JP2020054336A - 乾癬性関節炎の診断及び治療 - Google Patents

Abstract

【課題】乾癬性関節炎のリスクを診断または予測するための方法およびキットの提供。【解決手段】被験者のサンプル中にｍｉＲ−１４６ａ−５ｐ及びｍｉＲ−９４１からなる群から選択される少なくとも一つのｍｉＲＮＡの発現レベルを測定するステップとを含み、前記サンプル中の前記少なくとも一つのｍｉＲＮＡの発現レベルが、乾癬性関節炎のないサンプル中の少なくとも一つの対応のｍｉＲＮＡの発現レベルより高い場合、前記被験者が乾癬性関節炎を罹患または発症リスクが存在することの指標となることを特徴とする、被験者の乾癬性関節炎（ｐｓｏｒｉａｔｉｃ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）を検出または発症リスクを予測するためのインビトロ方法。【選択図】図１−１

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年７月２４日に出願された米国出願第６２／７０２，５５１号の利益を主張するものであり、この内容は、全体が参照により本明細書に組み込まれる。

乾癬性関節炎（ｐｓｏｒｉａｔｉｃ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ， ＰｓＡ）は、乾癬に関連した進行性関節症（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ａｒｔｈｒｏｐａｔｈｙ）を伴う慢性炎症性疾患です。乾癬患者の約３０％が乾癬性関節炎を患っていると推定された。通常、皮膚症状（ｍａｎｉｆｅｓｔａｔｉｏｎｓ）はＰｓＡの発症前に平均１０年先行している。Ｈａｒｏｏｎら（Ａｎｎａｌｓ ｏｆ ｔｈｅ ｒｈｅｕｍａｔｉｃ ｄｉｓｅａｓｅｓ ２０１５；７４（６）：１０４５−５０）は、６か月以上の診断遅延が、ＰｓＡ患者の放射線検査結果および機能検査結果の不良の一因であると報告した。よって、永続的な関節の変形と破壊を防ぐには、早期診断と迅速な介入が不可欠となる。現在、ＰｓＡの診断は主に臨床的表現型に基づいている。しかし、現在ではまだ、ＰｓＡの早期発見に利用できる標準化された信頼できる評価方法はありません。その結果、ＰｓＡを罹患した多くの乾癬患者が正確的に診断されず、治療結果が不十分となる（Ｖｅａｌｅ ＤＪ ら、Ｌａｎｃｅｔ ２０１８；３９１ （１０１３６）：２２７３−８４を参照）。

マイクロＲＮＡ（ＭｉｃｒｏＲＮＡｓ，ｍｉＲＮＡｓ）は進化的に保存された、通常２１〜２５ヌクレオチド長の非コードＲＮＡ分子であり、ｍＲＮＡの３’−非翻訳領域（３’−ＵＴＲ）に結合することにより、タンパク質の翻訳を抑制またはｍＲＮＡの分解を促進するように機能する（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ Ｓ （２００４）． Ｔｈｅ ｍｉｃｒｏＲＮＡ Ｒｅｇｉｓｔｒｙ． Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ ３２： Ｄ１０９−１１１を参照）。現在ｍｉＲＮＡに関するほとんどの研究は基本レベルのものであり、乾癬性関節炎での臨床応用を確立するにはさらなる研究が必要となる。

よって、乾癬性関節炎の診断および発症リスクを予測するための非侵襲的且つ便利な方法および／または乾癬性関節炎の治療が必要であり、本発明はこれらのニーズおよび他のニーズを満たす。

一実施例では、本発明は被験者の乾癬性関節炎を検出または発症リスクを予測するための方法を提供し、その方法は、被験者のサンプル中にｍｉＲ−１４６ａ−５ｐ（配列番号１）及びｍｉＲ−９４１（配列番号２）からなる群から選択される少なくとも一つのｍｉＲＮＡの発現レベル（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌ）を測定するステップとを含み、そのうち、ｍｉＲＮＡはサンプルから抽出（ｅｘｔｒａｃｔｅｄ）されたＣＤ１４＋単球（ｍｏｎｏｃｙｔｅ）または破骨細胞（ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ）で表し、且つサンプル中の少なくとも一つのｍｉＲＮＡの発現レベルが、乾癬性関節炎のないサンプル中の少なくとも一つの対応のｍｉＲＮＡの発現レベルより高い場合、被験者が乾癬性関節炎を罹患または発症リスクが存在することを表す。

別の実施例では、本発明は被験者の乾癬性関節炎を検出及び乾癬性関節炎を治療する方法を提供し、その方法は以下のステップを含む：（ａ）被験者のサンプル中にｍｉＲ−１４６ａ−５ｐ（配列番号１）及びｍｉＲ−９４１（配列番号２）からなる群から選択される少なくとも一つのｍｉＲＮＡの発現レベル（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌ）を測定し、そのうち、ｍｉＲＮＡはサンプルから抽出（ｅｘｔｒａｃｔｅｄ）されたＣＤ１４＋単球または破骨細胞で表し、且つサンプル中の少なくとも一つのｍｉＲＮＡの発現レベルが、乾癬性関節炎のないサンプル中の少なくとも一つの対応のｍｉＲＮＡの発現レベルより高い場合、被験者が乾癬性関節炎を罹患または発症リスクが存在することの指標となる；及び（ｂ）被験者に乾癬性関節炎を治療するための治療剤を投与する。

本発明は更に被験者の乾癬性関節炎を検出または発症リスクを予測するためのキットを提供し、そのキットは、（ａ）被験者のサンプルからＣＤ１４＋単球を抽出するための少なくとも１つのマイクロビーズ；及び（ｂ）ｍｉＲ−１４６ａ−５ｐ及びｍｉＲ−９４１からなるグループから選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの配列決定または発現レベルを測定するための薬剤、を含む。

例示的な一実施例では、前記キットは更に培地を含み、前記培地はＭ−ＣＳＦ、ＲＡＮＫＬ及びＴＮＦ−αを含む。

本発明はまた、乾癬性関節炎を治療する方法を提供し、その方法は、配列番号１と少なくとも９０％同一のｍｉＲ−１４６ａ−５ｐ阻害剤、または配列番号２と少なくとも９０％同一のｍｉＲ−９４１阻害剤を、必要とする被験者に有効量を投与するステップを含む。

本発明はまた、被験者中の乾癬性関節炎の治療の有効性を判断する方法を提供し、その方法は、（ａ）前記治療の少なくとも一部を前記被験者に提供する前に、前記被験者から得られた第１サンプルから抽出されたＣＤ１４＋単球のｍｉＲ−１４６ａ−５ｐ及びｍｉＲ−９４１からなる群から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現レベルを測定するステップ；及び（ｂ）前記治療の少なくとも一部を前記被験者に提供した後に、前記被験者から得られた第２サンプルから抽出されたＣＤ１４＋単球の前記ステップ（ａ）の少なくとも一つの対応のｍｉＲＮＡの発現レベルを測定するステップ、を含み、前記第１サンプルから抽出されたＣＤ１４＋単球の対応のｍｉＲＮＡの発現レベルと比較した、前記第２サンプルから抽出されたＣＤ１４＋単球の少なくとも一つのｍｉＲＮＡの発現レベルの低下は、前記治療が乾癬性関節炎に有効であることの指標となる。

本発明の例示的な実施例は、以下の図を参照して以下で詳細に説明される。
図１（Ａ）は、正常対照（ｎｏｒｍａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ、ＮＣ）および乾癬性関節炎（ＰｓＡ）患者から抽出されたＣＤ１４＋単球におけるｍｉＲ−１４６ａ−５ｐ及びｍｉＲ−９４１の発現レベルを示す棒グラフである。図１（Ｂ）は、ｍｉＲ−１４６Ａ−５Ｐ及びｍｉＲ−９４１のΔＣｔ（ｄｅｌｔａ Ｃｔ）値を示す棒グラフである。図１（Ｃ）及び図１（Ｄ）は、正常対照（ＣＤ１４＋ ＮＣ）及び乾癬性関節炎患者（ＰｓＡ ＣＤ１４＋）から抽出されたＣＤ１４＋単球、及び正常対照（ＣＤ１４− ＮＣ）及び乾癬性関節炎（ＰｓＡ ＣＤ１４−）患者の末梢単核細胞（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌｓ）におけるｍｉＲ−１４６ａ−５ｐ及びｍｉＲ−９４１の発現レベルを示す棒グラフである。 図１（Ａ）は、正常対照（ｎｏｒｍａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ、ＮＣ）および乾癬性関節炎（ＰｓＡ）患者から抽出されたＣＤ１４＋単球におけるｍｉＲ−１４６ａ−５ｐ及びｍｉＲ−９４１の発現レベルを示す棒グラフである。図１（Ｂ）は、ｍｉＲ−１４６Ａ−５Ｐ及びｍｉＲ−９４１のΔＣｔ（ｄｅｌｔａ Ｃｔ）値を示す棒グラフである。図１（Ｃ）及び図１（Ｄ）は、正常対照（ＣＤ１４＋ ＮＣ）及び乾癬性関節炎患者（ＰｓＡ ＣＤ１４＋）から抽出されたＣＤ１４＋単球、及び正常対照（ＣＤ１４− ＮＣ）及び乾癬性関節炎（ＰｓＡ ＣＤ１４−）患者の末梢単核細胞（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌｓ）におけるｍｉＲ−１４６ａ−５ｐ及びｍｉＲ−９４１の発現レベルを示す棒グラフである。 図１（Ａ）は、正常対照（ｎｏｒｍａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ、ＮＣ）および乾癬性関節炎（ＰｓＡ）患者から抽出されたＣＤ１４＋単球におけるｍｉＲ−１４６ａ−５ｐ及びｍｉＲ−９４１の発現レベルを示す棒グラフである。図１（Ｂ）は、ｍｉＲ−１４６Ａ−５Ｐ及びｍｉＲ−９４１のΔＣｔ（ｄｅｌｔａ Ｃｔ）値を示す棒グラフである。図１（Ｃ）及び図１（Ｄ）は、正常対照（ＣＤ１４＋ ＮＣ）及び乾癬性関節炎患者（ＰｓＡ ＣＤ１４＋）から抽出されたＣＤ１４＋単球、及び正常対照（ＣＤ１４− ＮＣ）及び乾癬性関節炎（ＰｓＡ ＣＤ１４−）患者の末梢単核細胞（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌｓ）におけるｍｉＲ−１４６ａ−５ｐ及びｍｉＲ−９４１の発現レベルを示す棒グラフである。 図２のＡとＢは、治療前及び治療６か月後の１１人のＰｓＡ患者の圧痛関節と腫脹した関節の数を示す。図２のＣとＤは、正常対照（ＮＣ）、１１人のＰｓＡ患者の治療前（ＰｓＡ（０））、及び治療６か月後（ＰｓＡ（２８週間））のサンプルから抽出されたＣＤ１４＋単球におけるｍｉＲ−１４６ａ−５ｐ及びｍｉＲ−９４１の発現レベルを示す。 図３（Ａ）及び図３（Ｂ）は、正常対照（ＮＣ）、１１人のＰｓＡ患者の治療前（ＰｓＡ（０））、及び治療６か月後（ＰｓＡ（２８週間））のＣＤ１４＋単球由来の破骨細胞におけるｍｉＲ−９４１およびｍｉＲ−１４６Ａ−５Ｐの発現レベルを示す棒グラフである。 図４（Ａ）ないし図４（Ｂ）は、ｍｉＲトランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）なし（図４（Ａ））、陰性対照ｍｉＲＮＡによるトランスフェクション（図４（Ｂ））、ｍｉＲ−９４１阻害剤（図４（Ｃ））またはｍｉＲ−１４６ａ−５ｐ阻害剤（図４（Ｄ））がＣＤ１４＋単球由来の破骨細胞の量に対する影響を示す顕微鏡画像である。図４（Ｅ）はｍｉＲトランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）なし（図４（Ａ））、陰性対照ｍｉＲＮＡによるトランスフェクション（図４（Ｂ））、ｍｉＲ−９４１阻害剤（図４（Ｃ））またはｍｉＲ−１４６ａ−５ｐ阻害剤（図４（Ｄ））がＣＤ１４＋単球由来の破骨細胞の量に対する影響を示す棒グラフである。 図５（Ａ）及び図５（Ｂ）は、正常対照（ＮＣ）、関節炎のない乾癬患者（ＰｓＯ）及び乾癬性関節炎患者から抽出されたＣＤ１４＋単球におけるｍｉＲ−１４６ａ−５ｐ及びｍｉＲ−９４１の発現を示す。

本明細書で使用される用語「ａ」および「ａｎ」は、一つまたは複数（即ち、少なくとも一つ）という意味で使用される。

特許請求の範囲において、「または（ｏｒ）」という用語は一般に、その内容が別途明らかに示されていない限り、本開示には「および／または（ａｎｄ／ｏｒ）」を含む意味において用いられる。

本明細書及び請求項で使用される用語「含む」、「有する」または「含有」は、包括的（ｉｎｃｌｕｓｉｖｅ）またはオープンエンド（ｏｐｅｎ−ｅｎｄｅｄ）の用語であり、且つ追加、列挙されていない要素または方法ステップを排除するものではありません。

本明細書で使用される「患者（ｐａｔｉｅｎｔ）」または「被験者（ｓｕｂｊｅｃｔ）」は、乾癬性関節炎を罹患と診断され、疑われ、または乾癬性関節炎の発症リスクを有する哺乳類被験者を指す。例示的な被験者は、乾癬性関節炎を発症する可能性のあるヒト、類人猿、犬、豚、牛、猫、馬、ヤギ、ヒツジ、げっ歯類及び他の哺乳類であり得る。

本明細書で互換的に使用されるように、「マイクロＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ）」、「ｍｉＲ」、または「ｍｉＲＮＡ」は、ｍｉＲ遺伝子からの未処理（例えば、前駆体）または処理済み（例えば、成熟）のＲＮＡ転写物（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ）を指す。マイクロＲＮＡは、真核生物の遺伝子発現を負に調節し、遺伝子調節因子（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ）の新しいクラスを構成する内因性の非コーディング一本鎖ＲＮＡ（Ｃｈｕａら、（２００９） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｍｏｌ． Ｔｈｅｒ． １１：１８９−１９９を参照）である。個々のｍｉＲＮＡはさまざまな生物で同定および配列決定されており、名前が付けられている。本明細書では、ｍｉＲＮＡの名前とその配列を提供する。

本明細書のすべての数字は、「約」によって修飾されたものとして理解され得る。本明細書で使用される「約」という用語は、測定可能な値、持続時間など、または範囲を指す場合、そのような変動はｍｉＲＮＡレベルの発現に適しているため、特に指定しない限り、指定値から±１０％の変動を包含することを意味する。

「より高い（ｈｉｇｈｅｒ）」ｍｉＲＮＡ発現は相対的な用語であり、サンプル中のｍｉＲＮＡ発現レベルと、乾癬性関節炎がないことが知られている健常者の参照プール（すなわち、正常対照）からのｍｉＲＮＡ発現レベルとの比較により判断できる。

本明細書で使用される「サンプル（ｓａｍｐｌｅ）」はｍｉＲＮＡを含むサンプルを指す。サンプルは目標ｍｉＲＮＡの存在及び／または発現レベルの検出に利用できる。正常対照と比較してｍｉＲＮＡの差次的発現を含む生体液および器官が最適と予測されるが、本発明が請求されている主題の方法で使用されるものは抽出されたＣＤ１４＋単球である。一部の実施例では、サンプルは例えば、血液またはその成分など、比較的簡単に入手できるものである。サンプルの非限定的な例には、体液（例えば、末梢血）、細胞（例えば、ＣＤ１４＋単球または破骨細胞）または組織（例えば、生検標本または関節液）が含まれる。

ｍｉＲＮＡの発現レベルの測定とは、サンプルに存在するｍｉＲＮＡの量を定量化すること。特定のｍｉＲＮＡまたは任意のｍｉＲＮＡの発現レベルの測定は、リアルタイムＰＣＲ（ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ）、ノーザンブロット（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ）分析など、当業者に知られているまたは本明細書に記載されている任意の方法を使用して達成することができる。ｍｉＲＮＡの発現レベルの測定には、ｍｉＲＮＡの成熟型またはｍｉＲＮＡ発現と関連する前駆体型の発現の測定が含まれる。

特定の実施例において、少なくとも一つのｍｉＲＮＡの発現レベルは、ノーザンブロット分析を使用して定量される。例えば、核酸抽出バッファーの存在下でのホモジナイゼーションとそれに続く遠心分離により、細胞から全細胞ＲＮＡを精製できる。核酸が沈殿し、ＤＮａｓｅ処理および沈殿によりＤＮＡが除去される。次に、ＲＮＡ分子は、標準的な技術に従ってアガロースゲルでのゲル電気泳動（ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）によって分離され、ニトロセルロースフィルターに移される。次に、ＲＮＡは加熱によりフィルターに固定（ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ）されます。特定のＲＮＡの検出と定量は、問題のＲＮＡに相補的な適切に標識されたＤＮＡまたはＲＮＡプローブを使用して行われる。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．， ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， １９８９， Ｃｈａｐｔｅｒ ７を参照。

いくつかの実施例では、マイクロアレイの使用が望ましい。マイクロアレイは、複雑な生化学サンプルの並行分析を可能にする核酸、タンパク質、小分子、細胞またはその他の物質の微視的、規則的な配列です。この技術は、サンプル中の相補鎖（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｓｔｒａｎｄｓ）を見つけてハイブリダイズするように、既知の配列情報を持つ多くのオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをプローブとして提供し、それによって選択的結合により相補鎖を捕捉する。プローブは、標的ｍｉＲＮＡ配列の少なくとも一部に対して相補的または本質的に相補的であるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列を含む。ここの「相補的」とは、２つの核酸鎖の領域間の配列相補性の広い概念を指す。第１核酸領域のアデニン残基は、残基がチミンまたはウラシルである場合、第１領域と逆平行である第２核酸領域の残基と特異的な水素結合（「塩基対合（ｂａｓｅ ｐａｉｒｉｎｇ）」）を形成できることが知られている。同様に、第１核酸鎖のシトシン残基は、残基がグアニンである場合、第１鎖と逆平行である第２核酸鎖の残基と塩基対合することができることが知られている。２つの領域が逆平行に配置され、且つ第１領域の少なくとも１つのヌクレオチド残基が第２領域の残基と塩基対合することができる場合、核酸の第１領域は、同じまたは異なる核酸の第２領域に相補的である。好ましくは、第１領域は第１部分を含み、第２領域は第２部分を含み、それにより、第１および第２部分が逆平行に配置される場合、第１部分のヌクレオチド残基の少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７５％、少なくとも約９０％または少なくとも約９５％は、第２部分のヌクレオチド残基と塩基対合することができる。より好ましくは、第１部分のすべてのヌクレオチド残基は、第２部分のヌクレオチド残基と塩基対合することができる。

例えば、ｍｉＲＮＡのマイクロアレイ分析は、当該分野で公知の任意方法に従って達成され得る。一実施例では、ＲＮＡはサンプルのＣＤ１４＋単球などの細胞から抽出され、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用して全ＲＮＡから低分子ＲＮＡ（１８〜２６ヌクレオチド）をサイズ選択される。オリゴヌクレオチドリンカーはｓｍａｌｌ ＲＮＡの５’および３’末端に結合し、得られたライゲーション生成物は、１０サイクルの増幅を伴うＲＴ−ＰＣＲ反応のテンプレートとして使用される。センス鎖ＰＣＲプライマーには、その５’末端にフルオロフォアが付いているため、ＰＣＲ産物のセンス鎖が蛍光標識されます。そのＰＣＲ産物は変性してから、マイクロアレイにハイブリダイズされる。アレイ上の対応するｍｉＲＮＡキャプチャープローブシーケンスに相補的なターゲット核酸と呼ばれるＰＣＲ産物は、キャプチャープローブが貼付されているスポットに塩基対を介してハイブリダイズされる。そしてそのスポットは、マイクロアレイレーザースキャナーを使用して励起すると蛍光を発する。各スポットの蛍光強度は、特定のｍｉＲＮＡの発現レベルの評価に使用する多くの陽性及び陰性対照及びアレイデータ正規化方法を使用して、特定のｍｉＲＮＡのコピー数に関して評価されます。本明細書に開示されるｍｉＲＮＡに関して、プローブは、標的ｍｉＲＮＡまたはポリヌクレオチド配列と１００％相補的であり得る。しかしながら、プローブは、特異的に標的ポリヌクレオチドに結合してサンプルからそれを捕捉できる限り、標的ポリヌクレオチドの全長に沿って標的ポリヌクレオチドに必ずしも完全に相補的である必要はない。いくつかの実施例において、プローブは、配列番号１または配列番号２と少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％同一のポリヌクレオチドに相補的である。

いくつかの実施例では、定量的ＲＴ−ＰＣＲの使用が望ましい。定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）は、ポリメラーゼ連鎖反応の産物の量を迅速に測定するために使用されるポリメラーゼ連鎖反応の修正である。ｑＲＴ−ＰＣＲは一般、ｍｉＲＮＡなどの遺伝子配列がサンプル内に存在するかどうか、及び存在する場合のサンプル内のコピー数を判断する目的で使用されている。ｍｉＲＮＡを含む核酸分子の発現を判断できるＰＣＲの任意の方法は、本開示の範囲内に含まれる。当該分野で知られているｑＲＴ−ＰＣＲ法にはいくつかのバリエーションがあり、アガロースゲル電気泳動によるＳＹＢＲグリーン（二本鎖ＤＮＡ色素）の使用、及び蛍光レポータープローブ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｐｒｏｂｅ）の使用が含まれますが、これらに限定されない。

乾癬性関節炎及び乾癬性関節炎のない被験者で差次的に発現されるｍｉＲＮＡの同定により、この情報をさまざまな方法で使用できる。例えば、特定の治療計画を評価することができる（例えば、治療が乾癬性関節炎の被験者に有効かどうかを判断するように）。乾癬性関節炎の診断は、サンプルから抽出されたＣＤ１４＋単球または破骨細胞のｍｉＲＮＡの発現レベルを、非乾癬性関節炎サンプルの抽出されたＣＤ１４＋単球または破骨細胞の既知のｍｉＲＮＡ発現プロファイルと比較することにより、実施または確認できます。さらに、一つまたは複数の診断または予測ｍｉＲＮＡレベルの複数の測定を行うことができ、発現レベルの一時的な変化を使用して、診断、予後（ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ）または再発（ｒｅｌａｐｓｅ）を判断することができる。例えば、特定のｍｉＲＮＡレベルを最初の時間に測定し、そして第２時間に再び測定することができる。いくつかの実施例では、初回から２回目までのｍｉＲＮＡレベルの増加は、乾癬性関節炎、または所定の予後の診断となり得る。同様に、初回から２回目までのｍｉＲＮＡレベルの低下は、乾癬性関節炎の寛解（ｒｅｍｉｓｓｉｏｎ）、または所定の予後を示す可能性がある。さらに、一つまたは複数のｍｉＲＮＡレベル変化の程度は、乾癬性関節炎の重症度に関連する可能性がある。

別の実施例では、被験者中の乾癬性関節炎の治療の有効性を判断する方法を提供し、その方法は、（ａ）治療の少なくとも一部を被験者に提供する前に、被験者から得られた第１サンプルから抽出されたＣＤ１４＋単球のｍｉＲ−１４６ａ−５ｐ及びｍｉＲ−９４１からなる群から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現レベルを測定するステップ；及び（ｂ）治療の少なくとも一部を被験者に提供した後に、被験者から得られた第２サンプルから抽出されたＣＤ１４＋単球の前記ステップ（ａ）の少なくとも一つの対応のｍｉＲＮＡの発現レベルを測定するステップを含み、そのうち、第１サンプルから抽出されたＣＤ１４＋単球の対応のｍｉＲＮＡの発現レベルと比較した、第２サンプルから抽出されたＣＤ１４＋単球の少なくとも一つのｍｉＲＮＡの発現レベルの低下は、その治療が乾癬性関節炎に有効であることの指標となる。例示的な一実施例では、前記サンプルは抽出されたＣＤ１４単球であり、ｍｉＲＮＡはｍｉＲ−１４６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−９４１またはその組み合わせである。

図１（Ｃ）および図１（Ｄ）を参照して、特定の理論に拘束されることなく、ｍｉＲ−１４６ａ−５ｐ及びｍｉＲ−９４１の発現レベルは、抽出されたＣＤ１４＋単球またはＰｓＡ患者の破骨細胞でのみ上昇し、ＰｓＡ患者の末梢単核細胞では上昇しないことがわかる。故に、ＣＤ１４＋単球以外の末梢単核細胞でのｍｉＲ−１４６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−９４１またはその組み合わせの発現レベルの測定は、ＰｓＡの診断に寄与しない。一つまたは複数の破骨細胞は、一つまたは複数のＣＤ１４＋単球またはＰｓＡ患者の関節液から分化（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ）した破骨細胞であり得る。

一実施例において、前記キットは、乾癬性関節炎の発症リスクの診断または予測を必要とする被験者のサンプル中のｍｉＲ−１４６ａ−５ｐ及びｍｉＲ−９４１からなる群から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの配列決定または発現レベルを測定するための少なくとも１つの薬剤を含む。

また一実施例において、前記キットは更に培地を含み、前記培地はＭ−ＣＳＦ、ＲＡＮＫＬ及びＴＮＦ−αを含む。培地は、抽出されたＣＤ１４＋単球を破骨細胞に分化させるために使用される。

例示的な一実施例では、前記薬剤はＲＴ−ＰＣＲである。また一つの例示的な実施例では、前記キットは、配列番号１または配列番号２と少なくとも９０％、９５％、または１００％同一のオリゴヌクレオチドに相補的な少なくとも１つのｍｉＲＮＡ特異的オリゴヌクレオチドプローブを含む。

本明細書で使用される「同一（ｉｄｅｎｔｉｃａｌ）」は、同じ核酸鎖の２つの領域間、または２つの異なる核酸鎖の領域間のヌクレオチド配列類似性を指す。その両方の領域のヌクレオチド残基の位置が同じヌクレオチド残基で占められている場合、その領域は当該位置で相同（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）である。各領域の少なくとも１つのヌクレオチド残基位置が同じ残基によって占められている場合、第１領域は第２領域と相同である。２つの領域間の相同性は、同じヌクレオチド残基が占める２つの領域のヌクレオチド残基位置の割合で表される。例として、ヌクレオチド配列５’−ＡＴＴＧＣＣ−３’を有する領域及びヌクレオチド配列５’−ＴＡＴＧＧＣ−３’を有する領域は、５０％の相同性を共有する。好ましくは、第１領域は第１部分を含み、第２領域は第２部分を含み、それにより各部分の位置のヌクレオチド残基の少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％が、同じヌクレオチド残基で占められている。また、各部分のすべてのヌクレオチド残基位置が同じヌクレオチド残基によって占められていることが好ましい。

被験者の乾癬性関節炎を検出する方法を提供し、その方法は、被験者のサンプル中に以下の少なくとも一つのｍｉＲＮＡの発現レベルをを測定する：ｍｉＲ−１４６ａ−５ｐ及びｍｉＲ−９４１、そのうち、サンプル中の前記少なくとも一つのｍｉＲＮＡの発現レベルが、乾癬性関節炎のないサンプル中の少なくとも一つの対応のｍｉＲＮＡの発現レベルより高い場合、サンプル中に前記少なくとも一つのｍｉＲＮＡの発現レベルが高い前記被験者が、乾癬性関節炎を罹患または発症リスクが存在することの指標となる。

本発明はまた、被験者の乾癬性関節炎を検出及び乾癬性関節炎を治療する方法を提供し、その方法は以下のステップを含む：（ａ）被験者のサンプル中に以下の少なくとも一つのｍｉＲＮＡの発現レベルをを測定する：ｍｉＲ−１４６ａ−５ｐ及びｍｉＲ−９４１、そのうち、サンプル中の前記少なくとも一つのｍｉＲＮＡの発現レベルが、乾癬性関節炎のないサンプル中の少なくとも一つの対応のｍｉＲＮＡの発現レベルより高い場合、サンプル中に前記少なくとも一つのｍｉＲＮＡの発現レベルが高い前記被験者が、乾癬性関節炎を罹患または発症リスクが存在することの指標となる；及び（ｂ）被験者に乾癬性関節炎を治療するための治療剤を投与する。治療剤の非限定的な例としては、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）、免疫抑制剤、ＴＮＦ−α阻害剤、アプレミラスト（Ｏｔｅｚｌａ）、ウステキヌマブ（Ｓｔｅｌａｒａ）、セクキヌマブ（Ｃｏｓｅｎｔｙｘ）、本明細書に開示されるｍｉＲ−１４６ａ−５ｐ阻害剤もしくはｍｉＲ−９４１阻害剤、またはそれらの組み合わせである。

いくつかの実施例では、必要とする被験者の乾癬性関節炎を治療する方法を提供し、その方法は、配列番号１と少なくとも９０％、少なくとも９５、または１００％同一のポリヌクレオチドに相補的なｍｉＲ−１４６ａ−５ｐ阻害剤を被験者に投与するステップ、及び／または配列番号２と少なくとも９０％、少なくとも９５、または１００％同一のポリヌクレオチドに相補的なｍｉＲ−９４１阻害剤を被験者に投与するステップとを含む。

本発明の実施形態を以下の実施例により説明するが、これらの実施例は、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。それどころか、本明細書の説明を読んだ後に、本発明の趣旨から逸脱することなく、様々な他の実施形態、修正、及びその同等物を想到することができることを明確に理解されたい。以下の実施例で説明する研究においては、特に明記しない限り、従来の手順に従った。いくつかの手順は、説明のために以下に記載する。

実施例１
研究参加者：乾癬性関節炎の患者（症例）及びＰｓＡのない正常対照（ＮＣ）における各ｍｉＲＮＡの発現を調べるために、症例対照研究を実施した。

１６人の健康な正常対照（ＮＣ）及び３１人のＰｓＡ患者（乾癬性関節炎の分類基準は、ＣＡＳＰＡＲ、Ｔａｙｌｏｒ Ｗら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ ２００６； ５４（８）：２６６５−７３に基づく）が研究に登録された。

次世代シーケンシング（ＮＧＳ）とその後の検証で使用した定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）アッセイによって、潜在的なＰｓＡバイオマーカーを探索した。２人のＮＣ及び４人のＰｓＡのＲＮＡサンプルを、ＮＧＳ研究の候補ｍｉＲＮＡの初期検証として使用した。

登録した被験者の末梢血中のＣＤ１４＋単球は、ＣＤ１４＋マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、台湾）によって抽出及び分離した。分離したＣＤ１４＋単球からＲＮＡサンプルを抽出し、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ ２１００（Ａｇｉｌｅｎｔ、ＵＳＡ）で品質検査を行って、ＲＮＡ整合性値が８．０以上のＲＮＡサンプルを選択した。選択したＲＮＡサンプルは、ＴｒｕＳｅｑ Ｓｍａｌｌ ＲＮＡ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎプロトコル（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、ＵＳＡ）で調製した。

プールされた（ｐｏｏｌｅｄ）２人の男性ＮＣ、プールされた２人の女性ＮＣ、プールされた２人のＰｓＡ男性患者とプールされた２人のＰｓＡ女性患者からのＲＮＡライブラリーをイルミナＮＧＳプラットフォームでシーケンスし、その後、ｍｉＲＳｅｑ８分析によりマイクロ（ｍｉ）−ＲＮＡ発現をプロファイリングした。調製したアンプリコンは、ＭｉＳｅｑ施設（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）でＶ３ １５０サイクルシーケンス試薬を使用してシーケンスし、５１−ｎｔのシングルエンドリード（ｓｉｎｇｌｅ−ｅｎｄ ｒｅａｄｓ）を生成しました。ＰｓＡ及びＮＣサンプルのｍｉＲＮＡ発現プロファイルを調べるためにクラスター分析（Ｃｌｕｓｔｅｒｄ ａｎａｌｙｓｉｓ）を実施しました。

ＮＧＳで検査されたＲＮＡサンプルのうち、合計で約２７７０万の未処理リード（ｒａｗ ｒｅａｄｓ）があり、各サンプルは平均６９０万リードを占めました。生成されたＮＧＳデータは、ｍｉＲＮＡの定量とシーケンスの品質評価のために、ｍｉＲＳｅｑ（Ｐａｎ ＣＴ．ら， Ｂｉｏｍｅｄ Ｒｅｓ Ｉｎｔ ２０１４：４６２１３５を参照）で分析されました。ｍｉＲＳｅｑは、１００万あたりの転写量（ＴＰＭ）でｍｉＲＮＡの発現レベルを示した。表１に示すように、少なくとも一つのサンプルにおける１３個のｍｉＲＮＡは１０００を超えるＴＰＭ値を持ち、且つ平均発現比（疾病対（ｖｅｒｓｕｓ）正常または正常対疾病）は少なくとも１．５でした。

１３個のｍｉＲＮＡにおいて、ＰｓＡ患者のｍｉＲ−９４１の発現は増加した。

ＮＧＳデータをさらに検証するように２つのＮＣサンプルと４つのＰｓＡサンプルでｑＰＣＲを実行した。ｑＰＣＲ分析によると、ＮＣの発現と比較して、ＰｓＡを有する患者においてｍｉＲ−９４１及びｍｉＲ−１４６ａ−５ｐの発現が増加したことを示した（図１（Ａ）を参照）。

ＳＶＭは、治療対（ｖｅｒｓｕｓ）対照または疾病対正常などのバイナリ分類問題を処理するための機械学習アルゴリズムである。図１（Ｂ）に示すＮＣ及びＰｓＡ患者のｍｉＲ−９４１およびｍｉＲ−１４６ａ−５ｐのＤＣｔ値を使用して、ＳＶＭ分類を５倍の交差検証で訓練し、過剰適合（ｏｖｅｒｆｉｔｔｉｎｇ）と不足適合（ｕｎｄｅｒｆｉｔｔｉｎｇ）を排除した。

図１（Ｃ）及び図１（Ｄ）に示すように、ｍｉＲ１４６ａ−５ｐ及びｍｉＲ−９４１の発現が、乾癬性関節炎（ＰｓＡ ＣＤ１４＋）の患者から抽出されたＣＤ１４＋単球において増加するが、乾癬性関節炎（ＰｓＡ ＣＤ１４−）の患者からの末梢単核細胞では増加しないことを示している。

表２は、ｍｉＲ−１４６ａ−５ｐとｍｉＲ−９４１の組み合わせがＰｓＡ診断での敏感度、特異性、および受信者操作特性（ｒｅｃｅｉｖｅｒ ｏｐｅｒａｔｉｎｇ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ）の曲線下の領域（ａｕＲＯＣ）に予期しない相乗効果をもたらすことを示している。

１６人のＮＣおよび１１人のＰｓＡ患者から抽出したＣＤ１４＋単球のｍｉＲ−９４１およびｍｉＲ−１４６ａ−５ｐの発現を、ＰｓＡ治療（アダリムマブ、エタネルセプト、ゴリムマブ、ウステキヌマブまたはセクキヌマブを含む）前及び６か月の治療後に測定した。

治療開始の２８週間後の１１人のＰｓＡ患者は、有意な症状の軽減（関節の圧痛および腫脹の軽減）を示した（図２のＡ及びＢを参照）。６か月の治療後の１１人のＰｓＡ患者から抽出されたＣＤ１４＋単球におけるｍｉＲ−９４１およびｍｉＲ−１４６ａ−５ｐの発現は有意的に減少した（図２のＣ及びＤ）。抽出されたＣＤ１４＋単球におけるｍｉＲ−９４１及びｍｉＲ−１４６ａ−５ｐの発現の減少は、ＰｓＡ患者の症状の軽減と相関している。

破骨細胞におけるｍｉＲ−９４１およびｍｉＲ−１４６ａ−５ｐの発現レベルは、抽出されたＣＤ１４＋単球から区別された。

ＣＤ１４＋単球は、６か月のＰｓＡ治療の前後に、２人のＮＣと２人のＰｓＡ患者の末梢血から抽出された。抽出したＣＤ１４＋単球をＭ−ＣＳＦ ５０ｎｇ／ｍｌで３日間培養した後、破骨細胞分化のために１００ｎｇ／ｍｌのＲＡＮＫＬ及び１００ ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−αで９日間培養した。破骨細胞はＰｓＡにおいて関節破壊を引き起こすことが知られている。図３（Ａ）及び図３（Ｂ）に示すように、治療の成功前後のＰｓＡ患者のＣＤ１４＋単球由来の破骨細胞におけるｍｉＲ−９４１及びｍｉＲ−１４６ａ−５ｐの発現は、ＮＣの発現よりも高かった（ｐ＜０．０５及びｐ＜０．０５）。結果を見ると、ＣＤ１４＋単球由来の破骨細胞におけるｍｉＲ−９４１およびｍｉＲ−１４６ａ−５ｐの発現は、疾患活動性（ｄｉｓｅａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ）に関係なく高いことを示している。

実施例２
ＰｓＡ患者のＣＤ１４＋単球由来の破骨細胞に対するｍｉＲ−９４１阻害剤及びｍｉＲ−１４６ａ−５ｐ阻害剤の効果のインビトロ評価を実施した。

ＣＤ１４＋単球をＰｓＡ患者の末梢血から抽出し、Ｍ−ＣＳＦで７２時間培養した。培養されたＣＤ１４の＋単球は、以下のプロトコルで処理しました：
（１）ｍｉＲＮＡトランスフェクションなし：破骨細胞に分化するために、ＣＤ１４＋単球を９日間、３日ごとにＴＮＦ−α及びＲＡＮＫＬとともに培養した。
（２）陰性対照ｍＲＮＡトランスフェクション：ＣＤ１４＋単球に陰性対照ｍｉＲＮＡ（配列番号３）を６時間トランスフェクトし、その後９日間３日ごとにＴＮＦ−α及びＲＡＮＫＬとともに培養して破骨細胞に分化させた。
（３）ｍｉＲ−９４１阻害剤トランスフェクション：ＣＤ１４＋単球にｍｉＲ−９４１阻害剤（配列番号４）を６時間トランスフェクトし、次いで破骨細胞に分化させるために９日間、３日ごとにＴＮＦ−αおよびＲＡＮＫＬとともに培養した。
（４）ｍｉＲ−１４６ａ−５ｐ阻害剤トランスフェクション：ＣＤ１４＋単球にｍｉＲ−１４６ａ−５ｐ阻害剤（配列番号５）を６時間トランスフェクトし、次いで破骨細胞に分化するために９日間、３日ごとにＴＮＦ−αおよびＲＡＮＫＬとともに培養した。

図４（Ａ）ないし図４（Ｅ）に示すように、ｍｉＲ−９４１阻害剤（図４（Ｃ））またはｍｉＲ−１４６ａ−５ｐ阻害剤（図４（Ｄ））は、陰性対照ｍｉＲトランスフェクション（図４（Ｂ））及びｍｉＲトランスフェクションなしのグループ（図４（Ａ））と比較して、ＣＤ１４＋単球由来破骨細胞の数を有意に減少させた。したがって、ｍｉＲ−１４６ａ−５ｐまたはｍｉＲ−９４１の阻害剤は、ＰｓＡ患者の破骨細胞形成を減少させ、ＰｓＡの治療に使用できる。

実施例３
さらに、４０人の健康な正常対照（ＮＣ）、４０人の関節炎のない乾癬患者（ＰｓＯ）、及び４０人の乾癬性関節炎患者（ＰｓＡ）におけるｍｉＲ１４６ａ−５ｐとｍｉＲ９４１の発現を調べるために含まれるケースコントロール研究を行われた。

ＰｓＡの診断とｍｉＲＮＡの発現は、実施例１の基準と手順に従って測定された。図５（Ａ）及び図５（Ｂ）は、ｍｉＲ１４６ａ−５ｐ及びｍｉＲ９４１の発現がＮＣ及びＰｓＯの発現よりも有意に高いことを示している。結果を見ると、ｍｉＲ１４６ａ−５ｐとｍｉＲ９４１の発現の増加が、乾癬患者の関節炎を発症するリスクを予測できることを示している。

Claims (11)

1. 被験者のサンプル中にｍｉＲ−１４６ａ−５ｐ及びｍｉＲ−９４１からなる群から選択される少なくとも一つのｍｉＲＮＡの発現レベルを測定するステップとを含み、
   前記サンプル中の前記少なくとも一つのｍｉＲＮＡの発現レベルが、乾癬性関節炎のないサンプル中の少なくとも一つの対応のｍｉＲＮＡの発現レベルより高い場合、前記被験者が乾癬性関節炎を罹患または発症リスクが存在することの指標となることを特徴とする、被験者の乾癬性関節炎（ｐｓｏｒｉａｔｉｃ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）を検出または発症リスクを予測するためのインビトロ方法。
2. 前記ｍｉＲＮＡの発現レベルは、リアルタイムＰＣＲ（ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ）によって検出されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
3. 前記ｍｉＲＮＡの発現レベルは、配列番号１または配列番号２と少なくとも９０％同一のオリゴヌクレオチドプローブによって検出されることを特徴とする、請求項に１記載の方法。
4. 前記サンプルはＣＤ１４＋単球（ｍｏｎｏｃｙｔｅ）であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
5. 前記サンプルは破骨細胞（ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ）であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
6. 前記破骨細胞はＣＤ１４＋単球に由来するものであることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
7. 配列番号１と少なくとも９０％同一のｍｉＲ−１４６ａ−５ｐ阻害剤、または配列番号２と少なくとも９０％同一のｍｉＲ−９４１阻害剤を投与するステップを含むことを特徴とする、被験者の乾癬性関節炎の治療方法。
8. 前記ｍｉＲ−１４６ａ−５ｐ阻害剤は配列番号５であることを特徴とする、請求項７に記載の使用。
9. 前記ｍｉＲ−９４１阻害剤は配列番号４であることを特徴とする、請求項７に記載の使用。
10. 被験者中の乾癬性関節炎の治療の有効性を判断する方法であって、
    （ａ）前記治療の少なくとも一部を前記被験者に提供する前に、前記被験者から得られた第１サンプル中のｍｉＲ−１４６ａ−５ｐ及びｍｉＲ−９４１からなる群から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現レベルを測定するステップと、
    （ｂ）前記治療の少なくとも一部を前記被験者に提供した後に、前記被験者から得られた第２サンプル中の前記ステップ（ａ）の少なくとも一つの対応のｍｉＲＮＡの発現レベルを測定するステップと、
    を含み、
    前記第１サンプル中の対応のｍｉＲＮＡの発現レベルと比較した、前記第２サンプル中の少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現レベルの低下は、前記治療が乾癬性関節炎に有効であることの指標となることを特徴とする、被験者中の乾癬性関節炎の治療の有効性を判断する方法。
11. 前記第１サンプル及び前記第２サンプルはＣＤ１４＋単球であることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。