JP2023002298A - 糖尿病指標値の検出方法 - Google Patents

Abstract

【課題】糖尿病指標値を検出するための検出マーカー、及び当該検出マーカーを用いた糖尿病指標値の検出方法の提供。【解決手段】被験者から採取された生体試料について、３１種の特定の遺伝子群より選択される少なくとも１つの遺伝子又はその発現産物の発現レベルを測定する工程を含む、当該被験者の糖尿病指標値の検出方法。【選択図】なし

Description

本発明は、糖尿病指標値の検出マーカーを用いた糖尿病指標値の検出方法に関する。

糖尿病は、インスリン作用の不足による慢性高血糖を主徴とし、種々の特徴的な代謝異常を伴う疾患群である。糖尿病の検査指標には、血糖値（空腹時、経口糖負荷試験（ＯＧＴＴ）２時間、随時）、ＨｂＡ１ｃ値、グリコアルブミン値等がある。糖尿病の臨床診断においては、空腹時血糖値が１２６ｍｇ／ｄＬ以上、ＨｂＡ１ｃ値が６．５％以上であると糖尿病型に分類され、ＨｂＡ１ｃ値が５．５～６．５％未満は境界領域と言われる（非特許文献１）。

糖尿病の予防や治療には、継続的に血糖値等の糖尿病指標値を管理することが重要である。現在、自宅において血糖値を測定可能な自己測定器が市販されている。しかしながら、指先採血は痛みが伴い、測定のたびに精神的苦痛もかかる上、採血する際に感染症を引き起こす可能性がある。最近では、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅリブレ（アボットジャパン）のような低侵襲的な血糖モニタリング機器が開発されているが、糖尿病患者向けの医療機器であり、未病領域の人が予防的に使用する類のものではない。そのため、非侵襲的に、痛み無く、糖尿病指標値を簡便に把握できる方法が望まれる。

近年、生体試料中のＤＮＡやＲＮＡ等の核酸の解析によりヒトの生体内の現在さらには将来の生理状態を調べる技術が開発されている。生体由来の核酸は、血液等の体液、分泌物、組織等から抽出することができる。さらに最近、皮膚表上脂質（ｓｋｉｎ ｓｕｒｆａｃｅ ｌｉｐｉｄｓ；ＳＳＬ）に含まれるＲＮＡを生体の解析用の試料として利用可能であることが報告されている（特許文献１）。

国際公開公報第２０１８／００８３１９号

糖尿病 (2012) 55(7): 485-504

本発明は、糖尿病指標値を検出するための検出マーカー、及び当該検出マーカーを用いた糖尿病指標値の検出方法を提供することに関する。

本発明者は、正常型、境界型、糖尿病型のいずれかに属する被験者からＳＳＬを採取し、ＳＳＬ中に含まれるＲＮＡの発現状態をシーケンス情報として網羅的に解析した結果、特定の遺伝子の発現レベルが糖尿病指標値と有意に相関し、当該遺伝子の発現レベルに基づいて糖尿病指標値を検出できることを見出した。

すなわち、本発明は、以下の１）～３）に係るものである。
１）被験者から採取された生体試料について、下記表１に示す３１種の遺伝子群より選択される少なくとも１つの遺伝子又はその発現産物の発現レベルを測定する工程を含む、当該被験者の糖尿病指標値の検出方法。
２）前記遺伝子又はそれに由来する核酸と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、又は前記遺伝子の発現産物を認識する抗体を含有する、１）の方法に用いられる糖尿病指標値を検出するための検査用キット。
３）下記表１に示す３１種の遺伝子群より選択される少なくとも１つの遺伝子又はその発現産物からなる、糖尿病指標値を検出するための検出マーカー。

本発明によれば、簡便且つ非侵襲的に、糖尿病指標値を検出することが可能である。

本明細書中で引用された全ての特許文献、非特許文献、及びその他の刊行物は、その全体が本明細書中において参考として援用される。

本発明において、「核酸」又は「ポリヌクレオチド」と云う用語は、ＤＮＡ又はＲＮＡを意味する。ＤＮＡには、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、及び合成ＤＮＡのいずれもが含まれ、「ＲＮＡ」には、ｔｏｔａｌ ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡ及び合成のＲＮＡのいずれもが含まれる。

本発明において「遺伝子」とは、ヒトゲノムＤＮＡを含む２本鎖ＤＮＡの他、ｃＤＮＡを含む１本鎖ＤＮＡ（正鎖）、当該正鎖と相補的な配列を有する１本鎖ＤＮＡ（相補鎖）、及びこれらの断片を包含するものであって、ＤＮＡを構成する塩基の配列情報の中に、何らかの生物学的情報が含まれているものを意味する。
また、本発明における「遺伝子」には、特定の塩基配列で表される「遺伝子」だけではなく、その同族体（すなわち、ホモログもしくはオーソログ）、遺伝子多型等の変異体、及び誘導体が包含される。
ここで、本明細書中に開示される遺伝子の名称は、ＮＣＢＩ（[www.ncbi.nlm.nih.gov/]）に記載のあるＯｆｆｉｃｉａｌ Ｓｙｍｂｏｌに従う。

本発明において、遺伝子の「発現産物」とは、遺伝子の転写産物及び翻訳産物を包含する概念である。「転写産物」とは、遺伝子（ＤＮＡ）から転写されて生じるＲＮＡであり、「翻訳産物」とは、ＲＮＡに基づき翻訳合成される、遺伝子にコードされたタンパク質を意味する。

本発明において、「糖尿病指標値」とは、糖尿病の臨床診断に利用される検査指標を指す。例えば、空腹時血糖値、７５ｇ経口糖負荷試験（ＯＧＴＴ）２時間値、随時血糖値、血中ＨｂＡ１ｃ値、血中グリコアルブミン値、血中１，５－ＡＧ（１，５－アンヒドログルシトール）値等が挙げられる。

本発明において、糖尿病指標値の「検出」は、検査、測定、判定又は評価支援等の用語で言い換えることもできる。なお、本発明における糖尿病指標値積の「検出」、「検査」、「測定」、「判定」又は「評価」という用語は、医師による診断を含むものではない。

後述する実施例に示すように、糖尿病指標値として知られている、空腹時血糖値、血中ＨｂＡ１ｃ値又は血中グリコアルブミン値が正常型、境界型、糖尿病型のいずれかを示す被験者について、以下の手順１）～３）でＲＮＡ発現解析を行ったところ、下記表１に示す３１種の遺伝子は、ＳＳＬ中の発現が当該糖尿病指標値のいずれかと正に相関する遺伝子であることが見出された。
１）ＳＳＬ由来ＲＮＡの発現量のデータ（リードカウント値）を取得する。
２）リードカウント値をサンプル被験者間の総リード数の違いを補正したＲＰＭ値に変換し、これに整数１を加算した底２の対数値（ｌｏｇ₂（ＲＰＭ＋１）値）と、糖尿病指標値に整数１を加算した自然対数値（ｌｎ（測定値＋１）値））の組み合わせについてスピアマンの順位相関係数を求める。
３）スピアマンの順位相関係数（ρ）の大きな遺伝子（上位遺伝子）を抽出・選択する。

上記表１に示す３１種の遺伝子は、これまでに糖尿病との関連が報告されていない遺伝子である。

したがって、当該３１種の遺伝子群より選択される遺伝子又はその発現産物は糖尿病指標値を検出するための検出マーカーとなり得る。また、当該３１種の遺伝子群より選択される遺伝子又はその発現産物の発現レベルに基づいて、被験者の糖尿病指標値の検出が可能である。糖尿病指標値の検出により、糖尿病の病態（病期）を把握することができ、糖尿病の有無の検出や糖尿病発症リスクの検出、糖尿病予備軍、糖尿病患者への指導、治療等に役立てることができる。

当該３１種の遺伝子は、それぞれ単独で糖尿病指標値を検出するための検出マーカーとなり得る。
本発明においては、精度向上の観点から、糖尿病指標値として空腹時血糖値を検出するにあたっては、ＰＩＭ２、ＲＰＴＮ、ＥＨＢＰ１Ｌ１、ＣＴＤＳＰ２、ＥＦＨＤ２、ＷＢＰ１Ｌ、ＳＮＯＲＡ１０、ＣＹＴＨ４、ＮＣＦ１Ｂ、ＦＬＪ４５４４５、ＺＦＰ３６Ｌ１、ＨＭＨＡ１及びＦＡＭ２５Ｂからなる１３種の遺伝子群より選択される遺伝子又はその発現産物を、空腹時血糖値を検出するための検出マーカーとして用いることが好ましい。当該１３種のうち、好ましくは２種以上、より好ましくは５種以上、更に好ましくは１３種全てを用いる。また、当該１３種のうち、好ましくはＰＩＭ２、ＲＰＴＮ、ＥＨＢＰ１Ｌ１、ＣＴＤＳＰ２、ＥＦＨＤ２及びＷＢＰ１Ｌ、より好ましくはＰＩＭ２、ＲＰＴＮ及びＥＨＢＰ１Ｌ１から選択される１種以上を用いる。

また、精度向上の観点から、糖尿病指標値として血中ＨｂＡ１ｃ値を検出するにあたっては、ＳＮＯＲＡ８、ＰＩＭ２、ＧＮＢ２、ＳＮＯＲＡ２１、ＳＮＯＲＡ３８、ＳＮＯＲＡ１０、ＲＥＸＯ１Ｌ２Ｐ、ＳＮＯＲＡ７１Ｄ、ＳＮＯＲＤ１７、ＡＲＨＧＡＰ９、ＳＣＡＲＮＡ１６、ＳＮＯＲＡ１６Ａ及びＳＮＯＲＡ１４Ｂからなる１３種の遺伝子群より選択される遺伝子又はその発現産物を、血中ＨｂＡ１ｃ値を検出するための検出マーカーとして用いることが好ましい。当該１３種のうち、好ましくは２種以上、より好ましくは５種以上、更に好ましくは１３種全てを用いる。また、当該１３種のうち、好ましくはＳＮＯＲＡ８、ＰＩＭ２、ＧＮＢ２、ＳＮＯＲＡ２１、ＳＮＯＲＡ３８及びＳＮＯＲＡ１０、より好ましくはＳＮＯＲＡ８、ＰＩＭ２及びＧＮＢ２から選択される１種以上を用いる。

また、精度向上の観点から、糖尿病指標値として血中グリコアルブミン値を検出するにあたっては、ＳＰＲＲ３、ＳＰＤＹＥ７Ｐ、ＳＮＯＲＡ３８、ＳＮＯＲＡ９、ＳＮＯＲＡ８１、ＭＹＯ１Ｆ、ＫＲＴ２５、ＮＣＦ１Ｂ、ＳＮＯＲＤ１７及びＥＣＥ１からなる１０種の遺伝子群より選択される遺伝子又はその発現産物を、血中グリコアルブミン値を検出するための検出マーカーとして用いることが好ましい。当該１０種のうち、好ましくは２種以上、より好ましくは５種以上、更に好ましくは１０種全てを用いる。また、当該１０種のうち、好ましくはＳＰＲＲ３、ＳＰＤＹＥ７Ｐ、ＳＮＯＲＡ３８、ＳＮＯＲＡ９及びＳＮＯＲＡ８１、より好ましくはＳＰＲＲ３、ＳＰＤＹＥ７Ｐ及びＳＮＯＲＡ３８から選択される１種以上を用いる。

上記の糖尿病指標値を検出するための検出マーカーとなり得る遺伝子（以下、「標的遺伝子」とも称す）には、糖尿病指標値を検出するための検出マーカーとなり得る限り、当該遺伝子を構成するＤＮＡの塩基配列と実質的に同一の塩基配列を有する遺伝子も包含される。ここで、実質的に同一の塩基配列とは、例えば、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴを用い、期待値＝１０；ギャップを許す；フィルタリング＝ＯＮ；マッチスコア＝１；ミスマッチスコア＝－３の条件にて検索をした場合、当該遺伝子を構成するＤＮＡの塩基配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましく９８％以上、さらに好ましくは９９％以上の同一性があることを意味する。

本発明の糖尿病指標値の検出方法は、被験者から採取された生体試料について、標的遺伝子、一態様として、上記表１に示す３１種の遺伝子群より選択される少なくとも１つの遺伝子又はその発現産物の発現レベルを測定する工程を含む。

本発明における被験者は、例えばヒト又は非ヒト哺乳動物であって、糖尿病指標値の検出を所望するか又は必要とする者が挙げられる。例えば、遺伝的に糖尿病リスクが高いと判断される者、糖尿病と判断される可能性がある者、具体的には空腹時血糖値が１２６ｍｇ／ｄＬ以上、血中ＨｂＡ１ｃ値が６．５％以上若しくは血中グリコアルブミン値が１８．３％以上の少なくとも１つを満たす者、又は糖尿病リスクが高いと判断される可能性がある者、具体的には空腹時血糖値が１１０～１２６ｍｇ／ｄＬ未満、血中ＨｂＡ１ｃ値が５．６～６．５％未満若しくは血中グリコアルブミン値が１５．６～１８．３％未満の少なくとも１つを満たす者が挙げられる。被験者は、好ましくはヒトである。

本発明において用いられる生体試料としては、非侵襲的に採取可能で、本発明の遺伝子が発現変化する細胞、組織及び生体材料であればよい。具体的には皮膚、尿、唾液、汗、角層、皮膚表上脂質（ＳＳＬ）、組織浸出液等の体液、その他、便、毛髪等が挙げられ、好ましくは皮膚又は皮膚表上脂質（ＳＳＬ）、より好ましくは皮膚表上脂質（ＳＳＬ）が挙げられる。

ここで、「皮膚表上脂質（ＳＳＬ）」とは、皮膚の表上に存在する脂溶性画分をいい、皮脂と呼ばれることもある。一般に、ＳＳＬは、皮膚にある皮脂腺等の外分泌腺から分泌された分泌物を主に含み、皮膚表面を覆う薄い層の形で皮膚表上に存在している。ＳＳＬは、皮膚細胞で発現したＲＮＡを含む。（前記特許文献１参照）。また本発明において、「皮膚」とは、特に限定しない限り、角層、表皮、真皮、毛包、ならびに汗腺、皮脂腺及びその他の腺等の組織を含む領域の総称である。

被験者の皮膚からのＳＳＬの採取には、皮膚からのＳＳＬの回収又は除去に用いられているあらゆる手段を採用することができる。好ましくは、後述するＳＳＬ吸収性素材、ＳＳＬ接着性素材、又は皮膚からＳＳＬをこすり落とす器具を使用することができる。ＳＳＬ吸収性素材又はＳＳＬ接着性素材としては、ＳＳＬに親和性を有する素材であれば特に限定されず、例えばポリプロピレン、パルプ等が挙げられる。皮膚からのＳＳＬの採取手順のより詳細な例としては、あぶら取り紙、あぶら取りフィルム等のシート状素材へＳＳＬを吸収させる方法、ガラス板、テープ等へＳＳＬを接着させる方法、スパーテル、スクレイパー等によりＳＳＬをこすり落として回収する方法、等が挙げられる。ＳＳＬの吸着性を向上させるため、脂溶性の高い溶媒を予め含ませたＳＳＬ吸収性素材を用いてもよい。一方、ＳＳＬ吸収性素材は、水溶性の高い溶媒や水分を含んでいるとＳＳＬの吸着が阻害されるため、水溶性の高い溶媒や水分の含有量が少ないことが好ましい。ＳＳＬ吸収性素材は、乾燥した状態で用いることが好ましい。
ＳＳＬが採取される皮膚の部位としては、特に限定されず、頭、顔、首、体幹、手足等の身体の任意の部位の皮膚が挙げられ、皮脂の分泌が多い部位、例えば顔の皮膚が好ましい。

被験者から採取されたＲＮＡ含有ＳＳＬは一定期間保存されてもよい。採取されたＳＳＬは、含有するＲＮＡの分解を極力抑えるために、採取後できるだけ速やかに低温条件で保存することが好ましい。本発明における該ＲＮＡ含有ＳＳＬの保存の温度条件は、０℃以下であればよく、好ましくは－２０±２０℃～－８０±２０℃、より好ましくは－２０±１０℃～－８０±１０℃、さらに好ましくは－２０±２０℃～－４０±２０℃、さらに好ましくは－２０±１０℃～－４０±１０℃、さらに好ましくは－２０±１０℃、さらに好ましくは－２０±５℃である。該ＲＮＡ含有ＳＳＬの該低温条件での保存の期間は、特に限定されないが、好ましくは１２か月以下、例えば６時間以上１２ヶ月以下、より好ましくは６ヶ月以下、例えば１日間以上６ヶ月以下、さらに好ましくは３ヶ月以下、例えば３日間以上３ヶ月以下である。

本発明において、標的遺伝子又はその発現産物の発現レベルの測定対象としては、ＲＮＡから人工的に合成されたｃＤＮＡ、そのＲＮＡをエンコードするＤＮＡ、そのＲＮＡにコードされるタンパク質、該タンパク質と相互作用をする分子、そのＲＮＡと相互作用する分子、又はそのＤＮＡと相互作用する分子等が挙げられる。ここで、ＲＮＡ、ＤＮＡ又はタンパク質と相互作用する分子としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、多糖、オリゴ糖、単糖、脂質、脂肪酸、及びこれらのリン酸化物、アルキル化物、糖付加物等、及び上記いずれかの複合体が挙げられる。また、発現レベルとは、当該遺伝子又は発現産物の発現量や活性を包括的に意味する。

本発明の方法においては、好ましい態様として、生体試料としてＳＳＬが用いられるが、この場合にはＳＳＬに含まれるＲＮＡの発現レベルが解析され、具体的にはＲＮＡを逆転写によりｃＤＮＡに変換した後、該ｃＤＮＡ又はその増幅産物が測定される。
ＳＳＬからのＲＮＡの抽出には、生体試料からのＲＮＡの抽出又は精製に通常使用される方法、例えば、フェノール/クロロホルム法、ＡＧＰＣ（ａｃｉｄ ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ－ｐｈｅｎｏｌ－ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）法、又はＴＲＩｚｏｌ（登録商標）、ＲＮｅａｓｙ（登録商標）、ＱＩＡｚｏｌ（登録商標）等のカラムを用いた方法、シリカをコーティングした特殊な磁性体粒子を用いる方法、Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ磁性体粒子を用いる方法、ＩＳＯＧＥＮ等の市販のＲＮＡ抽出試薬による抽出等を用いることができる。

該逆転写には、解析したい特定のＲＮＡを標的としたプライマーを用いてもよいが、より包括的な核酸の保存及び解析のためにはランダムプライマーを用いることが好ましい。該逆転写には、一般的な逆転写酵素又は逆転写試薬キットを使用することができる。好適には、正確性及び効率性の高い逆転写酵素又は逆転写試薬キットが用いられ、その例としては、Ｍ－ＭＬＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ及びその改変体、あるいは市販の逆転写酵素又は逆転写試薬キット、例えばＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標）Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅシリーズ（タカラバイオ社）、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅシリーズ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）等が挙げられる。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）III Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＶＩＬＯ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ（いずれもＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）等が好ましく用いられる。
該逆転写における伸長反応は、温度を好ましくは４２℃±１℃、より好ましくは４２℃±０．５℃、さらに好ましくは４２℃±０．２５℃に調整し、一方、反応時間を好ましくは６０分間以上、より好ましくは８０～１２０分間に調整するのが好ましい。

発現レベルを測定する方法は、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ又はＤＮＡを対象とする場合、これらにハイブリダイズするＤＮＡをプライマーとしたＰＣＲ法、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法、マルチプレックスＰＣＲ、ＳｍａｒｔＡｍｐ法、ＬＡＭＰ法等に代表される核酸増幅法、これらにハイブリダイズする核酸をプローブとして用いるハイブリダイゼーション法（ＤＮＡチップ、ＤＮＡマイクロアレイ、ドットブロットハイブリダイゼーション、スロットブロットハイブリダイゼーション、ノーザンブロットハイブリダイゼーション等）、塩基配列を決定する方法（シーケンシング）、又はこれらを組み合わせた方法から選ぶことができる。

ＰＣＲでは、解析したい特定のＤＮＡを標的としたプライマーペアを用いて該特定の１種のＤＮＡのみを増幅してもよいが、複数のプライマーペアを用いて同時に複数の特定のＤＮＡを増幅してもよい。好ましくは、該ＰＣＲはマルチプレックスＰＣＲである。マルチプレックスＰＣＲは、ＰＣＲ反応系に複数のプライマー対を同時に使用することで、複数の遺伝子領域を同時に増幅する方法である。マルチプレックスＰＣＲは、市販のキット（例えば、Ｉｏｎ ＡｍｐｌｉＳｅｑＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔ；ライフテクノロジーズジャパン株式会社等）を用いて実施することができる。
該ＰＣＲにおけるアニーリング及び伸長反応の温度は、使用するプライマーに依存するため一概には言えないが、上記のマルチプレックスＰＣＲキットは用いる場合、好ましくは６２℃±１℃、より好ましくは６２℃±０．５℃、さらに好ましくは６２℃±０．２５℃である。したがって、該ＰＣＲでは、好ましくはアニーリング及び伸長反応が１ステップで行われる。該アニーリング及び伸長反応のステップの時間は、増幅すべきＤＮＡのサイズ等に依存して調整され得るが、好ましくは１４～１８分間である。該ＰＣＲにおける変性反応の条件は、増幅すべきＤＮＡに依存して調整され得るが、好ましくは９５～９９℃で１０～６０秒間である。上記のような温度及び時間での逆転写及びＰＣＲは、一般的にＰＣＲに使用されるサーマルサイクラーを用いて実行することができる。

当該ＰＣＲで得られた反応産物の精製は、反応産物のサイズ分離によって行われることが好ましい。サイズ分離により、目的のＰＣＲ反応産物を、ＰＣＲ反応液中に含まれるプライマーやその他の不純物から分離することができる。ＤＮＡのサイズ分離は、例えば、サイズ分離カラムや、サイズ分離チップ、サイズ分離に利用可能な磁気ビーズ等によって行うことができる。サイズ分離に利用可能な磁気ビーズの好ましい例としては、Ａｍｐｕｒｅ ＸＰ等のＳｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ（ＳＰＲＩ）磁性ビーズが挙げられる。

精製したＰＣＲ反応産物に対して、その後の定量解析を行うために必要なさらなる処理を施してもよい。例えば、ＤＮＡのシーケンシングのために、精製したＰＣＲ反応産物を、適切なバッファー溶液へと調製したり、ＰＣＲ増幅されたＤＮＡに含まれるＰＣＲプライマー領域を切断したり、増幅されたＤＮＡにアダプター配列をさらに付加したりしてもよい。例えば、精製したＰＣＲ反応産物をバッファー溶液へと調製し、増幅ＤＮＡに対してＰＣＲプライマー配列の除去及びアダプターライゲーションを行い、得られた反応産物を、必要に応じて増幅して、定量解析のためのライブラリーを調製することができる。これらの操作は、例えば、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＶＩＬＯ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）に付属している５×ＶＩＬＯ ＲＴ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｉｘ、及びＩｏｎ ＡｍｐｌｉＳｅｑ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）に付属している５×Ｉｏｎ ＡｍｐｌｉＳｅｑ ＨｉＦｉ Ｍｉｘ、及びＩｏｎ ＡｍｐｌｉＳｅｑ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｃｏｒｅ Ｐａｎｅｌを用いて、各キット付属のプロトコルに従って行うことができる。

ノーザンブロットハイブリダイゼーション法を利用して標的遺伝子又はそれに由来する核酸の発現量を測定する場合は、例えば、まずプローブＤＮＡを放射性同位元素、蛍光物質等で標識し、次いで、得られた標識ＤＮＡを、常法に従ってナイロンメンブレン等にトランスファーした生体試料由来のＲＮＡとハイブリダイズさせる。その後、形成された標識ＤＮＡとＲＮＡとの二重鎖を、標識物に由来するシグナルを検出することにより測定する方法が挙げられる。

ＲＴ－ＰＣＲ法を用いて標的遺伝子又はそれに由来する核酸の発現量を測定する場合は、例えば、まず生体試料由来のＲＮＡから常法に従ってｃＤＮＡを調製し、これを鋳型として本発明の標的遺伝子が増幅できるように調製した一対のプライマー（上記ｃＤＮＡ（－鎖）に結合する正鎖、＋鎖に結合する逆鎖）をこれとハイブリダイズさせる。その後、常法に従ってＰＣＲ法を行い、得られた増幅二本鎖ＤＮＡを検出する。増幅された二本鎖ＤＮＡの検出には、予めＲＩ、蛍光物質等で標識しておいたプライマーを用いて上記ＰＣＲを行うことによって産生される標識二本鎖ＤＮＡを検出する方法等を用いることができる。

ＤＮＡマイクロアレイを用いて標的遺伝子又はそれに由来する核酸の発現量を測定する場合は、例えば、支持体に本発明の標的遺伝子由来の核酸（ｃＤＮＡ又はＤＮＡ）の少なくとも１種を固定化したアレイを用い、ｍＲＮＡから調製した標識化ｃＤＮＡ又はｃＲＮＡをマイクロアレイ上に結合させ、マイクロアレイ上の標識を検出することによって、ｍＲＮＡの発現量を測定することができる。
前記アレイに固定化される核酸としては、ストリンジェントな条件下に特異的（すなわち、実質的に目的の核酸のみに）にハイブリダイズする核酸であればよく、例えば、本発明の標的遺伝子の全配列を有する核酸であってもよく、部分配列からなる核酸であってもよい。ここで、「部分配列」とは、少なくとも１５～２５塩基からなる核酸が挙げられる。ここでストリンジェントな条件は、通常「１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、３７℃」程度の洗浄条件を挙げることができ、より厳しいハイブリダイズ条件としては「０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」程度、さらに厳しいハイブリダイズ条件としては「０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」程度の条件を挙げることができる。ハイブリダイズ条件は、J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Thrd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)等に記載されている。

シーケンシングによって標的遺伝子又はそれに由来する核酸の発現量を測定する場合は、例えば、次世代シーケンサー（例えばＩｏｎ Ｓ５／ＸＬシステム、ライフテクノロジーズジャパン株式会社）が用いて解析することが挙げられる。シーケンシングで作成されたリードの数（リードカウント）に基づいて、ＲＮＡ発現を定量することができる。

上記の測定に用いられるプローブ又はプライマー、すなわち、本発明の標的遺伝子又はそれに由来する核酸を特異的に認識し増幅するためのプライマー、又は該ＲＮＡ又はそれに由来する核酸を特異的に検出するためのプローブがこれに該当するが、これらは、当該標的遺伝子を構成する塩基配列に基づいて設計することができる。ここで「特異的に認識する」とは、例えばノーザンブロット法において、実質的に本発明の標的遺伝子又はそれに由来する核酸のみを検出できること、また例えばＲＴ－ＰＣＲ法において、実質的に当該核酸のみが増幅される如く、当該検出物又は生成物が当該遺伝子又はそれに由来する核酸であると判断できることを意味する。
具体的には、本発明の標的遺伝子を構成する塩基配列からなるＤＮＡ又はその相補鎖に相補的な一定数のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを利用することができる。ここで「相補鎖」とは、Ａ：Ｔ（ＲＮＡの場合はＵ）、Ｇ：Ｃの塩基対からなる２本鎖ＤＮＡの一方の鎖に対する他方の鎖を指す。また、「相補的」とは、当該一定数の連続したヌクレオチド領域で完全に相補配列である場合に限られず、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の塩基配列上の同一性を有すればよい。
塩基配列の同一性は、前記ＢＬＡＳＴ等のアルゴリズムにより決定することができる。
斯かるオリゴヌクレオチドは、プライマーとして用いる場合には、特異的なアニーリング及び鎖伸長ができればよく、通常、例えば１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上、より好ましくは２０塩基以上、かつ例えば１００塩基以下、好ましくは５０塩基以下、より好ましくは３５塩基以下の鎖長を有するものが挙げられる。また、プローブとして用いる場合には、特異的なハイブリダイゼーションができればよく、本発明の標的遺伝子を構成する塩基配列からなるＤＮＡ（又はその相補鎖）の少なくとも一部若しくは全部の配列を有し、例えば１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上、かつ例えば１００塩基以下、好ましくは５０塩基以下、より好ましくは２５塩基以下の鎖長のものが用いられる。
なお、ここで、「オリゴヌクレオチド」は、ＤＮＡあるいはＲＮＡであることができ、合成されたものでも天然のものでもよい。又、ハイブリダイゼーションに用いるプローブは、通常標識したものが用いられる。

また、本発明の標的遺伝子の翻訳産物（タンパク質）、当該タンパク質と相互作用する分子、ＲＮＡと相互作用する分子、又はＤＮＡと相互作用する分子を測定する場合は、プロテインチップ解析、免疫測定法（例えば、ＥＬＩＳＡ等）、質量分析（例えば、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＭＳ）、１－ハイブリッド法（PNAS 100, 12271-12276(2003)）や２－ハイブリッド法（Biol. Reprod. 58, 302-311 (1998)）のような方法を用いることができ、対象に応じて適宜選択できる。
例えば、測定対象としてタンパク質が用いられる場合は、本発明の発現産物を特異的に認識する抗体、具体的には発現産物であるタンパク質を他のタンパク質から識別することが可能な構造的特徴部位（エピトープ）を認識する抗体を生体試料と接触させ、当該抗体に結合した試料中のポリペプチド又はタンパク質を検出し、そのレベルを測定することによって実施される。例えば、ウェスタンブロット法によれば、一次抗体として上記の抗体を用いた後、二次抗体として放射性同位元素、蛍光物質又は酵素等で標識した一次抗体に結合する抗体を用いて、その一次抗体を標識し、これら標識物質由来のシグナルを放射線測定器、蛍光検出器等で測定することが行われる。
尚、上記翻訳産物に対する抗体は、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよい。これらの抗体は、公知の方法に従って製造することができる。具体的には、ポリクローナル抗体は、常法に従って大腸菌等で発現し精製したタンパク質を用いて、あるいは常法に従って当該タンパク質の部分ポリペプチドを合成して、家兎等の非ヒト動物に免疫し、該免疫動物の血清から常法に従って得ることが可能である。
一方、モノクローナル抗体は、常法に従って大腸菌等で発現し精製したタンパク質又は該タンパク質の部分ポリペプチドをマウス等の非ヒト動物に免疫し、得られた脾臓細胞と骨髄腫細胞とを細胞融合させて調製したハイブリドーマ細胞から得ることができる。また、モノクローナル抗体は、ファージディスプレイを用いて作製してもよい（Griffiths, A.D.; Duncan, A.R., Current Opinion in Biotechnology, Volume 9, Number 1, February 1998 , pp. 102-108(7)）。

斯くして、被験者から採取された生体試料中の本発明の標的遺伝子又はその発現産物の発現レベルが測定され、当該発現レベルに基づいて当該被験者の糖尿病指標値が検出される。
具体的には、予め十分な母数を有する任意の集団における本発明の標的遺伝子又はその発現産物の発現レベルを説明変数とし、該集団から得た糖尿病指標値を目的変数とする機械学習を行うことにより、該発現レベルから該糖尿病指標値を予測するための最適な予測モデルを構築する。次いで、構築された予測モデルに基づいて、糖尿病指標値を検出する対象である被験者における該標的遺伝子又はその発現産物の発現レベルから、該被験者の糖尿病指標値の予測値を算出することができる。
予測モデルの構築に用いられる集団としては、対象となる被験者の属性（性別、人種、年代等）が一致した集団であることが好ましい。
発現レベルとしては、上記したように、発現量のデータであるリードカウント値、当該リードカウント値をサンプル間の総リード数の違いを補正したＲＰＭ値、当該ＲＰＭ値を底２の対数値に変換した値（Ｌｏｇ₂ＲＰＭ値）又は整数１を加算した底２の対数値（ｌｏｇ₂（ＲＰＭ＋１）値）、あるいはＤＥＳｅｑ２（Love MI et al. Genome Biol. 2014）を用いて補正されたカウント値（Ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ ｃｏｕｎｔ値）又は整数１を加算した底２の対数値（ｌｏｇ₂（Ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ ｃｏｕｎｔ＋１）値）を指標として用いるのが好ましい。また、ＲＮＡ－ｓｅｑの定量値として一般的な、ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｐｅｒ ｋｉｌｏｂａｓｅ ｏｆ ｅｘｏｎ ｐｅｒ ｍｉｌｌｉｏｎ ｒｅａｄｓ ｍａｐｐｅｄ （ＦＰＫＭ）、ｒｅａｄｓ ｐｅｒ ｋｉｌｏｂａｓｅ ｏｆ ｅｘｏｎ ｐｅｒ ｍｉｌｌｉｏｎ ｒｅａｄｓ ｍａｐｐｅｄ （ＲＰＫＭ）、ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ ｐｅｒ ｍｉｌｌｉｏｎ （ＴＰＭ）等によって算出される値であってもよい。また、マイクロアレイ法によって得られるシグナル値、及びその補正値であってもよい。また、ＲＴ－ＰＣＲ等により特定の標的遺伝子のみの解析を行う場合には、対象遺伝子の発現量をハウスキーピング遺伝子の発現量を基準とする相対的な発現量に変換して解析する方法、又は標的遺伝子の領域を含むプラスミドを用いて絶対的なコピー数を定量（絶対定量）して解析する方法が好ましい。デジタルＰＣＲ法によって得られるコピー数であってもよい。
一方、糖尿病指標値としては、例えば実測値に整数１を加算した自然対数値（ｌｎ（測定値＋１）値）を用いることができる。
また精度向上の観点から、予測モデルの構築において本発明の標的遺伝子又はその発現産物の発現レベルに加えて、年齢情報を説明変数に加えても良い。

予測モデルの構築に用いるアルゴリズムとしては、機械学習に用いるアルゴリズム等の公知のものを利用することができる。機械学習アルゴリズムの例としては、ランダムフォレスト（Ｒａｎｄｏｍ ｆｏｒｅｓｔ）、線形カーネルのサポートベクターマシン（ＳＶＭ ｌｉｎｅａｒ）、ｒｂｆカーネルのサポートベクターマシン（ＳＶＭ ｒｂｆ）、ニューラルネットワーク（Ｎｅｒｕｒａｌ ｎｅｔ）、一般線形モデル（Ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ ｌｉｎｅａｒ ｍｏｄｅｌ）、正則化線形判別分析（Ｒｅｇｕｌａｒｉｚｅｄ ｌｉｎｅａｒ ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｎｔ ａｎａｌｙｓｉｓ）、正則化ロジスティック回帰（Ｒｅｇｕｌａｒｉｚｅｄ ｌｏｇｉｓｔｉｃ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ）、ラッソ（Ｌｅａｓｔ Ａｂｓｏｌｕｔｅ Ｓｈｒｉｎｋａｇｅ ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｏｐｅｒａｔｏｒ）回帰等が挙げられる。構築した予測モデルに検証用のデータを入力して予測値を算出し、当該予測値が実測値と最も適合するモデル、例えば正解率（Ａｃｃｕｒａｃｙ）が最も大きいモデルを最適な予測モデルとして選抜することができる。また、予測値と実測値から検出率（Ｒｅｃａｌｌ）、精度（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ）、及びそれらの調和平均であるＦ値を計算し、そのＦ値が最も大きいモデルを最適な予測モデルとして選抜することができる。また、予測値と実測値の二乗平均平方根誤差（ＲＭＳＥ）を予測モデルの精度評価指標として用い、そのＲＭＳＥの最も小さいモデルを最適な予測モデルとして選抜することができる。

また本発明では、標的遺伝子又はその発現産物の発現レベルを、予め設定した基準値と比較することによって、被験者の糖尿病の有無の検出や糖尿病発症リスクの検出等を行うことができる。具体的には、標的遺伝子又はその発現産物の発現レベルを、予め設定した基準値と比較することによって行われる。

ここで、「基準値」は、糖尿病指標値と、本発明の標的遺伝子又はその発現産物の発現レベルの関係に基づき、予め決定することができる。例えば、ある集団を、糖尿病指標値、例えば、空腹時血糖値、血中ＨｂＡ１ｃ値又は血中グリコアルブミン値に基づいて糖尿病型（空腹時血糖値：１２６ｍｇ／ｄＬ以上、血中ＨｂＡ１ｃ値：６．５％以上、血中グリコアルブミン値：１８．３％以上）、境界型（空腹時血糖値：１１０～１２６ｍｇ／ｄＬ未満、血中ＨｂＡ１ｃ値：５．６～６．５％未満、血中グリコアルブミン値：１５．６～１８．３％未満）、正常型（空腹時血糖値：１１０ｍｇ／ｄＬ未満、血中ＨｂＡ１ｃ値：５．６％未満、血中グリコアルブミン値：１５．６％未満）の群に分ける。そして、それぞれの群における当該標的遺伝子又はその発現産物の発現レベルの平均値や標準偏差等の統計値を参考に決定した値を、それぞれの群への属否を判別する基準値として決定することができる。
標的遺伝子として複数種の遺伝子を用いる場合は、それぞれ各々の遺伝子又はその発現産物について基準値を求めることが好ましい。
集団としては、対象となる被験者の属性（性別、人種、年代等）が一致した集団であることが好ましい。

基準値の決定方法は特に制限されず、公知の手法に従って決定することができる。例えば、判別式（予測モデル）を使用して作成されたＲＯＣ（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ Ｃｕｒｖｅ）曲線より求めることができる。ＲＯＣ曲線では、縦軸に陽性患者において陽性の結果がでる確率（感度）と、横軸に陰性患者において陰性の結果がでる確率（特異度）を１から減算した値（偽陽性率）がプロットされる。ＲＯＣ曲線に示される「真陽性（感度）」及び「偽陽性（１－特異度）」に関し、「真陽性（感度）」－「偽陽性（１－特異度）」が最大となる値（Ｙｏｕｄｅｎ ｉｎｄｅｘ）を基準値とすることができる。

本発明の糖尿病指標値を検出するための検査用キットは、患者から分離した生体試料における本発明の標的遺伝子又はその発現産物の発現レベルを測定するための検査試薬を含有するものである。具体的には、本発明の標的遺伝子又はそれに由来する核酸と特異的に結合（ハイブリダイズ）するオリゴヌクレオチド（例えば、ＰＣＲ用のプライマー）を含む、核酸増幅、ハイブリダイゼーションのための試薬、或いは、本発明の標的遺伝子の発現産物（タンパク質）を認識する抗体を含む免疫学的測定のための試薬等が挙げられる。当該キットに包含されるオリゴヌクレオチド、抗体等は、上述したとおり公知の方法により得ることができる。
また、当該検査用キットには、上記抗体や核酸の他、標識試薬、緩衝液、発色基質、二次抗体、ブロッキング剤や、試験に必要な器具やポジティブコントロールやネガティブコントロールとして使用するコントロール試薬、生体試料を採取するための用具（例えば、ＳＳＬを採取するためのあぶら取りフィルム等）等を含むことができる。

上述した実施形態に関し、本発明は以下の態様をさらに開示する。

＜１＞被験者から採取された生体試料について、上記表１に示す３１種の遺伝子群より選択される少なくとも１つの遺伝子又はその発現産物の発現レベルを測定する工程を含む、当該被験者の糖尿病指標値の検出方法。

＜２＞前記遺伝子が、ＰＩＭ２、ＲＰＴＮ、ＥＨＢＰ１Ｌ１、ＣＴＤＳＰ２、ＥＦＨＤ２、ＷＢＰ１Ｌ、ＳＮＯＲＡ１０、ＣＹＴＨ４、ＮＣＦ１Ｂ、ＦＬＪ４５４４５、ＺＦＰ３６Ｌ１、ＨＭＨＡ１及びＦＡＭ２５Ｂからなる１３種の遺伝子群より選択される遺伝子であり、前記糖尿病指標値が空腹時血糖値である＜１＞記載の検出方法。
＜３＞前記１３種のうち、好ましくは２種以上、より好ましくは５種以上、更に好ましくは１３種全ての遺伝子又はその発現産物の発現レベルが測定される＜２＞記載の検出方法。
＜４＞前記１３種のうち、好ましくはＰＩＭ２、ＲＰＴＮ、ＥＨＢＰ１Ｌ１、ＣＴＤＳＰ２、ＥＦＨＤ２及びＷＢＰ１Ｌ、より好ましくはＰＩＭ２、ＲＰＴＮ及びＥＨＢＰ１Ｌ１から選択される１種以上の遺伝子又はその発現産物の発現レベルが測定される＜２＞記載の検出方法。
＜５＞前記遺伝子が、ＳＮＯＲＡ８、ＰＩＭ２、ＧＮＢ２、ＳＮＯＲＡ２１、ＳＮＯＲＡ３８、ＳＮＯＲＡ１０、ＲＥＸＯ１Ｌ２Ｐ、ＳＮＯＲＡ７１Ｄ、ＳＮＯＲＤ１７、ＡＲＨＧＡＰ９、ＳＣＡＲＮＡ１６、ＳＮＯＲＡ１６Ａ及びＳＮＯＲＡ１４Ｂからなる１３種の遺伝子群より選択される遺伝子であり、前記糖尿病指標値が血中ＨｂＡ１ｃ値である＜１＞記載の検出方法。
＜６＞前記１３種のうち、好ましくは２種以上、より好ましくは５種以上、更に好ましくは１３種全ての遺伝子又はその発現産物の発現レベルが測定される＜５＞記載の検出方法。
＜７＞前記１３種のうち、好ましくはＳＮＯＲＡ８、ＰＩＭ２、ＧＮＢ２、ＳＮＯＲＡ２１、ＳＮＯＲＡ３８及びＳＮＯＲＡ１０、より好ましくはＳＮＯＲＡ８、ＰＩＭ２及びＧＮＢ２から選択される１種以上の遺伝子又はその発現産物の発現レベルが測定される＜５＞記載の検出方法。
＜８＞前記遺伝子が、ＳＰＲＲ３、ＳＰＤＹＥ７Ｐ、ＳＮＯＲＡ３８、ＳＮＯＲＡ９、ＳＮＯＲＡ８１、ＭＹＯ１Ｆ、ＫＲＴ２５、ＮＣＦ１Ｂ、ＳＮＯＲＤ１７及びＥＣＥ１からなる１０種の遺伝子群より選択される遺伝子であり、前記糖尿病指標値が血中グリコアルブミン値である＜１＞記載の検出方法。
＜９＞前記１０種のうち、好ましくは２種以上、より好ましくは５種以上、更に好ましくは１０種全ての遺伝子又はその発現産物の発現レベルが測定される＜８＞記載の検出方法。
＜１０＞前記１０種のうち、好ましくはＳＰＲＲ３、ＳＰＤＹＥ７Ｐ、ＳＮＯＲＡ３８、ＳＮＯＲＡ９及びＳＮＯＲＡ８１、より好ましくはＳＰＲＲ３、ＳＰＤＹＥ７Ｐ及びＳＮＯＲＡ３８から選択される１種以上の遺伝子又はその発現産物の発現レベルが測定される＜８＞記載の検出方法。
＜１１＞前記遺伝子又はその発現産物の発現レベルの測定対象が、好ましくはＲＮＡから人工的に合成されたｃＤＮＡ、そのＲＮＡをエンコードするＤＮＡ、そのＲＮＡにコードされるタンパク質、該タンパク質と相互作用をする分子、そのＲＮＡと相互作用する分子、又はそのＤＮＡと相互作用する分子である＜１＞～＜１０＞のいずれかに記載の検出方法。
＜１２＞前記遺伝子又はその発現産物の発現レベルが、好ましくはｍＲＮＡの発現量である＜１＞～＜１１＞のいずれかに記載の検出方法。
＜１３＞前記生体試料が、被験者の好ましくは皮膚、尿、唾液、汗、角層、皮膚表上脂質（ＳＳＬ）、組織浸出液等の体液、便又は毛髪であり、より好ましくは皮膚又は皮膚表上脂質（ＳＳＬ）であり、更に好ましくは皮膚表上脂質（ＳＳＬ）である＜１＞～＜１２＞のいずれかに記載の検出方法。
＜１４＞前記遺伝子又はその発現産物の発現レベルに基づいて前記被験者の糖尿病指標値を検出することを含む＜１＞～＜１３＞のいずれかに記載の検出方法。
＜１５＞好ましくは、前記遺伝子又はその発現産物の発現レベルに基づく予測モデルを用いて糖尿病指標値を検出することを含み、
前記予測モデルが、前記遺伝子又はその発現産物の発現レベルの測定値、又は当該発現レベルの測定値及び被験者の年齢を説明変数とし、糖尿病指標値を目的変数として構築される＜１＞～＜１４＞のいずれかに記載の検出方法。
＜１６＞前記遺伝子又はそれに由来する核酸と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、又は前記遺伝子の発現産物を認識する抗体を含有する、＜１＞～＜１５＞のいずれかに記載の検出方法に用いられる糖尿病指標値を検出するための検査用キット。
＜１７＞前記表１に示す３１種の遺伝子群より選択される少なくとも１つの遺伝子又はその発現産物からなる、糖尿病指標値を検出するための検出マーカー。
＜１８＞前記遺伝子が、ＰＩＭ２、ＲＰＴＮ、ＥＨＢＰ１Ｌ１、ＣＴＤＳＰ２、ＥＦＨＤ２、ＷＢＰ１Ｌ、ＳＮＯＲＡ１０、ＣＹＴＨ４、ＮＣＦ１Ｂ、ＦＬＪ４５４４５、ＺＦＰ３６Ｌ１、ＨＭＨＡ１及びＦＡＭ２５Ｂからなる１３種の遺伝子群より選択される少なくとも１つの遺伝子又はその発現産物であって、糖尿病指標値が空腹時血糖値である、＜１７＞記載の検出マーカー。
＜１９＞前記遺伝子が、ＳＮＯＲＡ８、ＰＩＭ２、ＧＮＢ２、ＳＮＯＲＡ２１、ＳＮＯＲＡ３８、ＳＮＯＲＡ１０、ＲＥＸＯ１Ｌ２Ｐ、ＳＮＯＲＡ７１Ｄ、ＳＮＯＲＤ１７、ＡＲＨＧＡＰ９、ＳＣＡＲＮＡ１６、ＳＮＯＲＡ１６Ａ及びＳＮＯＲＡ１４Ｂからなる１３種の遺伝子群より選択される少なくとも１つの遺伝子又はその発現産物であって、糖尿病指標値が血中ＨｂＡ１ｃ値である、＜１７＞記載の検出マーカー。
＜２０＞前記遺伝子が、ＳＰＲＲ３、ＳＰＤＹＥ７Ｐ、ＳＮＯＲＡ３８、ＳＮＯＲＡ９、ＳＮＯＲＡ８１、ＭＹＯ１Ｆ、ＫＲＴ２５、ＮＣＦ１Ｂ、ＳＮＯＲＤ１７及びＥＣＥ１からなる１０種の遺伝子群より選択される少なくとも１つの遺伝子又はその発現産物であって、糖尿病指標値が血中グリコアルブミン値である、＜１７＞記載の検出マーカー。

実施例１ ＳＳＬから抽出されたＲＮＡを用いた糖尿病指標値の検出（１）
１）被験者及び空腹時血糖値の測定
２０～８０歳代女性３７６名を被験者として試験を行った。被験者は試験会場に来る当日の朝食摂取を禁止とし、来場後、医師の監督のもと看護師が定法に従って血液を採取した。本血液を用いて、空腹時血糖値を測定した。その結果、この集団の空腹時血糖値の平均値±標準偏差は９３．７±１５．４ｍｇ／ｄＬ、中央値は９１ｍｇ／ｄＬであった。

２）ＳＳＬ採取
各被験者の全顔からあぶら取りフィルム（５×８ｃｍ、ポリプロピレン製、３Ｍ社）を用いて皮脂を回収後、該あぶら取りフィルムをバイアルに移し、ＲＮＡ抽出に使用するまで－８０℃にて保存した。

３）ＲＮＡ調製及びシーケンシング
上記２）のあぶら取りフィルムを適当な大きさに切断し、ＱＩＡｚｏｌ Ｌｙｓｉｓ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、付属のプロトコルに準じてＲＮＡを抽出した。抽出されたＲＮＡを元に、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＶＩＬＯ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を用いて４２℃、９０分間逆転写を行いｃＤＮＡの合成を行った。逆転写反応のプライマーには、キットに付属しているランダムプライマーを使用した。得られたｃＤＮＡから、マルチプレックスＰＣＲにより２０８０２遺伝子に由来するＤＮＡを含むライブラリーを調製した。マルチプレックスＰＣＲは、Ｉｏｎ ＡｍｐｌｉＳｅｑＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を用いて、［９９℃、２分→（９９℃、１５秒→６２℃、１６分）×２０サイクル→４℃、Ｈｏｌｄ］の条件で行った。得られたＰＣＲ産物は、Ａｍｐｕｒｅ ＸＰ（ベックマン・コールター株式会社）で精製した後に、バッファーの再構成、プライマー配列の消化、アダプターライゲーションと精製、増幅を行い、ライブラリーを調製した。調製したライブラリーをＩｏｎ ５４０ Ｃｈｉｐにローディングし、Ｉｏｎ Ｓ５／ＸＬシステム（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を用いてシーケンシングした。

４）データ解析
（１）使用データ
上記３）で測定したＳＳＬ由来ＲＮＡの発現量のデータ（リードカウント値）を取得し、サンプル被験者間の総リード数の違いを補正したＲＰＭ値に変換した。機械学習モデルの構築には、負の二項分布に従うＲＰＭ値を正規分布に近似するため、ＲＰＭ値に整数１を加算した底２の対数値（ｌｏｇ₂（ＲＰＭ＋１）値）を用いた。なお、全サンプル被験者の発現量データのうち９０％以上のサンプル被験者で欠損値ではない発現量データが得られている２２２７遺伝子のみ以下の解析に使用した。
また、空腹時血糖値を正規分布に近似するため、上記の測定値に整数１を加算した自然対数値（ｌｎ（測定値＋１）値）を用いた。

（２）データセット分割
被験者３７６名のデータセットのうち、３０４名のＲＮＡプロファイルデータをモデル構築の訓練データとし、残り７２名分のＲＮＡプロファイルデータをモデル精度評価に使用するテストデータとした。

（３）特徴量遺伝子の選択
３０４名分の空腹時血糖値（ｌｎ（測定値＋１）値）と、全ての遺伝子ＲＮＡ発現データ（ｌｏｇ₂（ＲＰＭ＋１）値）の組み合わせについてスピアマンの順位相関係数を求めた。
その結果、スピアマンの順位相関係数（ρ）の大きな遺伝子を抽出し、表２に示す１３遺伝子を選択した。これら１３遺伝子はいずれもこれまで空腹時血糖値との関連が報告されていない遺伝子である。

（４）モデル構築
（ａ）特徴量遺伝子による予測
訓練データである、ＳＳＬ由来ＲＮＡから選択された前記特徴量遺伝子の発現量のデータ（ｌｏｇ₂（ＲＰＭ＋１）値）を説明変数とし、空腹時血糖値（ｌｎ（測定値＋１）値）を目的変数として用い、予測モデルの構築を実施した。予測モデルは、一般線形モデル（Ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ ｌｉｎｅａｒ ｍｏｄｅｌ）、ニューラルネットワーク（Ｎｅｒｕｒａｌ ｎｅｔ）、ラッソ回帰（Ｌａｓｓｏ）、ランダムフォレスト（Ｒａｎｄｏｍ ｆｏｒｅｓｔ）、線形カーネルのサポートベクターマシン（ＳＶＭ ｌｉｎｅａｒ）、ｒｂｆカーネルのサポートベクターマシン（ＳＶＭ ｒｂｆ）の６種のアルゴリズムを用いて、１０分割交差検証を行って学習させた。各アルゴリズムについて、学習後のモデルに訓練データを入力し、二乗平均平方根誤差（ＲＭＳＥ）を求め、ＲＭＳＥの最も小さいモデルを採用した。
前記選択したモデルに、テストデータの特徴量遺伝子発現量（ｌｏｇ₂（ＲＰＭ＋１）値）を入力して、空腹時血糖値（ｌｎ（測定値＋１）値）の予測値を計算した。最後に、予測値と実測値からスピアマンの順位相関係数を求めた。

（ｂ）特徴量遺伝子＋年齢による予測
訓練データである、ＳＳＬ由来ＲＮＡから選択された前記特徴量遺伝子の発現量のデータ（ｌｏｇ₂（ＲＰＭ＋１）値）及び被験者年齢を説明変数とし、空腹時血糖値（ｌｎ（測定値＋１）値）を目的変数として用い、予測モデルの構築を実施した。その後は上記（ａ）と同様の方法で予測モデルの構築を行い、最後に、予測値と実測値からスピアマンの順位相関係数を求めた。

５）結果
特徴量遺伝子１３種を用いた予測モデル（ランダムフォレスト）において、テストデータで順位相関係数は０．４１８（ｐ＜０．００１）となり、空腹時血糖値の予測が可能であることが示された。特徴量遺伝子１３種及び年齢を用いた予測モデル（ラッソ回帰）場合には、０．６０７（ｐ＜０．００１）となり予測精度の向上が認められた。

実施例２ ＳＳＬから抽出されたＲＮＡを用いた糖尿病指標値の検出（２）
１）被験者及び血中ＨｂＡ１ｃ値の測定
被験者は実施例１と同一で、実施例１で採取した血液を用いて、血中ＨｂＡ１ｃ値を測定した。その結果、この集団の血中ＨｂＡ１ｃ値の平均値±標準偏差は５．７±０．５％、中央値は５．６％であった。

２）ＳＳＬ採取、３）ＲＮＡ調製及びシーケンシング
実施例１と同様に実施した。

４）データ解析
（１）使用データ
上記３）で測定したＳＳＬ由来ＲＮＡの発現量のデータ（リードカウント値）を取得し、サンプル被験者間の総リード数の違いを補正したＲＰＭ値に変換した。機械学習モデルの構築には、負の二項分布に従うＲＰＭ値を正規分布に近似するため、ＲＰＭ値に整数１を加算した底２の対数値（ｌｏｇ₂（ＲＰＭ＋１）値）を用いた。なお、全サンプル被験者の発現量データのうち９０％以上のサンプル被験者で欠損値ではない発現量データが得られている２２２７遺伝子のみ以下の解析に使用した。
また、血中ＨｂＡ１ｃ値を正規分布に近似するため、上記の測定値に整数１を加算した自然対数値（ｌｎ（測定値＋１）値）を用いた。

（２）データセット分割
被験者３７６名のデータセットのうち、３０４名のＲＮＡプロファイルデータをモデル構築の訓練データとし、残り７２名分のＲＮＡプロファイルデータをモデル精度評価に使用するテストデータとした。

（３）特徴量遺伝子の選択
３０４名分の血中ＨｂＡ１ｃ値（ｌｎ（測定値＋１）値）と、全ての遺伝子ＲＮＡ発現データ（ｌｏｇ₂（ＲＰＭ＋１）値）の組み合わせについてスピアマンの順位相関係数を求めた。
その結果、スピアマンの順位相関係数（ρ）の大きな遺伝子を抽出し、表３に示す１３遺伝子を選択した。これら１３遺伝子はいずれもこれまで血中ＨｂＡ１ｃ値との関連が報告されていない遺伝子である。

（４）モデル構築
（ａ）特徴量遺伝子による予測
訓練データである、ＳＳＬ由来ＲＮＡから選択された前記特徴量遺伝子の発現量のデータ（ｌｏｇ₂（ＲＰＭ＋１）値）を説明変数とし、血中ＨｂＡ１ｃ値（ｌｎ（測定値＋１）値）を目的変数として用い、予測モデルの構築を実施した。予測モデルは、一般線形モデル（Ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ ｌｉｎｅａｒ ｍｏｄｅｌ）、ニューラルネットワーク（Ｎｅｒｕｒａｌ ｎｅｔ）、ラッソ回帰（Ｌａｓｓｏ）、ランダムフォレスト（Ｒａｎｄｏｍ ｆｏｒｅｓｔ）、線形カーネルのサポートベクターマシン（ＳＶＭ ｌｉｎｅａｒ）、ｒｂｆカーネルのサポートベクターマシン（ＳＶＭ ｒｂｆ）の６種のアルゴリズムを用いて、１０分割交差検証を行って学習させた。各アルゴリズムについて、学習後のモデルに訓練データを入力し、二乗平均平方根誤差（ＲＭＳＥ）を求め、ＲＭＳＥの最も小さいモデルを採用した。
前記選択したモデルに、テストデータの特徴量遺伝子発現量（ｌｏｇ₂（ＲＰＭ＋１）値）を入力して、血中ＨｂＡ１ｃ値（ｌｎ（測定値＋１）値）の予測値を計算した。最後に、予測値と実測値からスピアマンの順位相関係数を求めた。

（ｂ）特徴量遺伝子＋年齢による予測
訓練データである、ＳＳＬ由来ＲＮＡから選択された前記特徴量遺伝子の発現量のデータ（ｌｏｇ₂（ＲＰＭ＋１）値）及び被験者年齢を説明変数とし、血中ＨｂＡ１ｃ値（ｌｎ（測定値＋１）値）を目的変数として用い、予測モデルの構築を実施した。その後は上記（ａ）と同様の方法で予測モデルの構築を行い、最後に、予測値と実測値からスピアマンの順位相関係数を求めた。

５）結果
特徴量遺伝子１３種を用いた予測モデル（ｒｂｆカーネルのサポートベクターマシン）において、テストデータで順位相関係数は０．２６７（ｐ＜０．０５）となり、血中ＨｂＡ１ｃ値の予測が可能であることが示された。特徴量遺伝子１３種及び年齢を用いた予測モデル（ラッソ回帰）の場合には、０．４５（ｐ＜０．００１）となり予測精度の向上が認められた。

実施例３ ＳＳＬから抽出されたＲＮＡを用いた糖尿病指標値の検出（３）
１）被験者及び血中グリコアルブミン値の測定
被験者は実施例１と同一で、実施例１で採取した血液を用いて、血中グリコアルブミン値を測定した。その結果、この集団の血中グリコアルブミン値の平均値±標準偏差は１４．６±１．７％、中央値は１４．５％であった。

２）ＳＳＬ採取、３）ＲＮＡ調製及びシーケンシング
実施例１と同様に実施した。

４）データ解析
（１）使用データ
上記３）で測定したＳＳＬ由来ＲＮＡの発現量のデータ（リードカウント値）を取得し、サンプル被験者間の総リード数の違いを補正したＲＰＭ値に変換した。機械学習モデルの構築には、負の二項分布に従うＲＰＭ値を正規分布に近似するため、ＲＰＭ値に整数１を加算した底２の対数値（ｌｏｇ₂（ＲＰＭ＋１）値）を用いた。なお、全サンプル被験者の発現量データのうち９０％以上のサンプル被験者で欠損値ではない発現量データが得られている２２２７遺伝子のみ以下の解析に使用した。
また、血中グリコアルブミン値を正規分布に近似するため、上記の測定値に整数１を加算した自然対数値（ｌｎ（測定値＋１）値）を用いた。

（２）データセット分割
被験者３７６名のデータセットのうち、３０４名のＲＮＡプロファイルデータをモデル構築の訓練データとし、残り７２名分のＲＮＡプロファイルデータをモデル精度評価に使用するテストデータとした。

（３）特徴量遺伝子の選択
３０４名分の血中グリコアルブミン値（ｌｎ（測定値＋１）値）と、全ての遺伝子ＲＮＡ発現データ（ｌｏｇ₂（ＲＰＭ＋１）値）の組み合わせについてスピアマンの順位相関係数を求めた。
その結果、スピアマンの順位相関係数（ρ）の大きな遺伝子を抽出し、表４に示す１０遺伝子を選択した。これら１０遺伝子はいずれもこれまで血中グリコアルブミン値との関連が報告されていない遺伝子である。

（４）モデル構築
（ａ）特徴量遺伝子による予測
訓練データである、ＳＳＬ由来ＲＮＡから選択された前記特徴量遺伝子の発現量のデータ（ｌｏｇ₂（ＲＰＭ＋１）値）を説明変数とし、血中グリコアルブミン値（ｌｎ（測定値＋１）値）を目的変数として用い、予測モデルの構築を実施した。予測モデルは、一般線形モデル（Ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ ｌｉｎｅａｒ ｍｏｄｅｌ）、ニューラルネットワーク（Ｎｅｒｕｒａｌ ｎｅｔ）、ラッソ回帰（Ｌａｓｓｏ）、ランダムフォレスト（Ｒａｎｄｏｍ ｆｏｒｅｓｔ）、線形カーネルのサポートベクターマシン（ＳＶＭ ｌｉｎｅａｒ）、ｒｂｆカーネルのサポートベクターマシン（ＳＶＭ ｒｂｆ）の６種のアルゴリズムを用いて、１０分割交差検証を行って学習させた。各アルゴリズムについて、学習後のモデルに訓練データを入力し、二乗平均平方根誤差（ＲＭＳＥ）を求め、ＲＭＳＥの最も小さいモデルを採用した。
前記選択したモデルに、テストデータの特徴量遺伝子発現量（ｌｏｇ₂（ＲＰＭ＋１）値）を入力して、血中グリコアルブミン値（ｌｎ（測定値＋１）値）の予測値を計算した。最後に、予測値と実測値からスピアマンの順位相関係数を求めた。

５）結果
特徴量遺伝子１０種を用いた予測モデル（線形カーネルのサポートベクターマシン）において、テストデータで順位相関係数は０．３４５（ｐ＜０．０１）となり、血中グリコアルブミン値の予測が可能であることが示された。

Claims (13)

1. 被験者から採取された生体試料について、下記表１に示す３１種の遺伝子群より選択される少なくとも１つの遺伝子又はその発現産物の発現レベルを測定する工程を含む、当該被験者の糖尿病指標値の検出方法。
   

   
2. 前記遺伝子又はその発現産物の発現レベルがｍＲＮＡの発現量である請求項１記載の検出方法。
3. 前記生体試料が被験者の皮膚表上脂質である請求項１又は２記載の検出方法。
4. 前記遺伝子又はその発現産物の発現レベルに基づいて前記被験者の糖尿病指標値を検出することを含む請求項１～３のいずれか１項記載の検出方法。
5. 前記遺伝子又はその発現産物の発現レベルに基づく予測モデルを用いて糖尿病指標値を検出することを含み、
   前記予測モデルが、前記遺伝子又はその発現産物の発現レベルの測定値、又は当該発現レベルの測定値及び被験者の年齢を説明変数とし、糖尿病指標値を目的変数として構築される請求項１～４のいずれか１項記載の検出方法。
6. 前記遺伝子が、ＰＩＭ２、ＲＰＴＮ、ＥＨＢＰ１Ｌ１、ＣＴＤＳＰ２、ＥＦＨＤ２、ＷＢＰ１Ｌ、ＳＮＯＲＡ１０、ＣＹＴＨ４、ＮＣＦ１Ｂ、ＦＬＪ４５４４５、ＺＦＰ３６Ｌ１、ＨＭＨＡ１及びＦＡＭ２５Ｂからなる１３種の遺伝子群より選択される遺伝子であり、前記糖尿病指標値が空腹時血糖値である請求項１～５のいずれか１項記載の検出方法。
7. 前記遺伝子が、ＳＮＯＲＡ８、ＰＩＭ２、ＧＮＢ２、ＳＮＯＲＡ２１、ＳＮＯＲＡ３８、ＳＮＯＲＡ１０、ＲＥＸＯ１Ｌ２Ｐ、ＳＮＯＲＡ７１Ｄ、ＳＮＯＲＤ１７、ＡＲＨＧＡＰ９、ＳＣＡＲＮＡ１６、ＳＮＯＲＡ１６Ａ及びＳＮＯＲＡ１４Ｂからなる１３種の遺伝子群より選択される遺伝子であり、前記糖尿病指標値が血中ＨｂＡ１ｃ値である請求項１～５のいずれか１項記載の検出方法。
8. 前記遺伝子が、ＳＰＲＲ３、ＳＰＤＹＥ７Ｐ、ＳＮＯＲＡ３８、ＳＮＯＲＡ９、ＳＮＯＲＡ８１、ＭＹＯ１Ｆ、ＫＲＴ２５、ＮＣＦ１Ｂ、ＳＮＯＲＤ１７及びＥＣＥ１からなる１０種の遺伝子群より選択される遺伝子であり、前記糖尿病指標値が血中グリコアルブミン値である請求項１～５のいずれか１項記載の検出方法。
9. 前記遺伝子又はそれに由来する核酸と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、又は前記遺伝子の発現産物を認識する抗体を含有する、請求項１～８のいずれか１項記載の検出方法に用いられる糖尿病指標値を検出するための検査用キット。
10. 前記表１に示す３１種の遺伝子群より選択される少なくとも１つの遺伝子又はその発現産物からなる、糖尿病指標値を検出するための検出マーカー。
11. 前記遺伝子が、ＰＩＭ２、ＲＰＴＮ、ＥＨＢＰ１Ｌ１、ＣＴＤＳＰ２、ＥＦＨＤ２、ＷＢＰ１Ｌ、ＳＮＯＲＡ１０、ＣＹＴＨ４、ＮＣＦ１Ｂ、ＦＬＪ４５４４５、ＺＦＰ３６Ｌ１、ＨＭＨＡ１及びＦＡＭ２５Ｂからなる１３種の遺伝子群より選択される少なくとも１つの遺伝子又はその発現産物であって、糖尿病指標値が空腹時血糖値である、請求項１０記載の検出マーカー。
12. 前記遺伝子が、ＳＮＯＲＡ８、ＰＩＭ２、ＧＮＢ２、ＳＮＯＲＡ２１、ＳＮＯＲＡ３８、ＳＮＯＲＡ１０、ＲＥＸＯ１Ｌ２Ｐ、ＳＮＯＲＡ７１Ｄ、ＳＮＯＲＤ１７、ＡＲＨＧＡＰ９、ＳＣＡＲＮＡ１６、ＳＮＯＲＡ１６Ａ及びＳＮＯＲＡ１４Ｂからなる１３種の遺伝子群より選択される少なくとも１つの遺伝子又はその発現産物であって、糖尿病指標値が血中ＨｂＡ１ｃ値である、請求項１０記載の検出マーカー。
13. 前記遺伝子が、ＳＰＲＲ３、ＳＰＤＹＥ７Ｐ、ＳＮＯＲＡ３８、ＳＮＯＲＡ９、ＳＮＯＲＡ８１、ＭＹＯ１Ｆ、ＫＲＴ２５、ＮＣＦ１Ｂ、ＳＮＯＲＤ１７及びＥＣＥ１からなる１０種の遺伝子群より選択される少なくとも１つの遺伝子又はその発現産物であって、糖尿病指標値が血中グリコアルブミン値である、請求項１０記載の検出マーカー。