剂盒可以包括可用于执行测定以检测一种或多种miRNA的试剂，例如，可以用于在qPCR反应中检测一种或多种miRNA的试剂。所述试剂盒同样可以包括可用于检测一种或多种miRNA的微阵列。

在另一个实施方案中，所述试剂盒可以含有一个或多个容器，所述容器装有miRNA生物标志物样品，所述样品将用作参比标准、合适对照或用于校准测定以检测试验样品中的miRNA生物标志物。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1

活动性肺结核患者、肺癌患者和健康志愿者血浆均来自上海市公共卫生临床中心。收集好的EDTA抗凝的全血3小时内4℃，3000rpm离心10min，去除细胞及细胞碎片，保存于-80℃待用。实验前从-80℃拿出室温溶解后，4℃，16000×g离心15min去除一些残留的细胞碎片或由于冻存产生的蛋白絮状物，然后采用QIAGEN公司exoRNeasy Serum/PlasmaMidi Kit试剂盒分离血浆中外泌体并随后按要求提取外泌体中总RNA。提取总RNA过程中按操作说明向每个样本中加入1.6×10⁸copies/μL从QIAGEN公司购买的cel-miR-39标准品，以便后续qRT-PCR定量外参使用。

实施例2

利用实施例1得到的外泌体总RNA作为模板，采用QIAGEN公司的miScript RTⅡKit反转录试剂盒，以下表的反应液配制，按照操作说明进行cDNA合成。

实施例3

以cDNA为模板，采用QIAGEN公司的miScript SYBR Green PCR试剂盒，以下表准备反应混合液。其中miScript Universal Primer(通用下游引物)由miScript SYBR GreenPCR试剂盒提供，外参cel-miR-39的miScript Primer Assay(特异性上游引物)由exoRNeasy Serum/Plasma Midi Kit试剂盒提供，如下表所示。此外，目的基因hsa-miR-548o-3p的特异性上游引物由上海擎科生物合成，引物序列为：5’-CAGCCAAAACTGCAGTTAC-3’(SEQ NO ID:2)。

然后以下表所示的反应体系进行PCR扩增。

实施例4

所述试剂盒，包括血浆样品中总RNA提取相关试剂、所述外泌体hsa-miRNA-548o-3p、外参的RT-PCR相关试剂以及定量PCR相关试剂。

所述RNA提取相关试剂：QIAGEN公司exoRNeasy Serum/Plasma Midi Kit试剂盒，以及QIAGEN公司购买的cel-miR-39标准品。

所述外泌体hsa-miRNA-548o-3p、外参cel-miR-39的RT-PCR相关试剂：5×miScriptHiSpec Buffer，10×miScriptNuclics Mix，RNase-free water，miScriptReverse Transcriptase Mix，Template RNA。

所述外泌体hsa-miRNA-548o-3p、外参cel-miR-39的及定量PCR相关试剂：2×QuantiTect SYBR Green PCR,Master Mix,10×miScript Universal Primer,10×miScript Primer Assay,RNase-free water,TemplatecDNA。

所述外泌体miRNA定量PCR上游引物如SQE ID NO:2所示。

实施例5

检测24例活动性肺结核患者、7例肺癌患者和7例健康志愿者血浆外泌体来源的miRNA中的hsa-miR-323a-3p的表达水平。

具体按照实施例1-3的方法进行检测。

以上实验重复三次，以cel-miR-39作为外参对照，通过2^-ΔΔCt法计算各组之间外泌体中hsa-miR-548o-3p表达水平的差异；按照下列公式计算样本的相对表达量：ΔC_T＝C_{T,hsa-miR-548o-3p}-C_T,cel-miR-39。

如附图1所示，与健康和肺癌患者相比，活动性肺结核患者血浆外泌体中hsa-miR-548o-3p表达水平明显下调。

此外，利用ROC曲线分析血浆外泌体中hsa-miR-548o-3p在活动性肺结核的诊断价值，结果表明检测血浆外泌体中hsa-miR-548o-3p的表达水平可作为活动性肺结核的诊断标志物。如附图2所示，当结核组(TB)和健康组(HC)进行ROC分析时，AUC面积为0.7738，且当结核组(TB)和肺癌组(LC)进行ROC分析时，AUC面积为0.869，表明血浆外泌体hsa-miR-548o-3p对活动性肺结核的诊断具有较好价值，具有特异性好，灵敏度高特点。

以上具体实施方式为便于理解本发明而说明的较佳实施例，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

序列表

<110> 上海市公共卫生临床中心

<120> 一种血浆外泌体来源的miR-548o-3p分子标记及其结核病检测试剂盒

<130> 2019

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> RNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

ccaaaacugc aguuacuuuu gc 22

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 2

cagccaaaac tgcagttac 19

Claims (6)

1. 选择性地检测一种外泌体miRNA水平的试剂在制备快速诊断活动性肺结核的试剂盒中的用途，其特征在于，所述试剂用于测定受试者的血浆样品中的hsa-miRNA-548o-3p的水平，其中所述hsa-miRNA-548o-3p的水平相对于正常人的水平的降低指示所述受试者中存在活动性肺结核；所述hsa-miRNA-548o-3p的序列如SEQ ID NO:1所示，具体为：CCAAAACUGCAGUUACUUUUGC。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，其中使用扩增、杂交、 和/或测序的方法检测所述外泌体miRNA的水平。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，使用定量PCR来检测所述外泌体miRNA的水平。

4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述试剂包括所述外泌体miRNA的反转录引物、定量PCR上游引物及下游引物。

5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述外泌体miRNA定量PCR的上游引物序列如SEQ ID NO:2所示。

6.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述试剂盒用于：

a.测定受试者血浆样品中hsa-miRNA-548o-3p的水平；

b.将血浆样品中hsa-miRNA-548o-3p的水平与一组数据对比，所述数据为正常人中hsa-miRNA-548o-3p的水平；

c.基于步骤b做出的对比结果，确定所述受试者是否患有活动性肺结核。

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