WO2022220299A1 - 乳幼児顔湿疹の症度の検出方法 - Google Patents

乳幼児顔湿疹の症度の検出方法 Download PDF

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WO2022220299A1
WO2022220299A1 PCT/JP2022/017953 JP2022017953W WO2022220299A1 WO 2022220299 A1 WO2022220299 A1 WO 2022220299A1 JP 2022017953 W JP2022017953 W JP 2022017953W WO 2022220299 A1 WO2022220299 A1 WO 2022220299A1
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gene
infant
facial eczema
eczema
severity
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PCT/JP2022/017953
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真恵子 岩村
高良 井上
哲矢 桑野
裕也 上原
恭子 志摩
優子 福田
倫子 高木
早苗 相良
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花王株式会社
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor

Definitions

  • the present invention relates to providing a method for detecting the degree of infant facial eczema using an infant facial eczema severity detection marker.
  • Eczema is a general term for inflammation that occurs on the surface of the skin. Infants develop various types of eczema (dermatitis) as they grow. Typical examples include neonatal acne, seborrheic eczema, contact dermatitis (rash), and atopic dermatitis (AD).
  • Atopic dermatitis is a disease whose main lesion is itchy eczema with repeated exacerbations and remissions, and many patients have atopic predisposition (family history, medical history, or a predisposition to produce IgE antibodies). It is characterized (Non-Patent Document 1).
  • Neonatal acne is a pimple-like eruption that appears mainly on the face from about 2 weeks after birth, and improves transiently.
  • Seborrheic eczema is eczema that causes erythema with desquamation on seborrheic sites (head and face in infants). In the case of infants, it is seen from around 1 month after birth, and then it often subsides spontaneously.
  • Contact dermatitis is temporary irritant contact dermatitis, in which some substance comes into contact with the skin, causing irritation and inflammation. Allergic contact dermatitis occurs at the site where an individual sensitized to a certain antigen comes into contact with that antigen. It is an eczema that causes erythema, edema, papules, blisters, etc. Contact dermatitis is caused by contact with an irritating causative substance, but is improved by removing the causative substance.
  • Non-Patent Document 2 Non-Patent Document 2
  • Diagnosis by a dermatologist is important for understanding the eczema condition, but the decision to see a medical institution is left to the subjective judgment of the guardian, and the value standard differs from individual to individual. It has the potential to be missed. Therefore, a technology that can more easily determine the eczema state is considered to be a technology that brings about appropriate skin care for infants and supports their healthy growth.
  • RNA contained in skin surface lipids can be used as a sample for biological analysis (Patent Document 1).
  • Patent Document 1 International Publication No. 2018/008319
  • Non-Patent Document 1 J Allenrgy Clin Immunol Pract. 2020; 8: 1721-1724
  • Non-Patent Document 2 J Allergy Clin Immunol. 2008; 121: 1331-6
  • the present invention relates to the following 1) to 4).
  • a method for detecting the severity of facial eczema in the infant comprising the step of: 2) To detect the severity of infant facial eczema used in the method of 1), which contains an oligonucleotide that specifically hybridizes with the gene or a nucleic acid derived therefrom, or an antibody that recognizes the expression product of the gene. test kit.
  • FIG. 4 is a graph showing the relationship between the predicted facial eczema score obtained by the facial eczema score prediction model and the diagnostic score.
  • the present invention relates to providing a detection marker for detecting the severity of infant facial eczema and a method for detecting the severity of infant facial eczema using the detection marker.
  • the present inventor collected SSL from the entire face of an infant with facial eczema, excluding the eyes and mouth, and comprehensively analyzed the expression state of RNA contained in SSL as sequence information. As a result, the expression of a specific gene The level was significantly correlated with the severity of infant facial eczema, and it was found that the severity of infant facial eczema can be detected using this as an index.
  • the guardian can grasp the condition of facial eczema of the infant based on the objective index, and can take appropriate measures against the facial eczema.
  • nucleic acid or “polynucleotide” means DNA or RNA.
  • DNA includes cDNA, genomic DNA, and synthetic DNA
  • RNA includes total RNA, mRNA, rRNA, tRNA, non-coding RNA, and synthetic RNA.
  • the term "gene” refers to double-stranded DNA containing human genomic DNA, single-stranded DNA (positive strand) containing cDNA, and single-stranded DNA (complementary strand) having a sequence complementary to the positive strand. , and fragments thereof, in which some biological information is contained in the sequence information of bases that constitute DNA.
  • the "gene” in the present invention includes not only “gene” represented by a specific nucleotide sequence, but also its homologues (i.e., homologs or orthologs), mutants such as genetic polymorphisms, and derivatives. be.
  • the names of the genes disclosed in this specification follow the Official Symbol described in NCBI ([www.ncbi.nlm.nih.gov/]).
  • the "expression product” of a gene is a concept that includes transcription products and translation products of genes.
  • a “transcription product” is RNA produced by transcription from a gene (DNA), and a “translation product” means a protein encoded by a gene that is translated and synthesized based on RNA.
  • facial eczema refers to inflammation occurring on the skin of the face. Clinically, erythema, papules, maceration, desquamation, and scratch marks are seen. As the symptoms worsen, erythema changes to erythema with edema, papules to pustules, and maceration to erosions. Sites where facial eczema is likely to occur include the frontal region, temporal region, infraorbital region, cheekbone region, parotid masseter muscle region, cheek region, and mental region.
  • Infants broadly refers to "children” before the onset of secondary sex characteristics, specifically a concept including children under the age of 12, preferably from 0 years old to entering school, specifically Generally refers to infants from 0 to 5 years old.
  • the "severity" of facial eczema refers to the severity of symptoms of facial eczema, and is classified into, for example, no symptoms, slight, mild, mild to moderate, moderate, moderate to severe, and severe. .
  • the degree of facial eczema can be determined, for example, based on a known evaluation score for evaluating symptoms of facial eczema (hereinafter also referred to as "facial eczema score").
  • a facial eczema score for example, in addition to the 4 symptoms of erythema, papules, maceration, and desquamation, 5 symptoms from the eczema triangle (indicating the transition of the eczema reaction from onset) to scratch marks corresponding to crusts are added.
  • 6 Severe 7-grade scores were added, and the scores were summed.
  • the facial eczema score is 0: no symptoms, 1 to 5: slight, 6 to 10: mild, 11 to 15: mild to moderate, 16 to 20: moderate, 21 to 25: moderate to Severe, 26-30: Severe.
  • the facial eczema score itself may be used as an indicator of the degree of infant facial eczema.
  • “detection” of the degree of facial eczema in infants can be rephrased by terms such as examination, measurement, judgment, or evaluation support.
  • the terms “detection”, “examination”, “measurement”, “determination” or “evaluation” of the degree of infant facial eczema in the present invention do not include diagnosis of the degree of infant facial eczema by a doctor. .
  • SSL was collected from the entire face of an infant with facial eczema except for the eyes and mouth, and the expression level data of the SSL-derived RNA was obtained by the following procedures 1) to 3).
  • 10 genes shown in Table 1 were selected as feature amount genes.
  • a discriminant facial eczema score prediction model
  • a gene or its expression product selected from the gene group shown in Table 1 can be used as a detection marker, and the degree of infant facial eczema can be detected based on the expression level.
  • Acquire expression level data (read count value) of SSL-derived RNA Acquire expression level data (read count value) of SSL-derived RNA.
  • the 8 genes BABAM1, PDLIM5, PMS2P5, SNHG8, COG5, GPR132, PSMD7 and CCDC134 indicated in bold with * in the table have been shown to be related to infant facial eczema. It is a gene that has not been reported, and a gene or its expression product selected from these gene groups is a novel detection marker for detecting the severity of infant facial eczema. In the present invention, at least one gene selected from the eight gene groups or its expression product is used as a detection marker, and the degree of infant facial eczema is detected based on the expression level.
  • At least one gene or expression product thereof selected from the eight gene groups is used as a detection marker.
  • By detecting the degree of facial eczema in infants it is possible to grasp the state of facial eczema in infants, for example, the presence or absence of onset of eczema, the progress of eczema pathology, the degree of healing of eczema, the therapeutic or preventive effect on eczema, and the like.
  • Each of the eight genes BABAM1, PDLIM5, PMS2P5, SNHG8, COG5, GPR132, PSMD7 and CCDC134 can independently serve as a detection marker for detecting the severity of infant facial eczema, and preferably two or more of these. , more preferably 5 or more, and more preferably a combination of all 8. Among them, it is preferable to select two or more that essentially contain BABAM1.
  • at least one selected from NRIP1 and PPIA to be combined with the eight genes is preferably PPIA, and two or more of the eight genes, NRIP1 and PPIA, including BABAM1 and PPIA are selected. is more preferred, and it is even more preferred to select all 10 species shown in Table 1.
  • the gene that can be a detection marker for detecting the severity of infant facial eczema includes the gene as long as it can be a biomarker for detecting the severity of infant facial eczema
  • a gene having a base sequence substantially identical to the base sequence of the DNA that constitutes is also included.
  • a biological sample collected from a test infant is subjected to target genes, one aspect of which is BABAM1, PDLIM5, PMS2P5, SNHG8, COG5, GPR132, PSMD7 and CCDC134. measuring the expression level of at least one gene or its expression product selected from the gene group of As another aspect, for a biological sample collected from a subject infant, the expression level of at least one gene or its expression product selected from the eight gene groups, and two gene groups of NRIP1 and PPIA measuring the level of expression of at least one gene or expression product thereof.
  • a subject infant in the present invention includes, for example, an infant who desires or needs detection of infant facial eczema.
  • the test infant may be an infant developing infant facial eczema, an infant suspected of developing infant facial eczema, an infant genetically predisposed to infant facial eczema, or a close relative such as a brother or sister having infant facial eczema. Infants who have or have had symptoms are included.
  • the biological samples used in the present invention may be cells, tissues, and biomaterials in which the expression of the gene of the present invention changes.
  • Specific examples include organs, skin, blood, urine, saliva, sweat, stratum corneum, superficial skin lipids (SSL), body fluids such as tissue exudate, serum prepared from blood, plasma, feces, hair, and the like. preferably skin or superficial skin lipids (SSL), more preferably skin superficial lipids (SSL).
  • the site of the skin from which the SSL is collected is not particularly limited, and includes the skin of any site of the body such as the head, face, neck, trunk, limbs, etc., preferably the site where infant facial eczema is likely to occur, For example, the frontal region, temporal region, suborbital region, cheekbone region, parotid masseter region, cheek region, chin region, or the whole face including these may be mentioned.
  • the site of the skin from which the SSL is collected may be either a rash area where infant facial eczema has developed or a non-rash area where infant facial eczema has not developed, but preferably the rash area or the vicinity of the rash area. It is a non-erupted part.
  • the vicinity of the rash refers to a range within 10 cm adjacent to the rash.
  • SSL artificial skin lipid
  • RNA expressed in skin cells RNA expressed in skin cells.
  • skin is a general term for areas including stratum corneum, epidermis, dermis, hair follicles, and tissues such as sweat glands, sebaceous glands and other glands.
  • any means used to collect or remove SSL from the skin can be used to collect SSL from the skin of the test infant.
  • an SSL absorbent material, an SSL adhesive material, or an instrument that scrapes the SSL off the skin can be used.
  • the SSL absorbent material or SSL adhesive material is not particularly limited as long as it has affinity for SSL, and examples thereof include polypropylene and pulp. More detailed examples of procedures for collecting SSL from the skin include a method of absorbing SSL into sheet-like materials such as blotting paper and blotting film, a method of adhering SSL to a glass plate, tape, etc., a spatula, a scraper, etc. and a method of scraping off and recovering the SSL.
  • an SSL absorbent material previously impregnated with a solvent having high fat solubility may be used.
  • the SSL absorptive material contains a highly water-soluble solvent or moisture, the adsorption of SSL is inhibited, so it is preferable that the content of the highly water-soluble solvent and moisture is small.
  • the SSL absorbent material is preferably used dry.
  • RNA-containing SSL collected from test infants may be stored for a certain period of time.
  • the collected SSL is preferably stored under low temperature conditions as soon as possible after collection in order to minimize degradation of the contained RNA.
  • the temperature condition for storing the RNA-containing SSL in the present invention may be 0°C or lower, preferably -20 ⁇ 20°C to -80 ⁇ 20°C, more preferably -20 ⁇ 10°C to -80 ⁇ 10°C. , More preferably -20 ⁇ 20°C to -40 ⁇ 20°C, more preferably -20 ⁇ 10°C to -40 ⁇ 10°C, more preferably -20 ⁇ 10°C, still more preferably -20 ⁇ 5°C .
  • the storage period of the RNA-containing SSL under the low-temperature conditions is not particularly limited, but is preferably 12 months or less, for example, 6 hours or more and 12 months or less, more preferably 6 months or less, for example, 1 day or more and 6 months or less, More preferably, it is 3 months or less, for example, 3 days or more and 3 months or less.
  • targets for measuring the expression level of the target gene or its expression product include cDNA artificially synthesized from RNA, DNA encoding the RNA, proteins encoded by the RNA, and interactions with the proteins.
  • molecules that interact with RNA, DNA or protein include DNA, RNA, protein, polysaccharides, oligosaccharides, monosaccharides, lipids, fatty acids, phosphorylated products thereof, alkylated products, sugar adducts, etc., and Any one of the above complexes may be mentioned.
  • the expression level comprehensively means the expression level and activity of the gene or expression product.
  • SSL is used as a biological sample.
  • the expression level of RNA contained in SSL is analyzed, specifically after converting RNA into cDNA by reverse transcription. , the cDNA or its amplification product is measured.
  • RNA from SSL For extraction of RNA from SSL, methods commonly used to extract or purify RNA from biological samples, such as the phenol/chloroform method, the AGPC (acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction) method, or TRIzol® ), a method using a column such as RNeasy (registered trademark), QIAzol (registered trademark), a method using special magnetic particles coated with silica, a method using Solid Phase Reversible Immobilization magnetic particles, a commercially available method such as ISOGEN Extraction with an RNA extraction reagent or the like can be used.
  • the AGPC acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction
  • TRIzol® a method using a column such as RNeasy (registered trademark), QIAzol (registered trademark)
  • a method using special magnetic particles coated with silica a method using Solid Phase Reversible Immobilization magnetic particles
  • primers targeting specific RNAs to be analyzed may be used, but random primers are preferably used for more comprehensive nucleic acid storage and analysis.
  • a common reverse transcriptase or reverse transcription reagent kit can be used for the reverse transcription.
  • a highly accurate and efficient reverse transcriptase or reverse transcription reagent kit is used, examples of which include M-MLV Reverse Transcriptase and variants thereof, or commercially available reverse transcriptase or reverse transcription reagent kit, Examples include PrimeScript (registered trademark) Reverse Transcriptase series (Takara Bio Inc.) and SuperScript (registered trademark) Reverse Transcriptase series (Thermo Scientific).
  • the temperature is preferably adjusted to 42°C ⁇ 1°C, more preferably 42°C ⁇ 0.5°C, even more preferably 42°C ⁇ 0.25°C, while the reaction time is preferably It is preferable to adjust the time to 60 minutes or more, more preferably 80 to 120 minutes.
  • Examples of methods for measuring expression levels include PCR, real-time RT-PCR, multiplex PCR, SmartAmp, LAMP, etc., using DNAs that hybridize to RNA, cDNA, or DNA as primers. nucleic acid amplification methods, hybridization methods using nucleic acids that hybridize to these as probes (DNA chips, DNA microarrays, dot blot hybridization, slot blot hybridization, Northern blot hybridization, etc.), methods for determining base sequences ( sequencing), or a combination thereof.
  • a primer pair targeting a specific DNA to be analyzed may be used to amplify only one specific DNA, but multiple primer pairs may be used to amplify a plurality of specific DNAs at the same time. good too.
  • said PCR is multiplex PCR.
  • Multiplex PCR is a method for simultaneously amplifying multiple gene regions by simultaneously using multiple primer pairs in a PCR reaction system. Multiplex PCR can be performed using a commercially available kit (eg, Ion AmpliSeq Transcriptome Human Gene Expression Kit; Life Technologies Japan Co., Ltd., etc.). The temperature of the annealing and extension reaction in the PCR depends on the primers used and cannot be generalized.
  • annealing and extension reactions are preferably performed in one step.
  • the time for the annealing and extension reaction steps can be adjusted depending on the size of the DNA to be amplified, etc., but is preferably 14 to 18 minutes.
  • the denaturation reaction conditions in the PCR can be adjusted depending on the DNA to be amplified, but are preferably 95-99° C. for 10-60 seconds. Reverse transcription and PCR at temperatures and times as described above can be performed using a thermal cycler commonly used for PCR.
  • Size separation allows separation of the desired PCR reaction product from primers and other impurities contained in the PCR reaction.
  • Size separation of DNA can be performed by, for example, a size separation column, a size separation chip, magnetic beads that can be used for size separation, or the like.
  • Preferred examples of magnetic beads that can be used for size separation include Solid Phase Reversible Immobilization (SPRI) magnetic beads such as Ampure XP.
  • Purified PCR reaction products may be subjected to further processing necessary for subsequent quantitative analysis.
  • a purified PCR reaction product is prepared into an appropriate buffer solution, a PCR primer region contained in PCR amplified DNA is cleaved, an adapter sequence is added to the amplified DNA, and an adapter sequence is added to the amplified DNA. may be added.
  • a purified PCR reaction product is prepared in a buffer solution, PCR primer sequences are removed from the amplified DNA and adapter ligation is performed, and the resulting reaction product is amplified as necessary for quantitative analysis. of libraries can be prepared.
  • the probe DNA is first labeled with a radioactive isotope, a fluorescent substance, or the like, and then the resulting labeled DNA is labeled. , and hybridize with biological sample-derived RNA transferred to a nylon membrane or the like according to a conventional method. After that, there is a method of measuring the formed double strand of labeled DNA and RNA by detecting a signal derived from the label.
  • cDNA is prepared from RNA derived from a biological sample according to a conventional method, and the target gene of the present invention is obtained using this as a template.
  • a pair of primers prepared for amplification (the positive strand that binds to the above cDNA ( ⁇ strand) and the reverse strand that binds to the + strand) is hybridized with this.
  • PCR is performed according to a conventional method, and the resulting amplified double-stranded DNA is detected.
  • a method for detecting the labeled double-stranded DNA produced by performing the above-mentioned PCR using primers previously labeled with RI, a fluorescent substance, etc. is used. can be done.
  • a DNA microarray When measuring the expression level of a target gene or a nucleic acid derived therefrom using a DNA microarray, for example, an array in which at least one nucleic acid (cDNA or DNA) derived from the target gene of the present invention is immobilized on a support is used.
  • mRNA expression level can be measured by binding labeled cDNA or cRNA prepared from mRNA onto a microarray and detecting the label on the microarray.
  • the nucleic acids immobilized on the array may be nucleic acids that hybridize specifically (that is, substantially only to the target nucleic acid) under stringent conditions. It may be a nucleic acid having a sequence or a nucleic acid consisting of a partial sequence.
  • the “partial sequence” includes nucleic acids consisting of at least 15 to 25 bases.
  • stringent conditions usually include washing conditions of about “1 ⁇ SSC, 0.1% SDS, 37° C.”, and more stringent hybridization conditions are "0.5 ⁇ SSC, 0.1% SDS. % SDS, about 42° C.”, and a more stringent hybridization condition is about “0.1 ⁇ SSC, 0.1% SDS, 65° C.”.
  • Hybridization conditions are described in J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001) and others.
  • RNA expression can be quantified based on the number of reads generated by sequencing (read count).
  • Probes or primers used for the above measurements that is, primers for specifically recognizing and amplifying the target gene of the present invention or nucleic acids derived therefrom, or for specifically detecting the RNA or nucleic acids derived therefrom Probes fall into this category, and they can be designed based on the nucleotide sequence that constitutes the target gene.
  • “specifically recognize” means that substantially only the target gene of the present invention or a nucleic acid derived therefrom can be detected, for example, in Northern blotting, and substantially only the nucleic acid in RT-PCR, for example. is amplified, it means that the detected product or product can be determined to be the gene or the nucleic acid derived therefrom.
  • an oligonucleotide containing a certain number of nucleotides complementary to a DNA consisting of a nucleotide sequence constituting the target gene of the present invention or its complementary strand can be used.
  • complementary strand refers to one strand of a double-stranded DNA consisting of base pairs of A:T (U in the case of RNA) and G:C against the other strand.
  • nucleotide sequence identity is not limited to the case of a completely complementary sequence in the certain number of contiguous nucleotide regions, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more, more preferably 80% or more, more preferably 90% or more More preferably, they should have 98% or more of nucleotide sequence identity.
  • the identity of nucleotide sequences can be determined by algorithms such as BLAST. When such oligonucleotides are used as primers, they only need to be capable of specific annealing and chain extension. Those having a chain length of preferably 50 bases or less, more preferably 35 bases or less are included.
  • oligonucleotide can be DNA or RNA, and may be synthetic or natural.
  • the probes used for hybridization are usually labeled ones.
  • protein chip analysis e.g., immunoassay (ELISA, etc.), mass spectrometry (e.g., LC-MS/MS, MALDI-TOF/MS), 1-hybrid method (PNAS 100, 12271-12276 (2003)) and 2-hybrid method (Biol. Reprod. 58 , 302-311 (1998)) can be used, and can be appropriately selected according to the subject.
  • mass spectrometry e.g., LC-MS/MS, MALDI-TOF/MS
  • 1-hybrid method PNAS 100, 12271-12276 (2003)
  • 2-hybrid method Biol. Reprod. 58 , 302-311 (1998)
  • a protein when a protein is used as a measurement target, an antibody that specifically recognizes the expression product of the present invention, specifically a structural characteristic site ( epitope) is brought into contact with a biological sample, the polypeptide or protein in the sample that binds to the antibody is detected, and the level is measured
  • an antibody that binds to the primary antibody labeled with a radioisotope, fluorescent substance, enzyme, etc. is used as a secondary antibody, and the primary antibody is Labeling is performed, and signals derived from these labeling substances are measured with a radiometer, a fluorescence detector, or the like.
  • the antibody against the translation product may be either a polyclonal antibody or a monoclonal antibody.
  • a polyclonal antibody is obtained by immunizing a non-human animal such as a rabbit using a protein expressed in Escherichia coli or the like and purified according to a conventional method, or by synthesizing a partial polypeptide of the protein according to a conventional method, It can be obtained from the serum of the immunized animal according to a conventional method.
  • monoclonal antibodies are obtained by immunizing a non-human animal such as a mouse with a protein expressed in Escherichia coli or the like and purified according to a conventional method or a partial polypeptide of the protein, and fusing the obtained spleen cells with myeloma cells. It can be obtained from prepared hybridoma cells.
  • Monoclonal antibodies may also be generated using phage display (Griffiths, AD; Duncan, AR, Current Opinion in Biotechnology, Volume 9, Number 1, February 1998, pp. 102-108(7)).
  • the expression level of the target gene of the present invention or its expression product in the biological sample collected from the test infant is measured, and the degree of facial eczema of the test infant is detected based on the expression level.
  • the expression level of the target gene of the present invention or its expression product in a biological sample collected from a test infant is measured at least at two times, and the change in the expression level or the amount of change is used as an index, and the test infant is It is possible to detect the presence or absence of change in the degree of facial eczema, or the degree of change. Specifically, detection is performed by comparing the measured expression level of the target gene of the present invention or its expression product with a preset cutoff value (reference value).
  • the read count value which is the expression level data, and the RPM value obtained by correcting the difference in the total read number between samples
  • a value obtained by converting the RPM value to a logarithm of base 2 log 2 RPM value
  • a logarithm of base 2 obtained by adding an integer 1 (log 2 (RPM + 1) value)
  • DESeq2 Love MI et al. Genome Biol 2014
  • the base 2 logarithm log 2 (Normalized count+1) value
  • RNA-seq is calculated by fragments per kilobase of exon per million reads mapped (FPKM), reads per kilobase of exon per million reads mapped (RPKM), transcripts per million (TPM), etc., which are common as quantitative values for RNA-seq. can be a value. Alternatively, it may be a signal value obtained by a microarray method and its correction value.
  • a method of converting the expression level of the target gene into a relative expression level based on the expression level of the housekeeping gene and analyzing it, or A method of quantifying the absolute copy number using a plasmid containing the region of the target gene (absolute quantification) and analyzing is preferred. It may be a copy number obtained by a digital PCR method.
  • the "cutoff value"("referencevalue”) can be determined in advance based on the relationship between the facial eczema score and the expression level of the target gene of the present invention or its expression product. For example, a population is classified into no symptoms, mild, mild, mild-to-moderate, moderate, moderate-to-severe, and severe groups according to facial eczema conditions, i.e., facial eczema scores, and the target gene or A value determined with reference to statistical values such as the average value and standard deviation of the expression level of the expression product can be determined as a cutoff value (reference value) for determining belonging to each group. When multiple types of genes are used as target genes, it is preferable to determine a cutoff value (reference value) for each gene or its expression product. Groups may be formed according to sex, race, and age.
  • a discriminant is constructed, and the discriminant is used to detect the severity of infant facial eczema.
  • the severity of infant facial eczema is determined by machine learning using the measured value of the expression level of the target gene or its expression product as an explanatory variable and the facial eczema score (e.g., the value obtained by converting the score into a deviation value) as the objective variable.
  • An optimal discriminant (prediction model) for detecting can be constructed.
  • the expression level of the target gene of the present invention or its expression product is similarly measured from the biological sample collected from the test infant, the obtained measured value is input into the discriminant (prediction model), and from the discriminant
  • the results obtained can be detected as the severity of facial eczema in the test infant.
  • facial eczema with different degrees of facial eczema with different degrees of facial eczema was obtained from a group of infants with different degrees of facial eczema with expression levels of target genes or expression products thereof derived from groups of infants with different degrees of facial eczema and target genes or expression levels of expression products thereof from healthy infants with different degrees of facial eczema.
  • Discriminant that divides infant groups (e.g., two or more groups selected from mild, mild, mild to moderate, moderate, moderate to severe, severe, etc.) and healthy infants (no symptoms)
  • a model is constructed, and a cutoff value (reference value) for discriminating each facial eczema infant group with different severity is obtained based on the discriminant.
  • the level of the target gene or its expression product is similarly measured from the biological sample collected from the test infant, the obtained measured value is substituted into the discriminant, and the result obtained from the discriminant is the cutoff value (reference value), the degree of facial eczema in the subject infant can be detected.
  • a known one such as an algorithm used for machine learning can be used.
  • machine learning algorithms include Random forest, linear kernel support vector machine (SVM linear), rbf kernel support vector machine (SVM rbf), neural network, generalized linear model model), regularized linear discriminant analysis, regularized logistic regression, Lasso (Least Absolute Shrinkage and Selection Operator) regression, and the like.
  • Enter verification data into the constructed prediction model to calculate prediction values, and select the model that best matches the prediction values with the measured values, for example, the model with the highest accuracy rate as the optimal prediction model. can be done.
  • the detection rate (Recall), the precision (Precision), and the F value, which is their harmonic average, are calculated from the predicted value and the measured value, and the model with the largest F value can be selected as the optimum prediction model.
  • the root mean square error (RMSE) between the predicted value and the measured value can be used as an accuracy evaluation index of the prediction model, and the model with the smallest RMSE can be selected as the optimum prediction model.
  • the method of determining the cutoff value is not particularly limited, and can be determined according to a known method. For example, it can be obtained from an ROC (Receiver Operating Characteristic Curve) curve created using a discriminant (prediction model).
  • ROC Receiveiver Operating Characteristic Curve
  • the vertical axis is the probability of a positive result in positive subjects (sensitivity)
  • the horizontal axis is the value obtained by subtracting the probability of a negative result in negative subjects (specificity) from 1 (false positive rate).
  • a test kit for detecting the severity of infant facial eczema of the present invention contains test reagents for measuring the expression level of the target gene of the present invention or its expression product in a biological sample isolated from a test infant. is. Specifically, a reagent for nucleic acid amplification or hybridization containing an oligonucleotide (e.g., primer for PCR) that specifically binds (hybridizes) to the target gene of the present invention or a nucleic acid derived therefrom, or Reagents for immunoassays containing antibodies that recognize the expression product (protein) of the target gene of the present invention, and the like.
  • an oligonucleotide e.g., primer for PCR
  • Oligonucleotides, antibodies and the like included in the kit can be obtained by known methods as described above.
  • the test kit also contains labeling reagents, buffers, chromogenic substrates, secondary antibodies, blocking agents, tools necessary for testing, control reagents used as positive and negative controls, Equipment for collecting biological samples (eg, blotting film for collecting SSL, etc.) and the like can be included.
  • the present invention further discloses the following aspects.
  • the expression level of at least one gene or its expression product selected from eight gene groups of BABAM1, PDLIM5, PMS2P5, SNHG8, COG5, GPR132, PSMD7 and CCDC134 A method for detecting the severity of facial eczema in said infant, comprising the step of measuring.
  • ⁇ 2> preferably 2 or more, more preferably 5 or more selected from the 8 gene groups of BABAM1, PDLIM5, PMS2P5, SNHG8, COG5, GPR132, PSMD7 and CCDC134, and still more preferably BABAM1 as essential
  • the detection method according to ⁇ 1> wherein expression levels of two or more, more preferably all eight genes or their expression products are measured.
  • the expression level of preferably PPIA, more preferably two or more types including BABAM1 and PPIA, more preferably all 10 types of genes shown in Table 1 or their expression products are measured ⁇ 3> Detection method.
  • the biological sample is preferably an organ, skin, blood, urine, saliva, sweat, stratum corneum, superficial skin lipid (SSL), body fluids such as tissue exudates, serum prepared from blood, plasma , stool or hair, more preferably skin or superficial skin lipids (SSL), still more preferably superficial skin lipids (SSL) ⁇ 1> to ⁇ 4>.
  • the object to be measured for the expression level of the gene or its expression product is preferably cDNA artificially synthesized from RNA, DNA encoding the RNA, a protein encoded by the RNA, and interacting with the protein.
  • the detection according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 5>, wherein the expression level of the gene or its expression product is preferably the expression level of mRNA collected from superficial skin lipids (SSL) of the test infant.
  • SSL superficial skin lipids
  • the test infant is an infant who has developed infant facial eczema, an infant suspected of developing infant facial eczema, an infant genetically predisposed to infant facial eczema, or a close relative such as a brother or sister who has infant facial eczema
  • the detection method according to ⁇ 7> which is an infant who is developing or was developing.
  • the detection method according to ⁇ 7> or ⁇ 8>, wherein the skin of the subject infant is the frontal region, temporal region, infraorbital region, cheekbone region, parotid masseter region, cheek region or chin region. .
  • the skin site from which the superficial skin lipid (SSL) is collected may be either a rash area where infant facial eczema has developed or a non-rash area where infant facial eczema has not developed.
  • ⁇ 12> The detection method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 11>, comprising detecting the degree of facial eczema in the test infant based on the expression level of the gene or its expression product.
  • detecting the severity of infant facial eczema using a discriminant (predictive model) based on the expression level of the gene or its expression product, Any one of ⁇ 1> to ⁇ 12>, wherein the discriminant (prediction model) is constructed by machine learning with the measured value of the expression level of the gene or its expression product as an explanatory variable and the facial eczema score as an objective variable.
  • ⁇ 14> The severity of infant facial eczema is 0: no symptoms, 1: slight, 2: mild, 3: mild to moderate for 5 symptoms of erythema, papules, maceration, desquamation, and scratch marks at the evaluation site. 4: Moderate, 5: Moderate to Severe, 6: Severe 7 grades are attached, and the sum of the scores (total value) is the degree of severity corresponding to any of ⁇ 1> to ⁇ 13>
  • the detection method according to . ⁇ 15> The detection method according to ⁇ 14>, wherein the evaluation site is the entire face of the infant.
  • Infant facial eczema used in the detection method of ⁇ 1> to ⁇ 15>, containing an oligonucleotide that specifically hybridizes with the gene or a nucleic acid derived therefrom, or an antibody that recognizes the expression product of the gene A test kit for detecting the severity of ⁇ 17>
  • a method for detecting the severity of infant facial eczema comprising at least one gene or its expression product selected from the eight gene groups of BABAM1, PDLIM5, PMS2P5, SNHG8, COG5, GPR132, PSMD7 and CCDC134 detection marker.
  • Example 1 Detection of Facial Eczema Severity Using RNA Extracted from SSL 1) Test Infants and Measurement of Facial Eczema Score Sixty-one Japanese male and female infants aged 3 to 8 months were used as test infants. A dermatologist confirmed that none of the test infants had been diagnosed with atopic dermatitis. Based on the criteria shown in Table 2, each of the five symptoms of erythema, papules, maceration, desquamation, and scratch marks was scored by a dermatologist based on the criteria shown in Table 2 for the entire face of the test infant. value) was taken as the facial eczema score.
  • RNA Preparation and Sequencing The blotting film of 2) above was cut into an appropriate size, and RNA was extracted using QIAzol Lysis Reagent (Qiagen) according to the attached protocol. Based on the extracted RNA, reverse transcription was performed at 42° C. for 90 minutes using SuperScript VILO cDNA Synthesis kit (Life Technologies Japan Co., Ltd.) to synthesize cDNA. Random primers attached to the kit were used as primers for the reverse transcription reaction. A library containing DNA derived from the 20802 gene was prepared from the resulting cDNA by multiplex PCR.
  • RNA profile data for 50 children was used as Train data for model construction, and RNA profile data for the remaining 11 children was used as Test data for model accuracy evaluation.
  • Data partitioning was performed using the createDataPartition function of [R] so that the distribution of the objective variable was uniform between the Train data and the Test data.
  • the caret package linear regression model (Lm), random forest (Rf), neural network (Nnet), Lasso regression (Lasso), rbf kernel support vector machine (SVM rbf ), a facial eczema score prediction model was constructed with six algorithms of linear kernel support vector machine (SVM linear). To reduce the impact of data bias on the model, model building was cross-validated 10 times. As an index of the best prediction model, RMSE (root mean square error) was calculated, and the model with the smallest value was selected as the best model.
  • SVM linear linear kernel support vector machine
  • the feature gene expression level (log 2 (RPM+1) value) of the Test data was input to calculate the predicted value (predicted score) of the facial eczema score.
  • the PEARSON correlation coefficient between the obtained prediction value (prediction score) and the actual diagnosis score was calculated, and the closer this value was to 1, the higher the prediction accuracy of the model.

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Abstract

乳幼児顔湿疹の症度を検出するための検出マーカー、及び当該検出マーカーを用いた乳幼児顔湿疹の症度の検出方法の提供。　被験乳幼児から採取された生体試料について、ＢＡＢＡＭ１、ＰＤＬＩＭ５、ＰＭＳ２Ｐ５、ＳＮＨＧ８、ＣＯＧ５、ＧＰＲ１３２、ＰＳＭＤ７及びＣＣＤＣ１３４の８種の遺伝子群より選択される少なくとも１つの遺伝子又はその発現産物の発現レベルを測定する工程を含む、当該乳幼児の顔湿疹の症度を検出する方法。

Description

乳幼児顔湿疹の症度の検出方法
　本発明は、乳幼児顔湿疹の症度検出マーカーを用いた乳幼児顔湿疹の症度の検出方法を提供することに関する。
　湿疹（皮膚炎）は皮膚の表面にできる炎症の総称である。乳幼児は成長に伴い、様々な湿疹（皮膚炎）を発症する。代表的なものとしては、新生児ざ瘡、脂漏性湿疹、接触皮膚炎（かぶれ）、アトピー性皮膚炎（ＡＤ）等がある。アトピー性皮膚炎は、増悪緩解を繰り返す、掻痒のある湿疹を主病変とする疾患であり、患者の多くはアトピー素因（家族歴、既往歴、またはＩｇＥ抗体を産生しやすい素因）を持つことを特徴とする（非特許文献１）。新生児ざ瘡とは、生後２週間ころから主に顔面に見られるにきび様の発疹であり、一過性に改善していく。脂漏性湿疹は脂漏部位(乳幼児では頭部や顔面)に落屑を伴う紅斑をきたす湿疹である。乳児の場合生後１か月頃から見られ、その後自然に軽快することが多い。接触皮膚炎は、皮膚に何らかの物質が触れ、それが刺激となって炎症を起こす一時刺激性接触皮膚炎、ある抗原に感作された個体にその抗原が接触した部位に生じるアレルギー性接触皮膚炎があり、紅斑、浮腫、丘疹、水疱等をきたす湿疹である。接触皮膚炎は刺激となる原因物質の接触により発症するが、それを除去することにより改善する。
　このような様々な乳幼児期の湿疹は、将来への影響も示唆されている。アトピー性皮膚炎においては、その後のアレルギーマーチ（１つのアレルギー発症を起点として次々とアレルギーを発症していくこと）に関係していることが報告されており、その発症予防、早期発見と治療介入が重要であるとされている。またそれ以外の湿疹においても、適切な処置がなされない状態が続くと、皮膚のバリア能低下、アレルゲンの侵入、アレルゲン長期暴露による感作の成立によりアトピー性皮膚炎を含むアレルギー疾患の発症にもつながる可能性もあることから、アトピー性皮膚炎と同様、その発症予防、早期発見と治療介入が重要であるといえる(非特許文献２)。
　湿疹状態の把握は皮膚科医の診断が重要であるが、医療機関の受診の判断は保護者主観に委ねられており、その価値基準は個々人で異なることから、早期かつ適切な治療のタイミングを逃してしまう可能性を秘めている。そのため、より簡便に湿疹状態を判定できる技術は、乳幼児の適切なスキンケアをもたらし、健全な成長をサポートする技術になると考えられる。
　近年、生体試料中のＤＮＡやＲＮＡ等の核酸の解析によりヒトの生体内の現在さらには将来の生理状態を調べる技術が開発されている。生体由来の核酸は、血液等の体液、分泌物、組織等から抽出することができる。さらに最近、皮膚表上脂質（ｓｋｉｎ　ｓｕｒｆａｃｅ　ｌｉｐｉｄｓ；ＳＳＬ）に含まれるＲＮＡを生体の解析用の試料として利用可能であることが報告されている（特許文献１）。
　　（特許文献１）国際公開公報第２０１８／００８３１９号
　　（非特許文献１）Ｊ　Ａｌｌｅｎｒｇｙ　Ｃｌｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　Ｐｒａｃｔ．２０２０；８：１７２１－１７２４
　　（非特許文献２）Ｊ　Ａｌｌｅｒｇｙ　Ｃｌｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００８；１２１：１３３１－６
　本発明は、以下の１）～４）に係るものである。
　１）被験乳幼児から採取された生体試料について、ＢＡＢＡＭ１、ＰＤＬＩＭ５、ＰＭＳ２Ｐ５、ＳＮＨＧ８、ＣＯＧ５、ＧＰＲ１３２、ＰＳＭＤ７及びＣＣＤＣ１３４の８種の遺伝子群より選択される少なくとも１つの遺伝子又はその発現産物の発現レベルを測定する工程を含む、当該乳幼児の顔湿疹の症度を検出する方法。
　２）前記遺伝子又はそれに由来する核酸と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、又は前記遺伝子の発現産物を認識する抗体を含有する、１）の方法に用いられる乳幼児顔湿疹の症度を検出するための検査用キット。
　３）ＢＡＢＡＭ１、ＰＤＬＩＭ５、ＰＭＳ２Ｐ５、ＳＮＨＧ８、ＣＯＧ５、ＧＰＲ１３２、ＰＳＭＤ７及びＣＣＤＣ１３４の８種の遺伝子群より選択される少なくとも１つの遺伝子又はその発現産物からなる、乳幼児顔湿疹の症度を検出するための検出マーカー。
　４）被験乳幼児から採取された生体試料に由来するＢＡＢＡＭ１、ＰＤＬＩＭ５、ＰＭＳ２Ｐ５、ＳＮＨＧ８、ＣＯＧ５、ＧＰＲ１３２、ＰＳＭＤ７及びＣＣＤＣ１３４の８種の遺伝子群より選択される少なくとも１つの遺伝子又はその発現産物の乳幼児顔湿疹の症度の検出マーカーとしての使用。
顔湿疹スコア予測モデルにより得られた顔湿疹スコアの予測スコアと診断スコアとの関係を示すグラフ。
発明の詳細な説明
　本発明は、乳幼児顔湿疹の症度を検出するための検出マーカー、及び当該検出マーカーを用いた乳幼児顔湿疹の症度の検出方法を提供することに関する。
　本発明者は、顔湿疹が見られる乳幼児の目元・口元を除く全顔からＳＳＬを採取し、ＳＳＬ中に含まれるＲＮＡの発現状態をシーケンス情報として網羅的に解析した結果、特定の遺伝子の発現レベルが乳幼児顔湿疹の症度と有意に相関し、これを指標として乳幼児顔湿疹の症度を検出できることを見出した。
　本発明によれば、簡便且つ非侵襲的に、乳幼児の顔湿疹の症度を検出することが可能である。これにより、保護者は、乳幼児の顔湿疹の状態を客観的指標に基づいて把握できるため、当該顔湿疹に対する適切な対策を講じることができる。
　本明細書中で引用された全ての特許文献、非特許文献、及びその他の刊行物は、その全体が本明細書中において参考として援用される。
　本発明において、「核酸」又は「ポリヌクレオチド」と云う用語は、ＤＮＡ又はＲＮＡを意味する。ＤＮＡには、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、及び合成ＤＮＡのいずれもが含まれ、「ＲＮＡ」には、ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇ　ＲＮＡ及び合成のＲＮＡのいずれもが含まれる。
　本発明において「遺伝子」とは、ヒトゲノムＤＮＡを含む２本鎖ＤＮＡの他、ｃＤＮＡを含む１本鎖ＤＮＡ（正鎖）、当該正鎖と相補的な配列を有する１本鎖ＤＮＡ（相補鎖）、及びこれらの断片を包含するものであって、ＤＮＡを構成する塩基の配列情報の中に、何らかの生物学的情報が含まれているものを意味する。
　また、本発明における「遺伝子」には、特定の塩基配列で表される「遺伝子」だけではなく、その同族体（すなわち、ホモログもしくはオーソログ）、遺伝子多型等の変異体、及び誘導体が包含される。
　ここで、本明細書中に開示される遺伝子の名称は、ＮＣＢＩ（[www.ncbi.nlm.nih.gov/]）に記載のあるＯｆｆｉｃｉａｌ　Ｓｙｍｂｏｌに従う。
　本発明において、遺伝子の「発現産物」とは、遺伝子の転写産物及び翻訳産物を包含する概念である。「転写産物」とは、遺伝子（ＤＮＡ）から転写されて生じるＲＮＡであり、「翻訳産物」とは、ＲＮＡに基づき翻訳合成される、遺伝子にコードされたタンパク質を意味する。
　本発明において、「顔湿疹」とは、顔の皮膚に起きる炎症を指す。臨床的には、紅斑、丘疹、浸軟、落屑、掻破痕が見られる。症状が強くなると、紅斑は浮腫を伴う紅斑に、丘疹は膿疱(うみ)をもち、浸軟は糜爛（びらん）へと変化が見られる。
　顔湿疹が生じやすい部位としては、前頭部、側頭部、眼窩下部、頬骨部、耳下腺咬筋部、頬部、オトガイ部等が挙げられる。
　「乳幼児」は、広義には第２次性徴が開始する前の「小児」、具体的には１２歳以下の小児を含めた概念であり、好ましくは０歳から学童に入るまでの年齢、具体的には０歳から５歳までの乳幼児を指す。
　顔湿疹の「症度」とは、顔湿疹の症状の悪さの程度を指し、例えば、症状なし、軽微、軽度、軽度から中等度、中等度、中等度から重度、重度のように分類される。顔湿疹の症度は、例えば、顔湿疹の症状を評価する公知の評価スコア（以下、「顔湿疹スコア」ともいう）に基づいて決定することができる。顔湿疹スコアとしては、例えば、紅斑、丘疹、浸軟、落屑の４症状に、湿疹三角（湿疹反応が発症から推移する状態を示したもの）から結痂に相当する掻破痕を加えた５症状について０：症状なし、１：軽微、２：軽度、３：軽度から中等度、４：中等度、５：中等度から重度、６：重度の７段階のスコアを付し、当該スコアを合算した値（合算値）が挙げられる（Pediatric Dermatology (2014) Vol. 31 No. 1 p.1？7、及びDermatology (2000) 200 p.238-243参照）。具体的には、顔湿疹スコアは、０：症状なし、１～５：軽微、６～１０：軽度、１１～１５：軽度から中等度、１６～２０：中等度、２１～２５：中等度から重度、２６～３０：重度である。本発明では、当該顔湿疹スコア自体を乳幼児顔湿疹の症度を示す指標としてもよい。
　本発明において、乳幼児顔湿疹の症度の「検出」は、検査、測定、判定又は評価支援等の用語で言い換えることもできる。なお、本発明における乳幼児顔湿疹の症度の「検出」、「検査」、「測定」、「判定」又は「評価」という用語は、医師による乳幼児顔湿疹の症度の診断を含むものではない。
　後述する実施例に示すように、顔湿疹が見られる乳幼児の目元・口元を除く全顔からＳＳＬを採取し、以下の手順１）～３）で該ＳＳＬ由来ＲＮＡの発現量データを取得して、表１に示す１０種の遺伝子を特徴量遺伝子として選択した。そして、該特徴量遺伝子を用いた判別式（顔湿疹スコアの予測モデル）で、乳幼児顔湿疹の症度の検出が可能であることが示された。したがって、表１に示された遺伝子群より選択される遺伝子又はその発現産物を検出マーカーとし、その発現レベルに基づいて、乳幼児顔湿疹の症度を検出することができる。
１）ＳＳＬ由来ＲＮＡの発現量のデータ（リードカウント値）を取得する。
２）リードカウント値をサンプル被験乳幼児間の総リード数の違いを補正したＲＰＭ値に変換し、当該ＲＰＭ値に整数１を加算し底２の対数値に変換した値（ｌｏｇ2（ＲＰＭ＋１）値）と、顔湿疹スコアについてスピアマンの順位相関係数を求める。
３）スピアマンの順位相関係数（ρ）の大きな遺伝子（上位遺伝子）を特徴量遺伝子として選択する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　当該１０種の遺伝子のうち、表中＊を付し太字で表示したＢＡＢＡＭ１、ＰＤＬＩＭ５、ＰＭＳ２Ｐ５、ＳＮＨＧ８、ＣＯＧ５、ＧＰＲ１３２、ＰＳＭＤ７及びＣＣＤＣ１３４の８種の遺伝子は、これまでに乳幼児顔湿疹との関係が報告されていない遺伝子であり、これら遺伝子群より選択される遺伝子又はその発現産物は、乳幼児顔湿疹の症度を検出するための新規な検出マーカーである。
　本発明では、当該８種の遺伝子群より選択される少なくとも１種の遺伝子又はその発現産物を検出マーカーとし、その発現レベルに基づいて乳幼児顔湿疹の症度を検出する。さらに当該８種の遺伝子群より選択される少なくとも１種の遺伝子又はその発現産物に加えて、ＮＲＩＰ１及びＰＰＩＡの２種の遺伝子群より選択される少なくとも１種の遺伝子又はその発現産物を検出マーカーとし、その発現レベルに基づいて乳幼児顔湿疹の症度を検出することが可能である。
　乳幼児顔湿疹の症度の検出により乳幼児の顔湿疹の状態、例えば、湿疹の発症の有無、湿疹の病態の進行度、湿疹の治癒の程度、湿疹に対する治療もしくは予防効果等を把握することができる。
　ＢＡＢＡＭ１、ＰＤＬＩＭ５、ＰＭＳ２Ｐ５、ＳＮＨＧ８、ＣＯＧ５、ＧＰＲ１３２、ＰＳＭＤ７及びＣＣＤＣ１３４の８種の遺伝子は、それぞれ単独で乳幼児顔湿疹の症度を検出するための検出マーカーとなり得るが、このうち、好ましくは２種以上、より好ましくは５種以上、さらに好ましくは８種全ての組み合わせを用いる。なかでも、ＢＡＢＡＭ１を必須として含む２種以上を選択することが好ましい。
　また、前記８種の遺伝子と組み合わせる、ＮＲＩＰ１及びＰＰＩＡから選択される少なくとも１種は、好ましくはＰＰＩＡであり、前記８種の遺伝子、ＮＲＩＰ１及びＰＰＩＡから、ＢＡＢＡＭ１とＰＰＩＡを含む２種以上を選択することがより好ましく、表１に示された１０種全てを選択することがさらに好ましい。
　上記の乳幼児顔湿疹の症度を検出するための検出マーカーとなり得る遺伝子（以下、「標的遺伝子」とも称す）には、乳幼児顔湿疹の症度を検出するためのバイオマーカーとなり得る限り、当該遺伝子を構成するＤＮＡの塩基配列と実質的に同一の塩基配列を有する遺伝子も包含される。ここで、実質的に同一の塩基配列とは、例えば、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ　ＢＬＡＳＴを用い、期待値＝１０；ギャップを許す；フィルタリング＝ＯＮ；マッチスコア＝１；ミスマッチスコア＝－３の条件にて検索をした場合、当該遺伝子を構成するＤＮＡの塩基配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましく９８％以上、さらに好ましくは９９％以上の同一性があることを意味する。
　本発明の乳幼児顔湿疹の症度を検出する方法は、被験乳幼児から採取された生体試料について、標的遺伝子、一態様として、ＢＡＢＡＭ１、ＰＤＬＩＭ５、ＰＭＳ２Ｐ５、ＳＮＨＧ８、ＣＯＧ５、ＧＰＲ１３２、ＰＳＭＤ７及びＣＣＤＣ１３４の８種の遺伝子群より選択される少なくとも１つの遺伝子又はその発現産物の発現レベルを測定する工程を含む。
　別の一態様として、被験乳幼児から採取された生体試料について、当該８種の遺伝子群より選択される少なくとも１つの遺伝子又はその発現産物の発現レベルと、ＮＲＩＰ１及びＰＰＩＡの２種の遺伝子群より選択される少なくとも１つの遺伝子又はその発現産物の発現レベルを測定する工程を含む。
　本発明における被験乳幼児は、例えば、乳幼児顔湿疹の検出を所望するか又は必要とする乳幼児が挙げられる。例えば、該被験乳幼児は、乳幼児顔湿疹を発症している乳幼児、乳幼児顔湿疹の発症が疑われる乳幼児、遺伝的に乳幼児顔湿疹の素因を有する乳幼児又は兄弟姉妹等の近親者が乳幼児顔湿疹を発症している若しくは発症していた乳幼児が挙げられる。
　本発明において用いられる生体試料としては、本発明の遺伝子が発現変化する細胞、組織及び生体材料であればよい。具体的には臓器、皮膚、血液、尿、唾液、汗、角層、皮膚表上脂質（ＳＳＬ）、組織浸出液等の体液、血液から調製された血清、血漿、その他、便、毛髪等が挙げられ、好ましくは皮膚又は皮膚表上脂質（ＳＳＬ）、より好ましくは皮膚表上脂質（ＳＳＬ）が挙げられる。ＳＳＬが採取される皮膚の部位としては、特に限定されず、頭、顔、首、体幹、手足等の身体の任意の部位の皮膚が挙げられるが、好ましくは乳幼児顔湿疹が生じやすい部位、例えば前頭部、側頭部、眼窩下部、頬骨部、耳下腺咬筋部、頬部、オトガイ部又はこれらを含む全顔等が挙げられる。ＳＳＬが採取される皮膚の部位は、乳幼児顔湿疹が発症している皮疹部であっても、発症していない無疹部であってもいずれでもよいが、好ましくは皮疹部又は皮疹部近傍の無疹部である。ここで皮疹部近傍とは、皮疹部に隣接する１０ｃｍ以内の範囲を指す。
　ここで、「皮膚表上脂質（ＳＳＬ）」とは、皮膚の表上に存在する脂溶性画分をいい、皮脂と呼ばれることもある。一般に、ＳＳＬは、皮膚にある皮脂腺等の外分泌腺から分泌された分泌物を主に含み、皮膚表面を覆う薄い層の形で皮膚表上に存在している。ＳＳＬは、皮膚細胞で発現したＲＮＡを含む。（前記特許文献１参照）。また本発明において、「皮膚」とは、特に限定しない限り、角層、表皮、真皮、毛包、ならびに汗腺、皮脂腺及びその他の腺等の組織を含む領域の総称である。
　被験乳幼児の皮膚からのＳＳＬの採取には、皮膚からのＳＳＬの回収又は除去に用いられているあらゆる手段を採用することができる。好ましくは、後述するＳＳＬ吸収性素材、ＳＳＬ接着性素材、又は皮膚からＳＳＬをこすり落とす器具を使用することができる。ＳＳＬ吸収性素材又はＳＳＬ接着性素材としては、ＳＳＬに親和性を有する素材であれば特に限定されず、例えばポリプロピレン、パルプ等が挙げられる。皮膚からのＳＳＬの採取手順のより詳細な例としては、あぶら取り紙、あぶら取りフィルム等のシート状素材へＳＳＬを吸収させる方法、ガラス板、テープ等へＳＳＬを接着させる方法、スパーテル、スクレイパー等によりＳＳＬをこすり落として回収する方法、等が挙げられる。ＳＳＬの吸着性を向上させるため、脂溶性の高い溶媒を予め含ませたＳＳＬ吸収性素材を用いてもよい。一方、ＳＳＬ吸収性素材は、水溶性の高い溶媒や水分を含んでいるとＳＳＬの吸着が阻害されるため、水溶性の高い溶媒や水分の含有量が少ないことが好ましい。ＳＳＬ吸収性素材は、乾燥した状態で用いることが好ましい。
　被験乳幼児から採取されたＲＮＡ含有ＳＳＬは一定期間保存されてもよい。採取されたＳＳＬは、含有するＲＮＡの分解を極力抑えるために、採取後できるだけ速やかに低温条件で保存することが好ましい。本発明における該ＲＮＡ含有ＳＳＬの保存の温度条件は、０℃以下であればよく、好ましくは－２０±２０℃～－８０±２０℃、より好ましくは－２０±１０℃～－８０±１０℃、さらに好ましくは－２０±２０℃～－４０±２０℃、さらに好ましくは－２０±１０℃～－４０±１０℃、さらに好ましくは－２０±１０℃、さらに好ましくは－２０±５℃である。該ＲＮＡ含有ＳＳＬの該低温条件での保存の期間は、特に限定されないが、好ましくは１２か月以下、例えば６時間以上１２ヶ月以下、より好ましくは６ヶ月以下、例えば１日間以上６ヶ月以下、さらに好ましくは３ヶ月以下、例えば３日間以上３ヶ月以下である。
　本発明において、標的遺伝子又はその発現産物の発現レベルの測定対象としては、ＲＮＡから人工的に合成されたｃＤＮＡ、そのＲＮＡをエンコードするＤＮＡ、そのＲＮＡにコードされるタンパク質、該タンパク質と相互作用をする分子、そのＲＮＡと相互作用する分子、又はそのＤＮＡと相互作用する分子等が挙げられる。ここで、ＲＮＡ、ＤＮＡ又はタンパク質と相互作用する分子としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、多糖、オリゴ糖、単糖、脂質、脂肪酸、及びこれらのリン酸化物、アルキル化物、糖付加物等、及び上記いずれかの複合体が挙げられる。また、発現レベルとは、当該遺伝子又は発現産物の発現量や活性を包括的に意味する。
　本発明の方法においては、好ましい態様として、生体試料としてＳＳＬが用いられるが、この場合にはＳＳＬに含まれるＲＮＡの発現レベルが解析され、具体的にはＲＮＡを逆転写によりｃＤＮＡに変換した後、該ｃＤＮＡ又はその増幅産物が測定される。
　ＳＳＬからのＲＮＡの抽出には、生体試料からのＲＮＡの抽出又は精製に通常使用される方法、例えば、フェノール/クロロホルム法、ＡＧＰＣ（ａｃｉｄ　ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ　ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ－ｐｈｅｎｏｌ－ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）法、又はＴＲＩｚｏｌ（登録商標）、ＲＮｅａｓｙ（登録商標）、ＱＩＡｚｏｌ（登録商標）等のカラムを用いた方法、シリカをコーティングした特殊な磁性体粒子を用いる方法、Ｓｏｌｉｄ　Ｐｈａｓｅ　Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ　Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ磁性体粒子を用いる方法、ＩＳＯＧＥＮ等の市販のＲＮＡ抽出試薬による抽出等を用いることができる。
　該逆転写には、解析したい特定のＲＮＡを標的としたプライマーを用いてもよいが、より包括的な核酸の保存及び解析のためにはランダムプライマーを用いることが好ましい。該逆転写には、一般的な逆転写酵素又は逆転写試薬キットを使用することができる。好適には、正確性及び効率性の高い逆転写酵素又は逆転写試薬キットが用いられ、その例としては、Ｍ－ＭＬＶ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ及びその改変体、あるいは市販の逆転写酵素又は逆転写試薬キット、例えばＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標）Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅシリーズ（タカラバイオ社）、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅシリーズ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）等が挙げられる。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）III  Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＶＩＬＯ　ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｋｉｔ（いずれもＴｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）等が好ましく用いられる。
　該逆転写における伸長反応は、温度を好ましくは４２℃±１℃、より好ましくは４２℃±０．５℃、さらに好ましくは４２℃±０．２５℃に調整し、一方、反応時間を好ましくは６０分間以上、より好ましくは８０～１２０分間に調整するのが好ましい。
　発現レベルを測定する方法は、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ又はＤＮＡを対象とする場合、これらにハイブリダイズするＤＮＡをプライマーとしたＰＣＲ法、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法、マルチプレックスＰＣＲ、ＳｍａｒｔＡｍｐ法、ＬＡＭＰ法等に代表される核酸増幅法、これらにハイブリダイズする核酸をプローブとして用いるハイブリダイゼーション法（ＤＮＡチップ、ＤＮＡマイクロアレイ、ドットブロットハイブリダイゼーション、スロットブロットハイブリダイゼーション、ノーザンブロットハイブリダイゼーション等）、塩基配列を決定する方法（シーケンシング）、又はこれらを組み合わせた方法から選ぶことができる。
　ＰＣＲでは、解析したい特定のＤＮＡを標的としたプライマーペアを用いて該特定の１種のＤＮＡのみを増幅してもよいが、複数のプライマーペアを用いて同時に複数の特定のＤＮＡを増幅してもよい。好ましくは、該ＰＣＲはマルチプレックスＰＣＲである。マルチプレックスＰＣＲは、ＰＣＲ反応系に複数のプライマー対を同時に使用することで、複数の遺伝子領域を同時に増幅する方法である。マルチプレックスＰＣＲは、市販のキット（例えば、Ｉｏｎ　ＡｍｐｌｉＳｅｑＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ　Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｋｉｔ；ライフテクノロジーズジャパン株式会社等）を用いて実施することができる。
　該ＰＣＲにおけるアニーリング及び伸長反応の温度は、使用するプライマーに依存するため一概には言えないが、上記のマルチプレックスＰＣＲキットは用いる場合、好ましくは６２℃±１℃、より好ましくは６２℃±０．５℃、さらに好ましくは６２℃±０．２５℃である。したがって、該ＰＣＲでは、好ましくはアニーリング及び伸長反応が１ステップで行われる。該アニーリング及び伸長反応のステップの時間は、増幅すべきＤＮＡのサイズ等に依存して調整され得るが、好ましくは１４～１８分間である。該ＰＣＲにおける変性反応の条件は、増幅すべきＤＮＡに依存して調整され得るが、好ましくは９５～９９℃で１０～６０秒間である。上記のような温度及び時間での逆転写及びＰＣＲは、一般的にＰＣＲに使用されるサーマルサイクラーを用いて実行することができる。
　当該ＰＣＲで得られた反応産物の精製は、反応産物のサイズ分離によって行われることが好ましい。サイズ分離により、目的のＰＣＲ反応産物を、ＰＣＲ反応液中に含まれるプライマーやその他の不純物から分離することができる。ＤＮＡのサイズ分離は、例えば、サイズ分離カラムや、サイズ分離チップ、サイズ分離に利用可能な磁気ビーズ等によって行うことができる。サイズ分離に利用可能な磁気ビーズの好ましい例としては、Ａｍｐｕｒｅ　ＸＰ等のＳｏｌｉｄ　Ｐｈａｓｅ　Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ　Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ（ＳＰＲＩ）磁性ビーズが挙げられる。
　精製したＰＣＲ反応産物に対して、その後の定量解析を行うために必要なさらなる処理を施してもよい。例えば、ＤＮＡのシーケンシングのために、精製したＰＣＲ反応産物を、適切なバッファー溶液へと調製したり、ＰＣＲ増幅されたＤＮＡに含まれるＰＣＲプライマー領域を切断したり、増幅されたＤＮＡにアダプター配列をさらに付加したりしてもよい。例えば、精製したＰＣＲ反応産物をバッファー溶液へと調製し、増幅ＤＮＡに対してＰＣＲプライマー配列の除去及びアダプターライゲーションを行い、得られた反応産物を、必要に応じて増幅して、定量解析のためのライブラリーを調製することができる。これらの操作は、例えば、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＶＩＬＯ　ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｋｉｔ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）に付属している５×ＶＩＬＯ　ＲＴ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｍｉｘ、及びＩｏｎ　ＡｍｐｌｉＳｅｑ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ　Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｋｉｔ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）に付属している５×Ｉｏｎ　ＡｍｐｌｉＳｅｑ　ＨｉＦｉ　Ｍｉｘ、及びＩｏｎ　ＡｍｐｌｉＳｅｑ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ　Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｃｏｒｅ　Ｐａｎｅｌを用いて、各キット付属のプロトコルに従って行うことができる。
　ノーザンブロットハイブリダイゼーション法を利用して標的遺伝子又はそれに由来する核酸の発現量を測定する場合は、例えば、まずプローブＤＮＡを放射性同位元素、蛍光物質等で標識し、次いで、得られた標識ＤＮＡを、常法に従ってナイロンメンブレン等にトランスファーした生体試料由来のＲＮＡとハイブリダイズさせる。その後、形成された標識ＤＮＡとＲＮＡとの二重鎖を、標識物に由来するシグナルを検出することにより測定する方法が挙げられる。
　ＲＴ－ＰＣＲ法を用いて標的遺伝子又はそれに由来する核酸の発現量を測定する場合は、例えば、まず生体試料由来のＲＮＡから常法に従ってｃＤＮＡを調製し、これを鋳型として本発明の標的遺伝子が増幅できるように調製した一対のプライマー（上記ｃＤＮＡ（－鎖）に結合する正鎖、＋鎖に結合する逆鎖）をこれとハイブリダイズさせる。その後、常法に従ってＰＣＲ法を行い、得られた増幅二本鎖ＤＮＡを検出する。増幅された二本鎖ＤＮＡの検出には、予めＲＩ、蛍光物質等で標識しておいたプライマーを用いて上記ＰＣＲを行うことによって産生される標識二本鎖ＤＮＡを検出する方法等を用いることができる。
　ＤＮＡマイクロアレイを用いて標的遺伝子又はそれに由来する核酸の発現量を測定する場合は、例えば、支持体に本発明の標的遺伝子由来の核酸（ｃＤＮＡ又はＤＮＡ）の少なくとも１種を固定化したアレイを用い、ｍＲＮＡから調製した標識化ｃＤＮＡ又はｃＲＮＡをマイクロアレイ上に結合させ、マイクロアレイ上の標識を検出することによって、ｍＲＮＡの発現量を測定することができる。
　前記アレイに固定化される核酸としては、ストリンジェントな条件下に特異的（すなわち、実質的に目的の核酸のみに）にハイブリダイズする核酸であればよく、例えば、本発明の標的遺伝子の全配列を有する核酸であってもよく、部分配列からなる核酸であってもよい。ここで、「部分配列」とは、少なくとも１５～２５塩基からなる核酸が挙げられる。ここでストリンジェントな条件は、通常「１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、３７℃」程度の洗浄条件を挙げることができ、より厳しいハイブリダイズ条件としては「０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」程度、さらに厳しいハイブリダイズ条件としては「０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」程度の条件を挙げることができる。ハイブリダイズ条件は、J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)等に記載されている。
　シーケンシングによって標的遺伝子又はそれに由来する核酸の発現量を測定する場合は、例えば、次世代シーケンサー（例えばＩｏｎ　Ｓ５／ＸＬシステム、ライフテクノロジーズジャパン株式会社）が用いて解析することが挙げられる。シーケンシングで作成されたリードの数（リードカウント）に基づいて、ＲＮＡ発現を定量することができる。
　上記の測定に用いられるプローブ又はプライマー、すなわち、本発明の標的遺伝子又はそれに由来する核酸を特異的に認識し増幅するためのプライマー、又は該ＲＮＡ又はそれに由来する核酸を特異的に検出するためのプローブがこれに該当するが、これらは、当該標的遺伝子を構成する塩基配列に基づいて設計することができる。ここで「特異的に認識する」とは、例えばノーザンブロット法において、実質的に本発明の標的遺伝子又はそれに由来する核酸のみを検出できること、また例えばＲＴ－ＰＣＲ法において、実質的に当該核酸のみが増幅される如く、当該検出物又は生成物が当該遺伝子又はそれに由来する核酸であると判断できることを意味する。
　具体的には、本発明の標的遺伝子を構成する塩基配列からなるＤＮＡ又はその相補鎖に相補的な一定数のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを利用することができる。ここで「相補鎖」とは、Ａ：Ｔ（ＲＮＡの場合はＵ）、Ｇ：Ｃの塩基対からなる２本鎖ＤＮＡの一方の鎖に対する他方の鎖を指す。また、「相補的」とは、当該一定数の連続したヌクレオチド領域で完全に相補配列である場合に限られず、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、よりさらに好ましくは９８％以上の塩基配列上の同一性を有すればよい。
　塩基配列の同一性は、前記ＢＬＡＳＴ等のアルゴリズムにより決定することができる。
　斯かるオリゴヌクレオチドは、プライマーとして用いる場合には、特異的なアニーリング及び鎖伸長ができればよく、通常、例えば１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上、より好ましくは２０塩基以上、かつ例えば１００塩基以下、好ましくは５０塩基以下、より好ましくは３５塩基以下の鎖長を有するものが挙げられる。また、プローブとして用いる場合には、特異的なハイブリダイゼーションができればよく、本発明の標的遺伝子を構成する塩基配列からなるＤＮＡ（又はその相補鎖）の少なくとも一部若しくは全部の配列を有し、例えば１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上、かつ例えば１００塩基以下、好ましくは５０塩基以下、より好ましくは２５塩基以下の鎖長のものが用いられる。
　なお、ここで、「オリゴヌクレオチド」は、ＤＮＡあるいはＲＮＡであることができ、合成されたものでも天然のものでもよい。又、ハイブリダイゼーションに用いるプローブは、通常標識したものが用いられる。
　また、本発明の標的遺伝子の翻訳産物（タンパク質）、当該タンパク質と相互作用する分子、ＲＮＡと相互作用する分子、又はＤＮＡと相互作用する分子を測定する場合は、プロテインチップ解析、免疫測定法（例えば、ＥＬＩＳＡ等）、質量分析（例えば、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＭＳ）、１－ハイブリッド法（PNAS 100, 12271-12276(2003)）や２－ハイブリッド法（Biol. Reprod. 58, 302-311 (1998)）のような方法を用いることができ、対象に応じて適宜選択できる。
　例えば、測定対象としてタンパク質が用いられる場合は、本発明の発現産物を特異的に認識する抗体、具体的には発現産物であるタンパク質を他のタンパク質から識別することが可能な構造的特徴部位（エピトープ）を認識する抗体を生体試料と接触させ、当該抗体に結合した試料中のポリペプチド又はタンパク質を検出し、そのレベルを測定することによって実施される。例えば、ウェスタンブロット法によれば、一次抗体として上記の抗体を用いた後、二次抗体として放射性同位元素、蛍光物質又は酵素等で標識した一次抗体に結合する抗体を用いて、その一次抗体を標識し、これら標識物質由来のシグナルを放射線測定器、蛍光検出器等で測定することが行われる。
　尚、上記翻訳産物に対する抗体は、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよい。これらの抗体は、公知の方法に従って製造することができる。具体的には、ポリクローナル抗体は、常法に従って大腸菌等で発現し精製したタンパク質を用いて、あるいは常法に従って当該タンパク質の部分ポリペプチドを合成して、家兎等の非ヒト動物に免疫し、該免疫動物の血清から常法に従って得ることが可能である。
　一方、モノクローナル抗体は、常法に従って大腸菌等で発現し精製したタンパク質又は該タンパク質の部分ポリペプチドをマウス等の非ヒト動物に免疫し、得られた脾臓細胞と骨髄腫細胞とを細胞融合させて調製したハイブリドーマ細胞から得ることができる。また、モノクローナル抗体は、ファージディスプレイを用いて作製してもよい（Griffiths, A.D.; Duncan, A.R., Current Opinion in Biotechnology, Volume 9, Number 1, February 1998 , pp. 102-108(7)）。
　斯くして、被験乳幼児から採取された生体試料中の本発明の標的遺伝子又はその発現産物の発現レベルが測定され、当該発現レベルに基づいて当該被験乳幼児の顔湿疹の症度が検出される。
　また本発明では、被験乳幼児から採取された生体試料中の本発明の標的遺伝子又はその発現産物の発現レベルを少なくとも２つの時期に測定し、発現レベルの変化、又は変化量を指標に、被験乳幼児における顔湿疹の症度の変化の有無、又は変化の程度を検出することができる。
　検出は、具体的には、測定された本発明の標的遺伝子又はその発現産物の発現レベルを予め設定したカットオフ値（参照値）と比較することによって行われる。
　シーケンシングにより複数の標的遺伝子の発現レベルの解析を行う場合は、上記したように、発現量のデータであるリードカウント値、当該リードカウント値をサンプル間の総リード数の違いを補正したＲＰＭ値、当該ＲＰＭ値を底２の対数値に変換した値（ｌｏｇ2ＲＰＭ値）又は整数１を加算した底２の対数値（ｌｏｇ2（ＲＰＭ＋１）値）、あるいはＤＥＳｅｑ２（Love MI et al. Genome Biol. 2014）を用いて補正されたカウント値（Ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ　ｃｏｕｎｔ値）又は整数１を加算した底２の対数値（ｌｏｇ2（Ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ　ｃｏｕｎｔ＋１）値）を指標として用いるのが好ましい。また、ＲＮＡ－ｓｅｑの定量値として一般的な、ｆｒａｇｍｅｎｔｓ　ｐｅｒ　ｋｉｌｏｂａｓｅ　ｏｆ　ｅｘｏｎ　ｐｅｒ　ｍｉｌｌｉｏｎ　ｒｅａｄｓ　ｍａｐｐｅｄ　（ＦＰＫＭ）、ｒｅａｄｓ　ｐｅｒ　ｋｉｌｏｂａｓｅ　ｏｆ　ｅｘｏｎ　ｐｅｒ　ｍｉｌｌｉｏｎ　ｒｅａｄｓ　ｍａｐｐｅｄ　（ＲＰＫＭ）、ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ　ｐｅｒ　ｍｉｌｌｉｏｎ　（ＴＰＭ）等によって算出される値であってもよい。また、マイクロアレイ法によって得られるシグナル値、及びその補正値であってもよい。また、ＲＴ－ＰＣＲ等により特定の標的遺伝子のみの解析を行う場合には、対象遺伝子の発現量をハウスキーピング遺伝子の発現量を基準とする相対的な発現量に変換して解析する方法、又は標的遺伝子の領域を含むプラスミドを用いて絶対的なコピー数を定量（絶対定量）して解析する方法が好ましい。デジタルＰＣＲ法によって得られるコピー数であってもよい。
　ここで、「カットオフ値」（「参照値」）は、顔湿疹スコアと、本発明の標的遺伝子又はその発現産物の発現レベルの関係に基づき、予め決定することができる。例えば、ある集団を、顔湿疹の状態、すなわち顔湿疹スコアより症状なし、軽微、軽度、軽度から中等度、中等度、中等度から重度、重度の群に分け、それぞれの群における当該標的遺伝子又はその発現産物の発現レベルの平均値や標準偏差等の統計値を参考に決定した値を、それぞれの群への属否を判別するカットオフ値（参照値）として決定することができる。
　標的遺伝子として複数種の遺伝子を用いる場合は、それぞれ各々の遺伝子又はその発現産物についてカットオフ値（参照値）を求めることが好ましい。
　集団としては、性別、人種、年齢毎に集団を形成してもよい。
　さらに、本発明の標的遺伝子又はその発現産物の発現レベルの測定値を利用して、判別式（予測モデル）を構築し、当該判別式を利用して、乳幼児顔湿疹の症度を検出することができる。例えば、当該標的遺伝子又はその発現産物の発現レベルの測定値を説明変数とし、顔湿疹スコア（例えば、スコアを偏差値に変換した値）を目的変数とした機械学習により、乳幼児顔湿疹の症度を検出するための最適な判別式（予測モデル）を構築することができる。
　そして、被験乳幼児から採取された生体試料から本発明の標的遺伝子又はその発現産物の発現レベルを同様に測定し、得られた測定値を当該判別式（予測モデル）に入力し、当該判別式から得られた結果（顔湿疹スコアの予測値）を、被験乳幼児における顔湿疹の症度として検出できる。
　さらに、症度が異なる顔湿疹乳幼児由来の標的遺伝子又はその発現産物の発現レベルと、健常乳幼児由来の標的遺伝子又はその発現産物の発現レベルの測定値を利用して、症度が異なる顔湿疹乳幼児群（例えば、軽微、軽度、軽度から中等度、中等度、中等度から重度、重度等の症度から選択される、２以上の群）及び健常乳幼児（症状なし）とを分ける判別式（予測モデル）を構築し、当該判別式を利用して、乳幼児顔湿疹の症度を検出することができる。すなわち、症度が異なる顔湿疹乳幼児群由来の標的遺伝子又はその発現産物の発現レベルと、健常乳幼児由来の標的遺伝子又はその発現産物の発現レベルの測定値を教師サンプルとして、症度が異なる顔湿疹乳幼児群（例えば、軽微、軽度、軽度から中等度、中等度、中等度から重度、重度等の症度から選択される、２以上の群）及び健常乳幼児（症状なし）を分ける判別式（予測モデル）を構築し、当該判別式に基づいて症度が異なる各顔湿疹乳幼児群を判別するカットオフ値（参照値）を求める。
　そして、被験乳幼児から採取された生体試料から標的遺伝子又はその発現産物のレベルを同様に測定し、得られた測定値を当該判別式に代入し、当該判別式から得られた結果をカットオフ値（参照値）と比較することによって、当該被検乳幼児における顔湿疹の症度を検出できる。
　判別式（予測モデル）の構築におけるアルゴリズムとしては、機械学習に用いるアルゴリズム等の公知のものを利用することができる。機械学習アルゴリズムの例としては、ランダムフォレスト（Ｒａｎｄｏｍ　ｆｏｒｅｓｔ）、線形カーネルのサポートベクターマシン（ＳＶＭ　ｌｉｎｅａｒ）、ｒｂｆカーネルのサポートベクターマシン（ＳＶＭ　ｒｂｆ）、ニューラルネットワーク（Ｎｅｒｕｒａｌ　ｎｅｔ）、一般線形モデル（Ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ　ｌｉｎｅａｒ　ｍｏｄｅｌ）、正則化線形判別分析（Ｒｅｇｕｌａｒｉｚｅｄ　ｌｉｎｅａｒ　ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｎｔ　ａｎａｌｙｓｉｓ）、正則化ロジスティック回帰（Ｒｅｇｕｌａｒｉｚｅｄ　ｌｏｇｉｓｔｉｃ　ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ）、ラッソ（Ｌｅａｓｔ　Ａｂｓｏｌｕｔｅ　Ｓｈｒｉｎｋａｇｅ　ａｎｄ　Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ　Ｏｐｅｒａｔｏｒ）回帰等が挙げられる。構築した予測モデルに検証用のデータを入力して予測値を算出し、当該予測値が実測値と最も適合するモデル、例えば正解率（Ａｃｃｕｒａｃｙ）が最も大きいモデルを最適な予測モデルとして選抜することができる。また、予測値と実測値から検出率（Ｒｅｃａｌｌ）、精度（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ）、及びそれらの調和平均であるＦ値を計算し、そのＦ値が最も大きいモデルを最適な予測モデルとして選抜することができる。また、予測値と実測値の二乗平均平方根誤差（ＲＭＳＥ）を予測モデルの精度評価指標として用い、そのＲＭＳＥの最も小さいモデルを最適な予測モデルとして選抜することができる。
　カットオフ値（参照値）の決定方法は特に制限されず、公知の手法に従って決定することができる。例えば、判別式（予測モデル）を使用して作成されたＲＯＣ（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ　Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ　Ｃｕｒｖｅ）曲線より求めることができる。ＲＯＣ曲線では、縦軸に陽性被験者において陽性の結果がでる確率（感度）と、横軸に陰性被験者において陰性の結果がでる確率（特異度）を１から減算した値（偽陽性率）がプロットされる。ＲＯＣ曲線に示される「真陽性（感度）」及び「偽陽性（１－特異度）」に関し、「真陽性（感度）」－「偽陽性（１－特異度）」が最大となる値（Ｙｏｕｄｅｎ　ｉｎｄｅｘ）をカットオフ値（参照値）とすることができる。
　本発明の乳幼児顔湿疹の症度を検出するための検査用キットは、被験乳幼児から分離した生体試料における本発明の標的遺伝子又はその発現産物の発現レベルを測定するための検査試薬を含有するものである。具体的には、本発明の標的遺伝子又はそれに由来する核酸と特異的に結合（ハイブリダイズ）するオリゴヌクレオチド（例えば、ＰＣＲ用のプライマー）を含む、核酸増幅、ハイブリダイゼーションのための試薬、或いは、本発明の標的遺伝子の発現産物（タンパク質）を認識する抗体を含む免疫学的測定のための試薬等が挙げられる。当該キットに包含されるオリゴヌクレオチド、抗体等は、上述したとおり公知の方法により得ることができる。
　また、当該検査用キットには、上記抗体や核酸の他、標識試薬、緩衝液、発色基質、二次抗体、ブロッキング剤や、試験に必要な器具やポジティブコントロールやネガティブコントロールとして使用するコントロール試薬、生体試料を採取するための用具（例えば、ＳＳＬを採取するためのあぶら取りフィルム等）等を含むことができる。
　上述した実施形態に関し、本発明は以下の態様をさらに開示する。
＜１＞被験乳幼児から採取された生体試料について、ＢＡＢＡＭ１、ＰＤＬＩＭ５、ＰＭＳ２Ｐ５、ＳＮＨＧ８、ＣＯＧ５、ＧＰＲ１３２、ＰＳＭＤ７及びＣＣＤＣ１３４の８種の遺伝子群より選択される少なくとも１つの遺伝子又はその発現産物の発現レベルを測定する工程を含む、当該乳幼児の顔湿疹の症度を検出する方法。
＜２＞前記ＢＡＢＡＭ１、ＰＤＬＩＭ５、ＰＭＳ２Ｐ５、ＳＮＨＧ８、ＣＯＧ５、ＧＰＲ１３２、ＰＳＭＤ７及びＣＣＤＣ１３４の８種の遺伝子群より選択される好ましくは２種以上、より好ましくは５種以上、さらに好ましくはＢＡＢＡＭ１を必須として含む２種以上、さらに好ましくは８種全ての遺伝子又はその発現産物の発現レベルが測定される＜１＞記載の検出方法。
＜３＞好ましくは、さらにＮＲＩＰ１及びＰＰＩＡの２種の遺伝子群より選択される少なくとも１つの遺伝子又はその発現産物の発現レベルを測定する工程を含む、＜１＞又は＜２＞記載の検出方法。
＜４＞好ましくはＰＰＩＡ、より好ましくはＢＡＢＡＭ１及びＰＰＩＡを含む２種以上、さらに好ましくは前記表１に示された１０種全ての遺伝子又はその発現産物の発現レベルが測定される＜３＞記載の検出方法。
＜５＞前記生体試料が、被験乳幼児の好ましくは臓器、皮膚、血液、尿、唾液、汗、角層、皮膚表上脂質（ＳＳＬ）、組織浸出液等の体液、血液から調製された血清、血漿、便又は毛髪であり、より好ましくは皮膚又は皮膚表上脂質（ＳＳＬ）であり、さらに好ましくは皮膚表上脂質（ＳＳＬ）である＜１＞～＜４＞のいずれかに記載の検出方法。
＜６＞前記遺伝子又はその発現産物の発現レベルの測定対象が、好ましくはＲＮＡから人工的に合成されたｃＤＮＡ、そのＲＮＡをエンコードするＤＮＡ、そのＲＮＡにコードされるタンパク質、該タンパク質と相互作用をする分子、そのＲＮＡと相互作用する分子、又はそのＤＮＡと相互作用する分子である＜１＞～＜５＞のいずれかに記載の検出方法。
＜７＞前記遺伝子又はその発現産物の発現レベルが、好ましくは被験乳幼児の皮膚表上脂質（ＳＳＬ）から採取されたｍＲＮＡの発現量である＜１＞～＜５＞のいずれかに記載の検出方法。
＜８＞前記被験乳幼児が、乳幼児顔湿疹を発症している乳幼児、乳幼児顔湿疹の発症が疑われる乳幼児、遺伝的に乳幼児顔湿疹の素因を有する乳幼児又は兄弟姉妹等の近親者が乳幼児顔湿疹を発症している若しくは発症していた乳幼児である＜７＞記載の検出方法。
＜９＞前記被験乳幼児の皮膚が、前頭部、側頭部、眼窩下部、頬骨部、耳下腺咬筋部、頬部又はオトガイ部の皮膚である＜７＞又は＜８＞記載の検出方法。
＜１０＞皮膚表上脂質（ＳＳＬ）が採取される皮膚の部位は、乳幼児顔湿疹が発症している皮疹部であっても、発症していない無疹部であってもいずれでもよいが、好ましくは皮疹部又は皮疹部近傍の無疹部である＜７＞～＜９＞のいずれかに記載の検出方法。
＜１１＞アトピー性皮膚炎による顔湿疹を含まない＜１＞～＜１０＞のいずれかに記載の検出方法。
＜１２＞前記遺伝子又はその発現産物の発現レベルに基づいて前記被験乳幼児の顔湿疹の症度を検出することを含む＜１＞～＜１１＞のいずれかに記載の検出方法。
＜１３＞好ましくは、前記遺伝子又はその発現産物の発現レベルに基づく判別式（予測モデル）を用いて乳幼児顔湿疹の症度を検出することを含み、
　前記判別式（予測モデル）が、前記遺伝子又はその発現産物の発現レベルの測定値を説明変数とし、顔湿疹スコアを目的変数とした機械学習により構築される＜１＞～＜１２＞のいずれかに記載の検出方法。
＜１４＞前記乳幼児顔湿疹の症度が、評価部位の紅斑、丘疹、浸軟、落屑及び掻破痕の５症状について０：症状なし、１：軽微、２：軽度、３：軽度から中等度、４：中等度、５：中等度から重度、６：重度の７段階のスコアを付し、当該スコアを合算した値（合算値）に対応する症度である＜１＞～＜１３＞のいずれかに記載の検出方法。
＜１５＞前記評価部位が、乳幼児の顔全体である＜１４＞記載の検出方法。
＜１６＞前記遺伝子又はそれに由来する核酸と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、又は前記遺伝子の発現産物を認識する抗体を含有する、＜１＞～＜１５＞の検出方法に用いられる乳幼児顔湿疹の症度を検出するための検査用キット。
＜１７＞ＢＡＢＡＭ１、ＰＤＬＩＭ５、ＰＭＳ２Ｐ５、ＳＮＨＧ８、ＣＯＧ５、ＧＰＲ１３２、ＰＳＭＤ７及びＣＣＤＣ１３４の８種の遺伝子群より選択される少なくとも１つの遺伝子又はその発現産物からなる、乳幼児顔湿疹の症度を検出するための検出マーカー。
＜１８＞被験乳幼児から採取された生体試料に由来するＢＡＢＡＭ１、ＰＤＬＩＭ５、ＰＭＳ２Ｐ５、ＳＮＨＧ８、ＣＯＧ５、ＧＰＲ１３２、ＰＳＭＤ７及びＣＣＤＣ１３４の８種の遺伝子群より選択される少なくとも１つの遺伝子又はその発現産物の、乳幼児顔湿疹の症度の検出マーカーとしての使用。
＜１９＞遺伝子又はその発現産物が前記被験乳幼児の皮膚表上脂質に含まれるｍＲＮＡである、＜１８＞記載の使用。
実施例１　ＳＳＬから抽出されたＲＮＡを用いた顔湿疹の症度の検出
１）被験乳幼児及び顔湿疹スコアの測定
　生後３～８ヵ月の日本人男女乳幼児６１名を被験乳幼児とした。当該被験乳幼児にはアトピー性皮膚炎の診断を受けている者が含まれないことを皮膚科医により確認した。
　被験乳幼児の全顔を対象に、紅斑、丘疹、浸軟、落屑、掻破痕の５症状それぞれについて表２に示す基準に基づき皮膚科医が診察によりスコアを付け、当該スコアを合算した値（合算値）を顔湿疹スコアとした。
　その結果、症状なし（スコア０）は１名、軽微（スコア１～５）は４７名、軽度（スコア６～１０）は１１名、軽度から中等度（スコア１１～１５）は２名、中等度（スコア１６～２０）は０名、中等度から重度（スコア２１～２５）は０名、重度（スコア２６～３０）は０名であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
２）ＳＳＬ採取
　各被験乳幼児の目元、口元を除く全顔からあぶら取りフィルム（５×８ｃｍ、ポリプロピレン製、３Ｍ社）を用いて皮脂を回収後、該あぶら取りフィルムをバイアルに移し、ＲＮＡ抽出に使用するまで－８０℃にて保存した。
３）ＲＮＡ調製及びシーケンシング
　上記２）のあぶら取りフィルムを適当な大きさに切断し、ＱＩＡｚｏｌ　Ｌｙｓｉｓ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、付属のプロトコルに準じてＲＮＡを抽出した。抽出されたＲＮＡを元に、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ　ＶＩＬＯ　ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｋｉｔ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を用いて４２℃、９０分間逆転写を行いｃＤＮＡの合成を行った。逆転写反応のプライマーには、キットに付属しているランダムプライマーを使用した。得られたｃＤＮＡから、マルチプレックスＰＣＲにより２０８０２遺伝子に由来するＤＮＡを含むライブラリーを調製した。マルチプレックスＰＣＲは、Ｉｏｎ　ＡｍｐｌｉＳｅｑＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ　Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｋｉｔ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を用いて、［９９℃、２分→（９９℃、１５秒→６２℃、１６分）×２０サイクル→４℃、Ｈｏｌｄ］の条件で行った。得られたＰＣＲ産物は、Ａｍｐｕｒｅ　ＸＰ（ベックマン・コールター株式会社）で精製した後に、バッファーの再構成、プライマー配列の消化、アダプターライゲーションと精製、増幅を行い、ライブラリーを調製した。調製したライブラリーをＩｏｎ　５４０　Ｃｈｉｐにローディングし、Ｉｏｎ　Ｓ５／ＸＬシステム（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を用いてシーケンシングした。
４）データ解析
（１）使用データ
　上記３）で測定したＳＳＬ由来ＲＮＡの発現量のデータ（リードカウント値）を取得し、サンプル被験乳幼児間の総リード数の違いを補正したＲＰＭ値に変換した。特徴量遺伝子の選択及び機械学習モデルの構築には、負の二項分布に従うＲＰＭ値を正規分布に近似するため、ＲＰＭ値に整数１を加算した底２の対数値（ｌｏｇ2（ＲＰＭ＋１）値）を用いた。なお、全サンプル被験乳幼児の発現量データのうち９０％以上のサンプル被験乳幼児で欠損値ではない発現量データが得られている５１００遺伝子のみ以下の解析に使用した。
（２）データセット分割
　被験乳幼児６１名のデータセットのうち、５０名のＲＮＡプロファイルデータをモデル構築のＴｒａｉｎデータとし、残り１１名分のＲＮＡプロファイルデータをモデル精度評価に使用するＴｅｓｔデータとした。
　データ分割は［Ｒ］のｃｒｅａｔｅＤａｔａＰａｒｔｉｔｉｏｎ関数を用い、ＴｒａｉｎデータとＴｅｓｔデータ間で目的変数の分布が均一になるように実施した。
（３）特徴量遺伝子の選択
　（２）で分割されたＴｒａｉｎデータを用いて、分類予測モデルに適すると推測される特徴量遺伝子をスピアマンの相関係数に基づいて選択した。
　Ｔｒａｉｎデータの由来元である５０名の被験乳幼児の顔湿疹スコアと、全ての遺伝子ＲＮＡ発現データの組み合わせについてスピアマンの順位相関係数を求めた。
　その結果、表３に示すスピアマンの順位相関係数（ρ）の大きな遺伝子上位１０遺伝子を特徴量遺伝子として選択した。表中＊を付し太字で表示した８遺伝子は、これまでに乳幼児顔湿疹との関連が報告されていない遺伝子であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
（４）ｃａｒｅｔパッケージ用いた顔湿疹スコア予測モデル作成
　顔湿疹スコアと相関が高い遺伝子上位１０遺伝子を特徴量として選抜し、ｃａｒｅｔパッケージで顔湿疹スコア予測モデルを構築した。ＳＳＬ由来ＲＮＡから選択された前記特徴量遺伝子の発現量のデータ（ｌｏｇ2（ＲＰＭ＋１）値）を説明変数とし、顔湿疹スコアを偏差値に変換した値を目的変数として用いた。
　上記で選抜した特徴量を用い、Ｔｒａｉｎデータで、ｃａｒｅｔパッケージで線形回帰モデル（Ｌｍ）、ランダムフォレスト（Ｒｆ）、ニューラルネットワーク（Ｎｎｅｔ）、ラッソ回帰（Ｌａｓｓｏ）、ｒｂｆカーネルのサポートベクターマシーン（ＳＶＭ　ｒｂｆ）、線形カーネルのサポートベクターマシーン（ＳＶＭ　ｌｉｎｅａｒ）の６つのアルゴリズムで顔湿疹スコア予測モデルを構築した。データの偏りがモデルに与える影響を抑えるために、モデル作成は１０回の交差検証を行った。最良の予測モデルの指標として、ＲＭＳＥ（二乗平均平方根誤差）を算出し、最も値が小さかったモデルを最良モデルに選択した。次いで、最良モデルに対し、Ｔｅｓｔデータの特徴量遺伝子発現量（ｌｏｇ2（ＲＰＭ＋１）値）を入力して、顔湿疹スコアの予測値（予測スコア）を計算した。得られた予測値（予測スコア）と実際の診断スコアとの間のＰＥＡＲＳＯＮ相関係数を算出し、この値が１に近いほど、予測精度が高いモデルであるとした。
（５）結果
　図１に示すように、顔湿疹スコアとの相関係数が上位の１０遺伝子を特徴量に用いた場合、ランダムフォレストによるモデル（モデル１）がＲＭＳＥ＝９．６１で最も精度が高かった。その時のＴｅｓｔデータによる予測スコアと診断スコアの相関係数は０．７１８（ｐ＝０．０１９）であった。
　このことから、顔湿疹スコアとの相関性により抽出した１０遺伝子は、乳幼児顔湿疹スコアの回帰予測に重要な遺伝子であり、乳幼児顔湿疹の症度の検出に有用であることが明らかとなった。
　また、１０種から選択されたＢＡＢＡＭ１とＰＰＩＡの２種遺伝子を用いて顔湿疹スコア予測モデルを構築した場合、線形回帰モデルによるモデルがＲＭＳＥ＝１０．６１で最も精度が高く、その時のＴｅｓｔデータによる予測スコアと診断スコアの相関係数は０．５７５（ｐ＝０．０６４）であり、顔湿疹スコアの予測が可能であることが確認された。
　さらに、ＢＡＢＡＭ１又はＰＰＩＡのいずれか１種のみを用いて顔湿疹スコア予測モデルを構築したところ、Ｔｅｓｔデータによる予測スコアと診断スコアの相関係数はそれぞれ、０．５４５（ニューラルネットワーク、ＲＭＳＥ＝１１．０２）（ｐ＝０．０８）、０．６１９（線形回帰モデル、ＲＭＳＥ＝１０．０２）（ｐ＜０．０５）であり、重要な遺伝子であることが明らかとなった。

Claims (10)

  1. 　被験乳幼児から採取された生体試料について、ＢＡＢＡＭ１、ＰＤＬＩＭ５、ＰＭＳ２Ｐ５、ＳＮＨＧ８、ＣＯＧ５、ＧＰＲ１３２、ＰＳＭＤ７及びＣＣＤＣ１３４の８種の遺伝子群より選択される少なくとも１つの遺伝子又はその発現産物の発現レベルを測定する工程を含む、当該乳幼児の顔湿疹の症度を検出する方法。
  2. 　さらにＮＲＩＰ１及びＰＰＩＡの２種の遺伝子群より選択される少なくとも１つの遺伝子又はその発現産物の発現レベルを測定する工程を含む、請求項１記載の検出方法。
  3. 　前記遺伝子又はその発現産物の発現レベルがｍＲＮＡの発現量である請求項１又は２記載の検出方法。
  4. 　前記生体試料が被験乳幼児の皮膚表上脂質である請求項１～３のいずれか１項記載の検出方法。
  5. 　前記被験乳幼児の皮膚が前頭部、側頭部、眼窩下部、頬骨部、耳下腺咬筋部、頬部又はオトガイ部の皮膚である請求項４のいずれか１項記載の検出方法。
  6. 　前記遺伝子又はその発現産物の発現レベルに基づいて前記被験乳幼児の顔湿疹の症度を検出することを含む請求項１～５のいずれか１項記載の検出方法。
  7. 　前記遺伝子又はそれに由来する核酸と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、又は前記遺伝子の発現産物を認識する抗体を含有する、請求項１～６の検出方法に用いられる乳幼児顔湿疹の症度を検出するための検査用キット。
  8. 　ＢＡＢＡＭ１、ＰＤＬＩＭ５、ＰＭＳ２Ｐ５、ＳＮＨＧ８、ＣＯＧ５、ＧＰＲ１３２、ＰＳＭＤ７及びＣＣＤＣ１３４の８種の遺伝子群より選択される少なくとも１つの遺伝子又はその発現産物からなる、乳幼児顔湿疹の症度を検出するための検出マーカー。
  9. 　被験乳幼児から採取された生体試料に由来するＢＡＢＡＭ１、ＰＤＬＩＭ５、ＰＭＳ２Ｐ５、ＳＮＨＧ８、ＣＯＧ５、ＧＰＲ１３２、ＰＳＭＤ７及びＣＣＤＣ１３４の８種の遺伝子群より選択される少なくとも１つの遺伝子又はその発現産物の乳幼児顔湿疹の症度の検出マーカーとしての使用。
  10. 　遺伝子又はその発現産物が前記被験乳幼児の皮膚表上脂質に含まれるｍＲＮＡである、請求項９記載の使用。
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