CN112877421B - 一种与瘢痕相关的生物标志物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种与瘢痕相关的生物标志物及其应用，所述的生物标志物为IGFL4。在具体实施例中，IGFL4在瘢痕患者组织样本和邻近正常组织中存在差异表达，且ROC曲线显示其具有较高的诊断效能，提示IGFL4可用于瘢痕的诊断。

Description

一种与瘢痕相关的生物标志物及其应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种生物标志物，具体涉及一种与瘢痕相关的生物标志物及其应用。

背景技术

人的皮肤作为最大的器官担负着保护人体内部结构和各大脏器系统的重要功能，同时也在细胞代谢和生长增殖等生理过程发挥着调节作用。瘢痕是一种创伤愈合的结果，瘢痕在过度增生等情况下，引起机体不适或造成畸形及功能障碍时，被认为是病理现象，称之为病理性瘢痕。病理性瘢痕是基因的表达发生变化，从而影响到碱基的转换。瘢痕具有独特的生长特性及临床表现，其增殖凋亡失衡时导致不断增生而且难以退化的细胞学基础。

瘢痕从外观和机体功能方面均可给患者带来心理和生理上的痛苦，严重者甚至影响患者自信心，使其产生自卑心理。因此，瘢痕的形成与防治已成为医学研究的一个重要领域，其防治措施和客观可靠的临床评判方法仍是热点和难点问题之一。在瘢痕防治及基础研究中，准确可靠的瘢痕评判方法对其临床诊断、疗效判定及比较研究均有着极其重要的作用。但迄今为止，仍缺乏简便有效、具有足够客观性和可重复性的量化评判指标。

发明内容

针对目前现有技术存在的不足，本发明研究了瘢痕中呈现差异表达的基因，从而为瘢痕的诊断和治疗提供了检测和靶向位点，同时为揭示瘢痕的发病机制提供了理论基础。

本发明第一方面提供了一种生物标志物在制备瘢痕诊断产品中的应用，所述的生物标志物包括IGFL4。

进一步，所述的瘢痕包括生理性瘢痕、病理性瘢痕。

进一步，所述的瘢痕为病理性瘢痕。

进一步，所述的病理性瘢痕包括瘢痕疙瘩、增生性瘢痕、萎缩性瘢痕。

进一步，所述的病理性瘢痕为增生性瘢痕。

进一步，利用所述的产品检测受试者样本中的IGFL4的表达水平，与正常人相比，受试者样本中的IGFL4的表达水平下调，则诊断该受试者为瘢痕患者。

进一步，所述的样本为组织。

进一步，所述的产品包括通过PCR、原位杂交或高通量测序平台检测IGFL4的表达水平的试剂。

进一步，所述的PCR包括RT-PCR、qPCR。

本发明第二方面提供了一种诊断瘢痕的产品，所述的产品包括检测样本中IGFL4的表达水平的试剂。

进一步，所述的瘢痕包括生理性瘢痕、病理性瘢痕。

进一步，所述的瘢痕为病理性瘢痕。

进一步，所述的病理性瘢痕包括瘢痕疙瘩、增生性瘢痕、萎缩性瘢痕。

进一步，所述的病理性瘢痕为增生性瘢痕。

进一步，所述的产品包括试剂盒、芯片或试纸。

进一步，所述的试剂选自：

特异性识别IGFL4的探针；

或特异性扩增IGFL4的引物；

或特异性结合IGFL4编码的蛋白的结合剂。

进一步，所述的引物的序列如SEQ ID NO.1、2所示。

本发明第三方面提供了IGFL4在制备预防或治疗瘢痕的药物组合物中的应用。

进一步，所述的瘢痕包括生理性瘢痕、病理性瘢痕。

进一步，所述的瘢痕为病理性瘢痕。

进一步，所述的病理性瘢痕包括瘢痕疙瘩、增生性瘢痕、萎缩性瘢痕。

进一步，所述的病理性瘢痕为增生性瘢痕。

进一步，所述的药物组合物包括促进IGFL4表达的试剂。

本发明第四方面提供了一种筛选治疗瘢痕的候选药物的方法，所述的方法包括：

(1)用待测试物质处理表达或含有IGFL4的体系；

(2)检测所述体系中IGFL4的表达；

(3)选择可提高IGFL4表达水平的测试物质为候选药物。

进一步，所述的瘢痕包括生理性瘢痕、病理性瘢痕。

进一步，所述的瘢痕为病理性瘢痕。

进一步，所述的病理性瘢痕包括瘢痕疙瘩、增生性瘢痕、萎缩性瘢痕。

进一步，所述的病理性瘢痕为增生性瘢痕。

附图说明

图1是IGFL4相对表达量统计图。

图2是IGFL4的ROC曲线图。

具体实施方式

本发明为了筛选可用于瘢痕诊断的生物标志物，通过收集增生性瘢痕患者的组织样本与邻近正常组织样本，通过测序分析筛选具有显著性差异表达的基因，并进一步分析基因在样本中的表达情况与诊断效能，从而发现适于瘢痕诊断和治疗的生物标志物。

在本发明中，术语“生物标志物”意指化合物，优选是基因，与来自具有第二表型(例如没有疾病)的受试者或一组受试者的生物样品相比，它在来自具有第一表型(例如患有疾病)的受试者或一组受试者的生物样品中差异地存在(即增加或减少)。术语“生物标志物”通常是指一种基因的存在/浓度/含量或两种或更多种基因的存在/浓度/含量。

生物标志物可以在任何水平上差异地存在，但是一般以如下的水平存在，所述水平增加了至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少100％、至少110％、至少120％、至少130％、至少140％、至少150％、或更多；或一般以如下的水平存在，所述水平减少了至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或100％(即不存在)。

在本发明的具体实施方式中，所述的生物标志物包括IGFL4。

在本发明中，IGFL4(GeneID:444882)包括IGFL4基因及其编码的蛋白及其同源物。该术语涵盖全长，未加工的IGFL4，以及源自细胞中加工的任何形式的IGFL4。该术语涵盖IGFL4的天然发生变体(例如剪接变体或等位变体)。

术语中使用的术语“受试者”意指任何动物，还指人类和非人类的动物。术语“非人类的动物”包括所有脊椎动物，例如，哺乳动物，如非人灵长类动物(特别是高等灵长类动物)、绵羊、狗、啮齿类动物(如小鼠或大鼠)、豚鼠、山羊、猪、猫、兔、牛、和任何家畜或宠物；以及非哺乳动物，如鸡，两栖类，爬行动物等。

在优选的实施方式中，所述的受试者为人。

术语“样本”与“样品”在本文中可以互换使用，用于本文时指获得自或衍生自受试者(例如感兴趣的个体)的组合物，其包含有待根据例如物理，生化，化学和/或生理特点来表征和/或鉴定的细胞和/或其它分子实体。例如，短语“疾病样本”或其变体指得自感兴趣的受试者的任何样本，预计或已知其包含待表征的细胞和/或分子实体。样本包括但不限于，组织样本(例如肿瘤组织样本)，原代或培养的细胞或细胞系，细胞上清，细胞裂解物，血小板，血清，血浆，玻璃体液，淋巴液，滑液，滤泡液，精液，羊水，乳，全血，血液衍生的细胞，尿液，脑脊髓液，唾液，痰，泪，汗液，粘液，肿瘤裂解物，和组织培养液，组织提取物如匀浆化的组织，肿瘤组织，细胞提取物及其组合。

作为优选的实施方式，所述的样本选自组织。

本发明中所述的用于瘢痕诊断的产品可以包括通过PCR、原位杂交或高通量测序平台检测IGFL4的表达水平的试剂。高通量测序平台是一种特殊工具，随着高通量测序技术的不断发展，对一个人的基因表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常人群的基因表达谱，容易分析出哪个基因的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知IGFL4基因的异常与瘢痕的发生相关也属于使用了本发明的IGFL4的新用途，同样在本发明的保护范围之内。

本发明提供了一种诊断瘢痕的产品，所述产品包括检测样本中本发明所述的生物标志物的试剂；并且可包括使用所述的试剂盒评估受试者是否患有或易患瘢痕的说明书。

当在实验室环境中处理样本时，可能获得最可靠的结果。例如，可在医生办公室中从受试者获取样本，然后将其发送到医院或商业医学实验室进行进一步测试。然而，在许多情况下，可能希望在临床医生的办公室提供即时结果或允许受试者在家中进行测试。在一些情况下，对于便携式、预包装、一次性的、可由受试者在无协助或指导等的情况下即可使用等等的测试的需求比高度准确度更为重要。在许多情况下，尤其是在有医师随访的情况下，进行初步测试，甚至灵敏度和/或特异度降低的测试也可能就足够了。因此，以产品形式提供的测定可涉及检测和测量相对少量的生物标志物，以降低测定的复杂性和成本。

可使用本文所述的能够检测样本生物标志物的任何形式的样本测定。通常，所述测定将定量样本中生物标志物至一定的程度，例如它们的浓度或量是高于还是低于预定阈值。此类试剂盒可采取测试条、浸杆、盒、药筒、基于芯片或基于珠粒的阵列、多孔板或一系列容器等的形式。提供一种或多种试剂以检测所选样本生物标志物的存在和/或浓度和/或量。可将受试者的样本直接分配到测定中，或从存储的或先前获得的样品中间接分配到测定中。高于或低于预定阈值的生物标志物的存在或不存在可以例如通过发色、发荧光、电化学发光或其他输出(例如在酶免疫测定(EIA)，诸如酶联免疫测定(ELISA)中)来显示。

在一个实施方案中，产品可包含固体基片诸如芯片、载玻片、阵列等，其具有能够检测和/或定量固定在基片上的预定位置处的一种或多种样本生物标志物的试剂。作为说明性实例，可向芯片提供固定在离散的预定位置的试剂，以用于检测和定量样本中生物标志物的存在和/或浓度和/或量。如上所述，在患有瘢痕的受试者的样本中发现所述生物标志物的水平降低或增加。芯片可被配置成使得仅当这些生物标志物中的一种或多种的浓度超过阈值时才提供可检测的输出(例如颜色变化)，所述阈值被选择或区分指示对照受试者的生物标志物的浓度和/或量与指示患有或易患瘢痕的患者的生物标志物的浓度和/或量。因此，可检测到的输出(诸如颜色变化)的存在立即表明样本中包含显著降低水平的生物标志物，表明受试者患有或易患瘢痕。

本发明提供了IGFL4在制备预防或治疗瘢痕的药物组合物中的应用，所述的药物组合物还可以包括有效量的用于瘢痕治疗的药物及药学上可接受的载体和/或辅料。

本文中使用的术语“有效量”，是指具有治疗效果的量或在治疗对象中产生治疗效果所需要的量。例如，药物治疗上或药学上有效量是指产生需要的治疗效果所需要的药物的量，治疗效果可以通过临床试验结果、模型动物研究和/或体外研究的结果来反映。药学上有效量取决于几个因素，包括但不限于治疗对象的特征因素(如身高、体重、性别、年龄和用药史)、罹患疾病的严重程度。

所述的药物组合物与用于瘢痕治疗的药物可以制备成单独的制剂联合应用，也可将两者制备成一种制剂以组合物的形式应用。

所述的载体和/或辅料包括药学上可接受的载体、稀释剂、填充剂、结合剂及其它赋形剂，这依赖于给药方式及所设计的剂量形式。本领域技术人员已知的治疗惰性的无机或有机的载体包括(但不限于)乳糖、玉米淀粉或其衍生物、滑石、植物油、蜡、脂肪、多羟基化合物(例如聚乙二醇、水、蔗糖、乙醇、甘油)，各种防腐剂、润滑剂、分散剂、矫味矫臭剂、湿润剂、甜味剂、香味剂、乳化剂、悬浮剂、保存剂、抗氧化剂、着色剂、稳定剂、盐、缓冲液，诸如此类的也可加入其中。

适合的药学上可接受的载体和/或辅料在Remington's PharmaceuticalSciences(19th ed.,1995)中有详细的记载，这些物质根据需要用于帮助配方的稳定性或有助于提高活性或它的生物有效性或在口服的情况下产生可接受的口感或气味，在这种药物组合物中可以使用的制剂可以是其原始化合物本身的形式，或任选地使用其药物学可接受的盐的形式。如此配制的药物组合物根据需要可选择本领域技术人员已知的任何适当的方式把药物进行给药，使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明的药物施用于人。

本发明的所述的药物组合物的适合的给药剂量根据制剂化方法、给药方式、患者的年龄、体重、性别、病态、饮食、给药时间、给药途径、排泄速度及反应灵敏性之类的因素而可以进行多种处方，熟练的医生通常能够容易地决定处方及处方对所希望的治疗或预防有效的给药剂量。

本发明提供了一种筛选治疗瘢痕的候选药物的方法，所述的方法包括：

(1)用待测试物质处理表达或含有IGFL4的体系；

(2)检测所述体系中IGFL4的表达；

(3)选择可提高IGFL4表达水平的测试物质为候选药物。

其中，所述的体系选自：细胞体系、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系。

以下结合附图对本申请的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本申请，并不用于限制本申请。

实施例1与增生性瘢痕相关的生物标志物1、实验样本信息和样本RNA信息：

(一)样本信息：

表1.样本信息表

(二)RNA提取与建库：

表2.RNA信息表

2、实验步骤(一)建库及测序

1)总RNADNaseⅠ消化：利用DNase I消化Total RNA样品中存在的DNA片段，磁珠纯化回收反应产物，最后溶解于DEPC水；

2)去除rRNA：取消化好的Total RNA样品，使用试剂盒去除rRNA，去除之后进行Agilent 2100检测，验证rRNA去除效果；

3)RNA打断：取上一步样品，加入打断Buffer，置于PCR仪中进行热打断，打断到140-160nt；

4)反转录一链的合成：向打断后的样品中加入适量引物，充分混匀后在Thermomixer适温反应一定时间，使之打开二级结构并与引物结合，再加入提前配制的一链合成反应体系Mix，在PCR仪上按相应程序合成一链cDNA；

5)反转录二链的合成：配制二链合成反应体系，在Thermomixer上适温反应一定时间，合成带有dUTP的二链cDNA，反应产物用磁珠进行纯化回收；

6)末端修复：配制末端修复反应体系，在Thermomixer中适温反应一定时间，在酶的作用下，对反转录得到的cDNA双链的粘性末端进行修复，末端修复产物用磁珠进行纯化回收，最后将样品溶于EB Solution；

7)cDNA 3’末端加“A”：配制加“A”反应体系，在Thermomixer中适温反应一定时间，在酶的作用下，使末端修复的产物cDNA的3’末端加上A碱基；

8)cDNA 5’adapter的连接：配制接头连接反应体系，在Thermomixer中适温反应一定时间，在酶的作用下，使接头与A碱基连接，产物用磁珠进行纯化回收；

9)UNG消化cDNA二链：配制UNG消化反应体系，通过UNG酶消化掉双链DNA中的二链，并用磁珠对产物进行纯化回收；

10)PCR反应及产物回收：配制PCR反应体系，选择适当的PCR反应程序，对上步骤得到的产物进行扩增，对PCR产物进行磁珠纯化回收，回收产物溶于EB溶液中，贴上标签，文库制备至此完成；

11)文库质量检测：使用Agilent 2100Bioanalyzer和ABI StepOnePlus Real-Time PCR System对文库质量进行检测；

12)上机测序：检测合格的文库，加入NaOH变性成单链，按照预期上机数据量，稀释至一定的上机浓度。变性稀释后的文库加入到FlowCell内，与FlowCell上的接头杂交，在cBot上完成桥式PCR扩增，最后使用Illumina Hiseq x-ten平台进行测序，PE150策略。

(二)数据分析

1)原始数据统计

基于边合成边测序(Sequencing By Synthesis，SBS)技术，Illumina高通量测序平台对cDNA文库进行测序，产出大量的高质量Data，称为原始数据(Raw Data)，其大部分碱基质量打分能达到或超过Q30。Raw Data以FASTQ格式提供，每个测序样品的Raw Data包括两个FASTQ文件，分别包含所有cDNA片段两端测定的Reads。FASTQ格式文件记录所测读段(read)的碱基及其质量分数。

利用分析软件FastqStat.jar对原始数据进行统计，版本为V1.0，自定义脚本，参数为默认参数。统计结果如下表所示：

表3.原始数据(raw data)统计表

2)质控数据统计

首先对原始测序数据进行质量过滤，从而得到高质量的质控数据(clean data)。具体步骤如下：

a、去除reads中的adapter序列；

b、剪切前去除5’端含有非AGCT的碱基；

c、修剪测序质量较低的reads末端(测序质量值小于Q20)；

d、去除含N的比例达到10％的reads；

e、舍弃去adapter及质量修剪后长度小于25bp的小片段。

运用统计学方法对经过质控之后的数据进行统计,如下表所示：

表4.质控数据(clean data)统计表

3)质控前后数据统计汇总

本项目各样品质控前后数据产出统计见下表：

表5.测序数据统计汇总表

4)比对参考基因组分析

将得到的高质量测序序列与指定的参考基因组比对，研究物种为人，参考基因组来自于Ensembl数据库，基因组版本GRCh38，基因注释信息为Ensemble 92。

分析软件：hisat2，版本为v 2.1.0，https://ccb.jhu.edu/software/hisat2/index.shtml，参数为-p 10--rna-strandness RF。

本项目每个样本的比对情况如下表所示：

表6.比对效率统计表

将比对到基因组上的reads在参考基因组不同区域的分布情况进行统计，定位区域分为CDS(编码区)、Intron(内含子)、Intergenic(基因间区)和UTR(5'和3’非翻译区)。Reads在不同区域的分布表如下：

表7.Reads在基因组上的分布情况

5)mRNA表达量分析

本研究共得到了19953个mRNA。

在RNA-seq分析中，通过比对到参考基因组区域的序列(clean reads)的数量来计算基因的表达水平。Stringtie根据Hisat2软件的比对结果，结合mRNA的基因注释信息，计算每个基因/转录本在样本中的FPKM值，以该值作为基因/转录本在样本中的表达量。

分析软件：

stringtie，版本为v1.3.3b，http://ccb.jhu.edu/software/stringtie/。ballgown版本为v2.14.0，http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/ballgown.html。

6)mRNA差异分析

a、首先对原始的read count进行标准化(normalization)，主要是对测序深度的校正；

b、通过统计学模型进行假设检验概率(P-value)的计算；

c、进行多重假设检验校正(BH)，得到padj值(错误发现率)。

3、实验结果

本研究中19953个mRNA，经ballgown包进行差异分析后，筛选标准为：|log2(FoldChange)|>1，padj<0.05，共得到487个显著差异的mRNAs。其中，上调的差异表达基因有457个，下调的差异表达基因有30个。

本发明中涉及的差异表达基因IGFL4在增生性瘢痕患者组织样本中表达下调。

实施例2qPCR验证IGFL4表达情况

收集增生性瘢痕患者组织样本和邻近正常组织样本各30例。

1、提取总RNA

利用TRIzol RNA提取方法提取增生性瘢痕患者组织和邻近正常组织中的总RNA。

2、逆转录

利用TIANGEN公司的逆转录试剂盒进行RNA的逆转录，具体反应体系如下：

1)去除基因组DNA的反应体系

将1.0μg的总RNA模板与2.0μL的5×gDNAbuffer和RNase Free水混合，终体积为10μL，42℃孵育3min。

2)逆转录PCR反应体系

将2.0μL的10×Fast RTbuffer、1.0μL的PrimerScript RT Enzyme Mix I与2.0μL的FQ-RTPrimer Mix混合，加入10μL的去除基因组DNA的反应体系和5.0μL的RNase Free水，共20μL，42℃反应15min，之后95℃反应3min。

3、QPCR扩增

1)引物设计

根据GeneBank中IGFL4基因和GAPDH基因(内参)的编码序列设计QPCR扩增引物，具体引物序列如下：

IGFL4基因：

正向引物为5’-CATCACACTACCTGACTTC-3’(SEQ ID NO.1)；

反向引物为5’-GCTCTGTTCTGTTCCATT-3’(SEQ ID NO.2)。

GAPDH基因：

正向引物为5’-TTTAACTCTGGTAAAGTGGATAT-3’(SEQ ID NO.3)；

反向引物为5’-GGTGGAATCATATTGGAACA-3’(SEQ ID NO.4)。

2)按照表1配制PCR反应体系：

SuperReal PreMix Plus试剂盒购自TIANGEN公司。

表8.PCR反应体系

试剂	体积
		2×SuperReal PreMix Plus	10μL
正向引物(10uM)	0.6μL
		反向引物(10uM)	0.6μL
50×ROX Reference Dye	2μL
		DNA模板	2μL
去离子水	4.8μL

3)PCR反应条件：95℃15min，(95℃10s，55℃30s，72℃32s)进行40个循环，之后95℃15s，60℃60s，95℃15s。以SYBR Green作为荧光标志物，在ABI 7300型荧光定量PCR仪上进行PCR反应，通过熔解曲线分析和电泳确定目的条带，2-^ΔΔCT法进行相对定量。

4、统计学方法

实验设置3次平行实验，结果数据以平均值±标准差的方式来表示，采用统计软件来进行统计分析，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

5、结果

统计结果如图1所示，与邻近正常组织相比，增生性瘢痕患者组织IGFL4表达量显著下调。

实施例3IGFL4的诊断效能验证

采用SPSS软件绘制受试者工作曲线(ROC)，分析AUC值、敏感性和特异性，判断指标单独的诊断效能。

如图2和表9所示，IGFL4具有较高的诊断效能(AUC值为0.906，敏感性值为0.833，特异性值为0.967)，提示IGFL4可用于诊断瘢痕。

表9、ROC曲线下方的区域

以上结合附图详细描述了本申请的优选实施方式，但是，本申请并不限于上述实施方式中的具体细节，在本申请的技术构思范围内，可以对本申请的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本申请的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本申请对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本申请的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本申请的思想，其同样应当视为本申请所公开的内容。

序列表

<110> 中国人民解放军联勤保障部队第九八〇医院

<120> 一种与瘢痕相关的生物标志物及其应用

<141> 2021-02-24

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

catcacacta cctgacttc 19

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gctctgttct gttccatt 18

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tttaactctg gtaaagtgga tat 23

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggtggaatca tattggaaca 20

Claims (5)

1.一种生物标志物的检测试剂在制备增生性瘢痕诊断产品中的应用，其特征在于，所述的生物标志物包括IGFL4。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，利用所述的产品检测受试者样本中的IGFL4的表达水平，与正常人相比，受试者样本中的IGFL4的表达水平下调，则诊断该受试者为增生性瘢痕患者。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的样本为组织。

4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述的产品包括通过PCR、原位杂交或高通量测序平台检测IGFL4的表达水平的试剂。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的PCR包括RT-PCR、qPCR。

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