JP2024075099A

JP2024075099A - アンモニア代謝能力の検出方法

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Publication number: JP2024075099A
Application number: JP2022186296A
Authority: JP
Inventors: 卓広蓮村; 幸一三澤
Original assignee: Kao Corp
Current assignee: Kao Corp
Filing date: 2022-11-22
Publication date: 2024-06-03

Abstract

【課題】アンモニア代謝能力を検出するためのマーカー、及び当該マーカーを用いたアンモニア代謝能力の検出方法の提供。
【解決手段】被験者から採取された生体試料について、３１種の遺伝子群より選択される少なくとも１つの遺伝子又はその発現産物の発現レベルを測定する工程を含む、当該被験者におけるアンモニア代謝能力を検出する方法。
【選択図】なし

Description

本発明は、アンモニア代謝能力の検出方法に関する。

体内のアンモニアは、主にタンパク質代謝や運動中のＡＴＰの分解などの過程で発生する。血中アンモニア濃度の上昇は食後の倦怠感をもたらす。また、アンモニアは、ピルビン酸からアセチルＣｏＡへの酸化を阻害して疲労を起こさせる（非特許文献１参照）。持久力が高い程、血中アンモニア濃度の上昇が抑制されることが知られている。さらに、アンモニアが神経系の機能低下をもたらして中枢性疲労の原因になることや、筋肉での乳酸の蓄積を促進して筋肉疲労を促すことが知られている（特許文献１）。アンモニアは、疲労時の体臭の原因成分の一つでもある。
また、従来、血中アンモニアレベルとアルツハイマー病との間の関連性が様々提唱・示唆されており、最近、アンモニア曝露の持続時間及び大きさに依存して、脳アンモニアの上昇は、記憶機能障害、認知及び空間学習障害を含むアルツハイマー病に共通する典型的な神経学的症状を引き起こすことが報告され、慢性的に上昇したアンモニアレベルがアルツハイマー病の発症に関連するとの従来の推定が妥当であることが報告されている（非特許文献２）。

体内のアンモニアは、主に肝臓の尿素回路により無毒な尿素へと変換され、尿中に排出される。当該アンモニアの代謝能力の把握は、持久力の評価やアンモニアがもたらす各種症状への早期かつ適切な対処を可能とする。しかし、従来、全血測定による血中アンモニア濃度の測定が行われているものの、アンモニアの代謝能力の検出手法は見出されていない。

近年、生体試料中のＤＮＡやＲＮＡ等の核酸の解析によりヒトの生体内の現在さらには将来の生理状態を調べる技術が開発されている。生体由来の核酸は、血液等の体液、分泌物、組織等から抽出することができる。さらに最近、皮膚表上脂質（ｓｋｉｎｓｕｒｆａｃｅｌｉｐｉｄｓ；ＳＳＬ）に含まれるＲＮＡを生体の解析用の試料として利用可能であることが報告されている（特許文献２）。

特開２０００－２３９１７９号公報国際公開公報第２０１８／００８３１９号

Takeda et al, J Nutr Sci Vitaminol, 2011, 57:246-250 Jin Y.Y. et.al., Nutrients, 2018, 10, 564

本発明は、アンモニア代謝能力を検出するための検出マーカー、及び当該検出マーカーを用いたアンモニア代謝能力の検出方法を提供することに関する。

本発明者は、アンモニア代謝能力の高い者と、アンモニア代謝能力の低い者からＳＳＬを採取し、ＳＳＬ中に含まれるＲＮＡの発現状態をシーケンス情報として網羅的に解析した結果、特定の遺伝子の発現レベルが両群間で有意に異なり、これを指標としてアンモニア代謝能力を検出できることを見出した。

すなわち、本発明は、以下の１）～３）に係るものである。
１）被験者から採取された生体試料について、下記表１に示す３１種の遺伝子群より選択される少なくとも１つの遺伝子又はその発現産物の発現レベルを測定する工程を含む、当該被験者におけるアンモニア代謝能力を検出する方法。
２）前記遺伝子又はそれに由来する核酸と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、又は前記遺伝子の発現産物を認識する抗体を含有する、１）の方法に用いられるアンモニア代謝能力を検出するための検査用キット。
３）下記表１に示す３１種の遺伝子群より選択される少なくとも１つの遺伝子又はその発現産物からなる、アンモニア代謝能力を検出するためのマーカー。

本発明によれば、簡便且つ非侵襲的に、アンモニア代謝能力を検出することが可能である。これにより、個々人のアンモニア代謝能力を客観的指標に基づいて把握できる。

本明細書中で引用された全ての特許文献、非特許文献、及びその他の刊行物は、その全体が本明細書中において参考として援用される。

本発明において、「核酸」又は「ポリヌクレオチド」と云う用語は、ＤＮＡ又はＲＮＡを意味する。ＤＮＡには、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、及び合成ＤＮＡのいずれもが含まれ、「ＲＮＡ」には、ｔｏｔａｌＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇＲＮＡ及び合成のＲＮＡのいずれもが含まれる。

本発明において「遺伝子」とは、ヒトゲノムＤＮＡを含む２本鎖ＤＮＡの他、ｃＤＮＡを含む１本鎖ＤＮＡ（正鎖）、当該正鎖と相補的な配列を有する１本鎖ＤＮＡ（相補鎖）、及びこれらの断片を包含するものであって、ＤＮＡを構成する塩基の配列情報の中に、何らかの生物学的情報が含まれているものを意味する。
また、本発明における「遺伝子」には、特定の塩基配列で表される「遺伝子」だけではなく、その同族体（すなわち、ホモログもしくはオーソログ）、遺伝子多型等の変異体、及び誘導体が包含される。
ここで、本明細書中に開示される遺伝子の名称は、ＮＣＢＩ（[www.ncbi.nlm.nih.gov/]）に記載のあるＯｆｆｉｃｉａｌＳｙｍｂｏｌに従う。

本発明において、遺伝子の「発現産物」とは、遺伝子の転写産物及び翻訳産物を包含する概念である。「転写産物」とは、遺伝子（ＤＮＡ）から転写されて生じるＲＮＡであり、「翻訳産物」とは、ＲＮＡに基づき翻訳合成される、遺伝子にコードされたタンパク質を意味する。

本発明において、「アンモニア代謝能力」とは、体内のアンモニアを無毒化、除去する能力をいう。体内のアンモニアの無毒化としては、肝臓の尿素回路での尿素への変換、骨格筋、脳、腎臓等におけるグルタミン合成酵素によるグルタミンへの変換等が挙げられる。
アンモニア代謝能力は、例えば、血中アンモニア変化量により、アンモニア代謝能力が高い（高アンモニア代謝能力）、又はアンモニア代謝能力が低い（低アンモニア代謝能力）のように分けることができる。「血中アンモニア変化量」は、運動直後の血中アンモニア濃度から運動直前（安静時）の血中アンモニア濃度を引いた値である。運動は、特に制限はないが、例えば、乳酸性閾値を超えるような、最大心拍数の75-80%程度の、中～高強度以上の運動強度の運動が挙げられる。本発明においては、血中アンモニア変化量が小さい、例えば、４０Ｎ－μｇ／ｄＬ以下の時、アンモニア代謝能力が高い（高アンモニア代謝能力）と判断することができ、また、血中アンモニア変化量が大きい、例えば、６０Ｎ－μｇ／ｄＬ以上の時、アンモニア代謝能力が低い（低アンモニア代謝能力）と判断される。

本発明において、アンモニア代謝能力の「検出」とは、アンモニア代謝能力の程度を明らかにする意味であり、検査、測定、判定又は評価等の用語で言い換えることもできる。なお、本発明におけるアンモニア代謝能力の「検出」、「検査」、「測定」、「判定」又は「評価」という用語は、医師による診断を含むものではない。

後述する実施例に示すように、アンモニア代謝能力が高い群と、アンモニア代謝能力が低い群の間で、全顔から採取したＳＳＬにおいて発現レベルが異なっている遺伝子が見出された。すなわち、当該ＳＳＬから抽出されたＲＮＡの発現量のデータ（リードカウント値）について、ＤＥＳｅｑ２（Love MI et al. Genome Biol. 2014）を用いて補正されたカウント値（Ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄｃｏｕｎｔ値）を用いて、アンモニア代謝能力が高い群とアンモニア代謝能力が低い群の２群間でＦＤＲ（Ｆａｌｓｅｄｉｓｃｏｖｅｒｙｒａｔｅ）を制御した（ＦＤＲ＜０．２５）調整済みｐ値が０．０５未満である発現差異遺伝子を抽出することにより、アンモニア代謝能力が高い群で発現が上昇する遺伝子２７種（下記表２の「ｕｐ」）、発現が低下する遺伝子４種（下記表２の「ｄｏｗｎ」）、計３１遺伝子が同定された。
したがって、斯かる３１種の遺伝子群より選択される遺伝子又はその発現産物は、アンモニア代謝能力を検出するためのマーカーとなり得る。この場合、アンモニア代謝能力が高い群で発現が上昇する２７遺伝子又はその発現産物はポジティブマーカーであり、発現が低下する４遺伝子又はその発現産物はネガティブマーカーである。

当該３１種の遺伝子は、これまでにアンモニア代謝能力との関係が報告されていない遺伝子であり、これら遺伝子群より選択される遺伝子又はその発現産物は、アンモニア代謝能力を検出するための新規な検出マーカーである。
本発明では、当該３１種の遺伝子群より選択される少なくとも１種の遺伝子又はその発現産物を検出マーカーとし、その発現レベルに基づいてアンモニア代謝能力を検出することが可能である。
アンモニア代謝能力の検出により、アンモニア代謝能力を把握することができ、持久力や体臭体質、タンパク質食耐性等の推定が可能であり、また、疲労や神経学的症状といったアンモニアがもたらす各種症状への対応に役立てることができる。

上記表２に示す３１種の遺伝子は、それぞれ単独でアンモニア代謝能力を検出するための検出マーカーとなり得るが、このうち、精度向上の観点から、好ましくは２種以上、より好ましくは５種以上、さらに好ましくは３１種全ての組み合わせを用いる。なかでも、ＮＣＯＡ３、ＫＲＴ３１、ＷＤＲ４４、ＩＴＧＡＸ、ＰＰＩＧ、ＫＲＴＡＰ１－１、ＫＲＴＡＰ１－５及びＫＲＴＡＰ３－１の８種の遺伝子群から１種以上、好ましくは２種以上を選択することがより好ましい。

上記のアンモニア代謝能力を検出するためのマーカーとなり得る遺伝子（以下、「標的遺伝子」とも称す）には、アンモニア代謝能力を検出するためのマーカーとなり得る限り、当該遺伝子を構成するＤＮＡの塩基配列と実質的に同一の塩基配列を有する遺伝子も包含される。ここで、実質的に同一の塩基配列とは、例えば、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩＢＬＡＳＴを用い、期待値＝１０；ギャップを許す；フィルタリング＝ＯＮ；マッチスコア＝１；ミスマッチスコア＝－３の条件にて検索をした場合、当該遺伝子を構成するＤＮＡの塩基配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上の同一性があることを意味する。

本発明のアンモニア代謝能力を検出する方法は、被験者から採取された生体試料について、表２で示される３１種の遺伝子群より選択される少なくとも１つの遺伝子又はその発現産物の発現レベルを測定する工程を含む。

本発明における被験者は、例えば、アンモニア代謝能力の検出を所望するか又は必要とする被験者が挙げられる。例えば、アスリートのように身体能力向上の目標値/指標として自身の運動能力、運動適性を知りたい人や、客観的な疲労度を知る（客観的な休み時を知る）、脳機能低下の原因を知りたい人、体臭体質を知りたい人などが挙げられる。

本発明において用いられる生体試料としては、本発明の遺伝子が発現変化する細胞、組織及び生体材料であればよい。具体的には臓器、皮膚、血液、尿、唾液、汗、角層、皮膚表上脂質（ＳＳＬ）、組織浸出液等の体液、血液から調製された血清、血漿、その他、便、毛髪等が挙げられ、好ましくは皮膚又は皮膚表上脂質（ＳＳＬ）、より好ましくは皮膚表上脂質（ＳＳＬ）が挙げられる。本発明において、ＳＳＬが採取される皮膚の部位としては、特に限定されず、頭、顔、首、体幹、手足等の身体の任意の部位の皮膚が挙げられるが、好ましくは顔、より好ましくは全顔の皮膚である。

本発明において、「皮膚表上脂質（ＳＳＬ）」とは、皮膚の表上に存在する脂溶性画分をいい、皮脂と呼ばれることもある。一般に、ＳＳＬは、皮膚にある皮脂腺等の外分泌腺から分泌された分泌物を主に含み、皮膚表面を覆う薄い層の形で皮膚表上に存在している。ＳＳＬは、皮膚細胞で発現したＲＮＡを含む。（前記特許文献２参照）。また本発明において、「皮膚」とは、特に限定しない限り、角層、表皮、真皮、毛包、ならびに汗腺、皮脂腺及びその他の腺等の組織を含む領域の総称である。

被験者の皮膚からのＳＳＬの採取には、皮膚からのＳＳＬの回収又は除去に用いられているあらゆる手段を採用することができる。好ましくは、後述するＳＳＬ吸収性素材、ＳＳＬ接着性素材、又は皮膚からＳＳＬをこすり落とす器具を使用することができる。ＳＳＬ吸収性素材又はＳＳＬ接着性素材としては、ＳＳＬに親和性を有する素材であれば特に限定されず、例えばポリプロピレン、パルプ等が挙げられる。皮膚からのＳＳＬの採取手順のより詳細な例としては、あぶら取り紙、あぶら取りフィルム等のシート状素材へＳＳＬを吸収させる方法、ガラス板、テープ等へＳＳＬを接着させる方法、スパーテル、スクレイパー等によりＳＳＬをこすり落として回収する方法、等が挙げられる。ＳＳＬの吸着性を向上させるため、脂溶性の高い溶媒を予め含ませたＳＳＬ吸収性素材を用いてもよい。一方、ＳＳＬ吸収性素材は、水溶性の高い溶媒や水分を含んでいるとＳＳＬの吸着が阻害されるため、水溶性の高い溶媒や水分の含有量が少ないことが好ましい。ＳＳＬ吸収性素材は、乾燥した状態で用いることが好ましい。

被験者から採取されたＲＮＡ含有ＳＳＬは一定期間保存されてもよい。採取されたＳＳＬは、含有するＲＮＡの分解を極力抑えるために、採取後できるだけ速やかに低温条件で保存することが好ましい。本発明における該ＲＮＡ含有ＳＳＬの保存の温度条件は、０℃以下であればよく、好ましくは－２０±２０℃～－８０±２０℃、より好ましくは－２０±１０℃～－８０±１０℃、さらに好ましくは－２０±２０℃～－４０±２０℃、さらに好ましくは－２０±１０℃～－４０±１０℃、さらに好ましくは－２０±１０℃、さらに好ましくは－２０±５℃である。該ＲＮＡ含有ＳＳＬの該低温条件での保存の期間は、特に限定されないが、好ましくは１２か月以下、例えば６時間以上１２ヶ月以下、より好ましくは６ヶ月以下、例えば１日間以上６ヶ月以下、さらに好ましくは３ヶ月以下、例えば３日間以上３ヶ月以下である。

本発明において、標的遺伝子又はその発現産物の発現レベルの測定対象としては、ＲＮＡ、そのＲＮＡをエンコードするＤＮＡ、そのＲＮＡにコードされるタンパク質、該タンパク質と相互作用をする分子、そのＲＮＡと相互作用する分子、又はそのＤＮＡと相互作用する分子等が挙げられ、ＲＮＡが好ましく、より好ましくはｍＲＮＡである。ここで、ＲＮＡ、ＤＮＡ又はタンパク質と相互作用する分子としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、多糖、オリゴ糖、単糖、脂質、脂肪酸、及びこれらのリン酸化物、アルキル化物、糖付加物等、及び上記いずれかの複合体が挙げられる。また、発現レベルとは、当該遺伝子又は発現産物の発現量や活性を包括的に意味する。

本発明の方法においては、好ましい態様として、生体試料としてＳＳＬが用いられるが、この場合にはＳＳＬに含まれるｍＲＮＡの発現レベルが解析され、具体的にはＲＮＡを逆転写によりｃＤＮＡに変換した後、該ｃＤＮＡ又はその増幅産物が測定される。
ＳＳＬからのＲＮＡの抽出には、生体試料からのＲＮＡの抽出又は精製に通常使用される方法、例えば、フェノール/クロロホルム法、ＡＧＰＣ（ａｃｉｄｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ－ｐｈｅｎｏｌ－ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）法、又はＴＲＩｚｏｌ（登録商標）、ＲＮｅａｓｙ（登録商標）、ＱＩＡｚｏｌ（登録商標）等のカラムを用いた方法、シリカをコーティングした特殊な磁性体粒子を用いる方法、ＳｏｌｉｄＰｈａｓｅＲｅｖｅｒｓｉｂｌｅＩｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ磁性体粒子を用いる方法、ＩＳＯＧＥＮ等の市販のＲＮＡ抽出試薬による抽出等を用いることができる。

該逆転写には、解析したい特定のＲＮＡを標的としたプライマーを用いてもよいが、より包括的な核酸の保存及び解析のためにはランダムプライマーを用いることが好ましい。該逆転写には、一般的な逆転写酵素又は逆転写試薬キットを使用することができる。好適には、正確性及び効率性の高い逆転写酵素又は逆転写試薬キットが用いられ、その例としては、Ｍ－ＭＬＶＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ及びその改変体、あるいは市販の逆転写酵素又は逆転写試薬キット、例えばＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅシリーズ（タカラバイオ社）、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅシリーズ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）等が挙げられる。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）III ＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＶＩＬＯｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓｋｉｔ（いずれもＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）等が好ましく用いられる。
該逆転写における伸長反応は、温度を好ましくは４２℃±１℃、より好ましくは４２℃±０．５℃、さらに好ましくは４２℃±０．２５℃に調整し、一方、反応時間を好ましくは６０分間以上、より好ましくは８０～１２０分間に調整するのが好ましい。

発現レベルを測定する方法は、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ又はＤＮＡを対象とする場合、これらにハイブリダイズするＤＮＡをプライマーとしたＰＣＲ法、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法、マルチプレックスＰＣＲ、ＳｍａｒｔＡｍｐ法、ＬＡＭＰ法等に代表される核酸増幅法、これらにハイブリダイズする核酸をプローブとして用いるハイブリダイゼーション法（ＤＮＡチップ、ＤＮＡマイクロアレイ、ドットブロットハイブリダイゼーション、スロットブロットハイブリダイゼーション、ノーザンブロットハイブリダイゼーション等）、塩基配列を決定する方法（シーケンシング）、又はこれらを組み合わせた方法から選ぶことができる。

ＰＣＲでは、解析したい特定のＤＮＡを標的としたプライマーペアを用いて該特定の１種のＤＮＡのみを増幅してもよいが、複数のプライマーペアを用いて同時に複数の特定のＤＮＡを増幅してもよい。好ましくは、該ＰＣＲはマルチプレックスＰＣＲである。マルチプレックスＰＣＲは、ＰＣＲ反応系に複数のプライマー対を同時に使用することで、複数の遺伝子領域を同時に増幅する方法である。マルチプレックスＰＣＲは、市販のキット（例えば、ＩｏｎＡｍｐｌｉＳｅｑＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅＨｕｍａｎＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＫｉｔ；ライフテクノロジーズジャパン株式会社等）を用いて実施することができる。
該ＰＣＲにおけるアニーリング及び伸長反応の温度は、使用するプライマーに依存するため一概には言えないが、上記のマルチプレックスＰＣＲキットを用いる場合、好ましくは６２℃±１℃、より好ましくは６２℃±０．５℃、さらに好ましくは６２℃±０．２５℃である。したがって、該ＰＣＲでは、好ましくはアニーリング及び伸長反応が１ステップで行われる。該アニーリング及び伸長反応のステップの時間は、増幅すべきＤＮＡのサイズ等に依存して調整され得るが、好ましくは１４～１８分間である。該ＰＣＲにおける変性反応の条件は、増幅すべきＤＮＡに依存して調整され得るが、好ましくは９５～９９℃で１０～６０秒間である。上記のような温度及び時間での逆転写及びＰＣＲは、一般的にＰＣＲに使用されるサーマルサイクラーを用いて実行することができる。

当該ＰＣＲで得られた反応産物の精製は、反応産物のサイズ分離によって行われることが好ましい。サイズ分離により、目的のＰＣＲ反応産物を、ＰＣＲ反応液中に含まれるプライマーやその他の不純物から分離することができる。ＤＮＡのサイズ分離は、例えば、サイズ分離カラムや、サイズ分離チップ、サイズ分離に利用可能な磁気ビーズ等によって行うことができる。サイズ分離に利用可能な磁気ビーズの好ましい例としては、ＡｍｐｕｒｅＸＰ等のＳｏｌｉｄＰｈａｓｅＲｅｖｅｒｓｉｂｌｅＩｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ（ＳＰＲＩ）磁性ビーズが挙げられる。

精製したＰＣＲ反応産物に対して、その後の定量解析を行うために必要なさらなる処理を施してもよい。例えば、ＤＮＡのシーケンシングのために、精製したＰＣＲ反応産物を、適切なバッファー溶液へと調製したり、ＰＣＲ増幅されたＤＮＡに含まれるＰＣＲプライマー領域を切断したり、増幅されたＤＮＡにアダプター配列をさらに付加したりしてもよい。例えば、精製したＰＣＲ反応産物をバッファー溶液へと調製し、増幅ＤＮＡに対してＰＣＲプライマー配列の除去及びアダプターライゲーションを行い、得られた反応産物を、必要に応じて増幅して、定量解析のためのライブラリーを調製することができる。これらの操作は、例えば、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＶＩＬＯｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓｋｉｔ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）に付属している５×ＶＩＬＯＲＴＲｅａｃｔｉｏｎＭｉｘ、及びＩｏｎＡｍｐｌｉＳｅｑＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅＨｕｍａｎＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＫｉｔ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）に付属している５×ＩｏｎＡｍｐｌｉＳｅｑＨｉＦｉＭｉｘ、及びＩｏｎＡｍｐｌｉＳｅｑＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅＨｕｍａｎＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＣｏｒｅＰａｎｅｌを用いて、各キット付属のプロトコルに従って行うことができる。

ノーザンブロットハイブリダイゼーション法を利用して標的遺伝子又はそれに由来する核酸の発現量を測定する場合は、例えば、まずプローブＤＮＡを放射性同位元素、蛍光物質等で標識し、次いで、得られた標識ＤＮＡを、常法に従ってナイロンメンブレン等にトランスファーした生体試料由来のＲＮＡとハイブリダイズさせる。その後、形成された標識ＤＮＡとＲＮＡとの二重鎖を、標識物に由来するシグナルを検出することにより測定する方法が挙げられる。

ＲＴ－ＰＣＲ法を用いて標的遺伝子又はそれに由来する核酸の発現量を測定する場合は、例えば、まず生体試料由来のＲＮＡから常法に従ってｃＤＮＡを調製し、これを鋳型として本発明の標的遺伝子が増幅できるように調製した一対のプライマー（上記ｃＤＮＡ（－鎖）に結合する正鎖、＋鎖に結合する逆鎖）をこれとハイブリダイズさせる。その後、常法に従ってＰＣＲ法を行い、得られた増幅二本鎖ＤＮＡを検出する。増幅された二本鎖ＤＮＡの検出には、予めＲＩ、蛍光物質等で標識しておいたプライマーを用いて上記ＰＣＲを行うことによって産生される標識二本鎖ＤＮＡを検出する方法等を用いることができる。

ＤＮＡマイクロアレイを用いて標的遺伝子又はそれに由来する核酸の発現量を測定する場合は、例えば、支持体に本発明の標的遺伝子由来の核酸（ｃＤＮＡ又はＤＮＡ）の少なくとも１種を固定化したアレイを用い、ｍＲＮＡから調製した標識化ｃＤＮＡ又はｃＲＮＡをマイクロアレイ上に結合させ、マイクロアレイ上の標識を検出することによって、ｍＲＮＡの発現量を測定することができる。
前記アレイに固定化される核酸としては、ストリンジェントな条件下に特異的（すなわち、実質的に目的の核酸のみに）にハイブリダイズする核酸であればよく、例えば、本発明の標的遺伝子の全配列を有する核酸であってもよく、部分配列からなる核酸であってもよい。ここで、「部分配列」とは、少なくとも１５～２５塩基からなる核酸が挙げられる。ここでストリンジェントな条件は、通常「１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、３７℃」程度の洗浄条件を挙げることができ、より厳しいハイブリダイズ条件としては「０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」程度、さらに厳しいハイブリダイズ条件としては「０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」程度の条件を挙げることができる。ハイブリダイズ条件は、J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Thrd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)等に記載されている。

シーケンシングによって標的遺伝子又はそれに由来する核酸の発現量を測定する場合は、例えば、次世代シーケンサー（例えばＩｏｎＳ５／ＸＬシステム、ライフテクノロジーズジャパン株式会社）が用いて解析することが挙げられる。シーケンシングで作成されたリードの数（リードカウント）に基づいて、ＲＮＡ発現を定量することができる。

上記の測定に用いられるプローブ又はプライマー、すなわち、本発明の標的遺伝子又はそれに由来する核酸を特異的に認識し増幅するためのプライマー、又は該ＲＮＡ又はそれに由来する核酸を特異的に検出するためのプローブがこれに該当するが、これらは、当該標的遺伝子を構成する塩基配列に基づいて設計することができる。ここで「特異的に認識する」とは、例えばノーザンブロット法において、実質的に本発明の標的遺伝子又はそれに由来する核酸のみを検出できること、また例えばＲＴ－ＰＣＲ法において、実質的に当該核酸のみが増幅される如く、当該検出物又は生成物が当該遺伝子又はそれに由来する核酸であると判断できることを意味する。
具体的には、本発明の標的遺伝子を構成する塩基配列からなるＤＮＡ又はその相補鎖に相補的な一定数のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを利用することができる。ここで「相補鎖」とは、Ａ：Ｔ（ＲＮＡの場合はＵ）、Ｇ：Ｃの塩基対からなる２本鎖ＤＮＡの一方の鎖に対する他方の鎖を指す。また、「相補的」とは、当該一定数の連続したヌクレオチド領域で完全に相補配列である場合に限られず、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、よりさらに好ましくは９５％以上、よりさらに好ましくは９８％以上の塩基配列上の同一性を有すればよい。
塩基配列の同一性は、前記ＢＬＡＳＴ等のアルゴリズムにより決定することができる。
斯かるオリゴヌクレオチドは、プライマーとして用いる場合には、特異的なアニーリング及び鎖伸長ができればよく、通常、例えば１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上、より好ましくは２０塩基以上、かつ例えば１００塩基以下、好ましくは５０塩基以下、より好ましくは３５塩基以下の鎖長を有するものが挙げられる。また、プローブとして用いる場合には、特異的なハイブリダイゼーションができればよく、本発明の標的遺伝子を構成する塩基配列からなるＤＮＡ（又はその相補鎖）の少なくとも一部若しくは全部の配列を有し、例えば１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上、かつ例えば１００塩基以下、好ましくは５０塩基以下、より好ましくは２５塩基以下の鎖長のものが用いられる。
なお、ここで、「オリゴヌクレオチド」は、ＤＮＡあるいはＲＮＡであることができ、合成されたものでも天然のものでもよい。又、ハイブリダイゼーションに用いるプローブは、通常標識したものが用いられる。

また、本発明の標的遺伝子の翻訳産物（タンパク質）、当該タンパク質と相互作用する分子、ＲＮＡと相互作用する分子、又はＤＮＡと相互作用する分子を測定する場合は、プロテインチップ解析、免疫測定法（例えば、ＥＬＩＳＡ等）、質量分析（例えば、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＭＳ）、１－ハイブリッド法（PNAS 100, 12271-12276(2003)）や２－ハイブリッド法（Biol. Reprod. 58, 302-311 (1998)）のような方法を用いることができ、対象に応じて適宜選択できる。
例えば、測定対象としてタンパク質が用いられる場合は、本発明の発現産物を特異的に認識する抗体、具体的には発現産物であるタンパク質を他のタンパク質から識別することが可能な構造的特徴部位（エピトープ）を認識する抗体を生体試料と接触させ、当該抗体に結合した試料中のポリペプチド又はタンパク質を検出し、そのレベルを測定することによって実施される。例えば、ウェスタンブロット法によれば、一次抗体として上記の抗体を用いた後、二次抗体として放射性同位元素、蛍光物質又は酵素等で標識した一次抗体に結合する抗体を用いて、その一次抗体を標識し、これら標識物質由来のシグナルを放射線測定器、蛍光検出器等で測定することが行われる。
尚、上記翻訳産物に対する抗体は、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよい。これらの抗体は、公知の方法に従って製造することができる。具体的には、ポリクローナル抗体は、常法に従って大腸菌等で発現し精製したタンパク質を用いて、あるいは常法に従って当該タンパク質の部分ポリペプチドを合成して、家兎等の非ヒト動物に免疫し、該免疫動物の血清から常法に従って得ることが可能である。
一方、モノクローナル抗体は、常法に従って大腸菌等で発現し精製したタンパク質又は該タンパク質の部分ポリペプチドをマウス等の非ヒト動物に免疫し、得られた脾臓細胞と骨髄腫細胞とを細胞融合させて調製したハイブリドーマ細胞から得ることができる。また、モノクローナル抗体は、ファージディスプレイを用いて作製してもよい（Griffiths, A.D.; Duncan, A.R., Current Opinion in Biotechnology, Volume 9, Number 1, February 1998 , pp. 102-108(7)）。

斯くして、被験者から採取された生体試料中の本発明の標的遺伝子又はその発現産物の発現レベルが測定され、当該発現レベルに基づいて当該被験者のアンモニア代謝能力が検出される。
また、本発明では、被験者から採取された生体試料中の本発明の標的遺伝子又はその発現産物の発現レベルを少なくとも２つの時期に測定し、発現レベルの変化、又は変化量を指標に、被験者におけるアンモニア代謝能力の変化の有無、又は変化の程度を検出することができる。
検出は、具体的には、測定された本発明の標的遺伝子又はその発現産物の発現レベルをカットオフ値（参照値）と比較することによって行われる。
シーケンシングにより複数の標的遺伝子の発現レベルの解析を行う場合は、上記したように、発現量のデータであるリードカウント値、当該リードカウント値をサンプル間の総リード数の違いを補正したＲＰＭ値、当該ＲＰＭ値を底２の対数値に変換した値（Ｌｏｇ₂ＲＰＭ値）又は整数１を加算した底２の対数値（Ｌｏｇ₂（ＲＰＭ＋１）値）、あるいはＤＥＳｅｑ２を用いて補正されたカウント値（Ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄｃｏｕｎｔ値）又は整数１を加算した底２の対数値（Ｌｏｇ₂（ｃｏｕｎｔ＋１）値）を指標として用いるのが好ましい。また、ＲＮＡ－ｓｅｑの定量値として一般的な、ｆｒａｇｍｅｎｔｓｐｅｒｋｉｌｏｂａｓｅｏｆｅｘｏｎｐｅｒｍｉｌｌｉｏｎｒｅａｄｓｍａｐｐｅｄ（ＦＰＫＭ）、ｒｅａｄｓｐｅｒｋｉｌｏｂａｓｅｏｆｅｘｏｎｐｅｒｍｉｌｌｉｏｎｒｅａｄｓｍａｐｐｅｄ（ＲＰＫＭ）、ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓｐｅｒｍｉｌｌｉｏｎ（ＴＰＭ）などによって算出される値であってもよい。また、マイクロアレイ法によって得られるシグナル値、及びその補正値であってもよい。また、ＲＴ－ＰＣＲなどにより特定の標的遺伝子のみ発現レベルの解析を行う場合には、対象遺伝子の発現量をハウスキーピング遺伝子の発現量を基準とする相対的な発現量に変換（相対定量）して解析する方法、又は標的遺伝子の領域を含むプラスミドを用いて絶対的なコピー数を定量（絶対定量）して解析する方法が好ましい。デジタルＰＣＲ法によって得られるコピー数であってもよい。

ここで、「カットオフ値」（「参照値」）は、血中アンモニア変化量と、本発明の標的遺伝子又はその発現産物の発現レベルの関係に基づき、予め決定することができる。例えば、ある集団を、血中アンモニア変化量より、アンモニア代謝能力が高い（高アンモニア代謝能力）群と、アンモニア代謝能力が低い（低アンモニア代謝能力）群に分け、それぞれの群における当該標的遺伝子又はその発現産物の発現レベルの平均値や標準偏差等の統計値を参考に決定した値を、それぞれの群への属否を判別するカットオフ値（参照値）として決定することができる。
標的遺伝子として複数種の遺伝子を用いる場合は、それぞれ各々の遺伝子又はその発現産物についてカットオフ値（参照値）を求めることが好ましい。
集団としては、性別、人種、年齢毎に集団を形成してもよい。

例えば、本発明の標的遺伝子又はその発現産物がポジティブマーカーとなる場合、該マーカーの発現レベルがカットオフ値（参照値）よりも高い場合、被験者はアンモニア代謝能力が高いと検出され得、そうでない場合、被験者はアンモニア代謝能力が低いと検出され得る。例えば、被験者における標的遺伝子又はその発現産物の発現レベルがカットオフ値（参照値）と比べて統計学的に有意に高ければ、該被験者はアンモニア代謝能力が高いと検出され得、そうでない場合、被験者はアンモニア代謝能力が低いと検出され得る。また例えば、被験者における標的遺伝子又はその発現産物の発現レベルがカットオフ値（参照値）に対して、好ましくは１１０％以上、より好ましくは１５０％以上、さらに好ましくは２００％以上であれば、該被験者はアンモニア代謝能力が高いと検出され得、そうでない場合、被験者はアンモニア代謝能力が低いと検出され得る。

一方、本発明の標的遺伝子又はその発現産物がネガティブマーカーとなる場合、該マーカーの発現レベルがカットオフ値（参照値）よりも低い場合、被験者はアンモニア代謝能力が高いと検出され得、そうでない場合、被験者はアンモニア代謝能力が低いと検出され得る。例えば、被験者における標的遺伝子又はその発現産物の発現レベルがカットオフ値（参照値）と比べて統計学的に有意に低ければ、該被験者はアンモニア代謝能力が高いと検出され得、そうでない場合、被験者はアンモニア代謝能力が低いと検出され得る。また例えば、被験者における標的遺伝子又はその発現産物の発現レベルがカットオフ値（参照値）に対して、好ましくは９０％以下、より好ましくは７５％以下、さらに好ましくは５０％以下であれば、該被験者はアンモニア代謝能力が高いと検出され得、そうでない場合、被験者はアンモニア代謝能力が低いと検出され得る。

あるいは、複数の標的遺伝子又はその発現産物を組み合わせて用いる場合には、それらの標的遺伝子又はその発現産物の一定割合、例えば５０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは１００％が上述した発現レベルの基準を満たすか否かに基づいて、被験者のアンモニア代謝能力を検出することができる。

さらに、アンモニア代謝能力が高い個体（高アンモニア代謝能力群）由来の標的遺伝子又はその発現産物の発現レベルと、アンモニア代謝能力が低い個体（低アンモニア代謝能力群）由来の標的遺伝子又はその発現産物の発現レベルの測定値（発現プロファイル）を利用してアンモニア代謝能力の高低を分ける判別式（予測モデル）を構築し、当該判別式を利用して、アンモニア代謝能力を検出することができる。
すなわち、高アンモニア代謝能力群由来の標的遺伝子又はその発現産物の発現レベルと、低アンモニア代謝能力群由来の標的遺伝子又はその発現産物の発現レベルの測定値を教師サンプルとして、高アンモニア代謝能力群と低アンモニア代謝能力群を分ける判別式（予測モデル）を構築し、当該判別式に基づいてアンモニア代謝能力を判別するカットオフ値（参照値）を求める。なお、判別式の作成においては、主成分分析（ＰＣＡ）により次元圧縮を行ない、主要成分を説明変数とすることができる。
そして、被験者の生体試料から標的遺伝子又はその発現産物のレベルを同様に測定し、得られた測定値を当該判別式に代入し、当該判別式から得られた結果をカットオフ値（参照値）と比較することによって、被験者におけるアンモニア代謝能力を検出できる。

判別式の構築に用いる変数には説明変数と目的変数がある。説明変数としては、例えば、下記の方法で選択した標的遺伝子又はその発現産物の発現レベル（特徴量）を用いることができる。目的変数としては、例えば、そのサンプルのアンモニア代謝能力の程度（高アンモニア代謝能力群か低アンモニア代謝能力群か）、を用いることができる。

特徴量の選択には、判別する２群間の統計学的に有意な差異、例えば、発現レベルが２群間で有意に変動する遺伝子（発現変動遺伝子）又はその発現産物の発現レベルを用いることができる。また、機械学習に用いるアルゴリズムなどの公知のものを利用して特徴量遺伝子を抽出し、その発現レベルを用いたりすることができる。例えば、下記に示すランダムフォレストにおける変数重要度の高い遺伝子またはその発現産物の発現レベルを用いたり、Ｒ言語の"Ｂｏｒｕｔａ"パッケージなどを用いて特徴量遺伝子を抽出し、その発現レベルを用いたりすることができる。

判別式の構築におけるアルゴリズムは、機械学習に用いるアルゴリズムなどの公知のものを利用することができる。機械学習アルゴリズムの例としては、ランダムフォレスト（Ｒａｎｄｏｍｆｏｒｅｓｔ）、線形カーネルのサポートベクターマシン（ＳＶＭｌｉｎｅａｒ）、ｒｂｆカーネルのサポートベクターマシン（ＳＶＭｒｂｆ）、ニューラルネットワーク（Ｎｅｒｕｒａｌｎｅｔ）、一般線形モデル（Ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄｌｉｎｅａｒｍｏｄｅｌ）、正則化線形判別分析（Ｒｅｇｕｌａｒｉｚｅｄｌｉｎｅａｒｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｎｔａｎａｌｙｓｉｓ）、正則化ロジスティック回帰（Ｒｅｇｕｌａｒｉｚｅｄｌｏｇｉｓｔｉｃｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ）などが挙げられる。構築した予測モデルに検証用のデータを入力して予測値を算出し、該予測値が実測値と最も適合するモデル、例えば正解率（Ａｃｃｕｒａｃｙ）が最も大きいモデルを最適な予測モデルとして選抜することができる。また、予測値と実測値から検出率（Ｒｅｃａｌｌ）、精度（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ）、及びそれらの調和平均であるＦ値を計算し、そのＦ値が最も大きいモデルを最適な予測モデルとして選抜することができる。

判別式の構築においてランダムフォレストのアルゴリズムを使用する場合、予測モデルの精度の指標として、未知データに対する推定の誤答率（ＯＯＢｅｒｒｏｒｒａｔｅ）を算出することができる（Breiman L. Machine Learning (2001) 45;5-32）。

ランダムフォレストにおいては、ブートストラップ法という手法に従い、全サンプル中から重複を許して、サンプル数の約３分の２のサンプルをランダムに抽出し、決定木と呼ばれる分類器を作成する。この時抽出されなかったサンプルはＯｕｔｏｆｂｕｇ（ＯＯＢ）と呼ばれ、1本の決定木を用いて、ＯＯＢの目的変数の予測を行い、正解ラベルと比較することでその誤答率を算出することができる（決定木におけるＯＯＢｅｒｒｏｒｒａｔｅ）。同様の作業を５００回繰り返し行い、５００本の決定木におけるＯＯＢｅｒｒｏｒｒａｔｅの平均値をとった値を、該ランダムフォレストのモデルのＯＯＢｅｒｒｏｒｒａｔｅとすることができる。

なお、ランダムフォレストのモデルを構築する決定木の数（ｎｔｒｅｅ値）は、デフォルトでは５００本であるが、必要に応じて１本から任意の本数に変更することができる。さらに、1つの決定木においてサンプルの判別式の作成に用いる変数の数（ｍｔｒｙ値）は、デフォルトでは説明変数の数の平方根をとった値であるが、必要に応じて１つから全説明変数の数までの値のいずれかに変更することができる。

ｍｔｒｙ値の決定にはＲ言語の“ｃａｒｅｔ”パッケージを用いることができる。“ｃａｒｅｔ”パッケージのメソッドにランダムフォレストを指定し、8通りのｍｔｒｙ値を試行し、例えばＡｃｃｕｒａｃｙが最大となるｍｔｒｙ値を最適なｍｔｒｙ値として選択することができる。なお、ｍｔｒｙ値の試行回数は、必要に応じて任意の試行回数に変更することができる。

判別式の構築においてランダムフォレストのアルゴリズムを使用する場合、モデルの構築に用いた説明変数の重要度を数値（変数重要度）化することができる。変数重要度の値には、例えば、ジニ係数の減少量（ＭｅａｎＤｅｃｒｅａｓｅＧｉｎｉ）を用いることができる。

カットオフ値（参照値）の決定方法は特に制限されず、公知の手法に従って決定することができる。例えば、判別式を使用して作成されたＲＯＣ（ＲｅｃｅｉｖｅｒＯｐｅｒａｔｉｎｇＣｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃＣｕｒｖｅ）曲線より求めることができる。ＲＯＣ曲線では、縦軸に陽性患者において陽性の結果がでる確率（感度）と、横軸に陰性患者において陰性の結果がでる確率（特異度）を１から減算した値（偽陽性率）がプロットされる。ＲＯＣ曲線に示される「真陽性（感度）」及び「偽陽性（１－特異度）」に関し、「真陽性（感度）」－「偽陽性（１－特異度）」が最大となる値（Ｙｏｕｄｅｎｉｎｄｅｘ）をカットオフ値（参照値）とすることができる。

本発明のアンモニア代謝能力の検出に用いられる予測モデルを構築するための特徴量遺伝子としては、上記表１で示される３１遺伝子からなる遺伝子群が挙げられる。

本発明のアンモニア代謝能力を検出するための検査用キットは、被験者から分離した生体試料における本発明の標的遺伝子又はその発現産物の発現レベルを測定するための検査試薬を含有するものである。具体的には、本発明の標的遺伝子又はそれに由来する核酸と特異的に結合（ハイブリダイズ）するオリゴヌクレオチド（例えば、ＰＣＲ用のプライマー）を含む、核酸増幅、ハイブリダイゼーションのための試薬、或いは、本発明の標的遺伝子の発現産物（タンパク質）を認識する抗体を含む免疫学的測定のための試薬等が挙げられる。当該キットに包含されるオリゴヌクレオチド、抗体等は、上述したとおり公知の方法により得ることができる。
また、当該検査用キットには、上記抗体や核酸の他、標識試薬、緩衝液、発色基質、二次抗体、ブロッキング剤や、試験に必要な器具やポジティブコントロールやネガティブコントロールとして使用するコントロール試薬、生体試料を採取するための用具（例えば、生体試料がＳＳＬの場合、ＳＳＬを採取するための脂取りフィルム）、採取した生体試料を保存するための試薬、保存用の容器等を含むことができる。

実施例１ＳＳＬから抽出されたＲＮＡを用いたアンモニア代謝能力の検出
１）被験者及び運動時中アンモニア濃度の測定
２０－６５歳の健常男性１８名を被検者として試験を行った。被験者には、昼食の約３時間後に屋内（気温２４±１℃制御）でエルゴメーター：エアロバイク７５Ｘ（コナミスポーツ（旧コンビ））を用いた漸増負荷運動を課した。被験者は心拍計、呼気マスクを装着した状態でエアロバイクのオリジナルモード（プログラムモード）にて、１５ｗ／分勾配の連続的多段階（漸次増加）負荷による５－２０分ほどの運動負荷試験を行った。運動負荷は、随時ボルグ指数において負担の大きさ（ＲＰＥ：自覚的運動強度）を被検者に確認し「かなりきつい」に達するか、若しくは、各被検者の最大心拍数（２２０－年齢）の約８０％に達するまで負荷増加した直後終了した。運動直前（安静時）、及び運動直後に指先穿刺採血を行い、血中アンモニア濃度を血中アンモニア測定装置：ポケットケム^TMＢＡＰＡ－４１４０（アークレイ株式会社）にて測定した。運動直前（安静時）に対する運動直後の血中アンモニア濃度をアンモニア変化量（運動直後－運動直前）とした。

２）アンモニア代謝の能力の高低設定
アンモニア変化量が小さい者（４０Ｎ－μｇ／ｄＬ以下、３名）をアンモニア代謝能力が高い（血中アンモニア濃度が高まりにくい）群、アンモニア変化量が大きい方（６０Ｎ－μｇ／ｄＬ以上、３名）をアンモニア代謝能力が低い（血中アンモニア濃度が高まりやすい）群（３名）とした。なお、群間に運動時間（運動量及び到達最大運動強度）、及び最大ＲＰＥに差はなかった。

３）ＳＳＬ採取
運動前の安静時に、各被験者の全顔からあぶら取りフィルム（５×８ｃｍ、ポリプロピレン製、３Ｍ社）を用いてＳＳＬを回収後、該あぶら取りフィルムをバイアルに移し、ＲＮＡ抽出に使用するまで－８０℃にて保存した。

４）ＲＮＡ調製及びシーケンシング
上記３）のあぶら取りフィルムを適当な大きさに切断し、ＱＩＡｚｏｌＬｙｓｉｓＲｅａｇｅｎｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、付属のプロトコルに準じてＲＮＡを抽出した。抽出されたＲＮＡを元に、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＶＩＬＯｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓｋｉｔ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を用いて４２℃、９０分間逆転写を行いｃＤＮＡの合成を行った。逆転写反応のプライマーには、キットに付属しているランダムプライマーを使用した。得られたｃＤＮＡから、マルチプレックスＰＣＲにより２０８０２遺伝子に由来するＤＮＡを含むライブラリーを調製した。マルチプレックスＰＣＲは、ＩｏｎＡｍｐｌｉＳｅｑＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅＨｕｍａｎＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＫｉｔ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を用いて、［９９℃、２分→（９９℃、１５秒→６２℃、１６分）×２０サイクル→４℃、Ｈｏｌｄ］の条件で行った。得られたＰＣＲ産物は、ＡｍｐｕｒｅＸＰ（ベックマン・コールター株式会社）で精製した後に、バッファーの再構成、プライマー配列の消化、アダプターライゲーションと精製、増幅を行い、ライブラリーを調製した。調製したライブラリーをＩｏｎ５４０Ｃｈｉｐにローディングし、ＩｏｎＳ５／ＸＬシステム（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を用いてシーケンシングした。シーケンシングで得られた各リード配列をヒトゲノムのリファレンス配列であるｈｇ１９ＡｍｐｌｉＳｅｑＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅＥＲＣＣｖ１を用いて遺伝子マッピングすることで各リード配列の由来する遺伝子を決定した。

５）データ解析
得られた各被験者の試験品塗布前のＳＳＬ由来のＲＮＡの発現量のデータ（リードカウント値）において、ＤＥＳｅｑ２法を用いて補正した。但し、全被験者の発現量データのうち９０％以上の被験者で欠損値ではない発現量データが得られている遺伝子のみ以下の解析に使用した。解析には、ＤＥＳｅｑ２法を用いて補正されたカウント値（Ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄｃｏｕｎｔ値）を用いた。

６）ＲＮＡ発現解析
取得された各被験者のＳＳＬ由来のＲＮＡ発現量（Ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄｃｏｕｎｔ値）を基に、アンモニア代謝能力が高い（血中アンモニア濃度が高まりにくい）群及びアンモニア代謝能力が低い（血中アンモニア濃度が高まりやすい）群において、２群間のＦＤＲ (Ｆａｌｓｅｄｉｓｃｏｖｅｒｙｒａｔｅ)を制御した(ＦＤＲ < ０．２５)、調整済みｐ値（閾値 < ０．０５）を元に発現差異遺伝子を抽出した。

７）結果
群間で統計学的に有意に発現が変動する３１種の遺伝子が得られた。アンモニア代謝能力が低い（血中アンモニア濃度が高まりやすい）群に対し、アンモニア代謝能力が高い（血中アンモニア濃度が高まりにくい）群で以下の２７遺伝子発現が有意に高かった。
ＮＣＯＡ３、ＫＲＴ３１、ＷＤＲ４４、ＣＤ６９、ＣＬＥＣ４Ａ、ＨＳＤ１７Ｂ１１、ＩＴＧＡＸ、ＲＮＦ１９Ｂ、ＴＲＩＰ１１、ＰＰＩＧ、ＨＳＰＡ１３、ＥＸＯＣ６、ＣＡＰＲＩＮ１、ＴＢＣＤ、ＴＮＦＡＩＰ３、ＣＬＡＳＲＰ、ＣＸＣＲ２、ＡＮＰＥＰ、ＰＸＤＣ１、ＰＲＯＫ２、ＨＣＡＲ３、ＫＲＴＡＰ１－１、ＫＲＴＡＰ１－５、ＧＲＩＮＡ、ＫＲＴＡＰ３－１、ＴＡＧＡＰ、ＤＤＸ６０Ｌ。
また、アンモニア代謝能力が低い（血中アンモニア濃度が高まりやすい）群に対し、アンモニア代謝能力が高い（血中アンモニア濃度が高まりにくい）群で以下の４遺伝子発現が有意に低かった。
ＦＡＭ１９３Ｂ、ＳＭＡ５、ＷＮＴ７Ａ、ＲＡＰＧＥＦＬ１。

Claims

被験者から採取された生体試料について、下記表１に示す３１種の遺伝子群より選択される少なくとも１つの遺伝子又はその発現産物の発現レベルを測定する工程を含む、当該被験者におけるアンモニア代謝能力を検出する方法。
前記遺伝子又はその発現産物の発現レベルがｍＲＮＡの発現量である請求項１記載の検出方法。
前記生体試料が被験者の皮膚表上脂質である請求項１又は２記載の検出方法。
前記被験者の皮膚が顔の皮膚である請求項３記載の検出方法。
発現レベルの測定値を前記各遺伝子又はその発現産物の参照値と比較し、アンモニア代謝能力を評価する、請求項１～４のいずれか１項記載の検出方法。
前記遺伝子又はそれに由来する核酸と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、又は前記遺伝子の発現産物を認識する抗体を含有する、請求項１～５のいずれか１項記載の検出方法に用いられるアンモニア代謝能力を検出するための検査用キット。
下記表２に示す３１種の遺伝子群より選択される少なくとも１つの遺伝子又はその発現産物からなる、アンモニア代謝能力を検出するためのマーカー。