TWI704927B - 乾癬性關節炎的診斷及治療、與其之套組 - Google Patents

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Abstract

用於在需要診斷或預測發展乾癬性關節炎風險之受試者中診斷或預測發展乾癬性關節炎之風險的方法及套組，其包含在受試者的樣品中測量一種或多種本文所揭露之miRNA的表現量，並與在無乾癬性關節炎樣品的測試樣品中的至少一種miRNA之表現量比較。亦提供藉由降低至少一種本文所揭露之miRNA的表現量來治療乾癬性關節炎的方法。

Description

乾癬性關節炎的診斷及治療、與其之套組
本發明主張於2018年7月24申請之美國申請號第62/702,551號的效益，其全文藉由引用的方式併入本文。
乾癬性關節炎(psoriatic arthritis，PsA)為慢性發炎性疾病，涉及與乾癬相關之進行性關節病(progressive arthropathy)。大約30%具有乾癬的患者估計具有乾癬性關節炎。通常，在PsA發病之前約10年為皮膚之表現(manifestations)。Haroon et al.(Annals of the rheumatic diseases 2015；74(6)：1045-50)報導了超過6個月的乾癬性關節炎診斷延遲造成PsA的患者之不良放射線影像學結果及不良的功能性結果。早期診斷與及時介入為避免永久性關節變形及破壞的關鍵。目前，PsA的診斷主要基於臨床表現型。至今並沒有早期偵測PsA之標準且可靠的評估方法，導致許多具有乾癬的患者未確診乾癬性關節炎造成不佳治療結果(Veale DJ et al.,Lancet 2018；391(10136)：2273-84)。
微小RNA(MicroRNAs，miRNAs)為演化上保守的通常長度為21-25個核苷酸之非編碼RNA分子，其藉由結合至mRNA的3’-未轉譯區(3’-UTRs)進行蛋白質轉譯抑制或促進mRNA降解的作用(參見Griffiths-Jones S(2004).The microRNA Registry.Nucleic acids research 32：D109-111)。miRNAs的大部分的現今研究為基礎等級，因此有需要進一步建立其在乾癬性關節炎的應用。
因此，有需要非侵入性且方便的方法來診斷及預測乾癬性關節炎的風險及/或乾癬性關節炎的治療，本發明滿足這些需求與其他需求。
在一個實施例中，本發明提供用於在受試者中偵測乾癬性關節炎或預測發展乾癬性關節炎之風險的方法，其包含在受試者的測試樣品中測量選自由miR-146a-5p(SEQ ID NO：1)及miR-941(SEQ ID NO：2)所組成之群組中的至少一種miRNA的表現量(expression level)的步驟，其中miRNA是在測試樣品中經萃取的(extracted)CD14+單核球(monocyte)或蝕骨細胞(osteoclast)表達，且相對於在無乾癬性關節炎樣品中的至少一種對應的miRNA的表現量，在測試樣品中的至少一種miRNA之較高的表現量係代表受試者具有乾癬性關節炎或具有發展乾癬性關節炎的風險。
在另一實施例中，本發明提供用於在受試者中偵測乾癬性關節炎及治療乾癬性關節炎的方法，其包含下列步驟：(a)在受試者的測試樣品中測量選自由miR-146a-5p(SEQ ID NO：1)及miR-941(SEQ ID NO：2)所組成之群組中的至少一種miRNA的表現量，其中miRNA是在測試樣品中經萃取的CD14+單核球或蝕骨細胞表達，且相對於在無乾癬性關節炎樣品中至少一種對應之miRNA的表現量，在測試樣品中的至少一種miRNA之較高的表現量係指示受試者具有乾癬性關節炎；以及(b)對受試者施予治療劑以治療乾癬性關節炎。
本發明亦提供用於在受試者中偵測乾癬性關節炎或預測發展乾癬性關節炎的風險的套組，其包含：(a)用於從受試者的樣品中萃取CD14+單核球的至少一微珠(microbead)；以及(b)用於定序或測量選自由miR-146a-5p及miR-941所組成之群組中的至少一種miRNA的表現量的試劑。
在一例示性實施例中，所述套組進一步包含培養基，所述培養基包含M-CSF、RANKL及TNF-α。
亦提供的是，用於治療乾癬性關節炎的方法，其包含：對有需要之受試者，施予有效劑量之至少與SEQ ID NO：1有90%互補之miR-146a-5p抑制劑、或者施予有效劑量之至少與SEQ ID NO：2有90%互補之miR-941抑制劑的步驟。
亦揭露治療乾癬性關節炎受試者之治療效果的方法，所述方法包含：(a)在對受試者提供至少一部份的治療之前，測量在來自受試者的第一樣品中經萃取的CD14+單核球之選自由miR-146a-5p及miR-941所組成之群組中的至少一種miRNA的表現量；以及(b)在對受試者提供至少一部份的治療之後，測量在取得自受試者的第二樣品中經萃取的CD14+單核球之步驟(a)的至少一種對應miRNA的表現量，其中，相對於在來自第一樣品中經萃取的CD14+單核球之對應的miRNA之表現量，來自第二樣品中經萃取的CD14+單核球之至少一種miRNA之下降的表現量代表有效治療乾癬性關節炎的指示。
本發明之說明性實施例參考下列圖式在下文中詳細描述：第1A圖為顯示在正常對照組(normal control，NC)及具有乾癬性關節炎(PsA)之患者的經萃取CD14+單核球中的miR-146a-5p及miR-941的表現量之柱狀圖的組合。第1B圖為顯示miR-146a-5p及miR-941的ΔCt(delta Ct)值之柱狀圖的組合。第1C圖及第1D圖為顯示來自正常對照組(CD14+NC)及具有乾癬性關節炎之患者(PsA CD14+)的經萃取的CD14+單核球中的miR-146a-5p及miR-941的表現的柱狀圖、以及在來自正常對照組(CD14-NC)及具有乾癬性關節炎之患者(PsA CD14-)的周邊單核細胞(peripheral mononuclear cells)中的表現的柱狀圖。
第2圖的圖面(panels)A及B顯示在治療前及6個月治療後的11位PsA患者中觸痛關節(tender joints)數目及腫脹關節(swollen joints)數目。第2圖的圖面C及D顯示在正常對照(NC)、11位PsA患者治療前(PsA(0))、以及6個月的治療後(PsA(28周))的經萃取的CD14+單核球中的miR-146a-5p及miR-941的表現。
第3A圖及第3B圖為顯示在正常對照組(NC)、11位PsA患者治療前(PsA(0))、以及6個月的治療後(PsA(28周))，由CD14+單核球衍生的蝕骨細胞中的miR-146a-5p及miR-941之表現的柱狀圖。
第4A至第4D圖為顯示無miR轉染(transfection)(第4A圖)、以負對照miRNA轉染(第4B圖)、miR-941抑制劑(第4C圖)、或miR-146a-5p抑制劑(第4D圖)對衍生自蝕骨細胞之CD14+單核球數量的影響的顯微影像之組合。第4E圖為顯示無miR轉染(PsA)、以負對照miRNA轉染、miR-941抑制劑、或miR-146a-5p抑制劑對由CD14+單核球衍生的蝕骨細胞數量的影響的柱狀圖。
第5A圖及第5B圖顯示在來自正常對照組(NC)、具有乾癬不具有關節炎的患者(PsO)、及具有乾癬性關節炎的患者的經萃取的CD14+單核球中的miR-146a-5p及miR-941的表現。
如本文使用的，冠詞「一(a)」及「一(an)」指的是一個或多於一個(亦即，至少一個(at least one))冠詞的語法對象。
在申請專利範圍中用語「或(or)」的使用意為「及/或(and/or)」。
當本說明書及申請專利範圍使用字詞「包含」、「具有」、或「含有」為涵蓋(inclusive)或開放式的(open-ended)且不排除額外的、未列舉的元件或方法步驟。
本文所使用的「患者(patient)」或「受試者(subject)」指的是經診斷具有或疑似具有發展乾癬性關節炎之風險的哺乳類受試者。例示性的受試者可為人類、人猿、狗、豬、牛、貓、馬、羊、綿羊、齧齒類及其他可發展乾癬性關節炎的哺乳類。
如本文中可替換使用的「微小RNA(microRNA)」、「微小RNA(miR)」或「微小RNA(miRNA)」指的是來自miR基因之未經加工的(如：前驅物)、或經加工的(如：成熟的)的RNA轉錄本(transcript)。微小RNA為在真核生物中負調控基因表現並構成新穎類基因調節子(regulators)的內源非編碼單股RNA(Chua,et al.(2009)Curr.Opin.Mol.Ther.11：189-199)。個別的miRNAs在不同生物體中被鑑別與定序，並給予其名稱。本文提供miRNAs的名稱及其序列。
本文的所有數目應被理解為藉由「大約」修飾，係意於涵蓋特定值的±10%的變異，當例如這些變異適合為miRNA量的表現。
「較高(higher)」的miRNA表現為相對的用語，且可藉由在測試樣品中與已知為無乾癬性關節炎的(亦即，正常對照組)健康受試者之參考池(referenced pool)比較miRNA表現量決定。
本文所使用的用語「樣品(sample)」指的是包含miRNA的樣品。樣品可利用來偵測感興趣miRNA的存在及/或表現量。儘管被預測為含有與正常對照組相較為不同表現的miRNA生物液體與器官最適合，但是經萃取的CD14+單核球與本發明主張的申請標的之方法一起使用。在一些實施例中，例如像是血液或其成分的樣品相對容易取得。樣品的非限制例包含體液(例如，周邊血液)、細胞(例如，CD14+單核球或蝕骨細胞)及組織(例如，活檢標本或關節液)。
miRNA的表現量的測量指的是量化存在樣品中miRNA的數量。特定或任何miRNA的表現量的測量可使用任何本發明技術領域中具有通常知識者所習知或如藉由即時聚合酶連鎖反應(real-time PCR)、北方墨點法(Northern blot)分析之本文所述的方法達成。miRNA的表現量的測量包含測量成熟形式的miRNA或與miRNA的表現相關之前驅物形式的表現。
在一特定的實施例中，至少一種miRNA的表現量係使用北方墨點法分析量化。例如，可藉由在核酸萃取緩衝液的存在下均質化(homogenization)，然後離心，以從細胞中純化出總細胞RNA。沉澱核酸，且DNA藉由以DNA分解酶(DNase)處理及沉澱來移除。然後，RNA分子根據標準技術藉由在瓊脂糖凝膠(agarose gels)上的膠體電泳(gel electrophoresis)分離並轉移至硝化纖維素濾紙。之後，RNA藉由加熱固定化(immobilized)於濾紙上。特定RNA的偵測及量化使用適合的經標定DNA或RNA探針互補至所討論的RNA而完成。參見，例如 Molecular Cloning：A Laboratory Manual,J.Sambrook et al.,eds.,2nd edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989,Chapter 7，其揭露的全文與此併入作為參考。
在一些實施例中，微陣列(microarray)的使用為可行的。微陣列是核酸、蛋白質、小分子、細胞或可對複合生物樣品平行分析的其他物質的微觀、序化陣列。所述技術提供許多具有已知序列資訊的寡核苷酸(oligonucleotides)或多核苷酸(polynucleotides)作為探針，以找尋並與樣品中的互補股(complementary strands)雜交(hybridize)，因此藉由選擇性結合捕獲互補股。探針包含對目標miRNA序列的至少一部分互補或實質上互補的寡核苷酸或多核苷酸序列。「互補(complementary)」指的是在兩個核酸股的區域之間序列互補的廣義概念。已知的是，若殘基為胸腺嘧碇(thymine)或脲嘧啶(uracil)，則第一核酸區域的腺嘌呤殘基(adenine residue)可與反向平行於第一區域的第二核酸區域的殘基形成特定的氫鍵(「鹼基對(base pairing)」)。相似地，已知的是，若殘基為鳥嘌呤(guanine)，則第一核酸區域的胞嘧啶殘基(cytosine residue)可與反向平行於第一股的第二核酸股的殘基鹼基配對。當如果兩個區域以反向平行形式(fashion)排列，第一區域的至少一核苷酸殘基可與第二區域的殘基鹼基配對時，核酸的第一區域互補於相同或不同核酸的第二區域。較佳地，第一區域包含第一部份且第二區域包含第二部分，因此當第一部份及第二部分以反向平行形式排列，第一部分的核苷酸殘基的至少大約50%及較佳為至少大約75%、至少大約90%或至少大約95%可與第二部分中的核苷酸殘基鹼基配對。更佳地，所有第一部份的核苷酸殘基可與第二部分中的核苷酸殘基鹼基配對。
例如，miRNAs的微陣列分析可根據任何所屬技術領域習知方法完成。在一個實施例中，RNA從樣品的如CD14+單核球的細胞進行萃取，使用變性聚丙烯醯胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis)從所有RNA中尺寸選擇(size-selected)小的RNA(18~26個核苷酸)。寡核苷酸連接子附著於小的RNA 的5’及3’端，且產生的接合產物作為用於10個放大(amplification)循環的RT-PCR反應之模板。有義股(sense strand)PCR引子具有附著其之5’端的螢光團，因而螢光標記PCR產物的有義股。所述PCR產物變性，接著雜交至微陣列。PCR產物指的是作為與陣列上相應的miRNA捕獲探針序列互補的目標核酸，其將經由鹼基配對雜交至固定有捕獲探針的點。之後，當所述的點使用微陣列雷射掃瞄器激發時將發出螢光。然後，各點的螢光強度是使用數個陽性及陰性對照組及陣列數據標準化方法來評估特定miRNA的複製數量，其將產生特定miRNA的表現量之評估。關於本文所揭露的miRNA，探針可以與目標miRNA或多核苷酸序列100%互補。然而，由於探針可以特異性結合目標多核苷酸並從樣品捕獲目標多核苷酸，因而所述探針不需必須沿著目標多核苷酸的全長完全互補至目標多核苷酸。在一些實施例中，探針為與SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2至少90%、至少95%或100%相同的多核苷酸互補。
在一些實施例中，定量反轉錄聚合酶鏈鎖反應(quantitative RT-PCR)的使用為可行的。定量反轉錄聚合酶鏈鎖反應(qRT-PCR)為用來快速測定聚合酶鏈鎖反應的產物量之聚合酶鏈鎖的修改。qRT-PCR的目的通常為用於測定如miRNA的基因序列是否存在於樣品中，以及若其存在時，則在所述樣品中的複製量為何。可測定包含miRNA的核酸分子之表現的PCR之任何方法落在本揭露的範圍中。在所屬技術領域中已知的qRT-PCR方法的數種變化包含但不限制於經由瓊酯醣膠體電泳分析(agarose gel electrophoresis)、SYBR Green的使用(雙股DNA染劑)以及螢光報導探針(fluorescent reporter probe)的使用。
在乾癬性關節炎及無乾癬性關節炎的受試者中為不同表現的miRNA的鑑別允許以多種方式使用這些資訊。例如，可評估特定的治療方案(例如，以測定治療在具有乾癬性關節炎的受試者中是否有效)。乾癬性關節炎的診斷可藉由比較測試樣品的經萃取的CD14+單核球或蝕骨細胞的miRNA表現量與 非乾癬性關節炎樣品的經萃取的CD14+單核球或蝕骨細胞的已知表現miRNA表現量圖譜來完成或確認。進一步地，可進行一個或多個診斷或預測miRNA量的多重測定，且在表現量的持續時間變化可被用於測定、診斷、預斷(prognosis)或復發(relapse)。例如，可在起始時間測定特定的miRNA量，並在第二時間再次測定。在一些實施例中，從起始時間到第二時間的miRNA量的增加可診斷為乾癬性關節炎或給出預斷(given prognosis)。相同地，從起始時間到第二時間的miRNA量的減少可指示乾癬性關節炎或給出預斷。進一步地，一個或多個miRNA量的改變程度可與乾癬性關節炎的嚴重性相關。
在另一實施例中，提供一種決定在受試者中治療乾癬性關節炎之治療效果的方法，所述方法包含步驟，所述步驟比較：(a)在對受試者提供至少一部份的治療之前，在來自受試者的第一樣品中測量之經萃取的CD14+單核球之選自由miR-146a-5p及miR-941所組成之群組中的至少一種miRNA的表現量；以及(b)在對受試者提供至少一部份的治療之後，在取得自受試者的第二樣品中之經萃取的CD14+單核球之在步驟(a)的至少一種對應miRNA的表現量，其中，相對於在第一樣品之對應的miRNA之表現量，在第二樣品之至少一種miRNA之下降的表現量為治療係有效治療乾癬性關節炎的指示。在一個例示性實施例中，樣品為經萃取的CD14+單核球，且miRNA為miR-146a-5p、miR-941或其組合。
參見第1C圖及第1D圖，不受任何特定理論的束縛，miR-146a-5p及miR-941的表現量僅在來自PsA患者的經萃取CD14+單核球或蝕骨細胞中評估，而不在PsA受試者的周邊單核細胞中評估。因此，測量在周邊單核細胞而非CD14+單核球中的miR-146a-5p、miR-941或其組合的表現量不能提供PsA的診斷。一種或多種蝕骨細胞可為來自一種或 多種CD14+單核球的分化(differentiated)或來自PsA患者的關節液的蝕骨細胞。
在一個實施例中，套組包含至少一種用於定序或測量需要診斷或預測發展乾癬性關節炎之風險之受試者的樣品中選自由miR-146a-5p及miR-941所組成之群組中的至少一種miRNA的表現量的試劑。
在又一個實施例中，套組進一步包含培養基，所述培養基包含M-CSF、RANKL及TNF-α的培養基。培養基係用以分化經萃取的CD14+單核球為蝕骨細胞。
在一例示性實施例中，試劑為RT-PCR。在另一例示性實施例中，套組包含至少一種miRNA-特異性寡聚核苷酸探針(miRNA-specific oligonucleotide probe)，所述探針與SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2至少90%、至少95%或100%相同的多核苷酸互補。
本文所使用的「相同(identical)」指的是在相同核酸股的兩個區域之間或兩個不同核酸股的區域之間的核苷酸序列相似度。當在兩個區域的核苷酸殘基位置由相同的核苷酸殘基佔據，則在那個位置的區域為同源(homologous)。若各區域的至少一個核苷酸殘基位置由相同的殘基佔據時，第一區域係同源於第二區域。兩個區域之間的同源性係藉由相同核苷酸殘基佔據之兩個區域的核苷酸殘基位置的比例來表示。作為實例，具有核苷酸序列5'-ATTGCC-3'的區域與具有核苷酸序列5'-TATGGC-3'的區域共享50%的同源性。較佳地，第一區域包含第一部份且第二區域包含第二部分，因此各部分的核苷酸殘基位置的至少大約50%及較佳為至少大約75%、至少大約90%或至少大約95%藉由相同的核苷酸殘基佔據。更佳地，各部分的所有核苷酸殘基位置藉由相同的核苷酸殘基佔據。
提供用於在受試者中檢測乾癬性關節炎的方法，其包含下列步驟：測量在受試者的測試樣品中至少一種下列miRNA之表現量：miR-146a-5p及miR-941，其中相對於無乾癬性關節炎樣品中至少一種相應的miRNA的表現量，在測試樣品中至少一種miRNA之較高的表現量指示受試者具有乾癬性關節炎或具有發展乾癬性關節炎之風險。
本發明進一步提供用於在受試者中偵測及治療乾癬性關節炎的方法，其包含下列步驟：(a)測量在受試者的測試樣品中至少一種下列miRNA之表現量：miR-146a-5p及miR-941，其中相對於在無乾癬性關節炎樣品中至少一種相應的miRNA的表現量，在測試樣品中至少一種miRNA之較高的表現量指示受試者具有乾癬性關節炎或具有發展乾癬性關節炎之風險；以及(b)施予治療劑來治療乾癬性關節炎。治療劑之非限制性實例包含非固醇類抗發炎藥物(nonsteroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDs)、疾病修飾抗風濕病藥物(disease-modifying anti-rheumatic drugs，DMARDs)、免疫抑制劑(immunosuppressant)、TNF-α抑制劑、阿司匹林(apremilast，Otezla)、優特克單抗(Ustekinumab，Stelara)、塞庫金單抗(secukinumab，Cosentyx)、本文所揭露的miR-146a-5p抑制劑或miR-941抑制劑或其組合。
在一些實施例中，提供在有需要之受試者中治療乾癬性關節炎的方法，所述方法包含對受試者施予與SEQ ID NO：1至少90%、至少95%或100%相同的多核苷酸互補的miR-146a-5p抑制劑、及/或與SEQ ID NO：2至少90%、至少95%或100%相同的多核苷酸互補的miR-941抑制劑。
本發明之實施例藉由下列實例說明，其不應以任何方式解釋為對其之範圍強加限制。相反地，應被清楚理解的是，在不脫離本發明的精神下，所屬技術領域中具有通常知識者在閱讀本文之後，可採取各種其他實施例、修 改及其等效物。除非另有指出，在描述下列實例的研究中，係遵循習知之程序。一些程序將在以下描述以用於說明目的。
實例1
研究參與：進行病例對照研究，以調查在具有乾癬性關節炎(病例)的患者及沒有PsA的健康正常對照(NC)的患者中各種miRNAs的表現。
招收16個健康正常對照(NC)及31個具有PsA的患者(基於用於乾癬性關節炎的分類診斷標準(based on the Classification Criteria for Psoriatic Arthritis)，CASPAR,Taylor W et al.，關節炎及風濕病2006；54(8)：2665-73)到本研究中。
藉由定量PCR(qPCR)分析具有後續驗證的次世代定序法(Next-generation sequencing，NGS)用以探索潛在的PsA生物標記。來自2個NC及4個PsA的RNA樣品被用作來自NGS研究之候選miRNA的初始驗證。
藉由CD14+微珠(MicroBeads)(Miltenyi Biotec，台灣)萃取及分離在經招募的受試者的周邊血液中的CD14+單核球。RNA樣品萃取自經分離的CD14+單核球，接著以Agilent Bioanalyzer 2100(Agilent，美國)進行品質檢驗來選擇具有RNA完整數(integrity number value)≧8.0的RNA樣品。經選擇的RNA樣品以TruSeq Small RNA製備流程(Illumina,USA)製備。
來自2個經合併的(pooled)男性NC、2個經合併的女性NC、兩個經合併的具有PsA的男性患者及2個經合併的具有PsA的女性患者的RNA庫以Illumina NGS平台定序，接著藉由miRSeq8分析來描繪微(mi)-RNA的表現。經製備的擴增子(amplicons)以V3150-循環的定序試劑在MiSeq facility(Illumina)上定序，以產生51-nt的單端測序(single-end reads)。進行群分析(Clusterd analysis)來檢驗PsA及NC樣品的miRNA表現圖譜。
用NGS檢驗的RNA樣品中，共有大約有27.7百萬個原始讀值(raw reads)，且每個樣品總量有平均6.9百萬個讀值。所產生的NGS數據以用以miRNA定量及定序品質的評估之miRSeq(Pan CT.et al.,Biomed Res Int 2014：462135)分析。miRSeq以百萬分之一的轉錄數(TPM)表示miRNA表現量。如表1所示，13個miRNAs在至少一個樣品中具有高於1000的TPM值且平均表現率(正常對疾病或疾病對正常)為至少1.5。
Figure 108126131-A0305-02-0015-1
在13個miRNAs當中，miR-941的表現在具有PsA的患者中增加。
qPCR在2個NC樣品及4個PsA樣品中進行以進一步驗證NGS數據。相較於來自NCs的那些表現，顯示miR-941及miR-146a-5p的表現之qPCR分析在具有PsA的患者中增加(參見第1A圖)。
SVM為一種用於解決二元分類問題的機器學習演算法(Machine learning algorithm)，如治療對於(versus)對照、或疾病對於正常。示於第1B圖中， 在NC及PsA患者中的miR-941及miR-146a-5p的DCt值，係用於以5倍交叉驗證訓練SVM分類，以消除過度擬合(overfitting)及低度擬合(underfitting)。
第1C圖及第1D圖顯示在來自具有乾癬性關節炎之患者的經萃取的CD14+單核球(PsA CD14+)中miR-941及miR-146a-5p的表現上升，而在來自具有乾癬性關節炎之患者的周邊單核細胞(PsA CD14-)則沒有上升。
表2顯示miR-146a-5p及miR-941的組合在PsA診斷中引出在靈敏度、特異性及接收者操作特性(receiver operating characteristic)下的面積(area under the receiver operating characteristic，auROC)值之無法預期的協同作用。
Figure 108126131-A0305-02-0016-4
測量在PsA治療(包含阿達木單抗(adalimumab)、依那西普(etanercept)、戈利木單抗(golimumab)、優特克單抗或塞庫金單抗)前及治療6個月後之來自16個NC和11個PsA患者之在經萃取的CD14+單核球中的miR-941及miR-146a-5p的表現。
11位PsA患者在治療28周後具有顯著的症狀緩解(觸痛關節及腫脹關節降低)(參見第2圖的圖面A及B)。在6個月的治療之後之11位PsA患者的經萃取CD14+單核球中的miR-941和miR-146a-5p的表現顯著的降低(第2圖的圖面C及D)。在經萃取的CD14+單核球中的miR-941及miR-146a-5p的表現下降與在PsA患者中症狀緩解相關。
在從經萃取的CD14+單核球分化之蝕骨細胞中之miR-941和miR-146a-5p的表現量。
CD14+單核球係萃取自2位NC及兩位PsA患者在PsA治療之前及治療6個月之後的周邊血液。經萃取的CD14+單核球以M-CSF 50ng/ml培養3天，接著以100ng/ml RANKL及100ng/ml TNF-α培養9天使衍生分化之蝕骨細胞。已知蝕骨細胞在PsA中造成關節損壞(joint destruction)。如第3A圖及第3B圖中所繪示，在成功治療前後的PsA患者之CD14+單核球衍生的蝕骨細胞中miR-941及miR-146a-5p的表現高於NC(p<0.05及p<0.05)。結果顯示，無論疾病活性(diseases activity)，在CD14+單核球衍生的蝕骨細胞中miR-941及miR-146a-5p的表現較高。
實例2
進行miR-941抑制劑及miR-146a-5p抑制劑對來自於具有PsA患者的CD14+單核球衍生的蝕骨細胞的影響之體外(in vitro)評估。
CD14+單核球係萃取自PsA患者的周邊血液，並以M-CSF培養72小時。經培養的CD14+單核球以下列流程處理：
(1)無miRNA轉染：每3天以TNF-α及RANKL培養CD14+單核球共9天以分化成蝕骨細胞。
(2)負對照miRNA轉染：CD14+單核球以負對照miRNA(SEQ ID NO：3)轉染6小時，然後每3天以TNF-α及RANKL培養CD14+單核球共9天以分化成蝕骨細胞。
(3)miR-941抑制劑轉染：CD14+單核球以miR-941抑制劑轉染(SEQ ID NO：4)6小時，然後每3天以TNF-α及RANKL培養CD14+單核球共9天以分化成蝕骨細胞。
(4)miR-146a-5p抑制劑轉染：CD14+單核球以miR-146a-5p抑制劑(SEQ ID NO：5)轉染6小時，然後每3天以TNF-α及RANKL培養CD14+單核球共9天以分化成蝕骨細胞。
如第4A至4E圖所繪示，相較於負對照miR轉染(第4B圖)及無miR轉染轉染組(第4A圖)，miR-941抑制劑(第4C圖)或miR-146a-5p抑制劑(第4D圖)顯著降低CD14+單核球衍生的蝕骨細胞的數目。因此，miR-146a-5p或miR-941的抑制劑降低在PsA患者中的蝕骨細胞生成(osteoclastogenesis)，且可被用於治療PsA。
實例3
被包含的病例對照研究被引導以檢驗在40位健康正常對照(NC)、40位具有乾癬不具有關節炎的患者(PsO)及40位具有乾癬性關節炎之患者(PsA)中之miR146a-5p及miR941的表現。
PsA的診斷及miRNAs的表現係根據準則及實例1中的步驟被測量。第5A圖及第5B圖顯示miR146a-5p及miR941的表現顯著地高於NC及PsO的表現量。此結果顯示miR146a-5p及miR941之增加的表現可預測在具有乾癬的患者中發展關節炎的風險。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
無。

Claims (9)

  1. 一種用於在受試者中偵測或預測發展乾癬性關節炎之風險的體外方法，其包含：在該受試者的一測試樣品中測量選自由miR-146a-5p及miR-941所組成之群組中的至少一種miRNA的表現量的步驟，其中該測試樣品為CD14+單核球(monocyte)，當相對於在無乾癬性關節炎樣品中的至少一種對應的miRNA的表現量，在該測試樣品中的該至少一種miRNA具有較高的表現量係指示該受試者具有乾癬性關節炎或具有發展乾癬性關節炎的風險。
  2. 如請求項1所述之方法，其中該miRNA的表現量藉由即時聚合酶連鎖反應(real-time PCR)偵測。
  3. 如請求項1所述之方法，其中該miRNA的表現量藉由與SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2相同的寡聚核苷酸探針偵測。
  4. 一種用於在受試者中偵測乾癬性關節炎或預測發展乾癬性關節炎之風險的套組，其包含：至少一微珠，用以從該受試者的一樣品中萃取CD14+單核球；以及一試劑，用於定序或測量選自由miR-146a-5p及miR-941所組成之群組中的至少一種miRNA的表現量。
  5. 如請求項4所述之套組，其進一步包含一培養基，該培養基包含M-CSF、RANKL及TNF-α。
  6. 一種miR抑制劑用於製備治療乾癬性關節炎的藥物的用途， 其包含：施予與SEQ ID NO：1多核苷酸互補之一miR-146a-5p抑制劑、或者施予與SEQ ID NO：2多核苷酸互補之一miR-941抑制劑至一受試者的步驟。
  7. 如請求項6所述之用途，其中該miR-146a-5p抑制劑為SEQ ID NO：5。
  8. 如請求項6所述之用途，其中該miR-941抑制劑為SEQ ID NO：4。
  9. 一種用於在受試者中決定治療乾癬性關節炎之效果的方法，其包含下列步驟：(a)在對該受試者提供至少一部份的該治療之前，測量在取得自該受試者的一第一樣品中選自由miR-146a-5p及miR-941所組成之群組中的至少一種miRNA的表現量；以及(b)在對該受試者提供至少一部份的該治療之後，測量在取得自該受試者的一第二樣品中之在步驟(a)的至少一種對應miRNA的表現量，其中，相對於在該第一樣品中對應之miRNA，在該第二樣品中至少一種miRNA之下降的表現量為該治療係有效治療乾癬性關節炎的指示，其中該第一樣品及該第二樣品為CD14+單核球。
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