JP2024075097A

JP2024075097A - アンモニア代謝促進効果の有効性検出方法

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Publication number: JP2024075097A
Application number: JP2022186294A
Authority: JP
Inventors: 卓広蓮村; 幸一三澤
Original assignee: Kao Corp
Current assignee: Kao Corp
Priority date: 2022-11-22
Filing date: 2022-11-22
Publication date: 2024-06-03

Abstract

【課題】個々人に対するカテキン類及びオルニチンの併用投与によるアンモニア代謝促進効果の有効性を検出する方法、及びそのためのマーカーを提供する。【解決手段】被験者から採取された試料について、１０４種の遺伝子群より選択される少なくとも１つの遺伝子又はその発現産物の発現レベルを測定する工程を含む、当該被験者に対するカテキン類及びオルニチンの併用投与による安静時アンモニア代謝促進効果の有効性の検出方法。【選択図】なし

Description

本発明は、個々人に対するカテキン類及びオルニチンの併用投与によるアンモニア代謝促進効果の有効性を検出する方法、及びそのためのマーカーに関する。

体内のアンモニアは、主にタンパク質代謝や運動中のＡＴＰの分解などの過程で発生する。アンモニアは、ピルビン酸からアセチルＣｏＡへの酸化を阻害して疲労を起こさせる（非特許文献１）。また、アンモニアが神経系の機能低下をもたらして中枢性疲労の原因になることや、筋肉での乳酸の蓄積を促進して筋肉疲労を促すこと（特許文献１）、及び高アンモニア血症が脳障害などの様々な障害を引き起こすこと（非特許文献２）が知られている。慢性肝臓病患者におけるアンモニアの蓄積は、肝性脳症及び多臓器不全（呼吸不全、心血管不全、腎不全）の進行に重要な役割を果たしていると考えられる（特許文献２）。

体内のアンモニアは、肝臓の尿素回路により無毒な尿素へと変換され、尿中に排出される。アルギニン、オルニチン及びシトルリンは、アンモニアを無毒な尿素に変換する肝臓の尿素回路に関与している。尿素回路に関与するアミノ酸であるオルニチン、シトルリン又はアルギニンにより血中アンモニアの上昇が抑制されることが報告されている（特許文献３、４及び非特許文献１）。生体内ではオルニチンからシトルリンが合成され、シトルリンはアルギニンへと変換される。オルニチンにより血中アンモニアの上昇が抑制されることや、疲労が改善するという報告がある（特許文献３）。またシトルリン摂取により血中アルギニンが上昇することや、脳疲労が改善することが報告されている（特許文献４、５）。

持久力は運動競技において必要とされるだけでなく、我々の日常生活において、歩く、走る等の単純な動作や、筋肉労作を繰り返し行う労働においても必要不可欠なものである。持久力の低下は、特に高齢者において、日常動作の困難の原因となり、生活の質（ｑｕａｌｉｔｙｏｆｌｉｆｅ：ＱＯＬ）に重大な悪影響をもたらす。持久力の向上には運動トレーニングが有効であることは広く認識されているが、時間の確保やモチベーションの維持の困難さから、また高齢者においては怪我の恐れがあるため、トレーニングによる持久力の維持又は向上は決して容易なことではない。

このような状況下、カテキン類とオルニチンとを組み合わせて摂取すると、運動中の血中アンモニア濃度の上昇や、血糖値及び筋肉グリコーゲンの低下が抑えられ、かつ運動により低下した血糖値の回復が促進されること、さらには持久力の向上、及び抗疲労効果が得られることが見出され、カテキン類とオルニチンを含有する製剤は、アンモニア代謝促進に有用であることが報告されている（特許文献６）。
しかしながら、カテキン類とオルニチンを摂取した場合の当該効果には個人差があり、必ずしも全ての使用者に対して十分な効果が発揮されるわけではなかった。

一方、生体試料中のＤＮＡやＲＮＡ等の核酸の解析によりヒトの生体内の現在、さらには将来の生理状態を調べる技術が開発されている。生体由来の核酸は、血液等の組織、体液、分泌物などから抽出することができ、特許文献７には皮膚表上脂質（ＳＳＬ）から被験者の皮膚細胞に由来するＲＮＡ等の核酸を分離し、生体の解析用の試料として用いることが記載されている。

従来、アンモニア代謝に関連するとされている遺伝子は多数報告されているが、カテキン類及びオルニチンを併用した場合の血中アンモニア濃度の変動によって、その発現が変動する遺伝子については何ら報告されていない。

特開２０００－２３９１７９号公報特開２０１２－２４６２９４号公報特開２０１１－１３２１７４号公報国際公開公報第２００９／０４８１４８号特開２０１３－０６０４０６号公報特開２０１９－６２９１４号公報国際公開公報第２０１８／００８３１９号

Takeda et al, J Nutr Sci Vitaminol, 2011, 57:246-250 Walker, Diabetes, Obesity and Metabolism, 2009, 11:823-835

本発明は、個々人に対するカテキン類及びオルニチンの併用投与によるアンモニア代謝促進効果の有効性を検出する方法、及びそのためのマーカーを提供することに関する。

本発明者らは、カテキン類及びオルニチンの併用投与による運動時又は安静時の血中アンモニア代謝促進効果が有効に発揮されるヒト（有効群）と有効に発揮されないヒト（非有効群）に分け、それぞれの皮膚からＳＳＬを採取し、ＳＳＬ中に含まれるＲＮＡの発現状態をシーケンス情報として網羅的に解析した結果、特定の遺伝子の発現レベルが両群間で有意に異なり、これを指標として被験者がカテキン類及びオルニチンの併用投与によるアンモニア代謝促進効果が有効に発揮される否かを検出できることを見出した。

すなわち、本発明は、以下の１）～５）に係るものである。
１）被験者から採取された試料について、下記表１－１及び表１－２に示す１０４種の遺伝子群より選択される少なくとも１つの遺伝子又はその発現産物の発現レベルを測定する工程を含む、当該被験者に対するカテキン類及びオルニチンの併用投与による安静時アンモニア代謝促進効果の有効性の検出方法。
２）被験者から採取された試料について、下記表２に示す８７種の遺伝子群より選択される少なくとも１つの遺伝子又はその発現産物の発現レベルを測定する工程を含む、当該被験者に対するカテキン類及びオルニチンの併用投与による運動時アンモニア代謝促進効果の有効性の検出方法。
３）試料の採取及び保存に必要な用具及び試薬、並びに試料から前記遺伝子又はその発現産物の発現レベルを測定するための試薬を含有する、１）又は２）の方法に用いられるカテキン類及びオルニチンの併用投与による安静時又は運動時アンモニア代謝促進効果の有効性検出用キット。
４）下記表１－１及び表１－２に示す１０４種の遺伝子群より選択される少なくとも１つの遺伝子又はその発現産物からなる、被験者に対するカテキン類及びオルニチンの併用投与による安静時アンモニア代謝促進効果の有効性検出マーカー。
５）下記表２に示す８７種の遺伝子群より選択される少なくとも１つの遺伝子又はその発現産物からなる、被験者に対するカテキン類及びオルニチンの併用投与による運動時アンモニア代謝促進効果の有効性検出マーカー。

本発明によれば、個々人に対するカテキン類及びオルニチンの併用投与による安静時又は運動時アンモニア代謝促進効果の有効性を、該カテキン類及びオルニチンを実際に用いることなく予測することができる。本発明により、消費者は、カテキン類及びオルニチンを実際に服用せずとも、それが自身にとって有効かどうかを予測することができる。すなわち、本発明によれば、個々人がカテキン類及びオルニチンの併用投与のアンモニア代謝促進効果を予測するための指針が提供され、自身に適した適切な素材を選択するための時間、コスト、労力等の使用者の負担が低減されるだけでなく、使用者の不安による効果の低下を抑えることで、該素材の効果の向上に繋がり得る。

本明細書中で引用されたすべての特許文献、非特許文献、及びその他の刊行物は、その全体が本明細書中において参考として援用される。

本発明において、「核酸」又は「ポリヌクレオチド」と云う用語は、ＤＮＡ又はＲＮＡを意味する。ＤＮＡには、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、及び合成ＤＮＡのいずれもが含まれ、「ＲＮＡ」には、ｔｏｔａｌＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｎｏｎ-ｃｏｄｉｎｇＲＮＡ及び合成のＲＮＡのいずれもが含まれる。

本発明において「遺伝子」とは、ヒトゲノムＤＮＡを含む２本鎖ＤＮＡの他、ｃＤＮＡを含む１本鎖ＤＮＡ（正鎖）、当該正鎖と相補的な配列を有する１本鎖ＤＮＡ（相補鎖）、及びこれらの断片を包含するものであって、ＤＮＡを構成する塩基の配列情報の中に、何らかの生物学的情報が含まれているものを意味する。
また、当該「遺伝子」は特定の塩基配列で表される「遺伝子」だけではなく、これらの同族体（すなわち、ホモログもしくはオーソログ）、遺伝子多型等の変異体、及び誘導体をコードする核酸が包含される。

本発明において、遺伝子の名称は、ＮＣＢＩ（[www.ncbi.nlm.nih.gov/]）に記載のあるＯｆｆｉｃｉａｌＳｙｍｂｏｌに従う。

本発明において、遺伝子の「発現産物」とは、遺伝子の転写産物及び翻訳産物を包含する概念である。「転写産物」とは、遺伝子（ＤＮＡ）から転写されて生じるＲＮＡであり、「翻訳産物」とは、ＲＮＡに基づき翻訳合成される、遺伝子にコードされたタンパク質を意味する。

本発明において、「カテキン類及びオルニチンの併用投与によるアンモニア代謝促進効果」とは、カテキン類及びオルニチンの併用投与によってアンモニア代謝能力が高められることを指す。アンモニア代謝能力とは、体内のアンモニアを無毒化、除去する能力をいう。体内のアンモニアの無毒化としては、例えば、肝臓の尿素回路での尿素への変換、骨格筋、脳、腎臓等におけるグルタミン合成酵素によるグルタミンへの変換等が挙げられる。
当該アンモニア代謝能力は、血中アンモニア濃度の変化量（低下量）により評価することができる。
カテキン類及びオルニチンの併用投与による安静時アンモニア代謝促進効果は、カテキン類及びオルニチンの併用投与がなかった場合の安静時（運動負荷なし）の血中アンモニア濃度に対する、カテキン類及びオルニチンの併用投与による安静時（運動負荷なし）の血中アンモニア濃度の変化量（低下量）によって評価することができ、運動時アンモニア代謝能力は、カテキン類及びオルニチンの併用投与がなかった場合の運動負荷後の血中アンモニア濃度に対する、カテキン類及びオルニチンの併用投与による運動負荷後の血中アンモニア濃度の変化量（低下量）によって評価することができる。
そして、血中アンモニア濃度の変化量が、例えば１０Ｎ－μｇ／ｄＬ以上低下した場合に、カテキン類及びオルニチンの併用投与によるアンモニア代謝促進効果があると評価できる。
血中アンモニア濃度の上昇は、前述のとおりタンパク質代謝や運動によるＡＴＰの分解などの過程で発生し、中枢性疲労や筋肉疲労、持久力低下、脳障害などの様々な障害を引き起こすことが知られている。
カテキン類及びオルニチンの併用投与による安静時アンモニア代謝促進効果は、日常生活における身体活動による疲労の軽減効果に繋がる他、肝性脳症の予防改善、脳機能、認知機能低下の改善、倦怠感の改善、体臭（悪臭）の低減などに繋がり、また、当該併用投与による運動時アンモニア代謝促進効果は、筋肉労作を伴う労働における持続性向上や疲労軽減、狭義の運動の際の持久力又は筋持久力の向上効果に繋がる他、運動による血糖低下の抑制、回復の亢進、ストレス時の脳機能、認知機能の低下の改善、倦怠感の改善、ストレス時の体臭（悪臭）の低減、食後の脳機能低下の改善、食後の倦怠感の改善に繋がると云える。したがって、本発明の方法によれば、カテキン類及びオルニチンの併用投与によるこれらの効果に対する有効性を検出することが可能であると云える。

本発明において、「カテキン類及びオルニチンの併用投与」とは、カテキン類とオルニチンを組み合わせてヒトに投与又は摂取することを指し、それらが生体内で協働できる限りにおいて、１組成物として同時に投与されてもよく、又はそれぞれが別個に投与される態様でもよい。また、カテキン類及びオルニチンの投与形態は、医薬品、医薬部外品又は食品（機能性食品、病者用食品、特定保健用食品、サプリメント等を含む）の何れの製剤であってもよく、製剤形態も固形、半固形又は液状のいずれでも良い。カテキン類の製剤形態とオルニチンの製剤形態が異なっていても良い。

ここで、カテキン類としては、カテキン、カテキンガレート、ガロカテキン及びガロカテキンガレート等の非エピ体；エピカテキン、エピカテキンガレート、エピガロカテキン及びエピガロカテキンガレート等のエピ体が挙げられる。ここで、カテキンガレート、ガロカテキンガレート、エピカテキンガレート及びエピガロカテキンガレートはガレート体、カテキン、ガロカテキン、エピカテキン及びエピガロカテキンは非ガレート体と称する。カテキン類は、上記に挙げた非重合体カテキン類のいずれか１種又は２種以上の組み合わせであり得る。カテキン類は上記８種を含むのが好ましい。なお、本発明において、カテキン類の含有量は上記８種の合計量に基づいて定義される。

カテキン類は、アンモニア代謝促進効果の点から、カテキン類中のエピ体の割合が、好ましくは３５～９５質量％、より好ましくは４５～９２質量％、更に好ましくは５０～９０質量％である。また、カテキン類は、カテキン類中のガレート体の割合が、好ましくは５～９５質量％、より好ましくは１０～８５質量％、更に好ましくは２５～６０質量％、更に好ましくは３５～５３質量％である。
カテキン類の分析は、通常知られている非重合体カテキン類の分析法のうち測定試料の状況に適した分析法により測定することができる。

カテキン類は、一般的には茶葉（煎茶、番茶、玉露、てん茶、釜入り茶等の緑茶；総称して烏龍茶と呼ばれる鉄観音、色種、黄金桂、武夷岩茶などの半発酵茶；紅茶と呼ばれるダージリン、ウバ、キーマン等の発酵茶）から抽出した茶抽出物、その濃縮物又はそれらの精製物（以下、これらを包括的に「茶抽出物等」とも称する）に含まれているため、これらの形態で使用されるのが好ましく、より好ましくは緑茶抽出物の濃縮物又は精製物の形態で使用される。

食品におけるカテキン類の含有量は、その使用形態により異なるが、飲料の形態では、通常０．０００１～１０質量％であり、好ましくは０．０００１～５質量％、より好ましくは０．００１～１質量％である。
医薬又は医薬部外品におけるカテキン類の含有量は、一般的に、０．０００１～２０質量％であり、好ましくは０．００１～１０質量％、より好ましくは０．０１～５質量％である。
錠剤や加工食品等の固形食品の形態では、カテキン類の含有量は、好ましくは５～１５質量％であり、より好ましくは６～１４．５質量％であり、より好ましくは７～１４質量％であり、より好ましくは１０．３～１３．５質量％である。

オルニチンは、遊離体又はその塩の形態で使用することができる。
オルニチンは、Ｌ－体、Ｄ－体、ＤＬ－体、及びそれらの混合物のいずれであってもよいが、好ましくはＬ－体である。

オルニチンの塩としては、酸付加塩、金属塩、アンモニウム塩、有機アミン付加塩、アミノ酸付加塩等が挙げられる。当該酸付加塩としては、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩等の無機酸塩、及び酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩、リンゴ酸塩、乳酸塩、α－ケトグルタル酸塩、グルコン酸塩、カプリル酸塩等の有機酸塩が挙げられる。当該金属塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、マグネシウム塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、亜鉛塩等が挙げられる。このうち、ナトリウム塩、又は塩酸塩が好ましい例として挙げられる。

食品におけるオルニチンの含有量は、その使用形態により異なるが、オルニチン遊離体換算で、通常、好ましくは０．１５～３０質量％、より好ましくは０．３～２０質量％、より好ましくは３～１５質量％である。
医薬又は医薬部外品におけるオルニチンの含有量は、その使用形態により異なるが、オルニチン遊離体換算で、通常０．３～６０質量％であり、好ましくは３～３０質量％、より好ましくは５～２０質量％である。

本発明において、カテキン類及びオルニチンの投与量は、経口投与の場合、１人１日当たり、カテキン類は、好ましくは１００～３０００ｍｇ／６０ｋｇ体重、より好ましくは２５０～２０００ｍｇ／６０ｋｇ体重、さらに好ましくは２５０～１０００ｍｇ／６０ｋｇ体重、さらに好ましくは２５０～６００ｍｇ／６０ｋｇ体重であり、オルニチン（遊離体換算）は、好ましくは１００～５０００ｍｇ／６０ｋｇ体重、より好ましくは２５０～３０００ｍｇ／６０ｋｇ体重、さらに好ましくは４００～２０００ｍｇ／６０ｋｇ体重、さらに好ましくは５００～２０００ｍｇ／６０ｋｇ体重であり、１日１回、又は１日２回もしくは３回以上に分けて投与することができる。

本発明において、被験者に対するカテキン類及びオルニチンの併用投与による安静時又は運動時アンモニア代謝促進効果の有効性の「検出」とは、被験者がカテキン類及びオルニチンの併用投与による安静時又は運動時アンモニア代謝促進効果が有効に作用する者か否かを明らかにする意味であり、検査、測定、判定、評価支援又は予測などの用語で言い換えることもできる。本発明において、被験者に対するカテキン類及びオルニチンの併用投与による安静時又は運動時アンモニア代謝促進効果の有効性の「検出」、「予測」、「検査」、「測定」、「判定」又は「評価」という用語は、医師による診断を含むものではない。

後述の実施例に示すとおり、被験者に対してカテキン類及びオルニチンを併用投与し、併用投与しなかった場合に対する、安静時又は運動時の血中アンモニア濃度の変化量をそれぞれ調べ、該併用投与が安静時又は運動時アンモニア代謝促進効果に対して有効に作用した被験者群（有効群）とそうでない被験者群（非有効群）に分けた。そして、被験者から検出された全てのＳＳＬ由来のＲＮＡの発現量のデータについて、ＤＥＳｅｑ２（Love MI et al. Genome Biol. 2014）を用いて補正されたカウント値（Ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄｃｏｕｎｔ値）を用いて、有効群と非有効群において、２群間のＦＤＲ（ＦＤＲｄｉｓｃｏｖｅｒｙｒａｔｅ）を制御した（ＦＤＲ＜０．２５）、調整済みｐ値（閾値＜０．０５）を元に発現差異遺伝子を抽出したところ、安静時アンモニア代謝促進効果については、無効群に対して有効群で発現が有意に上昇する遺伝子２６種（下記表１－１）、発現が有意に低下する遺伝子７８種（下記表１－２）、計１０４遺伝子が同定された。また、運動時アンモニア代謝促進効果については、無効群に対して有効群で発現が有意に低下する遺伝子８７種（下記表２）が同定された。

したがって、表１－１及び表１－２に記載の１０４種の遺伝子群より選択される遺伝子又はその発現産物は、被験者に対するカテキン類及びオルニチンの併用投与による安静時アンモニア代謝促進効果の有効性を検出するためのマーカーとなり得る。この場合、アンモニア代謝促進効果の有効性が高い群で発現が上昇する２６遺伝子又はその発現産物はポジティブマーカーであり、発現が低下する７８遺伝子又はその発現産物はネガティブマーカーである。
また、表２に記載の８７種の遺伝子群より選択される遺伝子又はその発現産物は、被験者に対するカテキン類及びオルニチンの併用投与による運動時アンモニア代謝促進効果の有効性を検出するためのマーカーとなり得る。当該マーカーは、アンモニア代謝促進効果の有効性が高い群で発現が低下するネガティブマーカーである。

これらの１０４種及び８７種の遺伝子は、これまでにアンモニア代謝能力との関係が報告されていない遺伝子であり、これら遺伝子群より選択される遺伝子又はその発現産物は、カテキン類及びオルニチンの併用投与による安静時又は運動時アンモニア代謝促進効果の有効性を検出するための新規な検出マーカーである。
該遺伝子又はその発現産物を指標に、カテキン類及びオルニチンの併用投与による安静時又は運動時アンモニア代謝促進効果の個々の被験者に対する有効性を予測することや、カテキン類及びオルニチンの併用投与によるアンモニア代謝の促進に適した被験者を選択することが可能になる。

本発明において、「運動時」の運動とは、最大心拍数の６０％以上になるような動作、若しくは軽く息が上がるような強度以上の動作、好ましくは最大心拍数の７０％以上になるような動作、若しくは息が上がるような強度以上の動作をいい、「安静時」とは、上記動作をしていない状態、若しくは最大心拍数の６０％未満程度の強度の日常動作を含む概念である。

上記表１－１及び表１－２に示す１０４種の遺伝子、表２に示す８７種の遺伝子は、それぞれ単独で、カテキン類及びオルニチンの併用投与による安静時又は運動時のアンモニア代謝促進効果の有効性を検出するための検出マーカーとなり得るが、このうち、精度向上の観点から、数種を組み合わせて使用してもよい。

なお、上記のカテキン類及びオルニチンの併用投与による安静時又は運動時アンモニア代謝促進効果の被験者に対する有効性検出マーカーとなり得る遺伝子（以下、「標的遺伝子」とも称す）には、カテキン類及びオルニチンの併用投与による安静時又は運動時アンモニア代謝促進効果の被験者に対する有効性を検出するためのバイオマーカーとなり得る限り、当該遺伝子を構成するＤＮＡの塩基配列と実質的に同一の塩基配列を有する遺伝子も包含される。ここで、実質的に同一の塩基配列とは、例えば、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩＢＬＡＳＴを用い、期待値＝１０；ギャップを許す；フィルタリング＝ＯＮ；マッチスコア＝１；ミスマッチスコア＝－３の条件にて検索をした場合、当該遺伝子を構成するＤＮＡの塩基配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９８％以上の同一性があることを意味する。

本発明のカテキン類及びオルニチンの併用投与による安静時又は運動時アンモニア代謝促進効果の被験者に対する有効性の検出方法は、被験者から採取された生体試料について、上記標的遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子又はその発現産物の発現レベルを測定する工程を含む。
本発明における被験者の例としては、カテキン類及びオルニチンの併用投与によって、安静時アンモニア代謝促進を所望する者、日常生活における身体活動による疲労の軽減を所望する者、カテキン類及びオルニチンの併用投与によって運動時アンモニア代謝促進を所望する者、筋肉労作を伴う労働における持続性向上や疲労軽減を所望する者、運動の際の持久力又は筋持久力の向上を所望する者、などが挙げられる。

生体試料は、例えば、細胞、体液（血液等）、尿、分泌物（唾液、ＳＳＬ等）であり得るが、ＳＳＬを用いるのが好ましい。
ここで、「皮膚表上脂質（ＳＳＬ）」とは、皮膚の表上に存在する脂溶性画分をいい、皮脂と呼ばれることもある。一般に、ＳＳＬは、皮膚にある皮脂腺等の外分泌腺から分泌された分泌物を主に含み、皮膚表面を覆う薄い層の形で皮膚表上に存在している。ＳＳＬは、皮膚細胞で発現したＲＮＡを含む（前記特許文献１，２参照）。また、「皮膚」とは、特に限定しない限り、角層、表皮、真皮、毛包、ならびに汗腺、皮脂腺及びその他の腺等の組織を含む領域の総称である。ＳＳＬが採取される皮膚の部位としては、頭、顔、首、体幹、手足等の身体の任意の部位の皮膚が挙げられ、皮脂の分泌が多い部位、例えば顔の皮膚が好ましい。

被験者の皮膚からのＳＳＬの採取には、皮膚からのＳＳＬの回収又は除去に用いられているあらゆる手段を採用することができる。好ましくは、後述するＳＳＬ吸収性素材、ＳＳＬ接着性素材、又は皮膚からＳＳＬをこすり落とす器具を使用することができる。ＳＳＬ吸収性素材又はＳＳＬ接着性素材としては、ＳＳＬに親和性を有する素材であれば特に限定されず、例えばポリプロピレン、パルプ等が挙げられる。皮膚からのＳＳＬの採取手順のより詳細な例としては、あぶら取り紙、あぶら取りフィルム等のシート状素材へＳＳＬを吸収させる方法、ガラス板、テープ等へＳＳＬを接着させる方法、スパーテル、スクレイパー等によりＳＳＬをこすり落として回収する方法、などが挙げられる。ＳＳＬの吸着性を向上させるため、脂溶性の高い溶媒を予め含ませたＳＳＬ吸収性素材を用いてもよい。一方、ＳＳＬ吸収性素材は、水溶性の高い溶媒や水分を含んでいるとＳＳＬの吸着が阻害されるため、水溶性の高い溶媒や水分の含有量が少ないことが好ましい。ＳＳＬ吸収性素材は、乾燥した状態で用いることが好ましい。

採取されたＳＳＬは、直ちに後述の核酸又はタンパク質の抽出工程に用いられてもよく、又は、該核酸又はタンパク質抽出工程に用いるまで保存されてもよい。保存する場合、ＳＳＬは、好ましくは低温条件で保存される。ＳＳＬの保存の温度条件は、０℃以下であればよく、好ましくは－２０±２０℃～－８０±２０℃、より好ましくは－２０±１０℃～－８０±１０℃、さらに好ましくは－２０±２０℃～－４０±２０℃、さらに好ましくは－２０±１０℃～－４０±１０℃、さらに好ましくは－２０±１０℃、さらに好ましくは－２０±５℃である。ＳＳＬの保存の期間は、特に限定されないが、好ましくは１２か月以下、例えば６時間以上１２ヶ月以下、より好ましくは６ヶ月以下、例えば１日間以上６ヶ月以下、さらに好ましくは３ヶ月以下、例えば３日間以上３ヶ月以下である。

本発明において、標的遺伝子又はその発現産物の発現レベルの測定対象としては、ＲＮＡ、そのＲＮＡをエンコードするＤＮＡ、そのＲＮＡにコードされるタンパク質、該タンパク質と相互作用をする分子、そのＲＮＡと相互作用する分子、又はそのＤＮＡと相互作用する分子等が挙げられ、ＲＮＡが好ましく、より好ましくはｍＲＮＡである。ここで、ＲＮＡ、ＤＮＡ又はタンパク質と相互作用する分子としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、多糖、オリゴ糖、単糖、脂質、脂肪酸、及びこれらのリン酸化物、アルキル化物、糖付加物等、及び上記いずれかの複合体が挙げられる。また、発現レベルとは、当該遺伝子又は発現産物の発現量や活性を包括的に意味する。

本発明の方法においては、ＲＮＡを標的遺伝子又はその発現産物の発現レベルの測定対象とする場合、ＲＮＡの発現レベルが解析されてもよいが、好ましくはＲＮＡを逆転写によりｃＤＮＡに変換した後、該ｃＤＮＡ又はその増幅産物が測定される。
ＳＳＬからのＲＮＡの抽出には、生体試料からのＲＮＡの抽出又は精製に通常使用される方法、例えば、フェノール/クロロホルム法、ＡＧＰＣ（ａｃｉｄｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ－ｐｈｅｎｏｌ－ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）法、又はＴＲＩｚｏｌ（登録商標）、ＲＮｅａｓｙ（登録商標）、ＱＩＡｚｏｌ（登録商標）等のカラムを用いた方法、シリカをコーティングした特殊な磁性体粒子を用いる方法、ＳｏｌｉｄＰｈａｓｅＲｅｖｅｒｓｉｂｌｅＩｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ磁性体粒子を用いる方法、ＩＳＯＧＥＮ等の市販のＲＮＡ抽出試薬による抽出等を用いることができる。

該逆転写には、解析したい特定のＲＮＡを標的としたプライマーを用いてもよいが、より包括的な核酸の保存及び解析のためにはランダムプライマーを用いることが好ましい。該逆転写には、一般的な逆転写酵素又は逆転写試薬キットを使用することができる。好適には、正確性及び効率性の高い逆転写酵素又は逆転写試薬キットが用いられ、その例としては、Ｍ－ＭＬＶＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ及びその改変体、あるいは市販の逆転写酵素又は逆転写試薬キット、例えばＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅシリーズ（タカラバイオ社）、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅシリーズ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）等が挙げられる。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）III ＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＶＩＬＯｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓｋｉｔ（いずれもＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）等が好ましく用いられる。
該逆転写における伸長反応は、温度を好ましくは４２℃±１℃、より好ましくは４２℃±０．５℃、さらに好ましくは４２℃±０．２５℃に調整し、一方、反応時間を好ましくは６０分間以上、より好ましくは８０～１２０分間に調整するのが好ましい。

発現レベルを測定する方法は、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ又はＤＮＡを対象とする場合、これらにハイブリダイズするＤＮＡをプライマーとしたＰＣＲ法、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法、マルチプレックスＰＣＲ、ＳｍａｒｔＡｍｐ法、ＬＡＭＰ法等に代表される核酸増幅法、これらにハイブリダイズする核酸をプローブとして用いるハイブリダイゼーション法（ＤＮＡチップ、ＤＮＡマイクロアレイ、ドットブロットハイブリダイゼーション、スロットブロットハイブリダイゼーション、ノーザンブロットハイブリダイゼーション等）、塩基配列を決定する方法（シーケンシング）、又はこれらを組み合わせた方法から選ぶことができる。

ＰＣＲでは、解析したい特定のＤＮＡを標的としたプライマーペアを用いて該特定の１種のＤＮＡのみを増幅してもよいが、複数のプライマーペアを用いて同時に複数の特定のＤＮＡを増幅してもよい。好ましくは、該ＰＣＲはマルチプレックスＰＣＲである。マルチプレックスＰＣＲは、ＰＣＲ反応系に複数のプライマー対を同時に使用することで、複数の遺伝子領域を同時に増幅する方法である。マルチプレックスＰＣＲは、市販のキット（例えば、ＩｏｎＡｍｐｌｉＳｅｑＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅＨｕｍａｎＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＫｉｔ；ライフテクノロジーズジャパン株式会社等）を用いて実施することができる。
該ＰＣＲにおけるアニーリング及び伸長反応の温度は、使用するプライマーに依存するため一概には言えないが、上記のマルチプレックスＰＣＲキットは用いる場合、好ましくは６２℃±１℃、より好ましくは６２℃±０．５℃、さらに好ましくは６２℃±０．２５℃である。したがって、該ＰＣＲでは、好ましくはアニーリング及び伸長反応が１ステップで行われる。該アニーリング及び伸長反応のステップの時間は、増幅すべきＤＮＡのサイズ等に依存して調整され得るが、好ましくは１４～１８分間である。該ＰＣＲにおける変性反応の条件は、増幅すべきＤＮＡに依存して調整され得るが、好ましくは９５～９９℃で１０～６０秒間である。上記のような温度及び時間での逆転写及びＰＣＲは、一般的にＰＣＲに使用されるサーマルサイクラーを用いて実行することができる。

当該ＰＣＲで得られた反応産物の精製は、反応産物のサイズ分離によって行われることが好ましい。サイズ分離により、目的のＰＣＲ反応産物を、ＰＣＲ反応液中に含まれるプライマーやその他の不純物から分離することができる。ＤＮＡのサイズ分離は、例えば、サイズ分離カラムや、サイズ分離チップ、サイズ分離に利用可能な磁気ビーズ等によって行うことができる。サイズ分離に利用可能な磁気ビーズの好ましい例としては、ＡｍｐｕｒｅＸＰ等のＳｏｌｉｄＰｈａｓｅＲｅｖｅｒｓｉｂｌｅＩｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ（ＳＰＲＩ）磁性ビーズが挙げられる。

精製したＰＣＲ反応産物に対して、その後の定量解析を行うために必要なさらなる処理を施してもよい。例えば、ＤＮＡのシーケンシングのために、精製したＰＣＲ反応産物を、適切なバッファー溶液へと調製したり、ＰＣＲ増幅されたＤＮＡに含まれるＰＣＲプライマー領域を切断したり、増幅されたＤＮＡにアダプター配列をさらに付加したりしてもよい。例えば、精製したＰＣＲ反応産物をバッファー溶液へと調製し、増幅ＤＮＡに対してＰＣＲプライマー配列の除去及びアダプターライゲーションを行い、得られた反応産物を、必要に応じて増幅して、定量解析のためのライブラリーを調製することができる。これらの操作は、例えば、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＶＩＬＯｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓｋｉｔ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）に付属している５×ＶＩＬＯＲＴＲｅａｃｔｉｏｎＭｉｘ、及びＩｏｎＡｍｐｌｉＳｅｑＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅＨｕｍａｎＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＫｉｔ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）に付属している５×ＩｏｎＡｍｐｌｉＳｅｑＨｉＦｉＭｉｘ、及びＩｏｎＡｍｐｌｉＳｅｑＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅＨｕｍａｎＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＣｏｒｅＰａｎｅｌを用いて、各キット付属のプロトコルに従って行うことができる。

ノーザンブロットハイブリダイゼーション法を利用して標的遺伝子又はそれに由来する核酸の発現量を測定する場合は、例えば、まずプローブＤＮＡを放射性同位元素、蛍光物質等で標識し、次いで、得られた標識ＤＮＡを、常法に従ってナイロンメンブレン等にトランスファーした生体試料由来のＲＮＡとハイブリダイズさせる。その後、形成された標識ＤＮＡとＲＮＡとの二重鎖を、標識物に由来するシグナルを検出することにより測定する方法が挙げられる。

ＲＴ－ＰＣＲ法を用いて標的遺伝子又はそれに由来する核酸の発現量を測定する場合は、例えば、まず生体試料由来のＲＮＡから常法に従ってｃＤＮＡを調製し、これを鋳型として本発明の標的遺伝子が増幅できるように調製した一対のプライマー（上記ｃＤＮＡ（－鎖）に結合する正鎖、＋鎖に結合する逆鎖）をこれとハイブリダイズさせる。その後、常法に従ってＰＣＲ法を行い、得られた増幅二本鎖ＤＮＡを検出する。増幅された二本鎖ＤＮＡの検出には、予めＲＩ、蛍光物質等で標識しておいたプライマーを用いて上記ＰＣＲを行うことによって産生される標識二本鎖ＤＮＡを検出する方法等を用いることができる。

ＤＮＡマイクロアレイを用いて標的遺伝子又はそれに由来する核酸の発現量を測定する場合は、例えば、支持体に本発明の標的遺伝子由来の核酸（ｃＤＮＡ又はＤＮＡ）の少なくとも１種を固定化したアレイを用い、ｍＲＮＡから調製した標識化ｃＤＮＡ又はｃＲＮＡをマイクロアレイ上に結合させ、マイクロアレイ上の標識を検出することによって、ｍＲＮＡの発現量を測定することができる。
前記アレイに固定化される核酸としては、ストリンジェントな条件下に特異的（すなわち、実質的に目的の核酸のみに）にハイブリダイズする核酸であればよく、例えば、本発明の標的遺伝子の全配列を有する核酸であってもよく、部分配列からなる核酸であってもよい。ここで、「部分配列」とは、少なくとも１５～２５塩基からなる核酸が挙げられる。ここでストリンジェントな条件は、通常「１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、３７℃」程度の洗浄条件を挙げることができ、より厳しいハイブリダイズ条件としては「０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」程度、さらに厳しいハイブリダイズ条件としては「０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」程度の条件を挙げることができる。ハイブリダイズ条件は、J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)等に記載されている。

シーケンシングによって標的遺伝子又はそれに由来する核酸の発現量を測定する場合は、例えば、次世代シーケンサー（例えばＩｏｎＳ５／ＸＬシステム、ライフテクノロジーズジャパン株式会社）が用いて解析することが挙げられる。シーケンシングで作成されたリードの数（リードカウント）に基づいて、ＲＮＡ発現を定量することができる。

上記の測定に用いられるプローブ又はプライマー、すなわち、本発明の標的遺伝子又はそれに由来する核酸を特異的に認識し増幅するためのプライマー、又は該ＲＮＡ又はそれに由来する核酸を特異的に検出するためのプローブがこれに該当するが、これらは、当該標的遺伝子を構成する塩基配列に基づいて設計することができる。ここで「特異的に認識する」とは、例えばノーザンブロット法において、実質的に本発明の標的遺伝子又はそれに由来する核酸のみを検出できること、また例えばＲＴ－ＰＣＲ法において、実質的に当該核酸のみが増幅される如く、当該検出物又は生成物が当該遺伝子又はそれに由来する核酸であると判断できることを意味する。
具体的には、本発明の標的遺伝子を構成する塩基配列からなるＤＮＡ又はその相補鎖に相補的な一定数のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを利用することができる。ここで「相補鎖」とは、Ａ：Ｔ（ＲＮＡの場合はＵ）、Ｇ：Ｃの塩基対からなる２本鎖ＤＮＡの一方の鎖に対する他方の鎖を指す。また、「相補的」とは、当該一定数の連続したヌクレオチド領域で完全に相補配列である場合に限られず、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、よりさらに好ましくは９９％以上の塩基配列上の同一性を有すればよい。塩基配列の同一性は、前記ＢＬＡＳＴ等のアルゴリズムにより決定することができる。
斯かるオリゴヌクレオチドは、プライマーとして用いる場合には、特異的なアニーリング及び鎖伸長ができればよく、通常、例えば１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上、より好ましくは２０塩基以上、かつ例えば１００塩基以下、好ましくは５０塩基以下、より好ましくは３５塩基以下の鎖長を有するものが挙げられる。また、プローブとして用いる場合には、特異的なハイブリダイゼーションができればよく、本発明の標的遺伝子を構成する塩基配列からなるＤＮＡ（又はその相補鎖）の少なくとも一部若しくは全部の配列を有し、例えば１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上、かつ例えば１００塩基以下、好ましくは５０塩基以下、より好ましくは２５塩基以下の鎖長のものが用いられる。
なお、ここで、「オリゴヌクレオチド」は、ＤＮＡあるいはＲＮＡであることができ、合成されたものでも天然のものでもよい。又はハイブリダイゼーションに用いるプローブは、通常標識したものが用いられる。

また、本発明の標的遺伝子の翻訳産物（タンパク質）、当該タンパク質と相互作用する分子、ＲＮＡと相互作用する分子、又はＤＮＡと相互作用する分子を測定する場合は、プロテインチップ解析、免疫測定法（例えば、ＥＬＩＳＡ等）、質量分析（例えば、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＭＳ）、１－ハイブリッド法（PNAS 100, 12271-12276(2003)）や２－ハイブリッド法（Biol. Reprod. 58, 302-311 (1998)）のような方法を用いることができ、対象に応じて適宜選択できる。
例えば、測定対象としてタンパク質が用いられる場合は、本発明の発現産物に対する抗体を生体試料と接触させ、当該抗体に結合した試料中のタンパク質を検出し、そのレベルを測定することによって実施される。例えば、ウェスタンブロット法によれば、一次抗体として上記の抗体を用いた後、二次抗体として放射性同位元素、蛍光物質又は酵素等で標識した一次抗体に結合する抗体を用いて、その一次抗体を標識し、これら標識物質由来のシグナルを放射線測定器、蛍光検出器等で測定することが行われる。
尚、上記翻訳産物に対する抗体は、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよい。これらの抗体は、公知の方法に従って製造することができる。具体的には、ポリクローナル抗体は、常法に従って大腸菌等で発現し精製したタンパク質を用いて、あるいは常法に従って当該タンパク質の部分ポリペプチドを合成して、家兎等の非ヒト動物に免疫し、該免疫動物の血清から常法に従って得ることが可能である。
一方、モノクローナル抗体は、常法に従って大腸菌等で発現し精製したタンパク質又は該タンパク質の部分ポリペプチドをマウス等の非ヒト動物に免疫し、得られた脾臓細胞と骨髄腫細胞とを細胞融合させて調製したハイブリドーマ細胞から得ることができる。また、モノクローナル抗体は、ファージディスプレイを用いて作製してもよい（Griffiths, A.D.; Duncan, A.R., Current Opinion in Biotechnology, Volume 9, Number 1, February 1998 , pp. 102-108(7)）。

斯くして、被験者から採取された生体試料中の標的遺伝子又はその発現産物の発現レベルが測定され、当該発現レベルに基づいて被験者に対するカテキン類及びオルニチンの併用投与による安静時又は運動時アンモニア代謝促進効果の有効性が検出される。

シーケンシングにより複数の標的遺伝子の発現レベルの解析を行う場合は、発現量のデータであるリードカウント値、該リードカウント値をサンプル間の総リード数の違いを補正したＲＰＭ値、当該ＲＰＭ値を底２の対数値に変換した値（Ｌｏｇ_２ＲＰＭ値）又は整数１を加算した底２の対数値（Ｌｏｇ_２（ＲＰＭ＋１）値）、あるいはＤＥＳｅｑ２を用いて補正されたカウント値（Ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄｃｏｕｎｔ値）又は整数１を加算した底２の対数値（Ｌｏｇ_２（ｃｏｕｎｔ＋１）値）を指標として用いるのが好ましい。また、ＲＮＡ－ｓｅｑの定量値として一般的な、ｆｒａｇｍｅｎｔｓｐｅｒｋｉｌｏｂａｓｅｏｆｅｘｏｎｐｅｒｍｉｌｌｉｏｎｒｅａｄｓｍａｐｐｅｄ（ＦＰＫＭ）、ｒｅａｄｓｐｅｒｋｉｌｏｂａｓｅｏｆｅｘｏｎｐｅｒｍｉｌｌｉｏｎｒｅａｄｓｍａｐｐｅｄ（ＲＰＫＭ）、ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓｐｅｒｍｉｌｌｉｏｎ（ＴＰＭ）などによって算出される値であってもよい。また、マイクロアレイ法によって得られるシグナル値、及びその補正値であってもよい。また、ＲＴ－ＰＣＲなどにより特定の標的遺伝子のみ発現レベルの解析を行う場合には、対象遺伝子の発現量をハウスキーピング遺伝子の発現量を基準とする相対的な発現量に変換（相対定量）して解析する方法、又は標的遺伝子の領域を含むプラスミドを用いて絶対的なコピー数を定量（絶対定量）して解析する方法が好ましい。デジタルＰＣＲ法によって得られるコピー数であってもよい。

本発明の被験者に対するカテキン類及びオルニチンの併用投与による安静時又は運動時アンモニア代謝促進効果の有効性の検出は、本発明の標的遺伝子又はその発現産物の発現レベルを、各遺伝子又はその発現産物の参照値（カットオフ値）と比較することにより行われる。参照値としては、例えば、予めカテキン類及びオルニチンの併用投与による安静時又は運動時アンモニア代謝促進効果が有効に作用する者（有効群）における当該標的遺伝子又はその発現産物の発現レベル、又はカテキン類及びオルニチンの併用投与による安静時又は運動時アンモニア代謝促進効果が有効に作用しない者（非有効群）における当該標的遺伝子又はその発現産物の発現レベルを基準データとして取得しておき、それに基づく発現レベルの平均値や標準偏差等の統計的数値に基づき、適宜決定すれば良い。

被験者由来の当該標的遺伝子又はその発現産物の発現レベルと参照値との比較は、両者が統計学的に有意に異なるか否か等によって評価することができる。
例えば、本発明の標的遺伝子又はその発現産物がポジティブマーカーとなる場合、該マーカーの発現レベルがカットオフ値（参照値）よりも高い場合、被験者はカテキン類及びオルニチンの併用投与による安静時又は運動時アンモニア代謝促進効果が有効に作用する者と検出され得、そうでない場合、被験者はカテキン類及びオルニチンの併用投与による安静時又は運動時アンモニア代謝促進効果が有効に作用しない者と検出され得る。
例えば、被験者における標的遺伝子又はその発現産物の発現レベルがカットオフ値（参照値）と比べて統計学的に有意に高ければ、該被験者はカテキン類及びオルニチンの併用投与による安静時又は運動時アンモニア代謝促進効果が有効に作用する者と検出され得、そうでない場合、被験者はカテキン類及びオルニチンの併用投与による安静時又は運動時アンモニア代謝促進効果が有効に作用しない者と検出され得る。
また例えば、被験者における標的遺伝子又はその発現産物の発現レベルがカットオフ値（参照値）に対して、好ましくは１１０％以上、より好ましくは１５０％以上、さらに好ましくは２００％以上であれば、該被験者はカテキン類及びオルニチンの併用投与による安静時又は運動時アンモニア代謝促進効果が有効に作用する者と検出され得、そうでない場合、被験者はカテキン類及びオルニチンの併用投与による安静時又は運動時アンモニア代謝促進効果が有効に作用しない者と検出され得る。

一方、本発明の標的遺伝子又はその発現産物がネガティブマーカーとなる場合、該マーカーの発現レベルがカットオフ値（参照値）よりも低い場合、被験者はカテキン類及びオルニチンの併用投与による安静時又は運動時アンモニア代謝促進効果が有効に作用する者と検出され得、そうでない場合、被験者はカテキン類及びオルニチンの併用投与による安静時又は運動時アンモニア代謝促進効果が有効に作用しない者と検出され得る。
例えば、被験者における標的遺伝子又はその発現産物の発現レベルがカットオフ値（参照値）と比べて統計学的に有意に低ければ、該被験者はカテキン類及びオルニチンの併用投与による安静時又は運動時アンモニア代謝促進効果が有効に作用する者と検出され得、そうでない場合、被験者はカテキン類及びオルニチンの併用投与による安静時又は運動時アンモニア代謝促進効果が有効に作用しない者と検出され得る。
また例えば、被験者における標的遺伝子又はその発現産物の発現レベルがカットオフ値（参照値）に対して、好ましくは９０％以下、より好ましくは７５％以下、さらに好ましくは５０％以下であれば、該被験者はカテキン類及びオルニチンの併用投与による安静時又は運動時アンモニア代謝促進効果が有効に作用する者と検出され得、そうでない場合、被験者はカテキン類及びオルニチンの併用投与による安静時又は運動時アンモニア代謝促進効果が有効に作用しない者と検出され得る。

また、標的遺伝子又はその発現産物として複数の標的遺伝子又はその発現産物を用いる場合には、それらの標的遺伝子又はその発現産物の一定割合、例えば５０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは１００％が上述した発現レベルの基準を満たすか否かを調べることで、該被験者に対するカテキン類及びオルニチンの併用投与による安静時又は運動時アンモニア代謝促進効果の有効性を検出することができる。

さらに、カテキン類及びオルニチンの併用投与による安静時又は運動時アンモニア代謝促進効果が有効に作用する個体（有効群）由来の標的遺伝子又はその発現産物の発現レベルと、カテキン類及びオルニチンの併用投与による安静時又は運動時アンモニア代謝促進効果が有効に作用しない個体（非有効群由来の標的遺伝子又はその発現産物の発現レベルの測定値（発現プロファイル）を利用して、カテキン類及びオルニチンの併用投与による安静時又は運動時アンモニア代謝促進効果が有効に作用する者か否かを分ける判別式（予測モデル）を構築し、当該判別式を利用して、カテキン類及びオルニチンの併用投与による安静時又は運動時のアンモニア代謝促進効果の被験者に対する有効性を検出することができる。
すなわち、教師サンプル集団（例えば、有効群、非有効群を含む集団）の各人から取得した１つ以上の標的遺伝子又はその発現産物の発現レベル（特徴量）を説明変数とし、該集団の各人におけるカテキン類及びオルニチンの併用投与による安静時又は運動時アンモニア代謝促進効果の有効性についてのデータを目的変数とした機械学習により、有効群と非有効群を分ける判別式（予測モデル）を構築し、当該判別式に基づいて被験者がカテキン類及びオルニチンの併用投与による安静時又は運動時のアンモニア代謝促進効果が有効に作用する者か否かを判別する参照値（カットオフ値）を求める。なお、判別式の作成においては、主成分分析（ＰＣＡ）により次元圧縮を行ない、主要成分を説明変数とすることができる。
次いで、カテキン類及びオルニチンの併用投与による安静時又は運動時アンモニア代謝促進効果の有効性を調べたい被験者由来の標的遺伝子又はその発現産物のレベル（特徴量）を同様に測定し、得られた測定値を当該判別式に代入し、当該判別式から得られた結果を参照値と比較することによって、被験者に対してカテキン類及びオルニチンの併用投与による安静時又は運動時アンモニア代謝促進効果が有効か否かが判別される。

判別式を構築するための特徴量の選択には、判別する２群間の統計学的に有意な差異、例えば、発現レベルが２群間で有意に変動する標的遺伝子（発現変動遺伝子）又はその発現産物の発現レベルを用いることができる。また、機械学習に用いるアルゴリズムなどの公知のものを利用して特徴量となる標的遺伝子を抽出し、その発現レベルを用いたりすることができる。例えば、下記に示すランダムフォレストにおける変数重要度の高い標的遺伝子又はその発現産物の発現レベルを用いたり、Ｒ言語の“Ｂｏｒｕｔａ”パッケージ、Ｐｙｔｈｏｎ言語の“Ｅｌｉ５”及び“ＳＨＡＰ”などを用いて標的遺伝子を抽出し、その発現レベルを用いたりすることができる。

判別式の構築におけるアルゴリズムは、機械学習に用いるアルゴリズムなどの公知のものを利用することができる。機械学習アルゴリズムとしては、特に限定されず、例えば、線形回帰モデル（Ｌｉｎｅａｒｍｏｄｅｌ）、ラッソ回帰（Ｌａｓｓｏ）、ランダムフォレスト（ＲａｎｄｏｍＦｏｒｅｓｔ）、ニューラルネットワーク（Ｎｅｕｒａｌｎｅｔ）、線形カーネルのサポートベクターマシン（ＳＶＭ（ｌｉｎｅａｒ））、ｒｂｆカーネルのサポートベクターマシン（ＳＶＭ（ｒｂｆ））などのアルゴリズムが挙げられ、このうちランダムフォレスト及び線形カーネルのサポートベクターマシンが好ましい。
構築した予測モデルに検証用のデータを入力して予測値を算出し、該予測値が実測値と最も適合するモデル、例えば正解率（Ａｃｃｕｒａｃｙ）が最も大きいモデル又は該予測値と実測値の差の二乗平均平方根誤差（ＲＭＳＥ）が最も小さいモデルを、最適な予測モデルとして選抜することができる。

カテキン類及びオルニチンの併用投与による安静時又は運動時アンモニア代謝促進効果の有効性の検出キットは、本発明によるカテキン類及びオルニチンの併用投与による安静時又は運動時のアンモニア代謝促進効果の有効性の検出方法に従って、被験者に対するカテキン類及びオルニチンの併用投与による安静時又は運動時のアンモニア代謝促進効果の有効性を検出するためのキットである。
本発明のキットは、ＳＳＬ等の生体試料の採取及び保存に必要な用具及び試薬、標的遺伝子又はその発現産物の発現レベルを測定するための試薬を含有する。
例えばＳＳＬの採取及び保存に必要な用具及び試薬としては、例えば、ＳＳＬを採取するための脂取りフィルム、採取したＳＳＬを保存するための試薬、保存用の容器等が挙げられる。
標的遺伝子又はその発現産物の発現レベルを測定するための試薬としては、例えば採取したＳＳＬからＲＮＡを抽出・精製するための試薬、標的遺伝子に由来する核酸と特異的に結合（ハイブリダイズ）するオリゴヌクレオチド（例えば、ＰＣＲ用のプライマー、シーケンシング用アダプター配列等）を含む、核酸増幅又はハイブリダイゼーションのための試薬、遺伝子発現産物（タンパク質）を認識する抗体を含む免疫学的測定のための試薬の他、標識試薬、緩衝液、発色基質、二次抗体、ブロッキング剤、ポジティブコントロールやネガティブコントロールとして使用するコントロール試薬、試験に必要な器具の他、標的遺伝子又はその発現産物の発現レベルを検出するための指標又はガイダンス等が包含される。

以下、実施例に基づき本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
１）試験概要
２０－６５歳の健常男性１４名を被験者としてプラセボ対照２重盲検クロスオーバー試験を行った。カテキン類及びオルニチン（６００ｍｇ茶カテキンを含む粉末飲料、及び８００ｍｇオルニチンを含むサプリメント）、若しくは、プラセボ（それぞれを含まない粉末飲料、及びサプリメント）を２週間摂取し、最終日に運動負荷試験を行う、１週間以上のウォッシュアウトを挟んだクロスオーバー試験を行った。

２）運動負荷試験
昼食の約３時間後に屋内（気温２４±１℃制御）でエルゴメーター：エアロバイク（登録商標）７５Ｘ（コナミスポーツ（旧コンビ））を用いた漸増負荷運動を課した。当日の朝食、昼食は指定のものを提供することで内容を試行間で固定した。被験者は心拍計、呼気マスクを装着した状態で、エアロバイク（登録商標）のオリジナルモード（プログラムモード）にて、事前検査で予め最大心拍数の８０％に到達することが確認された強度まで負荷増加する、５－２０分間の漸増運動負荷（１５ｗ／分）を行った（２試行での運動プログラム（負荷運動量）は被験者内で同一である）。運動直前（安静時）、及び運動直後に指先穿刺採血を行い、血中アンモニア濃度を血中アンモニア測定装置：ポケットケム（商標）ＢＡＰＡ－４１４０（アークレイ株式会社）にて測定した。

３）介入の有効性判定（安静時アンモニア代謝促進）
２試行において、計２回の運動負荷試験での運動直前（安静時）の血中アンモニア濃度が正常に測定できた９名にて解析を行った。プラセボ試行の運動負荷試験、運動直前（安静時）の血中アンモニア濃度に対し、カテキン類及びオルニチン試行のそれが１０Ｎ－ｕｇ／ｄＬ（窒素量として）以上低下した４名を安静時有効群とし、これ以外の５名を安静時無効群とした。

４）介入の有効性判定（運動時アンモニア代謝促進）
２試行において、計２回の運動負荷試験での運動直後の血中アンモニア濃度が正常に測定できた１２名にて解析を行った。プラセボ試行の運動負荷試験、運動直後の血中アンモニア濃度に対し、カテキン類及びオルニチン試行のそれが１０Ｎ－ｕｇ／ｄＬ（窒素量として）以上低下した５名を運動時有効群とし、これ以外の７名を運動時無効群とした。

５）ＳＳＬ採取
介入に前もって行った運動強度を決定するための事前運動試験の運動前安静時に、各被験者の全顔からあぶら取りフィルム（５×８ｃｍ、ポリプロピレン製、３Ｍ社）を用いてＳＳＬを回収後、該あぶら取りフィルムをバイアルに移し、ＲＮＡ抽出に使用するまで－８０℃にて保存した。

６）ＲＮＡ調製及びシーケンシング
上記５）のあぶら取りフィルムを適当な大きさに切断し、ＱＩＡｚｏｌＬｙｓｉｓＲｅａｇｅｎｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、付属のプロトコルに準じてＲＮＡを抽出した。抽出されたＲＮＡを元に、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＶＩＬＯｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓｋｉｔ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を用いて４２℃、９０分間逆転写を行いｃＤＮＡの合成を行った。逆転写反応のプライマーには、キットに付属しているランダムプライマーを使用した。得られたｃＤＮＡから、マルチプレックスＰＣＲにより２０８０２遺伝子に由来するＤＮＡを含むライブラリーを調製した。マルチプレックスＰＣＲは、ＩｏｎＡｍｐｌｉＳｅｑＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅＨｕｍａｎＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＫｉｔ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を用いて、［９９℃、２分→（９９℃、１５秒→６２℃、１６分）×２０サイクル→４℃、Ｈｏｌｄ］の条件で行った。得られたＰＣＲ産物は、ＡｍｐｕｒｅＸＰ（ベックマン・コールター株式会社）で精製した後に、バッファーの再構成、プライマー配列の消化、アダプターライゲーションと精製、増幅を行い、ライブラリーを調製した。調製したライブラリーをＩｏｎ５４０Ｃｈｉｐにローディングし、ＩｏｎＳ５／ＸＬシステム（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を用いてシーケンシングした。シーケンシングで得られた各リード配列をヒトゲノムのリファレンス配列であるｈｇ１９ＡｍｐｌｉＳｅｑＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅＥＲＣＣｖ１を用いて遺伝子マッピングすることで各リード配列の由来する遺伝子を決定した。

７）データ解析
得られた各被験者のＳＳＬ由来ＲＮＡの発現量データ（リードカウント値）において、ＤＥＳｅｑ２法を用いて補正した。但し、全被験者の発現量データのうち９０％以上の被験者で欠損値ではない発現量データが得られている遺伝子のみ以下の解析に使用した。解析には、ＤＥＳｅｑ２法を用いて補正されたカウント値（Ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄｃｏｕｎｔ値）を用いた。

８）ＲＮＡ発現解析
安静時アンモニア代謝促進有効性判定では取得された各被験者（９名）のＳＳＬ由来のＲＮＡ発現量（Ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄｃｏｕｎｔ値）を基に、安静時無効群及び安静時有効群間のＦＤＲ (ＦＤＲｄｉｓｃｏｖｅｒｙｒａｔｅ)を制御した(ＦＤＲ <０．２５)、調整済みｐ値（閾値 <０．０５）を元に発現差異遺伝子を抽出した。また、運動時アンモニア代謝促進有効性判定でも同様に、運動時無効群及び運動時有効群間のＦＤＲ (ＦＤＲｄｉｓｃｏｖｅｒｙｒａｔｅ)を制御した(ＦＤＲ <０．２５)、調整済みｐ値（閾値 <０．０５）を元に発現差異遺伝子を抽出した。

９）結果（安静時アンモニア代謝促進有効性）
安静時無効群に対し、安静時有効群で以下の遺伝子発現が有意に高かった。ＰＴＥＮ，ＡＷＡＴ１，ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ４，ＡＣＡＴ１，ＧＤＥ１，ＭＩＮＡ，ＮＥＮＦ，ＤＧＡＴ２Ｌ６，ＤＨＣＲ２４，ＤＤＨＤ１，Ｃ１４ｏｒｆ１６２，ＦＡＤＳ１，ＴＭＥＭ５６，ＥＬＯＶＬ３，ＡＲＬ５Ａ，ＧＬＴＰＤ１，ＭＳＲＢ１，ＴＴＣ３９Ｃ，ＡＣＯＴ２，ＳＰＴＬＣ３，ＶＷＡ１，ＳＰＲＲ３，ＲＯＲＣ，ＣＡＣＮＢ３，ＴＣＥＢ３，ＬＯＣ７３０１０２。

安静時無効群に対し、安静時有効群で以下の遺伝子発現が有意に低かった。
ＩＤＯ１，ＣＣＬ２２，ＣＣＲ７，ＲＧＳ１，ＳＤＣ２，ＳＬＣ９Ａ７，ＺＮＦ３３０，ＡＮＸＡ４，ＭＫＬ１，ＺＣ３Ｈ１２Ｃ，ＩＳＧ１５，ＵＣＰ２，ＣＸＣＬ１６，ＳＬＦＮ５，ＦＴＳＪ３，ＢＩＲＣ３，ＤＮＰＥＰ，ＬＡＭＰ３，ＥＭＩＬＩＮ２，ＰＲＭＴ１，ＩＦＩ６，ＫＣＮＮ４，ＡＴＰ１Ａ１，ＴＩＡ１，ＦＣＧＢＰ，ＨＬＡ－ＤＱＢ２，ＳＮＡＰＩＮ，ＳＹＮＧＲ２，ＤＥＦＢ４Ａ，ＣＴＳＺ，ＣＣＲＬ２，ＣＲＩＰ１，ＤＤＸ３９Ａ，ＥＭＰ３，ＩＦＩ３０，ＫＣＴＤ４，ＬＧＡＬＳ１，ＬＩＰＡ，ＭＹＯ９Ｂ，ＳＥＰＴＩＮ９，ＰＤＸＤＣ２Ｐ，ＳＥＭＡ６Ｂ，ＡＬＣＡＭ，ＣＤ８３，ＯＴＵＤ１，ＰＥＰＤ，ＣＤ９９，ＮＲ４Ａ３，ＰＩ３，ＴＩＭＰ１，ＲＦＴＮ１，ＲＨＯＣ，ＧＮＧ５，ＩＬ３２，ＲＧＳ１０，ＴＳＰＡＮ３，ＳＮＯＲＡ８４，ＡＴＰ９Ｂ，ＤＳＧ２，ＭＣＭ３ＡＰ，ＹＷＨＡＨ，ＩＮＨＢＡ，ＣＵＸ１，ＦＢＸＬ３，ＲＮＦ５，ＴＰＰ１，ＣＤ１Ａ，ＬＯＣ１００１３２２４７，ＳＨ３ＲＦ２，ＺＮＦ７８０Ａ，ＨＬＡ－ＤＲＡ，ＲＵＮＸ３，ＮＵＢ１，ＣＤ８１，ＣＡＰＧ，ＤＡＲＳ，ＬＩＬＲＢ４，ＳＥＲＰＩＮＢ４。

１０）結果（運動時アンモニア代謝促進有効性）
運動時無効群に対し、運動時有効群で以下の遺伝子発現が有意に低かった。
ＨＬＡ－ＤＱＢ２，ＲＡＭＰ１，ＲＧＳ１，ＨＵＷＥ１，ＩＳＧ１５，ＣＣＬ２２，ＬＡＭＰ３，ＣＤ４０，ＬＯＣ６４５６３８，ＮＲ４Ａ３，ＯＴＵＤ１，ＰＲＭＴ１，ＲＲＡＧＣ，ＳＩＫ３，ＳＹＮＧＲ２，ＴＳＣ２２Ｄ３，ＩＬ３２，ＰＡＤＩ２，ＺＣ３Ｈ１２Ｃ，ＡＮＯ６，ＢＩＲＣ３，ＣＤ１Ａ，ＦＣＧＢＰ，ＧＡＤＤ４５Ｂ，ＧＰＲ１８３，ＨＳＰＤ１，ＳＴＸ１１，ＳＷＡＰ７０，ＡＴＰ６Ｖ０Ｅ１，ＣＸＣＬ１６，ＳＰＣＳ１，ＳＴＡＴ５Ａ，ＲＲＢＰ１，ＡＲＨＧＡＰ２５，ＲＭＲＰ，ＦＭＮＬ３，ＧＲＡＭＤ１Ａ，ＨＣＬＳ１，ＬＩＰＡ，ＭＡＮ２Ａ２，ＲＰＬ１３，ＫＥＡＰ１，ＨＳＰＡ１Ａ，ＩＬＫ，ＡＣＴＢ，ＣＣＲ７，ＤＡＲＳ，ＤＵＳＰ４，ＧＬＩＰＲ２，ＭＹＯ９Ｂ，ＰＥＰＤ，ＳＴＡＴ６，ＵＢＡＰ２Ｌ，ＺＭＩＺ１，ＷＢＰ２，ＭＡＤ２Ｌ２，ＣＹＢ５Ｂ，ＳＹＮＣＲＩＰ，ＳＰＴＢＮ１，ＫＩＡＡ０２２６，ＡＬＣＡＭ，ＣＹＬＤ，ＤＤＸ３Ｘ，ＦＴＨ１，ＩＤＨ３Ｇ，ＰＦＤＮ５，ＲＡＳＡ４，ＺＳＷＩＭ６，ＡＣＴＮ４，ＡＧＰＡＴ６，ＡＬＹＲＥＦ，ＢＡＳＰ１，ＣＤ８１，ＥＭＰ３，ＦＭＮＬ１，ＧＲＡＳＰ，ＰＡＲＫ７，ＰＩ３，ＰＩＫ３Ｒ５，ＳＥＰＴＩＮ９，ＵＸＴ，ＦＡＭ４９Ａ，ＧＡＰＤＨ，ＰＤＣＤ１０，ＲＰＳ２，ＳＣＡＲＦ１，ＵＢＥ２Ｇ２。

Claims

被験者から採取された試料について、下記表１－１及び表１－２に示す１０４種の遺伝子群より選択される少なくとも１つの遺伝子又はその発現産物の発現レベルを測定する工程を含む、当該被験者に対するカテキン類及びオルニチンの併用投与による安静時アンモニア代謝促進効果の有効性の検出方法。
安静時アンモニア代謝促進効果が、日常生活における身体活動による疲労の軽減効果である、請求項１記載の方法。
被験者から採取された試料について、下記表２に示す８７種の遺伝子群より選択される少なくとも１つの遺伝子又はその発現産物の発現レベルを測定する工程を含む、当該被験者に対するカテキン類及びオルニチンの併用投与による運動時アンモニア代謝促進効果の有効性の検出方法。
運動時アンモニア代謝促進効果が、筋肉労作を伴う労働における持続性向上若しくは疲労軽減効果、又は運動の際の持久力若しくは筋持久力の向上効果である、請求項３記載の方法。
発現レベルの測定値を前記各遺伝子又はその発現産物の参照値と比較し、当該被験者がカテキン類及びオルニチンの併用投与による安静時又は運動時アンモニア代謝促進効果が有効に作用する者であるか否かを評価する、請求項１～４のいずれか１項記載の方法。
遺伝子又はその発現産物の発現レベルが皮膚表上脂質から採取されたｍＲＮＡの発現量の測定である、請求項１～５のいずれか１項記載の方法。
前記カテキン類が緑茶抽出物の濃縮物又は精製物を含有する飲料である、請求項１～６のいずれか１項記載の方法。
試料の採取及び保存に必要な用具及び試薬、並びに試料から前記遺伝子又はその発現産物の発現レベルを測定するための試薬を含有する、請求項１～７のいずれか１項記載の方法に用いられるカテキン類及びオルニチンの併用投与による安静時又は運動時アンモニア代謝促進効果の有効性検出用キット。
下記表１－１及び表１－２に示す１０４種の遺伝子群より選択される少なくとも１つの遺伝子又はその発現産物からなる、被験者に対するカテキン類及びオルニチンの併用投与による安静時アンモニア代謝促進効果の有効性検出マーカー。
下記表２に示す８７種の遺伝子群より選択される少なくとも１つの遺伝子又はその発現産物からなる、被験者に対するカテキン類及びオルニチンの併用投与による運動時アンモニア代謝促進効果の有効性検出マーカー。