CN114107487B - 一种可用于诊断脑卒中的产品 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种可用于诊断脑卒中的产品，所述的产品包含能够检测样本中生物标志物的表达水平的试剂。本发明所涉及的生物标志物在正常人与脑卒中患者中差异表达，且具有较高的诊断效能，提示该生物标志物能够实现对脑卒中的有效判断。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种可用于诊断脑卒中的产品。
背景技术
到2050年，全球65岁以上人口将达到15亿，而对于年龄超过60岁的人群来说，脑卒中是导致死亡的第二位原因，也是致残的首位原因。而在我们的国家，第三次死因回顾性抽样调查报告显示，脑血管病已跃升至我国居民死亡原因的第一位(陈竺，全国第三次死因回顾抽样调查报告[M].中国协和医科大学出版社，2008:10-17.)。
生物标记物的临床意义，已经在许多疾病的诊治过程中得到了证明，例如心肌梗死患者进行的肌钙蛋白检测，心衰患者的利尿钠肽及肺炎患者的降钙素原检测等等。尽管已经进行很多研究，但是目前还没有一种生物标记物可以在灵敏度及特异度等方面达到要求，可用于脑卒中的诊断。
首先，要想具有一定临床意义，指导临床实践，用于辅助诊断脑卒中的生物标记物需具备以下条件：(1)高灵敏度，确保所有脑卒中患者可以被及时诊断以获得有效治疗；(2)可以进行方便、快速的检测，才可以在缺少影像学检查设备的基层医疗机构广泛普及。血脑屏障的存在曾被认为是利用外周血检测生物标记物的阻碍，但是脑卒中事件发生以后，血脑屏障发生破坏，脑源性生物标记物随之释放到外周循环中，相对于脑脊液等其它组织，血液采集更方便，适合作为诊断性生物标记物的检测对象。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可用于诊断脑卒中的产品，为脑卒中诊断提供新途径。
为实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种试剂，所述试剂能够检测样本中生物标志物的表达水平，所述的生物标志物包括CEACAM6、ECHDC3、FCGR1A中的两种或三种。
术语“检测”包括任何检测手段，包括直接和间接检测。
术语“样本”在用于本文时指获得自或衍生自感兴趣的受试者和/或个体的组合物，其包含有待根据例如物理、生化、化学和/或生理特点来表征和/或鉴定的细胞和/或其它分子实体。样本包括但不限于，血液、玻璃体液、淋巴液、滑液、精液、羊水、乳、尿液、脑脊髓液、唾液、痰、泪、汗液、粘液、及其组合。
在本发明的具体实施例中，所述的样本为血液。
如本文中使用的，术语“生物标志物”指可在样品中检测的指示物，例如预测性、诊断性和/或预后性的指示物。生物标志物可以充当由特定的分子、病理学、组织学和/或临床特征表征的特定疾病或病症亚型的指示物。在一些实施方案中，生物标志物是一种基因。生物标志物包括但不限于，多核苷酸(例如DNA和/或RNA)、多核苷酸拷贝数目改变(例如DNA拷贝数)、多肽、多肽和多核苷酸修饰(例如翻译后修饰)、碳水化合物和/或基于糖脂的分子标志物。
本发明中，生物标志物例如CEACAM6(Gene ID:4680)、ECHDC3(Gene ID:79746)、FCGR1A(Gene ID:2209)包括基因及其编码的蛋白及其同源物，突变，和同等型。该术语涵盖全长，未加工的生物标志物，以及源自细胞中加工的任何形式的生物标志物。该术语涵盖生物标志物的天然发生变体(例如剪接变体或等位变体)。
术语“表达的水平”或“表达水平”一般可互换使用，一般指生物学样品中生物标志物的量。“表达”一般指信息(例如基因编码和/或表观遗传)转化成细胞中存在并运行的结构的过程。因此，如本文中使用的，“表达”可以指转录成多核苷酸、翻译成多肽、或甚至多核苷酸和/或多肽修饰(例如多肽的翻译后修饰)。转录的多核苷酸的、翻译的多肽的、或多核苷酸和/或多肽修饰(例如多肽的翻译后修饰)的片段也应视为表达的，无论它们是源自通过可变剪接生成的转录物或经过降解的转录物，或者是源自多肽的翻译后加工(例如通过蛋白水解)。
在任何方法的一些实施方案中，升高的表达指生物标志物(例如蛋白质或核酸(例如基因或mRNA))水平中相比于参照样品、参照细胞、参照组织、对照样品、对照细胞或对照组织的任意的约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的总体增加，其通过标准的本领域已知方法诸如本文中描述的那些检测。在某些实施方案中，升高的表达指样品中生物标志物的表达水平/量的增加，其中所述增加是参照样品、参照细胞、参照组织、对照样品、对照细胞或对照组织中相应生物标志物表达水平/量的任意的至少约1.5倍、1.75倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、25倍、50倍、75倍或100倍。在一些实施方案中，升高的表达指相比参照样品、参照细胞、参照组织、对照样品、对照细胞、对照组织或内部对照(例如持家基因)高约1.5倍、约1.75倍、约2倍、约2.25倍、约2.5倍、约2.75倍、约3.0倍或约3.25倍的总体增加。
在任何方法的一些实施方案中，降低的表达指生物标志物(例如蛋白质或核酸(例如基因或mRNA))水平中相比于参照样品、参照细胞、参照组织、对照样品、对照细胞或对照组织的任意的约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的总体降低，其通过标准的本领域已知方法诸如本文中描述的那些检测。在某些实施方案中，降低的表达指样品中生物标志物的表达水平/量的降低，其中所述降低是参照样品、参照细胞、参照组织、对照样品、对照细胞或对照组织中相应生物标志物表达水平/量的任意的至少约0.9倍、0.8倍、0.7倍、0.6倍、0.5倍、0.4倍、0.3倍、0.2倍、0.1倍、0.05倍或0.01倍。
本发明所述的试剂包括在mRNA水平或蛋白水平上检测所述生物标志物的表达水平的试剂。
进一步，所述试剂包括通过聚合酶链反应、实时荧光定量逆转录多聚酶链反应、逆转录聚合酶链反应、竞争性聚合酶链反应、核酸酶保护分析、原位杂交法、核酸微阵列、RNA印迹或DNA芯片的方法进行检测mRNA水平的试剂。
进一步，所述试剂包括通过免疫印迹、酶联免疫吸附试验、放射免疫分析、放射免疫扩散法、免疫电泳、组织免疫染色、免疫沉淀分析法、补体固定分析法、荧光激活细胞分选、质量分析或蛋白质微阵列的方法进行检测蛋白水平的试剂。
进一步，所述的试剂包括：
特异性识别CEACAM6、ECHDC3或FCGR1A基因的探针；、
特异性扩增CEACAM6、ECHDC3或FCGR1A基因的引物；
特异性结合CEACAM6、ECHDC3或FCGR1A编码的蛋白的结合剂。
术语“引物”是指短核酸序列，其具有短的游离羟基的核酸序列，能够与互补的模板形成碱基对，其充当用于模板链复制的起点。引物可以在适当的缓冲液及温度下，在用于聚合反应(即，DNA聚合酶或逆转录酶)的试剂及不同的4种核苷三磷酸的存在下诱发DNA合成。
术语“探针”是指对应于能够特异性结合mRNA的数个碱基至数百个碱基的核酸片段，例如RNA或DNA等。由于被标记，因而可以确认是否存在特定的mRNA。探针能够以寡核苷酸探针、单链DNA探针、双链DNA探针、RNA探针等形式制造。在本发明中，利用与CEACAM6、ECHDC3或FCGR1A基因互补的探针进行杂交，并且可通过是否杂交来诊断上述基因的表达水平。可以基于本技术领域中公知的技术来更改用于合适探针的选择及杂交条件，在本发明中，对此没有特别限制。
本发明的引物或探针可以使用亚磷酰胺固相载体方法或其他公知的方法化学合成。这种核酸序列可以利用本领域中公知的多种手段来进行变形。这种变形的非限制性实施例包括甲基化、封装、天然核苷酸的一种以上的同源物的取代以及核苷酸之间的变形，例如，变形为不带电的连接体(例：膦酸甲酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)或带电的连接体(例：硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯等)。
在本发明中，可通过优化步骤在一系列过程中确定使探针与cDNA分子杂交的合适条件。该步骤由本领域普通技术人员通过一系列过程进行，以建立用于在研究室中使用的协议。例如，温度、成分浓度、杂交及洗涤时间、缓冲液成分及其pH以及离子强度等条件取决于探针的长度、GC量及靶核苷酸序列等各种因素。
作为可选择的实施方案，蛋白的结合剂包括但不限于是肽、肽模拟物、aptamer、spiegelmer、darpin、锚蛋白重复蛋白、Kunitz型域、抗体、单域抗体和单价抗体片段。
作为一种优选地实施方案，蛋白的结合剂为抗体。
第二方面，本发明提供了一种试剂盒，所述的试剂盒包括本发明第一方面所述的试剂。
本发明提供的是诊断试剂盒，该试剂盒用于确定生物标志物的水平(其中序列任选地包含尿嘧啶以代替所公开的胸腺嘧啶中的一种、多于一种或全部)及其组合。试剂盒可以包括适于选择性检测来源于受试者的样品中用于诊断脑卒中的生物标志物或生物标志物组的存在的材料和试剂。例如，在一个实施方案中，该试剂盒可以包括与生物标志物特异性杂交的试剂。这类试剂可以是适于检测生物标志物的形式的核酸分子，例如，探针或引物。该试剂盒可以包括用于进行测定以检测一种或多种生物标志物的试剂，例如，可以用于在qPCR反应中检测一种或多种生物标志物的试剂。该试剂盒同样可以包括用于检测一种或多种生物标志物的微阵列。
在进一步的实施方案中，试剂盒可以含有标记或产品插页形式的合适操作参数的说明书。例如，说明书可以包括关于如何收集样品，如何确定样品中一种或多种生物标志物的水平，或如何将样品中一种或多种生物标志物的水平与受试者的脑卒中状态相关联的信息或指导。
在另一个实施方案中，试剂盒可以含有一个或多个容器，其具有生物标志物样品，以用作参比标准，合适的对照，或用于测定的校准以检测测试样品中的生物标志物。
第三方面，本发明提供了一种芯片，所述的芯片包括本发明第一方面所述的试剂。
术语“芯片”可指具有附着有吸附剂的、一般为平面的表面的固体基底。生物芯片的表面可包含多个可寻址的位置，其中每个位置可结合有吸附剂。生物芯片可适合于接合探针接口，并因此用作探针。蛋白质生物芯片适用于捕获多肽，并可包含在可寻址位置处附着有层析或生物特异性吸附剂的表面。微阵列芯片一般用于DNA和RNA基因表达检测。
第四方面，本发明提供了一种组合物，所述的组合物包括CEACAM6的抑制剂、ECHDC3的抑制剂、FCGR1A的抑制剂中的两种或三种。
所述的抑制剂选自：以所述基因为靶序列、且能够抑制所述基因表达或基因转录的干扰分子，包括：shRNA(小发夹RNA)、小干扰RNA(siRNA)、dsRNA、微小RNA、反义核酸，或能表达或形成所述shRNA、小干扰RNA、dsRNA、微小RNA、反义核酸的构建物。
进一步，所述的组合物包含活性成分，加上一种或多种药物可接受的载体、稀释剂、填充剂、结合剂及其它赋形剂，这依赖于给药方式及所设计的剂量形式。本领域枝术人员已知的治疗惰性的无机或有机的载体包括(但不限于)乳糖、玉米淀粉或其衍生物、滑石、植物油、蜡、脂肪、多羟基化合物例如聚乙二醇、水、蔗糖、乙醇、甘油，诸如此类，各种防腐剂、润滑剂、分散剂、矫味剂。保湿剐、抗氧化剂、甜味剂、着色剂、稳定剂、盐、缓冲液诸如此类也可加入其中，这些物质根据需要用于帮助配方的稳定性或有助于提高活性或它的生物有效性或在口服的情况下产生可接受的口感或气味，在这种组合物中可以使用的制剂可是其原始化合物本身的形式，或任选地使用其药物学可接受的盐的形式。如此配制的组合物根据需要可选择本领域技术人员已知的任何适当的方式把药物进行给药。使用组合物时，是将安全有效量的本发明的药物施用于人。
第五方面，本发明提供了一种诊断对象是否患有脑卒中或预测对象是否存在患脑卒中的风险的系统或装置，所述的系统/装置包括：
分析单元，所述单元适于测量对象样本中生物标志物的量；和
评估单元，其包含存储的参考和数据处理器，所述数据处理器已经实现了用于比较分析单元测量的生物标志物的量与存储的参考的算法，由此诊断对象是否患有脑卒中或预测对象是否存在患脑卒中的风险；
所述的生物标志物包括CEACAM6、ECHDC3、FCGR1A中的两个或三个。
术语“诊断”在本文中用于指对分子或病理学状态、疾病或疾患(例如脑卒中)的鉴定或分类。
进一步，所述的脑卒中包括缺血性脑卒中、出血性脑卒中。
进一步，所述的脑卒中为缺血性脑卒中。
进一步，所述的缺血性脑卒中包括大动脉粥样硬化性卒中、心源性脑栓塞、小动脉闭塞性卒中、或其他原因引发的缺血性卒中。
进一步，所述的缺血性脑卒中为心源性脑栓塞。
第六方面，本发明提供了一种计算机可读存储介质，其上存储有计算机程序，所述计算机程序被处理器执行时实现本发明第五方面所述的系统/装置。
第七方面，本发明提供了如下任一项所述的应用：
(1)本发明第一方面所述的试剂在制备诊断脑卒中的产品中的应用；
(2)本发明第二方面所述的试剂盒在制备诊断脑卒中的产品中的应用；
(3)本发明第三方面所述的芯片在制备诊断脑卒中的产品中的应用；
(4)本发明第四方面所述的组合物在制备预防或治疗脑卒中的药物中应用；
进一步，与正常人相比，CEACAM6、ECHDC3或FCGR1A在脑卒中患者中的表达上调。
进一步，所述的脑卒中包括缺血性脑卒中、出血性脑卒中。
进一步，所述的脑卒中为缺血性脑卒中。
进一步，所述的缺血性脑卒中包括大动脉粥样硬化性卒中、心源性脑栓塞、小动脉闭塞性卒中、或其他原因引发的缺血性卒中。
进一步，所述的缺血性脑卒中为心源性脑栓塞。
附图说明
图1为CEACAM6差异表达的箱线图；
图2为ECHDC3差异表达的箱线图；
图3为FCGR1A差异表达的箱线图；
图4为CEACAM6诊断心源性脑栓塞的ROC曲线图；
图5为ECHDC3诊断心源性脑栓塞的ROC曲线图；
图6为FCGR1A诊断心源性脑栓塞的ROC曲线图；
图7为CEACAM6和ECHDC3联合诊断心源性脑栓塞的ROC曲线图；
图8为ECHDC3和FCGR1A联合诊断心源性脑栓塞的ROC曲线图；
图9为CEACAM6和FCGR1A联合诊断心源性脑栓塞的ROC曲线图；
图10为CEACAM6+ECHDC3+FCGR1A联合诊断心源性脑栓塞的ROC曲线图。
具体实施方式
以下结合附图对本申请的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本申请，并不用于限制本申请。
实施例1高通量测序分析
1、样本采集
收集4例脑卒中患者和4例健康对照者的血液样本。
1.1脑卒中患者纳入标准：
(1)诊断为脑卒中；
(2)尚未接受药物方式或手术等任何针对脑卒中的治疗；
(3)无感染性、自身免疫性或严重慢性疾病。
1.2健康对照者的纳入标准：
(1)男性或女性志愿者，年龄在20到90岁之间；
(2)身体健康，没有任何慢性、感染性或遗传学疾病；
(3)近期没有服用常规处方药；
(4)没有献血、怀孕，在研究开始前的3个月内没有接种过疫苗；
(5)非过敏体质；
(6)经常规体检确认身体健康。
2、实验方法
2.1血液总RNA的提取
使用PAXgene血液RNA提取试剂盒(PAXgene Blood RNA Kit)提取外周血总RNA。
2.2样品检测
使用Agilent 2100Bioanalyzer(Agilent RNA 6000Nano Kit)检测total RNA的浓度、RIN值、28S/18S和片段大小。
2.3文库的构建与转录组测序
1)DNase消化去除DNA：利用DNase I消化Total RNA样品中存在的DNA片段，磁珠纯化回收反应产物，最后溶解于DEPC水。
2)去除rRNA：取消化好的Total RNA样品，使用试剂盒去除rRNA，去除之后进行Agilent 2100检测，验证rRNA去除效果；
3)RNA打断：取上一步样品，加入打断Buffer，置于PCR仪中进行热打断，打断到130-160nt；
4)反转录一链的合成：向打断后的样品中加入适量引物，充分混匀后在Thermomixer适温反应一定时间，使之打开二级结构并与引物结合，再加入提前配制的一链合成反应体系Mix，在PCR仪上按相应程序合成一链cDNA；
5)反转录二链的合成：配制二链合成反应体系，在Thermomixer上适温反应一定时间，合成二链cDNA，反应产物用磁珠进行纯化回收。产物用磁珠进行纯化回收；
6)末端修复：配制末端修复反应体系，在Thermomixer中适温反应一定时间，在酶的作用下，对反转录得到的cDNA双链的粘性末端进行修复。末端修复产物用磁珠进行纯化回收，最后将样品溶于EB Solution；
7)cDNA末端加“A”：配制加“A”反应体系，在Thermomixer中适温反应一定时间，在酶的作用下，使末端修复的产物cDNA的3’末端加上A碱基；
8)cDNA adapter的连接：配制接头连接反应体系，在Thermomixer中适温反应一定时间，在酶的作用下，使接头与A碱基连接，产物用磁珠进行纯化回收。
9)PCR反应及产物回收：配制PCR反应体系，选择适当的PCR反应程序，对上步骤得到的产物进行扩增。对PCR产物进行磁珠纯化回收。回收产物溶于EB溶液中。贴上标签，文库制备至此完成。
10)文库质量检测：使用Agilent 2100Bioanalyzer(Agilent DNA 1000Reagents)检测文库的片段大小及浓度。
11)PCR产物环化：将PCR产物变性为单链后，配制环化反应体系，充分混匀适温反应一定时间，得到单链环形产物，消化掉未被环化的线性DNA分子后，即得到最终的文库。
12)上机测序：单链环状DNA分子通过滚环复制，形成一个包含200多个拷贝的DNA纳米球(DNB)。将得到的DNBs采用高密度DNA纳米芯片技术，加到芯片上的网状小孔内。通过边合成边测序的方法，得到50bp/100bp的测序读长。
2.4测序数据质量控制
对原始测序数据进行过滤，从而得到高质量的测序数据(clean data)，步骤如下：去除reads中的adapter序列；剪切前去除5’端含有非AGCT的碱基；修剪测序质量较低的reads末端(测序质量值小于Q20)；去除含N的比例达到10％的reads；舍弃去adapter及质量修剪后长度小于25bp的小片段。
2.5与参考基因组比对
使用hisat2分析软件将测序数据比对到参考基因组上。参考基因组来自于Ensembl数据库。
2.6基因表达水平分析
通过比对到参考基因组区域的序列(clean reads)的数量来计算基因的表达水平。使用Stringtie根据Hisat2软件的比对结果，计算每个基因/转录本在样本中的FPKM值，以该值作为基因/转录本在样本中的表达量。
2.7mRNA差异表达分析
使用DESeq2比较对照组跟疾病组mRNA的表达差异，差异分析步骤如下：首先对原始的read count进行标准化(normalization)，主要是对测序深度的校正；通过统计学模型进行假设检验概率(P-value)的计算，进行多重假设检验校正(BH)，得到padj值(错误发现率)，差异表达基因的筛选标准为：pvalue<0.05和|log2foldchange|>1。
3、结果与分析
与对照组相比，本发明所涉及的生物标志物CEACAM6、ECHDC3、FCGR1A在脑卒中患者中表达显著上调，差异具有统计学意义。
实施例2生物标志物表达情况
以来源于数据库的患有心源性脑栓塞受试者(n＝23，女性11例，男性12例)、无症状性血管疾病史的受试者(n＝23；11名女性，12名男性)的血液作为样本(数据集为GSE58294)，对基因表达数据进行差异分析。把对应到多个基因的探针去掉，然后有多个探针对应的基因只保留平均表达量最大的一个探针。对数据集scale标准化。差异分析使用工具为R-4.0.5，采用metaMA、limma包分析，meta分析中p值合并所用方法为inverse normalmethod。metaMA包对P、FDR值计算的描述(Calculates differential expression p-values and effect sizes from data either from classical or moderated t-tests(Limma,SMVar)for study and combines these p-values by the inverse normalmethod，FDR值计算：Benjamini Hochberg threshold.By default,the False DiscoveryRate is controlled at 5％)。
差异表达基因筛选标准：adj.P.Val<0.05&|logFC|>1，得到208个差异表达基因，本发明所涉及的生物标志物在心源性脑栓塞受试者中的表达情况如表1、图1-3所示，所述生物标志物在疾病组中均是表达上调的，差异具有统计学意义。
表1生物标志物在心源性脑栓塞患者血液样本中的表达情况
| Symbol | logFC | P.Value | adj.P.Val | UpDown |
| CEACAM6 | 1.016 | 0.001 | 0.006 | Up |
| ECHDC3 | 1.258 | 0.000 | 0.000 | Up |
| FCGR1A | 1.096 | 0.000 | 0.000 | Up |
实施例3诊断效能
受试者操作特征曲线(receiver operating characteristic,ROC)能够直观地鉴别各诊断指标的诊断效能，ROC曲线越靠近左上角，曲线下面积(area under curve,AUC)越大，诊断价值越高(参考The meaning and use of the area under a receiveroperating characteristic(ROC)curve.[J].Radiology,1982)。本发明使用R语言pROC对上述基因进行ROC诊断分析，以筛选具有诊断价值的生物标志物。
结果：
AUC＞0.5的情况下，AUC值越接近1，表明诊断标志物的诊断效果越好。基于GEO数据集，本发明利用R语言绘制了本发明所涉及的基因的ROC曲线。结果如图4-6所示，本发明所述的基因的AUC值基本位于0.65～0.90，其中，CEACAM6(AUC＝0.689)，ECHDC3(AUC＝0.829)，FCGR1A(AUC＝0.863)，进一步分析生物标志物组合的诊断效能，如图7-10，表2所示。
表2生物标志物组合诊断效能
与单个生物标志物相比，生物标志物组合具有更好的诊断效能。上述结果证明，本发明所涉及的生物标志物可用于诊断心源性脑栓塞。
以上结合附图详细描述了本申请的优选实施方式，但是，本申请并不限于上述实施方式中的具体细节，在本申请的技术构思范围内，可以对本申请的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本申请的保护范围。另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本申请对各种可能的组合方式不再另行说明。此外，本申请的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本申请的思想，其同样应当视为本申请所公开的内容。
Claims (9)
1.一种诊断对象是否患有脑卒中或预测对象是否存在患脑卒中的风险的系统或装置，其特征在于，所述的系统/装置包括：
分析单元，所述单元适于测量对象样本中生物标志物的量；和
评估单元，其包含存储的参考和数据处理器，所述数据处理器已经实现了用于比较分析单元测量的生物标志物的量与存储的参考的算法，由此诊断对象是否患有脑卒中或预测对象是否存在患脑卒中的风险；
所述的生物标志物包括CEACAM6、ECHDC3、FCGR1A中的两个或三个。
2.一种计算机可读存储介质，其特征在于，其上存储有计算机程序，所述计算机程序被处理器执行时实现权利要求1所述的系统/装置。
3.试剂在制备诊断脑卒中的产品中的应用，所述试剂能够检测样本中生物标志物的表达水平，所述的生物标志物包括CEACAM6、ECHDC3、FCGR1A中的两种或三种。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂包括通过聚合酶链反应、核酸酶保护分析、原位杂交法、核酸微阵列、RNA印迹或DNA芯片的方法进行检测mRNA水平的试剂。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述聚合酶链反应包括实时荧光定量逆转录多聚酶链反应、逆转录聚合酶链反应、竞争性聚合酶链反应。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂包括通过免疫印迹、酶联免疫吸附试验、放射免疫分析、放射免疫扩散法、免疫电泳、组织免疫染色、免疫沉淀分析法、补体固定分析法、荧光激活细胞分选、质量分析或蛋白质微阵列的方法进行检测蛋白水平的试剂。
7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的试剂包括：
特异性识别CEACAM6、ECHDC3或FCGR1A基因的探针；
特异性扩增CEACAM6、ECHDC3或FCGR1A基因的引物；
特异性结合CEACAM6、ECHDC3或FCGR1A编码的蛋白的结合剂。
8.试剂盒在制备诊断脑卒中的产品中的应用，所述试剂盒包括权利要求3-7任一项中所述的试剂。
9.芯片在制备诊断脑卒中的产品中的应用，所述芯片包括权利要求3-7任一项中所述的试剂。
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