JP2022134126A - アトピー性皮膚炎の症度悪化の検出方法 - Google Patents

Abstract

【課題】ＡＤの症度悪化の検出マーカーを用いたＡＤの症度悪化の検出方法、及び当該ＡＤの症度悪化の検出マーカーを提供する。【解決手段】被験者から採取された生体試料について、ＮＣＬＮ及びＺＮＦ４２９の２種の遺伝子より選択される少なくとも１つの遺伝子、又はその発現産物の発現レベルを測定する工程を含む、当該被験者のアトピー性皮膚炎の症度悪化の検出方法。【選択図】なし

Description

本発明は、アトピー性皮膚炎の症度悪化の検出マーカーを用いたアトピー性皮膚炎の症度悪化の検出方法に関する。

アトピー性皮膚炎（以下、「ＡＤ」とも称する）は、アトピー素因を有する者に主に発症する湿疹性皮膚疾患である。ＡＤの典型的な症状は、左右対側性に発生する、慢性及び反復性の痒み、皮疹、紅斑等、ならびに角化不全、バリア能低下、乾燥肌などである。ＡＤの多くは乳幼児に発症し、成長と共に軽快傾向を示すが、近年では成人型や難治性のＡＤも増加している。ＡＤでは、様々な病因が複合的に関わることにより、症状や表現型の多様性が形成され、増悪と軽快を繰り返すことが知られている（非特許文献１）。例えば、外用薬による寛解導入後に保湿を継続しない場合、１４日で約４割のＡＤ患者が、２８日で約６割のＡＤ患者が、症状の再燃を起こすことが報告されている（非特許文献２）。従って、ＡＤを治療するにあたっては、症状や表現型の多様性も含めたＡＤの症度、及びその経過を正しく把握することが必要である。

従来のＡＤの症度の評価方法としては、医師の肉眼による所見に基づく評価が挙げられる。所見項目としては、乾燥症状、紅斑、鱗屑、丘疹、掻破痕、浮腫、痂疲の付着、小水疱、びらん、痒診結節など様々に存在する。これらをスコア化した指標として、Ｅｃｚｅｍａ Ａｒｅａ ａｎｄ Ｓｅｖｅｒｉｔｙ Ｉｎｄｅｘ（ＥＡＳＩ）やＳｅｖｅｒｉｔｙ ＳＣＯＲｉｎｇ ｏｆ Ａｔｏｐｉｃ Ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ（ＳＣＯＲＡＤ）が存在する。一方、肉眼による所見や触覚を通した自覚に基づく、患者自身によるＡＤの評価も行われており、評価のためのスコア化した指標として、Ｐａｔｉｅｎｔ Ｏｒｉｅｎｔｅｄ Ｅｃｚｅｍａ Ｍｅａｓｕｒｅ（ＰＯＥＭ）、Ｐａｔｉｅｎｔ Ｏｒｉｅｎｔｅｄ ＳＣＯＲＡＤ（ＰＯ－ＳＣＯＲＡＤ）やＶｉｓｕａｌ Ａｎａｌｏｇ Ｓｃａｌｉｎｇ（ＶＡＳ）が存在する。

また、疾患の病態の客観的な理解には、皮膚生検、血液、角層などに含まれる遺伝子またはその発現産物や、特定の細胞種の存在（これらを総称してバイオマーカーと称することもある）が用いられることが多い。従来、ＡＤの存在の有無や症度を評価するためのバイオマーカーとしては、血液の末梢血好酸球数、血清総ＩｇＥ値、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）値、血清中のＴｈｙｍｕｓ ａｎｄ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ－Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ（ＴＡＲＣ）やＳｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ａｎｔｉｇｅｎ ２（ＳＣＣＡ２）等が提案されている（非特許文献３、４）。

ＡＤの治療においては、上記のような評価指標に基づき、医師による適切な治療方針のもと、薬剤の量や種類をコントロールし、寛解状態をできるだけ長く維持することや、急激な悪化を起こさないよう努めることが重要であると考えられる。例えば、外見や自覚には症状は表れていないように見えても、皮膚内部の組織や細胞では潜在的な炎症が続いているケースが存在し、症状が現れていない期間にも外用薬の塗布や保湿を継続することで寛解状態を維持する治療法はプロアクティブ療法と呼ばれる（非特許文献５）。しかし、症状が現れていない寛解期には患者の判断で治療を中断してしまうことがあり、ＡＤ患者への十分な説明や指導が重要と考えられる。

しかしながら、前記の従来の各種ＡＤの症度の評価方法は、評価又はバイオマーカー採取時点でのＡＤの存在の有無や症度を評価するものであり、その後の症状の増悪又は軽快の経過を予測するものではないのが実情である。したがって、今後１４日から２８日の間にＡＤ症状が増悪の経過を辿るか否かを客観的に把握することは、医師による治療法選択、及び患者の治療法遵守にとって有用な情報であると云える。

近年、生体試料中のＤＮＡやＲＮＡ等の核酸の解析によりヒトの生体内の現在さらには将来の生理状態を調べる技術が開発されている。生体由来の核酸は、血液等の体液、分泌物、組織等から抽出することができる。さらに最近、皮膚表上脂質（ｓｋｉｎ ｓｕｒｆａｃｅ ｌｉｐｉｄｓ；ＳＳＬ）に含まれるＲＮＡを生体の解析用の試料として利用可能であることが報告されている（特許文献１）。ＳＳＬからＡＤのマーカー遺伝子が検出できることも報告されている（特許文献２）。

国際公開公報第２０１８／００８３１９号 特開２０２０－０７４７６９号公報

加藤ら, 日本皮膚科学会誌, 2018, 128:2431-2502. Lin et al., Adv Ther. 2017, 34:2601-2611. Sugawara et al., Allergy. 2002, 57:180-181. Ohta et al., Ann Clin Biochem. 2012, 49:277-284. Schmitt et al., Br J Dermatol. 2011, 164:415-28.

本発明は、ＡＤの症度悪化の検出マーカーを用いたＡＤの症度悪化の検出方法、及び当該ＡＤの症度悪化の検出マーカーを提供することに関する。

本発明者らは、軽症及び中等症のＡＤ患者からＳＳＬを採取し、ＳＳＬ中に含まれるＲＮＡの発現状態をシーケンス情報として網羅的に解析した結果、特定の遺伝子の発現レベルが、ＳＳＬ採取時点から一定期間後の時点でその症度が悪化する患者とそうでない患者の間で有意に異なり、当該遺伝子を指標としてＡＤの症度悪化を予測できることを見出した。

すなわち、本発明は、以下の１）～３）に係るものである。
１）被験者から採取された生体試料について、ＮＣＬＮ及びＺＮＦ４２９の２種の遺伝子より選択される少なくとも１つの遺伝子、又はその発現産物の発現レベルを測定する工程を含む、当該被験者のアトピー性皮膚炎の症度悪化の検出方法。
２）前記遺伝子又はそれに由来する核酸と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、又は前記遺伝子の発現産物を認識する抗体を含有する、１）の方法に用いられるアトピー性皮膚炎の症度悪化を検出するための検査用キット。
３）ＮＣＬＮ及びＺＮＦ４２９の２種の遺伝子より選択される少なくとも１つの遺伝子、又はその発現産物からなる、アトピー性皮膚炎の症度悪化の検出マーカー。

本発明によれば、症状の増悪と軽快を繰り返すことが多いＡＤ患者において、近い将来、症度が悪化するか否かの予測を容易に行うことができ、患者ごとに将来の症状悪化を想定した最適治療や情報の提供を受けることが可能になる。

本明細書中で引用された全ての特許文献、非特許文献、及びその他の刊行物は、その全体が本明細書中において参考として援用される。

本発明において、「核酸」又は「ポリヌクレオチド」と云う用語は、ＤＮＡ又はＲＮＡを意味する。ＤＮＡには、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、及び合成ＤＮＡのいずれもが含まれ、「ＲＮＡ」には、ｔｏｔａｌ ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡ及び合成のＲＮＡのいずれもが含まれる。

本発明において「遺伝子」とは、ヒトゲノムＤＮＡを含む２本鎖ＤＮＡの他、ｃＤＮＡを含む１本鎖ＤＮＡ（正鎖）、当該正鎖と相補的な配列を有する１本鎖ＤＮＡ（相補鎖）、及びこれらの断片を包含するものであって、ＤＮＡを構成する塩基の配列情報の中に、何らかの生物学的情報が含まれているものを意味する。
また、本発明における「遺伝子」には、特定の塩基配列で表される「遺伝子」だけではなく、その同族体（すなわち、ホモログもしくはオーソログ）、遺伝子多型等の変異体、及び誘導体が包含される。

本発明において、遺伝子の「発現産物」とは、遺伝子の転写産物及び翻訳産物を包含する概念である。「転写産物」とは、遺伝子（ＤＮＡ）から転写されて生じるＲＮＡであり、「翻訳産物」とは、ＲＮＡに基づき翻訳合成される、遺伝子にコードされたタンパク質を意味する。

本発明において、「アトピー性皮膚炎（ＡＤ）」とは、増悪・寛解を繰り返す、そう痒のある湿疹を主病原とする疾患を指し、その患者の多くは、アトピー素因を持つとされている。アトピー素因としては、ｉ）家族歴・既往歴（気管支喘息、アレルギー性鼻炎・結膜炎、アトピー性皮膚炎のうちいずれか、あるいは複数の疾患）、又はii）ＩｇＥ抗体を産生し易い素因、が挙げられる。

本発明において、ＡＤの「症度」とは、ＡＤの症状のレベルを指し、かつ軽度、中等度、重度などの大まかな分類だけでなく、より軽微な違いによる分類を含む。ＡＤの「症度」は、例えばＡＤ症状を評価する公知の各種評価スコアに基づいて決定することができる。本発明では、該評価スコアを「ＡＤの症度に係るスコア」と称する。該ＡＤの症度に係るスコアの例としては、ＡＤによる全身の皮疹に係るＥＡＳＩスコア及びＰＯＥＭスコア、ＡＤによる皮膚の痒みのＶＡＳスコア、ＡＤによる皮膚乾燥のＶＡＳスコア（アトピー性皮膚炎診療ガイドライン, 日本皮膚科学会刊行, 日本皮膚科学会誌:128(12), 2431-2502 (2018)）等が挙げられ、好ましくはＡＤによる全身の皮疹に係るＥＡＳＩスコア及びＰＯＥＭスコアであり、より好ましくはＡＤによる全身の皮疹に係るＥＡＳＩスコアである。「症度」として、該ＡＤの症度に係るスコア自体をＡＤの症状のレベルとして用いても良い。

本発明において、ＡＤの症度悪化の「検出」は、検査、測定、判定又は評価支援などの用語で言い換えることもできる。なお、本発明におけるＡＤの症度悪化の「検出」、「検査」、「測定」、「判定」又は「評価」という用語は、医師によるＡＤの症度悪化の診断を含むものではない。

後述する実施例に示すように、重症度が軽症及び中等症のＡＤ患者を被験者とし、４２日間（６週間）の観察期間を設けて、所定の時期（０日目（０週目）と２８日目（４週目））にＳＳＬを採取し、以下の１）～４）の手順で、ＳＳＬ中に含まれるＲＮＡの発現解析を行った。ＳＳＬ採取時点から１４日間（２週間）経過後の時点（１４日目（２週目）と４２日目（６週目））でその症度が悪化する患者群（悪化群）とそうでない患者群（非悪化群）のＲＮＡ発現レベルを比較したところ、いずれの時期においてもＮＣＬＮ及びＺＮＦ４２９の２種の遺伝子の発現レベルが悪化群において有意に上昇することが認められた。
１）ＳＳＬから抽出されたＲＮＡの発現量のデータ（リードカウント値）を取得する。 ２）リードカウント値をサンプル間の総リード数の違いを補正したＲＰＭ値に変換し、これに整数１を加算したＲＰＭ＋１値を底２の対数値に変換した値（Ｌｏｇ_２（ＲＰＭ＋１）値）を発現レベルの指標とし、これに基づいて、悪化群と非悪化群で発現レベルに差異がある遺伝子を選択する。
具体的には、まず、悪化群と非悪化群の２群間でＷｅｌｃｈのｔ検定においてｐ値が０．０５未満である遺伝子を選択する。ここで、「ｐ値（ｐ ｖａｌｕｅ）」とは、統計学的検定において、帰無仮説の下で実際にデータから計算された統計量よりも極端な統計量が観測される確率を示す。したがって「ｐ値」が小さいほど、比較対象間に有意差があるとみなせる。
３）次に、悪化群と非悪化群との間で、発現レベルの平均値に１を超える差がある遺伝子を選択する。
具体的には、｛悪化群のＬｏｇ_２（ＲＰＭ＋１）値の平均値｝－｛非悪化群のＬｏｇ_２（ＲＰＭ＋１）値の平均値｝を算出し、その絶対値が１より大きい遺伝子を選択する。
４）悪化群と非悪化群の２群間でｐ値が０．０５未満であり、且つ発現レベルの差が１を超える遺伝子を、悪化群と非悪化群との間の発現変動遺伝子として選択する。

したがって、ＮＣＬＮ及びＺＮＦ４２９の２種の遺伝子群より選択される遺伝子又はその発現産物は症度悪化の検出マーカーとなり得る。
ここで、「ＮＣＬＮ」及び「ＺＮＦ４２９」なる遺伝子名は、ＮＣＢＩ（[www.ncbi.nlm.nih.gov/]）に記載のあるＯｆｆｉｃｉａｌ Ｓｙｍｂｏｌに従うものであり、Ｇｅｎ
ｅ ＩＤは、ＮＣＬＮが５６９２６、ＺＮＦ４２９は３５３０８８である。

本発明において、「症度悪化の検出」とは、試料採取時点から隔てられた期間後の時点における、当該被験者のＡＤの症度悪化の有無を検出することを指す。すなわち、症度悪化の検出とは、試料採取時点から隔てられた期間後の時点における症度の悪化の有無を予測するものである。
ここで、「隔てられた期間」としては、好ましくは１２日間以上、より好ましくは１３日以上で、且つ好ましくは１６日間以下、より好ましくは１５日間以下であり、更に好ましくは１４日間である。

本発明において、「症度悪化」とは、ＡＤの症度が、現時点（試料採取時）のレベルより悪いことを指す。ＡＤの「症度」は、前述したとおり、ＡＤ症状を評価する公知の各種評価スコアに基づいて決定することができる。すなわち、ＡＤによる全身の皮疹に係るＥＡＳＩスコア及びＰＯＥＭスコア、ＡＤによる皮膚の痒みのＶＡＳスコア、ＡＤによる皮膚乾燥のＶＡＳスコア（アトピー性皮膚炎診療ガイドライン, 日本皮膚科学会刊行, 日皮会誌:128(12), 2431-2502 (2018)）等による評価が悪化することが挙げられる。
このうち、本発明ではＡＤによる全身の皮疹に係るＥＡＳＩスコア及びＰＯＥＭスコアを用いることが好ましく、ＥＡＳＩスコアによる評価を用いることがさらに好ましい。
ＥＡＳＩは、頭頚部、体幹、上肢、下肢を評価部位とし、それぞれの評価部位における紅斑、浮腫/浸潤/丘疹、掻破痕、苔癬化の４つの症状別スコアと、評価部位全体に占める上の４つの症状の面積のパーセンテージ（％）に基づいて算出される、０～７２の値である（Hanifin et al. Exp Dermatol, 10, 2001）。ＥＡＳＩスコアが悪化する場合とは、
例えば、ＥＡＳＩスコアを用いた既存の重症度分類（Chopra et al. Br J Dermatol.177, 2017）における軽症から中等症へ症度が悪化する場合に限らず、現時点（試料採取時）
のＥＡＳＩスコアに比べてＥＡＳＩスコアが上昇する全ての場合が含まれる。

なお、上記のＡＤの症度悪化の検出マーカーとなり得る遺伝子（以下、「標的遺伝子」とも称す）には、ＡＤの症度悪化を検出するためのバイオマーカーとなり得る限り、当該遺伝子を構成するＤＮＡの塩基配列と実質的に同一の塩基配列を有する遺伝子も包含される。ここで、実質的に同一の塩基配列とは、例えば、相同性計算アルゴリズムNCBI BLASTを用い、期待値＝１０；ギャップを許す；フィルタリング＝ＯＮ；マッチスコア＝１；ミスマッチスコア＝－３の条件にて検索をした場合、当該遺伝子を構成するＤＮＡの塩基配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上の同一性があることを意味する。

本発明のＡＤの症度悪化の検出方法は、被験者から採取された生体試料について、標的遺伝子、一態様として、ＮＣＬＮ及びＺＮＦ４２９の２種の遺伝子より選択される少なくとも１つの遺伝子又はその発現産物の発現レベルを測定する工程を含む。

本発明のＡＤの症度悪化の検出方法において、被験者の性別、年齢及び人種等は特に限定されず、乳児から老人までを含み得る。好ましくは、該被験者は、ＡＤの症度悪化の検出を必要とするか又は希望するヒトである。例えば、該被験者は、アトピー性皮膚炎を発症しているヒト、アトピー性皮膚炎の発症が疑われるヒト又は遺伝的にアトピー性皮膚炎の素因を有するヒトである。

本発明において用いられる生体試料としては、ＡＤの症度悪化に応じて本発明の遺伝子が発現変化する細胞、組織及び生体材料であればよい。具体的には臓器、皮膚、血液、尿、唾液、汗、角層、皮膚表上脂質（ＳＳＬ）、組織浸出液等の体液、血液から調製された血清、血漿、その他、便、毛髪等が挙げられ、好ましくは皮膚、角層、または皮膚表上脂質（ＳＳＬ）、より好ましくは皮膚表上脂質（ＳＳＬ）が挙げられる。ＳＳＬが採取される皮膚の部位としては、特に限定されず、頭、顔、首、体幹、手足等の身体の任意の部位の皮膚が挙げられ、皮脂の分泌が多い部位、例えば頭又は顔の皮膚が好ましく、顔の皮膚がより好ましい。また、ＳＳＬが採取される皮膚の部位は、アトピー性皮膚炎が発症している皮疹部であっても、発症していない無疹部であってもいずれでもよいが、好ましくは、皮疹部又は皮疹部近傍の無疹部が好ましい。ここで皮疹部近傍とは、皮疹部に隣接する１０ｃｍ以内の範囲を指す。

ここで、「皮膚表上脂質（ＳＳＬ）」とは、皮膚の表上に存在する脂溶性画分をいい、皮脂と呼ばれることもある。一般に、ＳＳＬは、皮膚にある皮脂腺等の外分泌腺から分泌された分泌物を主に含み、皮膚表面を覆う薄い層の形で皮膚表上に存在している。ＳＳＬは、皮膚細胞で発現したＲＮＡを含む。（前記特許文献１参照）。また本発明において、「皮膚」とは、特に限定しない限り、角層、表皮、真皮、毛包、ならびに汗腺、皮脂腺及びその他の腺等の組織を含む領域の総称である。

被験者の皮膚からのＳＳＬの採取には、皮膚からのＳＳＬの回収又は除去に用いられているあらゆる手段を採用することができる。好ましくは、後述するＳＳＬ吸収性素材、ＳＳＬ接着性素材、又は皮膚からＳＳＬをこすり落とす器具を使用することができる。ＳＳＬ吸収性素材又はＳＳＬ接着性素材としては、ＳＳＬに親和性を有する素材であれば特に限定されず、例えばポリプロピレン、パルプ等が挙げられる。皮膚からのＳＳＬの採取手順のより詳細な例としては、あぶら取り紙、あぶら取りフィルム等のシート状素材へＳＳＬを吸収させる方法、ガラス板、テープ等へＳＳＬを接着させる方法、スパーテル、スクレイパー等によりＳＳＬをこすり落として回収する方法、等が挙げられる。ＳＳＬの吸着性を向上させるため、脂溶性の高い溶媒を予め含ませたＳＳＬ吸収性素材を用いてもよい。一方、ＳＳＬ吸収性素材は、水溶性の高い溶媒や水分を含んでいるとＳＳＬの吸着が阻害されるため、水溶性の高い溶媒や水分の含有量が少ないことが好ましい。ＳＳＬ吸収性素材は、乾燥した状態で用いることが好ましい。

被験者から採取されたＲＮＡ含有ＳＳＬは一定期間保存されてもよい。採取されたＳＳＬは、含有するＲＮＡの分解を極力抑えるために、採取後できるだけ速やかに低温条件で保存することが好ましい。本発明における該ＲＮＡ含有ＳＳＬの保存の温度条件は、０℃以下であればよく、好ましくは－２０±２０℃～－８０±２０℃、より好ましくは－２０
±１０℃～－８０±１０℃、さらに好ましくは－２０±２０℃～－４０±２０℃、さらに
好ましくは－２０±１０℃～－４０±１０℃、さらに好ましくは－２０±１０℃、さらに
好ましくは－２０±５℃である。該ＲＮＡ含有ＳＳＬの該低温条件での保存の期間は、特
に限定されないが、好ましくは１２か月以下、例えば６時間以上１２ヶ月以下、より好ましくは６ヶ月以下、例えば１日間以上６ヶ月以下、さらに好ましくは３ヶ月以下、例えば３日間以上３ヶ月以下である。

本発明において、標的遺伝子又はその発現産物の発現レベルの測定対象としては、ＲＮＡから人工的に合成されたｃＤＮＡ、そのＲＮＡをエンコードするＤＮＡ、そのＲＮＡにコードされるタンパク質、該タンパク質と相互作用をする分子、そのＲＮＡと相互作用する分子、又はそのＤＮＡと相互作用する分子等が挙げられる。ここで、ＲＮＡ、ＤＮＡ又はタンパク質と相互作用する分子としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、多糖、オリゴ糖、単糖、脂質、脂肪酸、及びこれらのリン酸化物、アルキル化物、糖付加物等、及び上記いずれかの複合体が挙げられる。また、発現レベルとは、当該遺伝子又は発現産物の発現量や活性を包括的に意味する。

本発明の方法においては、好ましい態様として、生体試料としてＳＳＬが用いられるが、この場合にはＳＳＬに含まれるＲＮＡの発現レベルが解析され、具体的にはＲＮＡを逆転写によりｃＤＮＡに変換した後、該ｃＤＮＡ又はその増幅産物が測定される。
ＳＳＬからのＲＮＡの抽出には、生体試料からのＲＮＡの抽出又は精製に通常使用される方法、例えば、フェノール/クロロホルム法、ＡＧＰＣ（ａｃｉｄ ｇｕａｎｉｄｉｎ
ｉｕｍ ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ－ｐｈｅｎｏｌ－ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）法、又はＴＲＩｚｏｌ（登録商標）、ＲＮｅａｓｙ（登録商標）、ＱＩＡｚｏｌ（登録商標）等のカラムを用いた方法、シリカをコーティングした特殊な磁性体粒子を用いる方法、Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ磁性体粒子を用いる方法、ＩＳＯＧＥＮ等の市販のＲＮＡ抽出試薬による抽出等を用いることができる。

該逆転写には、解析したい特定のＲＮＡを標的としたプライマーを用いてもよいが、より包括的な核酸の保存及び解析のためにはランダムプライマーを用いることが好ましい。該逆転写には、一般的な逆転写酵素又は逆転写試薬キットを使用することができる。好適には、正確性及び効率性の高い逆転写酵素又は逆転写試薬キットが用いられ、その例としては、Ｍ－ＭＬＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ及びその改変体、あるいは市販の逆転写酵素又は逆転写試薬キット、例えばＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標）Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅシリーズ（タカラバイオ社）、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅシリーズ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）等が挙げられる。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）III Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＶＩＬＯ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ（いずれもＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）等が好ましく用いられる。
該逆転写における伸長反応は、温度を好ましくは４２℃±１℃、より好ましくは４２℃±０．５℃、さらに好ましくは４２℃±０．２５℃に調整し、一方、反応時間を好ましくは６０分間以上、より好ましくは８０～１２０分間に調整するのが好ましい。

発現レベルを測定する方法は、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ又はＤＮＡを対象とする場合、これらにハイブリダイズするＤＮＡをプライマーとしたＰＣＲ法、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法、マルチプレックスＰＣＲ、ＳｍａｒｔＡｍｐ法、ＬＡＭＰ法等に代表される核酸増幅法、これらにハイブリダイズする核酸をプローブとして用いるハイブリダイゼーション法（ＤＮＡチップ、ＤＮＡマイクロアレイ、ドットブロットハイブリダイゼーション、スロットブロットハイブリダイゼーション、ノーザンブロットハイブリダイゼーション等）、塩基配列を決定する方法（シーケンシング）、又はこれらを組み合わせた方法から選ぶことができる。

ＰＣＲでは、解析したい特定のＤＮＡを標的としたプライマーペアを用いて該特定の１種のＤＮＡのみを増幅してもよいが、複数のプライマーペアを用いて同時に複数の特定のＤＮＡを増幅してもよい。好ましくは、該ＰＣＲはマルチプレックスＰＣＲである。マルチプレックスＰＣＲは、ＰＣＲ反応系に複数のプライマー対を同時に使用することで、複数の遺伝子領域を同時に増幅する方法である。マルチプレックスＰＣＲは、市販のキット（例えば、Ｉｏｎ ＡｍｐｌｉＳｅｑＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔ；ライフテクノロジーズジャパン株式会社等）を用いて実施することができる。
該ＰＣＲにおけるアニーリング及び伸長反応の温度は、使用するプライマーに依存するため一概には言えないが、上記のマルチプレックスＰＣＲキットは用いる場合、好ましくは６２℃±１℃、より好ましくは６２℃±０．５℃、さらに好ましくは６２℃±０．２５℃である。したがって、該ＰＣＲでは、好ましくはアニーリング及び伸長反応が１ステップで行われる。該アニーリング及び伸長反応のステップの時間は、増幅すべきＤＮＡのサイズ等に依存して調整され得るが、好ましくは１４～１８分間である。該ＰＣＲにおける変性反応の条件は、増幅すべきＤＮＡに依存して調整され得るが、好ましくは９５～９９℃で１０～６０秒間である。上記のような温度及び時間での逆転写及びＰＣＲは、一般的にＰＣＲに使用されるサーマルサイクラーを用いて実行することができる。

当該ＰＣＲで得られた反応産物の精製は、反応産物のサイズ分離によって行われることが好ましい。サイズ分離により、目的のＰＣＲ反応産物を、ＰＣＲ反応液中に含まれるプライマーやその他の不純物から分離することができる。ＤＮＡのサイズ分離は、例えば、サイズ分離カラムや、サイズ分離チップ、サイズ分離に利用可能な磁気ビーズ等によって行うことができる。サイズ分離に利用可能な磁気ビーズの好ましい例としては、Ａｍｐｕｒｅ ＸＰ等のＳｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ（ＳＰＲＩ）磁性ビーズが挙げられる。

精製したＰＣＲ反応産物に対して、その後の定量解析を行うために必要なさらなる処理を施してもよい。例えば、ＤＮＡのシーケンシングのために、精製したＰＣＲ反応産物を、適切なバッファー溶液へと調製したり、ＰＣＲ増幅されたＤＮＡに含まれるＰＣＲプライマー領域を切断したり、増幅されたＤＮＡにアダプター配列をさらに付加したりしてもよい。例えば、精製したＰＣＲ反応産物をバッファー溶液へと調製し、増幅ＤＮＡに対してＰＣＲプライマー配列の除去及びアダプターライゲーションを行い、得られた反応産物を、必要に応じて増幅して、定量解析のためのライブラリーを調製することができる。これらの操作は、例えば、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＶＩＬＯ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）に付属している５×ＶＩＬＯ ＲＴ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｉｘ、及びＩｏｎ ＡｍｐｌｉＳｅｑ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）に付属している５×Ｉｏｎ ＡｍｐｌｉＳｅｑ ＨｉＦｉ Ｍｉｘ、及びＩｏｎ ＡｍｐｌｉＳｅｑ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｃｏｒｅ Ｐａｎｅｌを用いて、各キット付属のプロトコルに従って行うことができる。

ノーザンブロットハイブリダイゼーション法を利用して標的遺伝子又はそれに由来する核酸の発現量を測定する場合は、例えば、まずプローブＤＮＡを放射性同位元素、蛍光物質等で標識し、次いで、得られた標識ＤＮＡを、常法に従ってナイロンメンブレン等にトランスファーした生体試料由来のＲＮＡとハイブリダイズさせる。その後、形成された標識ＤＮＡとＲＮＡとの二重鎖を、標識物に由来するシグナルを検出することにより測定する方法が挙げられる。

ＲＴ－ＰＣＲ法を用いて標的遺伝子又はそれに由来する核酸の発現量を測定する場合は、例えば、まず生体試料由来のＲＮＡから常法に従ってｃＤＮＡを調製し、これを鋳型として本発明の標的遺伝子が増幅できるように調製した一対のプライマー（上記ｃＤＮＡ（－鎖）に結合する正鎖、＋鎖に結合する逆鎖）をこれとハイブリダイズさせる。その後、常法に従ってＰＣＲ法を行い、得られた増幅二本鎖ＤＮＡを検出する。増幅された二本鎖ＤＮＡの検出には、予めＲＩ、蛍光物質等で標識しておいたプライマーを用いて上記ＰＣＲを行うことによって産生される標識二本鎖ＤＮＡを検出する方法等を用いることができる。

ＤＮＡマイクロアレイを用いて標的遺伝子又はそれに由来する核酸の発現量を測定する場合は、例えば、支持体に本発明の標的遺伝子由来の核酸（ｃＤＮＡ又はＤＮＡ）の少なくとも１種を固定化したアレイを用い、ｍＲＮＡから調製した標識化ｃＤＮＡ又はｃＲＮＡをマイクロアレイ上に結合させ、マイクロアレイ上の標識を検出することによって、ｍＲＮＡの発現量を測定することができる。
前記アレイに固定化される核酸としては、ストリンジェントな条件下に特異的（すなわち、実質的に目的の核酸のみに）にハイブリダイズする核酸であればよく、例えば、本発明の標的遺伝子の全配列を有する核酸であってもよく、部分配列からなる核酸であってもよい。ここで、「部分配列」とは、少なくとも１５～２５塩基からなる核酸が挙げられる。ここでストリンジェントな条件は、通常「１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、３７℃」程度
の洗浄条件を挙げることができ、より厳しいハイブリダイズ条件としては「０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」程度、さらに厳しいハイブリダイズ条件としては「０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」程度の条件を挙げることができる。ハイブリダイズ条件は、J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Thrd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)等に記載されている。

シーケンシングによって標的遺伝子又はそれに由来する核酸の発現量を測定する場合は、例えば、次世代シーケンサー（例えばＩｏｎ Ｓ５／ＸＬシステム、ライフテクノロジーズジャパン株式会社）が用いて解析することが挙げられる。シーケンシングで作成されたリードの数（リードカウント）に基づいて、ＲＮＡ発現を定量することができる。

上記の測定に用いられるプローブ又はプライマー、すなわち、本発明の標的遺伝子又はそれに由来する核酸を特異的に認識し増幅するためのプライマー、又は該ＲＮＡ又はそれに由来する核酸を特異的に検出するためのプローブがこれに該当するが、これらは、当該標的遺伝子を構成する塩基配列に基づいて設計することができる。ここで「特異的に認識する」とは、例えばノーザンブロット法において、実質的に本発明の標的遺伝子又はそれに由来する核酸のみを検出できること、また例えばＲＴ－ＰＣＲ法において、実質的に当該核酸のみが増幅される如く、当該検出物又は生成物が当該遺伝子又はそれに由来する核酸であると判断できることを意味する。
具体的には、本発明の標的遺伝子を構成する塩基配列からなるＤＮＡ又はその相補鎖に相補的な一定数のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを利用することができる。ここで「相補鎖」とは、Ａ：Ｔ（ＲＮＡの場合はＵ）、Ｇ：Ｃの塩基対からなる２本鎖ＤＮＡの一方の鎖に対する他方の鎖を指す。また、「相補的」とは、当該一定数の連続したヌクレオチド領域で完全に相補配列である場合に限られず、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、よりさらに好ましくは９８％以上の塩基配列上の同一性を有すればよい。塩基配列の同一性は、前記ＢＬＡＳＴ等のアルゴリズムにより決定することができる。
斯かるオリゴヌクレオチドは、プライマーとして用いる場合には、特異的なアニーリング及び鎖伸長ができればよく、通常、例えば１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上、より好ましくは２０塩基以上、かつ例えば１００塩基以下、好ましくは５０塩基以下、より好ましくは３５塩基以下の鎖長を有するものが挙げられる。また、プローブとして用いる場合には、特異的なハイブリダイゼーションができればよく、本発明の標的遺伝子を構成する塩基配列からなるＤＮＡ（又はその相補鎖）の少なくとも一部若しくは全部の配列を有し、例えば１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上、かつ例えば１００塩基以下、好ましくは５０塩基以下、より好ましくは２５塩基以下の鎖長のものが用いられる。
なお、ここで、「オリゴヌクレオチド」は、ＤＮＡあるいはＲＮＡであることができ、合成されたものでも天然のものでもよい。又、ハイブリダイゼーションに用いるプローブは、通常標識したものが用いられる。

また、本発明の標的遺伝子の翻訳産物（タンパク質）、当該タンパク質と相互作用する分子、ＲＮＡと相互作用する分子、又はＤＮＡと相互作用する分子を測定する場合は、プロテインチップ解析、免疫測定法（例えば、ＥＬＩＳＡ等）、質量分析（例えば、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＭＳ）、１－ハイブリッド法（PNAS 100, 12271-12276(2003)）や２－ハイブリッド法（Biol. Reprod. 58, 302-311 (1998)）のような方法を用いることができ、対象に応じて適宜選択できる。
例えば、測定対象としてタンパク質が用いられる場合は、本発明の発現産物を特異的に認識する抗体、具体的には発現産物であるタンパク質を他のタンパク質から識別することが可能な構造的特徴部位（エピトープ）を認識する抗体を生体試料と接触させ、当該抗体に結合した試料中のポリペプチド又はタンパク質を検出し、そのレベルを測定することによって実施される。例えば、ウェスタンブロット法によれば、一次抗体として上記の抗体を用いた後、二次抗体として放射性同位元素、蛍光物質又は酵素等で標識した一次抗体に結合する抗体を用いて、その一次抗体を標識し、これら標識物質由来のシグナルを放射線測定器、蛍光検出器等で測定することが行われる。
尚、上記翻訳産物に対する抗体は、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよい。これらの抗体は、公知の方法に従って製造することができる。具体的には、ポリクローナル抗体は、常法に従って大腸菌等で発現し精製したタンパク質を用いて、あるいは常法に従って当該タンパク質の部分ポリペプチドを合成して、家兎等の非ヒト動物に免疫し、該免疫動物の血清から常法に従って得ることが可能である。
一方、モノクローナル抗体は、常法に従って大腸菌等で発現し精製したタンパク質又は該タンパク質の部分ポリペプチドをマウス等の非ヒト動物に免疫し、得られた脾臓細胞と骨髄腫細胞とを細胞融合させて調製したハイブリドーマ細胞から得ることができる。また、モノクローナル抗体は、ファージディスプレイを用いて作製してもよい（Griffiths, A.D.; Duncan, A.R., Current Opinion in Biotechnology, Volume 9, Number 1, February 1998 , pp. 102-108(7)）。

斯くして、被験者から採取された生体試料中の本発明の標的遺伝子又はその発現産物の発現レベルが測定され、当該発現レベルに基づいてＡＤの症度悪化が検出される。検出は、具体的には、測定された本発明の標的遺伝子又はその発現産物の発現レベルを対照レベルまたは予め設定したカットオフ値（参照値）と比較することによって行われる。
シーケンシングにより複数の標的遺伝子の発現レベルの解析を行う場合は、上記したように、発現量のデータであるリードカウント値、該リードカウント値をサンプル間の総リード数の違いを補正したＲＰＭ値、当該ＲＰＭ値を底２の対数値に変換した値（Ｌｏｇ_２ＲＰＭ値）又は整数１を加算した底２の対数値（Ｌｏｇ_２（ＲＰＭ＋１）値）、あるいはＤＥＳｅｑ２（Love MI et al. Genome Biol. 2014）を用いて補正されたカウント値（Ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ ｃｏｕｎｔ値）又は整数１を加算した底２の対数値（Ｌｏｇ_２（Ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ ｃｏｕｎｔ＋１）値）を指標として用いるのが好ましい。また、ＲＮＡ－ｓｅｑの定量値として一般的な、ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｐｅｒ ｋｉｌｏｂａｓｅ ｏｆ ｅｘｏｎ ｐｅｒ ｍｉｌｌｉｏｎ ｒｅａｄｓ ｍａｐｐｅｄ（ＦＰＫＭ）、ｒｅａｄｓ ｐｅｒ ｋｉｌｏｂａｓｅ ｏｆ ｅｘｏｎ ｐｅｒ ｍｉｌｌｉｏｎ ｒｅａｄｓ ｍａｐｐｅｄ（ＲＰＫＭ）、ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ ｐｅｒ ｍｉｌｌｉｏｎ（ＴＰＭ）などによって算出される値であってもよい。また、マイクロアレイ法によって得られるシグナル値、及びその補正値であってもよい。また、ＲＴ－ＰＣＲなどにより特定の標的遺伝子のみの解析を行う場合には、対象遺伝子の発現量をハウスキーピング遺伝子の発現量を基準とする相対的な発現量に変換して解析する方法、又は標的遺伝子の領域を含むプラスミドを用いて絶対的なコピー数を定量（絶対定量）して解析する方法が好ましい。デジタルＰＣＲ法によって得られるコピー数であってもよい。
ここで、「対照レベル」とは、一定期間に症度が悪化しなかった患者集団における、当該標的遺伝子又はその発現産物の発現レベルが挙げられる。該発現レベルは、該集団から測定した当該標的遺伝子又はその発現産物の発現レベルの平均値や標準偏差等の統計値を参考に決定した値であっても良い。「参照値」とは、一定期間に症度が悪化したか否かと、標的マーカーの発現レベルの関係に基づき、予め決定することができる。例えば、ある集団を、一定期間に症度が悪化したか否かに基づいて悪化群と非悪化群に分け、それぞれの群における標的マーカーの発現レベルの平均値や標準偏差等の統計値を参考に決定した値を、それぞれの群への属否を判別する参照値として決定することができる。標的遺伝子として複数種の遺伝子を用いる場合は、それぞれ各々の遺伝子又はその発現産物について対照レベルや参照値を求めることが好ましい。

さらに、一定期間内に症度が悪化するＡＤ患者由来の標的遺伝子又はその発現産物の発現レベルと、一定期間内に症度が悪化しないＡＤ患者由来の標的遺伝子又はその発現産物の発現レベルの測定値を利用して、症度が悪化する患者群及び症度が悪化しない患者群とを分ける判別式（予測モデル）を構築し、当該判別式を利用して、ＡＤの症度悪化を検出することができる。すなわち、一定期間内に症度が悪化するＡＤ患者由来の標的遺伝子又はその発現産物の発現レベルと、一定期間内に症度が悪化しないＡＤ患者由来の標的遺伝子又はその発現産物の発現レベルの測定値を教師サンプルとして、症度が悪化する患者群（悪化群）及び症度が悪化しない患者群（非悪化群）を分ける判別式（予測モデル）を構築し、当該判別式に基づいて症度悪化が異なる各患者群を判別するカットオフ値（参照値）を求める。
そして、被験者から採取された生体試料から標的遺伝子又はその発現産物のレベルを同様に測定し、得られた測定値を当該判別式に代入し、当該判別式から得られた結果を参照値と比較することによって、被検者におけるＡＤの症度悪化を検出できる。

判別式の構築におけるアルゴリズムとしては、機械学習に用いるアルゴリズムなどの公知のものを利用することができる。機械学習アルゴリズムの例としては、ランダムフォレスト（Ｒａｎｄｏｍ ｆｏｒｅｓｔ）、線形カーネルのサポートベクターマシン（ＳＶＭ ｌｉｎｅａｒ）、ｒｂｆカーネルのサポートベクターマシン（ＳＶＭ ｒｂｆ）、ニューラルネットワーク（Ｎｅｒｕｒａｌ ｎｅｔ）、一般線形モデル（Ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ ｌｉｎｅａｒ ｍｏｄｅｌ）、正則化線形判別分析（Ｒｅｇｕｌａｒｉｚｅｄ ｌｉｎｅａｒ ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｎｔ ａｎａｌｙｓｉｓ）、正則化ロジスティック回帰（Ｒｅｇｕｌａｒｉｚｅｄ ｌｏｇｉｓｔｉｃ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ）などが挙げられる。構築した予測モデルに検証用のデータを入力して予測値を算出し、該予測値が実測値と最も適合するモデル、例えば正解率（Ａｃｃｕｒａｃｙ）が最も大きいモデルを最適な予測モデルとして選抜することができる。また、予測値と実測値から検出率（Ｒｅｃａｌｌ）、精度（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ）、及びそれらの調和平均であるＦ値を計算し、そのＦ値が最も大きいモデルを最適な予測モデルとして選抜することができる。

カットオフ値（参照値）の決定方法は特に制限されず、公知の手法に従って決定することができる。例えば、判別式を使用して作成されたＲＯＣ（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ Ｃｕｒｖｅ）曲線より求めることができる。ＲＯＣ曲線では、縦軸に陽性患者において陽性の結果がでる確率（感度）と、横軸に陰性患者において陰性の結果がでる確率（特異度）を１から減算した値（偽陽性率）がプロットされる。ＲＯＣ曲線に示される「真陽性（感度）」及び「偽陽性（１－特異度）」に関し、「真陽性（感度）」－「偽陽性（１－特異度）」が最大となる値（Ｙｏｕｄｅｎ ｉｎｄｅｘ）をカットオフ値（参照値）とすることができる。

本発明のＡＤの症度悪化を検出するための検査用キットは、患者から分離した生体試料における本発明の標的遺伝子又はその発現産物の発現レベルを測定するための検査試薬を含有するものである。具体的には、本発明の標的遺伝子又はそれに由来する核酸と特異的に結合（ハイブリダイズ）するオリゴヌクレオチド（例えば、ＰＣＲ用のプライマー）を含む、核酸増幅、ハイブリダイゼーションのための試薬、或いは、本発明の標的遺伝子の発現産物（タンパク質）を認識する抗体を含む免疫学的測定のための試薬等が挙げられる。当該キットに包含されるオリゴヌクレオチド、抗体等は、上述したとおり公知の方法により得ることができる。
また、当該検査用キットには、上記抗体や核酸の他、標識試薬、緩衝液、発色基質、二次抗体、ブロッキング剤や、試験に必要な器具やポジティブコントロールやネガティブコントロールとして使用するコントロール試薬、生体試料を採取するための用具（例えば、ＳＳＬを採取するためのあぶら取りフィルムなど）等を含むことができる。

上述した実施形態に関し、本発明においてはさらに以下の態様が開示される。
＜１＞被験者から採取された生体試料について、ＮＣＬＮ及びＺＮＦ４２９の２種の遺伝子より選択される少なくとも１つの遺伝子又はその発現産物の発現レベルを測定する工程を含む、当該被験者のアトピー性皮膚炎の症度悪化の検出方法。
＜２＞前記測定された発現レベルを、対照レベルまたはカットオフ値（参照値）と比較する工程をさらに含む、＜１＞の方法。
＜３＞前記対照レベルまたはカットオフ値（参照値）を決定する工程をさらに含む、＜２＞の方法。
＜４＞症度が悪化する患者群及び症度が悪化しない患者群とを分ける判別式（予測モデル）を利用してアトピー性皮膚炎の症度悪化を検出する工程をさらに含む、＜１＞の方法。
＜５＞前記判別式（予測モデル）を構築する工程をさらに含む、＜４＞の方法。
＜６＞症度悪化が、試料採取時点から１２日間以上１６日間以下の期間後の時点における状態である、＜１＞～＜５＞のいずれかの方法。
＜７＞症度がＥｃｚｅｍａ Ａｒｅａ ａｎｄ Ｓｅｖｅｒｉｔｙ Ｉｎｄｅｘに対応する、全身を対象としたアトピー性皮膚炎の症度である、＜１＞～＜６＞のいずれかの方法。
＜８＞遺伝子又はその発現産物の発現レベルがｍＲＮＡの発現レベルの測定である、＜１＞～＜７＞のいずれかの方法。
＜９＞遺伝子又はその発現産物が前記被験者の皮膚表上脂質に含まれるＲＮＡである、＜１＞～＜８＞のいずれかの方法。
＜１０＞前記被験者が、アトピー性皮膚炎の症度悪化の検出を必要とするか又は希望するヒトである、＜１＞～＜９＞のいずれかの方法。
＜１１＞前記被験者が、アトピー性皮膚炎を発症しているヒト、アトピー性皮膚炎の発症が疑われるヒト又は遺伝的にアトピー性皮膚炎の素因を有するヒトである、＜１＞～＜９＞のいずれかの方法。
＜１２＞被験者から採取された生体試料に由来するＮＣＬＮ及びＺＮＦ４２９の２種の遺伝子より選択される少なくとも１つの遺伝子又はその発現産物のアトピー性皮膚炎の症度悪化の検出マーカーとしての使用。
＜１３＞症度悪化が、試料採取時点から１２日間以上１６日間以下の期間後の時点における状態である、＜１２＞の使用。
＜１４＞症度がＥｃｚｅｍａ Ａｒｅａ ａｎｄ Ｓｅｖｅｒｉｔｙ Ｉｎｄｅｘに対応する、全身を対象としたアトピー性皮膚炎の症度である、＜１２＞又は＜１３＞の使用。
＜１５＞遺伝子又はその発現産物が前記被験者の皮膚表上脂質に含まれるｍＲＮＡである、＜１２＞～＜１４＞のいずれかの使用。
＜１６＞前記遺伝子又はそれに由来する核酸と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、又は前記遺伝子の発現産物を認識する抗体を含有する、＜１＞～＜１１＞のいずれかの方法に用いられるアトピー性皮膚炎の症度悪化を検出するための検査用キット。
＜１７＞ＮＣＬＮ及びＺＮＦ４２９の２種の遺伝子より選択される少なくとも１つの遺伝子又はその発現産物からなる、アトピー性皮膚炎の症度悪化の検出マーカー。
＜１８＞前記症度がＥｃｚｅｍａ Ａｒｅａ ａｎｄ Ｓｅｖｅｒｉｔｙ Ｉｎｄｅｘに対応する、全身を対象としたアトピー性皮膚炎の症度である、＜１７＞のマーカー。

以下、実施例に基づき本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
実施例１ ＳＳＬ由来ＲＮＡを用いた症度悪化群対非悪化群の発現変動遺伝子の探索（ケース１）
１）ＡＤ患者の症度に係るスコア取得及びＳＳＬ採取
ＡＤを有する成人２５名（２３～５６歳、男性）を被験者とした。被験者は、初回測定時に皮膚科専門医により重症度が軽症又は中等症のＡＤであるとの診断を受けたＡＤ患者であった。被験者は初回測定時にＡＤの症度に係るスコアの取得とＳＳＬの採取を受けた。初回測定の１４日後、被験者は再びＡＤの症度に係るスコアの取得を受けた。ＡＤの症度に係るスコアとして、医師による全身のＥＡＳＩスコア（Hanifin et al. Exp dermatol.10, 2001、全身の皮疹に基づき症状を０～７２までにスコアリングする）を用いた。初回測定時、及びその１４日後に取得したＥＡＳＩスコアをそれぞれ初回のＥＡＳＩスコア、及び１４日目のＥＡＳＩスコアと称し、初回測定時に採取したＳＳＬを初回のＳＳＬと称する。

前述の通りＳＳＬは皮膚表上脂質のことであり、各被験者の全顔からあぶら取りフィルム（５×８ｃｍ、ポリプロピレン製、３Ｍ社）を用いて回収した。該あぶら取りフィルム
をバイアルに移し、ＲＮＡ抽出に使用するまで－８０℃で約１ヶ月間保存した。

２）ＲＮＡ調製及びシーケンシング
上記１）のあぶら取りフィルムを適当な大きさに切断し、ＱＩＡｚｏｌ Ｌｙｓｉｓ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、付属のプロトコルに準じてＲＮＡを水層に移行させた。該水層から、ＲＮＡ抽出用スピンカラムを用いた市販のＲＮＡ抽出キットを用いて、付属のプロトコルに従いＲＮＡを抽出した。抽出されたＲＮＡを、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＶＩＬＯ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を用いて４２℃、９０分間逆転写し、ｃＤＮＡを合成した。逆転写反応のプライマーには、キットに付属しているランダムプライマーを使用した。得られたｃＤＮＡから、マルチプレックスＰＣＲにより２０８０２遺伝子に由来するＤＮＡを含むライブラリーを調製した。マルチプレックスＰＣＲは、Ｉｏｎ ＡｍｐｌｉＳｅｑＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を用いて、［９９℃、２分→（９９℃、１５秒→６２℃、１６分）×２０サイクル→４℃、Ｈｏｌｄ］の条件で行った。得られたＰＣＲ産物は、Ａｍｐｕｒｅ ＸＰ（ベックマン・コールター株式会社）で精製した後に、バッファーの再構成、プライマー配列の消化、アダプターライゲーションと精製、及び増幅を行い、ライブラリーを調製した。調製したライブラリーをＩｏｎ ５４０ Ｃｈｉｐにローディングし、Ｉｏｎ Ｓ５／ＸＬシステム（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を用いてシーケンシングした。シーケンシングで得られた各リード配列をヒトゲノムのリファレンス配列であるｈｇ１９ ＡｍｐｌｉＳｅｑ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ ＥＲＣＣ ｖ１を用いて遺伝子マッピングすることで各リード配列の由来する遺伝子を決定した。

３）使用データ
上記１）で取得した２５名のＡＤ患者の初回測定時（初回）のＥＡＳＩスコアと、その１４日後（１４日目）のＥＡＳＩスコアを比較し、１４日間でＥＡＳＩスコアがどのくらい変化したかを算出した。より詳細には、同一個人の１４日目のＥＡＳＩスコアから初回のＥＡＳＩスコアを減じた値（Δ値）を算出した。Δ値が正の値である場合を「悪化」、負又は零の値の場合を「非悪化」と定義し、被験者のＡＤ患者２５名を６名の悪化群と１９名の非悪化群に群分けした。

上記２）で測定した被験者の初回のＳＳＬ由来ＲＮＡのシーケンシングによる各リードのリードカウントを、各ＲＮＡの発現レベルのデータとした。シーケンシングでの増幅領域が少なくとも２つ以上のエキソンをまたぐ遺伝子を解析対象遺伝子とし、サンプル間の総リードカウントの違いを補正するため、解析対象遺伝子のリードカウントをＲＰＭ（Ｒｅａｄｓ ｐｅｒ ｍｉｌｌｉｏｎ ｍａｐｐｅｄ ｒｅａｄｓ）値に変換した。この中で、９０％以上のサンプルで２０以上のリードカウントが得られた５４５３遺伝子を以下の解析に使用した。さらに、ＲＰＭ値を正規分布に近似するため、整数１を加算した底２の対数値（Ｌｏｇ₂（ＲＰＭ＋１）値）に変換した。以上の手順で、２５名の被験者からの、５４５３遺伝子の発現レベルデータ（Ｌｏｇ₂（ＲＰＭ＋１）値）を作成した。

４）データ解析
上記３）で作成した初回のＳＳＬ由来の５４５３遺伝子の発現レベルデータ（Ｌｏｇ_２（ＲＰＭ＋１）値）を基に、初回測定時点において悪化群と非悪化群で発現レベルに差異がある遺伝子を探索した。まず、悪化群と非悪化群の２群間でＷｅｌｃｈのｔ検定においてｐ値が０．０５未満である遺伝子を選択した。次に、｛悪化群のＬｏｇ_２（ＲＰＭ＋１）値の平均値｝－｛非悪化群のＬｏｇ_２（ＲＰＭ＋１）値の平均値｝を算出し、その絶対値が１より大きい遺伝子を選択した。ｐ値が０．０５未満であり、且つ発現レベルデータ（Ｌｏｇ_２（ＲＰＭ＋１）値）の差の絶対値が１より大きい遺伝子を悪化群と非悪化群との間の発現変動遺伝子として抽出したところ、７８種の遺伝子が該当した。

実施例２ ＳＳＬ由来ＲＮＡを用いた症度悪化群対非悪化群の発現変動遺伝子の探索（ケース２）
１）ＡＤ患者の症度に係るスコア取得及びＳＳＬ採取
実施例１の被験者のうち２３名（２３～５６歳、男性）を被験者として同様の試験を実施した。被験者は、実施例１の初回から１４日目からさらに１４日経過後（実施例１の初回から２８日目）に、実施例１と同様にＡＤの症度に係るスコアの取得とＳＳＬの採取を受けた。２８日目のさらに１４日後（実施例１の初回から４２日目）、被験者は再び実施例１と同様にＡＤの症度に係るスコアの取得を受けた。２８日目、及び４２日目に取得したＥＡＳＩスコアをそれぞれ２８日目のＥＡＳＩスコア、及び４２日目のＥＡＳＩスコアと称し、２８日目に採取したＳＳＬを２８日目のＳＳＬと称する。

実施例１と同様の方法で、各被験者の全顔からあぶら取りフィルム（５×８ｃｍ、ポリプロピレン製、３Ｍ社）を用いてＳＳＬを回収した。該あぶら取りフィルムをバイアルに移し、ＲＮＡ抽出に使用するまで－８０℃で約１ヶ月間保存した。

２）ＲＮＡ調製及びシーケンシング
実施例１と同様の方法で、上記１）で採取したあぶらとりフィルムからＲＮＡ調製及びシーケンシングを行った。

３）使用データ
上記１）で取得した２３名のＡＤ患者の２８日目のＥＡＳＩスコアと、その１４日後（４２日目）のＥＡＳＩスコアを比較し、１４日間でＥＡＳＩスコアがどのくらい変化したかを算出した。より詳細には、同一個人の４２日目のＥＡＳＩスコアから２８日目のＥＡＳＩスコアを減じた値（Δ値）を算出した。実施例１の定義に従い、被験者のＡＤ患者２３名を７名の悪化群と１６名の非悪化群に群分けした。

上記２）で測定した被験者の２８日目のＳＳＬ由来ＲＮＡのシーケンシングによる各リードのリードカウントを、各ＲＮＡの発現レベルのデータとした。シーケンシングでの増幅領域が少なくとも２つ以上のエキソンをまたぐ遺伝子を解析対象遺伝子とした。サンプル間の総リードカウントの違いを補正するため、解析対象遺伝子のリードカウントをＲＰＭ（Ｒｅａｄｓ ｐｅｒ ｍｉｌｌｉｏｎ ｍａｐｐｅｄ ｒｅａｄｓ）値に変換した。この中で、９０％以上のサンプルで２０以上のリードカウントが得られた５９９１遺伝子を以下の解析に使用した。さらに、ＲＰＭ値を正規分布に近似するため、整数１を加算した底２の対数値（Ｌｏｇ₂（ＲＰＭ＋１）値）に変換した。以上の手順で、２３名の被験者からの、５９９１遺伝子の発現レベルデータ（Ｌｏｇ₂（ＲＰＭ＋１）値）を作成した。

４）データ解析
上記３）で作成した２８日目のＳＳＬ由来の５９９１遺伝子の発現レベルデータ（Ｌｏｇ_２（ＲＰＭ＋１）値）を基に、２８日目測定時点において悪化群と非悪化群で発現レベルに差異がある遺伝子を探索した。まず、悪化群と非悪化群の２群間でＷｅｌｃｈのｔ検定においてｐ値が０．０５未満である遺伝子を選択した。次に、｛悪化群のＬｏｇ_２（ＲＰＭ＋１）値の平均値｝－｛非悪化群のＬｏｇ_２（ＲＰＭ＋１）値の平均値｝を算出し、その絶対値が１より大きい遺伝子を選択した。ｐ値が０．０５未満であり、且つ発現レベルデータ（Ｌｏｇ_２（ＲＰＭ＋１）値）の差の絶対値が１より大きい遺伝子を悪化群と非悪化群との間の発現変動遺伝子として抽出したところ、３３種の遺伝子が該当した。

実施例３ ケース１とケース２の発現変動遺伝子の比較
上記実施例１（ケース１）で抽出した７８種の発現変動遺伝子と、上記実施例２（ケース２）で抽出した３３種の発現変動遺伝子を比較した。その結果、表１に示すようにＮＣＬＮ及びＺＮＦ４２９の２種の遺伝子が、ケース１及びケース２のいずれにおいても、非悪化群に比べて悪化群で有意に発現レベルが上昇していた（ｐ値が０．０５未満であり、且つ発現レベルデータの差が１より大きかった）。したがって、ＳＳＬ由来のＮＣＬＮ及びＺＮＦ４２９の発現レベルの上昇は、ＳＳＬ採取時点から１４日後のＥＡＳＩスコアの増加、若しくはＥＡＳＩスコアに対応する全身のＡＤ症度の悪化の兆候となっている可能性が示された。

Claims (7)

1. 被験者から採取された生体試料について、ＮＣＬＮ及びＺＮＦ４２９の２種の遺伝子より選択される少なくとも１つの遺伝子又はその発現産物の発現レベルを測定する工程を含む、当該被験者のアトピー性皮膚炎の症度悪化の検出方法。
2. 症度悪化が、試料採取時点から１２日間以上１６日間以下の期間後の時点における状態である、請求項１記載の方法。
3. 症度がＥｃｚｅｍａ Ａｒｅａ ａｎｄ Ｓｅｖｅｒｉｔｙ Ｉｎｄｅｘに対応する、全身を対象としたアトピー性皮膚炎の症度である、請求項１又は２記載の方法。
4. 遺伝子又はその発現産物の発現レベルがｍＲＮＡの発現レベルの測定である、請求項１～３のいずれか１項記載の方法。
5. 遺伝子又はその発現産物が前記被験者の皮膚表上脂質に含まれるＲＮＡである、請求項１～４のいずれか１項記載の方法。
6. 前記遺伝子又はそれに由来する核酸と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、又は前記遺伝子の発現産物を認識する抗体を含有する、請求項１～５のいずれか１項記載の方法に用いられるアトピー性皮膚炎の症度悪化を検出するための検査用キット。
7. ＮＣＬＮ及びＺＮＦ４２９の２種の遺伝子より選択される少なくとも１つの遺伝子又はその発現産物からなる、アトピー性皮膚炎の症度悪化の検出マーカー。