CN1552875A - 瘢痕疙瘩与增生性瘢痕差异表达基因文库及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了瘢痕疙瘩与增生性瘢痕差异表达基因文库及其构建方法。瘢痕疙瘩与增生性瘢痕差异表达基因文库，由序列表中的SEQ ID№：1－39组成；其中SEQ ID№.1－15是在增生性瘢痕组织中表达高于瘢痕疙瘩的基因，SEQ ID№.16－39是在瘢痕疙瘩组织中表达高于增生性瘢痕的基因。本发明从基因表达水平探讨了增生性瘢痕与瘢痕疙瘩的区别，对从基因表达调控方面认识瘢痕疙瘩的发病机理有着重大意义，揭示了中国人瘢痕易感性的基因学基础；为将来从基因表达上鉴别诊断瘢痕疙瘩与增生性瘢痕以及研究开发促进创伤正常愈合、治疗瘢痕疙瘩和增生性瘢痕及其他组织、器官纤维组织异常增生性疾病的相关药物提供了理论基础。

Description

瘢痕疙瘩与增生性瘢痕差异表达基因文库及其构建方法

技术领域

本发明涉及生物工程领域中的差异表达基因文库及其构建方法，特别是涉及瘢痕疙瘩与增生性瘢痕差异表达基因文库及其构建方法。

背景技术

早在13世纪就出现了关于瘢痕疙瘩(keloid，简称K)和增生性瘢痕(hypertrophic scar，HS)的记载，但是长期以来人们常将这两个疾病混为一谈。原因是它们都具有成纤维细胞增殖旺盛并分泌大量细胞外基质的特征，尤其是以胶原的合成与沉积最为显著。然而，它们的生物学性状和临床特征虽有许多相似之处，但的确差别较大(Muir I F.On the nature of keloid and hypertrophic scars.BrJ Plast Surg，1990，43：61)。现在多数人认为增生性瘢痕和瘢痕疙瘩是异常伤口愈合过程的两种不同形式。增生性瘢痕的病变局限于损伤范围，它的发生主要受创伤影响，与创伤深度、张力、应力、感染等有关，没有资料表明增生性瘢痕存在部位易感性，亦无家族遗传性。瘢痕疙瘩是一种特殊的增生性瘢痕，它具有某些肿瘤特性，它的病变超出原发范围，侵蚀周围正常皮肤形成新的瘢痕，瘢痕不断蔓延、扩大和融合。除白化病病人不发生外，它可见于任何种族。瘢痕疙瘩存在一定的好发部位，如前胸、肩膀、耳垂、上肢易发，而眼睑、生殖器、掌跖、粘膜及脐带则罕见。瘢痕疙瘩发病具有种族性及家族性特点，并有报道瘢痕疙瘩与某些特殊疾病伴发(Hendrix-JD Jr.Greer-KE Rubinstein-Taybi syndrome with multiple flamboyant keloids.Cutis.1996 May；57(5)：346-8.D’Souza P，Iyer VK，Ramam M.Familial acne keloidalis.Acta Derm Venereol 1998 Sep；78(5)：382.)，表明瘢痕疙瘩存在一定的遗传倾向。有文献认为深肤色人种的发病率是浅肤色人种的15倍(Alhady S M.，Sivanantharajah K.Keloid in various races：A review of 175 cases.Plast ReconstrSurg，1969，44：564)。黑人、西班牙人、亚洲人发病率较高(Ketchum L D.Hypertrophicscars and keloids.Clin Plast Surg，1977，4：301)。北京大学第三医院成形外科瘢痕门诊资料分析表明，在3000例瘢痕患者中瘢痕疙瘩占23.6％(鲍卫汉，陈东明，赵惠勇，等.3000例瘢痕门诊患者资料分析.中华医学美容杂志，2000，9：146-147)，其中，有家族遗传倾向者约占25％(鲍卫汉主编.实用瘢痕学.北京医科大学出版社，北京，2000)。有报道认为瘢痕疙瘩的发生可能与常染色体隐性或显性遗传有关(ElliotD，Cory-Pearce R，and Rees G M.The behaviour of presternal scars in afair-skinned population.Ann R Coll Surg Engl，1985，67：238；LeFlore I，andAntoine G A.Keloid formation on palmar surgace of hand.J Natl MedAssoc，1991，83：463；Omo-Sare P.Genestudies on keloid.J Natl MedAssoc，1975，67：428)。LeFlore和Berman认为瘢痕疙瘩的发生与A型血型有关(LeFlore I，and Antoine G A.Keloid formation on palmar surgace of hand.JNatl Med Assoc，1991，83：463；Berman B，and Bieley H C.Keloids.J Am AcadDermatol，1995，33：117)。Castagnoli等发现瘢痕疙瘩的发生与HLA-B14、B11、BW16、BW35、DR5、DQW3抗原有相关性(Castagnoli C，Peruccio D，Stella M.，et al.TheHLA class IImolecules on keratinocytes and fibroblasts in hypertrophic scarsconsequent to thermal injury.Clin Exp Immunol，1990，82：350；Castagnoli G，Peruccio D，Stella M，et al.The HLA-DR beta 16 allogeneotype constitutes arisk factor for hypertrophic scarring.Hum Immunol，1990，29：229)，然而Cohen则认为其间没有联系(Cohen I K，McCoy B J，Mohanakumar T，and Diegelmann R F.Immunoglobulin，complement，and histocompatibility antigen studies in keloidpatients.Plast Teconstr Surg，1979，63：689)。另外，瘢痕疙瘩的形成与免疫因素有关。与增生性瘢痕病人相比，瘢痕疙瘩患者的过敏反应发生率较高，种族、年龄、性别与瘢痕疙瘩的发生有关，而这些因素又与血浆IgE有联系，从而Smith推测IgE的水平与瘢痕增生相关(Smith G J，Smith J C，and Finn M C.The possible roleof mast cells(allergy)in the production of keloid and hypertrophic scarring.J Burn Care Rehabil，1987，8：126)。

目前，已有学者从细胞增殖调控原理推测检查一些基因，陆续在瘢痕疙瘩等病理性瘢痕中发现了一些基因的异常。Saed GM等人首先报道了7例病人中的瘢痕疙瘩组织及培养的瘢痕疙瘩成纤维细胞均存在p53的突变；所有病人的正常组织和培养的正常皮肤成纤维细胞中没有检测到p53的突变(Saed GM，Ladin D，Olson J，Han X，HouZ，Fivenson D.Analysis of p53 gene mutations in keloids using polymerase chainreaction-based single-strand conformational polymorphism and DNA sequencing.Arch Dermatol，Aug 1998，134(8)：963-7)。Bcl-2基因编码一种防止细胞凋亡的蛋白，而p53蛋白则为细胞增生的负性调节子。这两个细胞凋亡调节基因在组织的动态平衡调节中起重要作用。c-jun和c-fos作为一种转化活性因子亦参与调节成纤维细胞的增生。Teofoli等人用免疫组化的方法研究了3例临床活动期的瘢痕疙瘩和增生性瘢痕，2例静止期的瘢痕疙瘩及2例早期局限性硬皮病的病人的Bcl-2及p53的表达情况，结果表明，在成纤维样细胞和血管周梭样细胞中Bcl-2，c-jun及c-fos基因的表达及p53蛋白的缺乏与成纤维细胞的增生相关(Teofoli P，Barduagni S，Ribuffo M，et al.Expression of Bcl-2，p53，c-jun and c-fos protooncogenes in keloids andhypertrophic scars.J Dermatol Sci，Dec 1999，22(1)：31-7)。近来发现凋亡参与了肉芽组织转化为最终瘢痕的过程。Messadi DV等人利用Annexin-V-FIT结合分析研究结果表明，培养的正常皮肤成纤维细胞中的凋亡细胞比瘢痕疙瘩成纤维细胞中的凋亡细胞高两倍。与正常皮肤成纤维细胞相比，瘢痕疙瘩成纤维细胞对凋亡相关基因的表达减少(Messadi DV，Le A，Berg S，Jewett A，et al.Expression of apoptosis-associated genes by human dermal scar fibroblasts.Wound Repair Regen，Nov-Dec 1999，7(6)：511)。Sayah DN等人亦发现64个凋亡相关基因中有8个基因在瘢痕疙瘩组织中明显受抑(Sayah DN，Soo C，Shaw WW.Downregulation of apoptosis-related genes in keloid tissues.J Surg Res Dec 1999，87(2)：209-16)。

人们从机理推测或借鉴其他疾病研究结果去研究已经发现了诸如上述的一些基因或因子有改变，但是尚不能说明这些变化在增生性瘢痕、瘢痕疙瘩发病机理中是否起着重要作用。创伤愈合涉及的已知基因已有一些，然而还有很多未知数。其它未测基因是否变化更大，其作用孰重孰轻呢？目前已发现约四万条基因及片断，既使采用基因芯片亦不可能逐一检测，基因芯片仅能检测已知基因，主要对于“全或无”的变化结果明确，其特异性、敏感性尚有不足。怎样才能从这些众多的基因中排查到导致瘢痕过度增生的关键基因——瘢痕相关基因呢？瘢痕疙瘩的关键异常基因——瘢痕疙瘩易感基因显然是瘢痕疙瘩的重要致病因素(尤其是对于有家族史的患者而言)。发明人以为瘢痕疙瘩易感基因中的一些基因可能也是导致普通增生性瘢痕的关键基因。有家族史的瘢痕疙瘩患者的异常基因活动可能源于先天遗传，而正常体质人的普通增生性瘢痕的基因异常则是由于严重创伤激发的基因异常表达。因此，发明人试图从搜寻瘢痕疙瘩易感基因着手探索瘢痕相关基因，考虑采用特定技术方法，将创伤愈合瘢痕形成有关基因均处于激活状态的有家族史的瘢痕疙瘩与普通增生性瘢痕进行对比，忽略两者共同的皮肤正常愈合所有的基因变化，捕捉两者表达明显不同的差异基因，进而筛选获得瘢痕疙瘩易感基因和瘢痕相关基因。

发明内容

本发明的目的是通过寻找瘢痕疙瘩易感基因，以求发现影响瘢痕过度增生的关键基因——瘢痕相关基因。提供一个瘢痕疙瘩与增生性瘢痕的差异表达基因文库及其构建方法。

为了达到上述目的，本发明采用消减杂交法，去除增生性瘢痕与瘢痕疙瘩两种组织表达相同和差异小的基因，获得差别大的差异表达基因，构建了基因文库。

瘢痕疙瘩与增生性瘢痕差异表达基因文库，由序列表中的SEQ ID №：1-39组成；其中SEQ ID №.1-15是在增生性瘢痕组织中表达高于瘢痕疙瘩的基因，SEQ ID№.16-39是在瘢痕疙瘩组织中表达高于增生性瘢痕的基因。

瘢痕疙瘩与增生性瘢痕差异表达基因文库的构建方法，包括以下步骤：

1)提取瘢痕疙瘩与增生性瘢痕组织的mRNA；

2)消减杂交，得到瘢痕疙瘩与增生性瘢痕组织候选差异表达基因；

3)扩增后的候选差异表达基因连接载体后转化到表达菌株中，经蓝白斑筛选出阳性克隆，得到消减文库；

4)消减文库的菌落回复杂交筛选，进行细菌斑点杂交，得到含有在瘢痕疙瘩组织中表达高而在增生性瘢痕组织中表达低的基因的转化菌落及含有在瘢痕疙瘩组织中表达低而在增生性瘢痕组织中表达高的基因的转化菌落；

5)将阳性菌落提取质粒DNA进行Southern杂交，确认阳性克隆；

6)测序得到瘢痕疙瘩与增生性瘢痕差异表达基因文库。

上述方法中，所述瘢痕疙瘩与增生性瘢痕组织的mRNA来自特征性瘢痕疙瘩(有家族史者)与增生性瘢痕组织的总RNA。

所述消减杂交包括以下步骤：

1)合成双链cDNA；

2)限制性内切酶进行消化；

3)连接接头；

4)第一次杂交；

5)第二次杂交。

本发明建立了瘢痕疙瘩与增生性瘢痕的差异表达基因文库，进而从该文库中可以筛选获得瘢痕疙瘩易感基因和瘢痕相关基因。本发明从分子生物学角度、基因表达水平探讨了增生性瘢痕与瘢痕疙瘩的区别，对从基因表达调控方面认识瘢痕疙瘩的发病机理有着重大意义；为瘢痕疙瘩与增生性瘢痕的临床鉴别提供了一定的理论依据，为将来从基因表达上鉴别诊断此两种疾病提供了工作基础；为将来研究开发促进创伤正常愈合、治疗瘢痕疙瘩、增生性瘢痕及其他组织、器官纤维组织异常增生性疾病的相关药物奠定了一定的理论基础。本发明从基因表达水平揭示了中国人瘢痕易感性的基因学基础，不仅对创伤愈合和瘢痕发病机理方面，而且对人类基因功能学方面也存在着重要意义。

附图说明

图1为RNA变性胶电泳结果。

图2为巢式PCR产物电泳分析。

图3为用未消减之K和HS的cDNA标记探针进行的菌落滤膜杂交结果。

图4为用消减之K和HS的cDNA标记探针进行的菌落滤膜杂交结果。

图5为消减文库的酶切质粒片断电泳图。

图6-图8为Southern杂交图谱。

具体实施方式

实施例1、瘢痕疙瘩与增生性瘢痕差异表达基因文库的构建

一、标本来源及保存

瘢痕疙瘩与增生性瘢痕标本来自成形外科门诊及病房手术病人的病变组织。所有标本先由液氮冻存，再转移至-80℃冰柜冻存。

二、瘢痕疙瘩与增生性瘢痕总RNA及mRNA的提取

1、用Trizol RNA提取试剂盒(GIBICO，美国)提取总RNA。总RNA提取后进行甲醛变性胶电泳分析，结果如图1所示，28S与18S RNA之比大于1.5，说明RNA分子完整性好。

2、用mRNA提取试剂盒(Promega，美国)提取mRNA。

三、消减杂交

参照Clontech公司消减杂交试剂盒实验流程进行实验。

1、双链cDNA的合成

1)第一链的合成：用消减杂交试剂盒(Clontech公司，美国)所提供cDNA合成引物(5’-TTTTGTACAAGCTT30N1N-3)1μl(10μM)，PolyA⁺RNA 2μg，加水补至5μl，混匀，70℃孵育2分钟，0℃ 2分钟，再加入5×第一链缓冲液(CLONTECH公司的消减杂交试剂盒提供)2μl，dNTP 1μl(每种10mM)，纯净水1μl，AMV反转录酶1μl(20u/μl)，42℃孵育1.5小时后，将管置冰上；

2)往管中加入水48.4μl，第二链缓冲液(CLONTECH公司的消减杂交试剂盒提供)16μl，dNTP 1.6μl(每种10mM)，20×第二链酶鸡尾酒(CLONTECH公司的消减杂交试剂盒提供)4μl，16℃孵育2小时，加入2μl(6u)T4 DNA聚合酶，混匀，16℃孵育30分钟，加4μl 20×EDTA/glycogen混合物中止第二链合成。采用苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提法按常规纯化后溶于50μl纯净水。

2、用Rsa I酶切双链cDNA。反应管中加入上述得到的双链cDNA 43.5μl，10×Rsa I限制性内切酶缓冲液5.0μl，Rsa I限制性内切酶(10μ/μl)1.5μl，混匀，37℃孵育1.5小时。

3、连接接头。将酶切消化产物经苯酚∶氯仿∶异戊醇抽提法纯化后溶于5.5μl水中。以5μl水稀释1μl酶切纯化产物。按实验流程把酶切纯化产物与Adaptor1和Adaptor2连接(Adaptor1序列：5’-CTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3’；Adaptor2R的序列：5’-CTAATACGACTCACTATAGGGCAGCGTGGTCGCGGCCGAGGT-3’)，检测连接效率。

4、消减杂交，用消减杂交试剂盒(Clontech公司，美国)进行消减杂交反应。

设置正向消减和反向消减实验。正向消减反应以增生性瘢痕cDNA为driver cDNA，瘢痕疙瘩与接头连接的酶切产物为tester。反向消减反应以瘢痕疙瘩cDNA为drivercDNA，增生性瘢痕与接头连接的酶切产物为tester。

1)第一次杂交，反应管中加入Rsa I消化的driver cDNA 1.5μl，与Adaptor1连接的酶切产物1.5μl及4×杂交缓冲液1μl，98℃孵育1.5分钟，68℃孵育8小时，得到杂交样品1；反应管中加入Rsa I消化的driver cDNA 1.5μl，与Adaptor2连接的酶切产物1.5μl及4×杂交缓冲液1μl，98℃孵育1.5分钟，68℃孵育8小时，得到杂交样品2。

2)第二次杂交，管中加入driver cDNA 1μl，4×杂交缓冲液1μl及纯净水2μl，98℃孵育1.5分钟，同时与杂交样品1、2混合，68℃孵育过夜，得到瘢痕疙瘩与增生性瘢痕组织候选差异表达基因，-20℃保存。

四、抑制性PCR及PCR产物的克隆

采用两轮巢式PCR反应富集差异表达基因片段。第一轮PCR反应体系：1μl稀释的cDNA，10×PCR缓冲液2.5μl，dNTP(每种10mM)0.5μl，10μM的PCR引物1(PCR引物1：5’-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3’)1μl，50×Advantage高效cDNA聚合酶0.5μl。第一轮PCR反应条件：75℃ 5分钟，94℃ 25秒；94℃ 10秒，66℃ 30秒，72℃ 1.5分钟，27个循环。第二轮PCR反应体系：稀释物1μl(3μl第一次PCR产物+27μl水)，10×PCR缓冲液2.5μl，10μM的巢式PCR引物11μl，10μM的巢式PCR引物2R1μl(巢式PCR引物1序列：5’-TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3’；巢式PCR引物2R序列：5’-AGCGTGGTCGCGGCCGAGGT-3’)，dNTP(每种10mM)0.5μl，50×Advantage高效cDNA聚合酶0.5μl。第二轮PCR反应条件：94℃ 10秒，68℃30秒，72℃ 1.5分钟，10-12个循环。取8μl第一轮及第二轮PCR产物，经变性胶电泳，分析。

第两轮PCR产物如图2所示。泳道1：K-Hs(正向消减)第二轮PCR产物，即瘢痕疙瘩比增生性瘢痕组织表达增多的基因片断；2：Hs-K(反向消减)第二轮PCR产物，即瘢痕疙瘩比增生性瘢痕组织表达减少的基因片断；3：骨骼肌对照第二轮PCR产物，M：φX174/HeaIII Markers。可见1、2泳道内均有多条瘢痕疙瘩与增生性瘢痕组织差异表达的基因片断。

应用Qiaquick PCR Purification Kit(QIAGEN公司，德国)将PCR产物纯化后，按《分子克隆》相关方法将其连接于pGEM-T Easy载体(Promega，美国)，再导入到JM109菌中，转化为瘢痕疙瘩与增生性瘢痕组织差异表达基因的细菌克隆。K-Hs(正向消减，即瘢痕疙瘩比增生性瘢痕组织表达增多的基因片断)转化克隆和Hs-K(反向消减，即瘢痕疙瘩比增生性瘢痕组织表达减少的基因片断)转化克隆经蓝白斑筛选阳性克隆；得到K-Hs(正向消减表达基因)和Hs-K(反向消减表达基因)瘢痕疙瘩与增生性瘢痕组织的两个消减基因文库。

五、回复杂交筛选转化克隆

1、将阳性克隆菌液点在两张相同的尼龙膜上，用罗氏公司所产地高辛标记试剂分别标记未消减的增生性瘢痕(H)与瘢痕疙瘩组织(K)的cDNA或者消减的增生性瘢痕与瘢痕疙瘩组织的cDNA，用此未消减的K-探针及H-探针(或者消减的K-探针及H-探针)分别与两张膜杂交。筛选得到阻性克隆。菌落杂交筛选结果如图3、图4所示，由于膜的数量较大，这里仅提供有代表性的两张，其它的与此类似。

2、阳性克隆目的基因片断插入效率的验证

将菌斑杂交选择出的阳性克隆扩增后提取质粒，用EcoR I酶切后行凝胶电泳。结果如图5所示，M1：φX174/HeaIII Markers，M2：λDNA/EcoR I+HindIII Markers，道1：未酶切之对照质粒，2-14：酶切质粒片断。图中显示，质粒插入片断在凝胶上迁移位置不同，表明有大小不同片断插入质粒，消减文库建立成功。

3、Southern杂交确认阳性克隆

将菌斑杂交选择出的克隆的质粒酶切基因片断转移到尼龙膜上，用未消减的增生性瘢痕(H)与瘢痕疙瘩组织(K)的cDNA标记探针分别与之杂交。结果如图6、图7、图8所示，由于数量较大，这里提供的是有代表性的部分照片。图6、图7中箭头所示为差异表达片断之克隆，图8中上方的三角所指为酶切片段与H cDNA探针杂交的结果，下方的三角所指为酶切片段与K cDNA探针杂交的结果，可见下方条带较上方条带颜色深，为阳性结果。瘢痕疙瘩与增生性瘢痕组织表达的基因量明显不同。Hs-K文库筛选出15个克隆。K-Hs文库筛选出24个克隆；两文库合计39个克隆。

六、基因测序

将K-Hs文库和Hs-K文库所筛选到的39个克隆进行基因序列分析，SEQ ID №.1-15是在增生性瘢痕组织中表达高于瘢痕疙瘩的Hs-K文库基因。SEQ ID №.16-39是在瘢痕疙瘩中表达高于增生性瘢痕组织的K-Hs文库基因。

                                  序列表

<160>39

<210>1

<211>304

<212>DNA

<213>人属人(Homo sapiens)

<400>1

accaagattg tttctttgtt tctttttttc aaattgtgtt tagaaatact gtaataaata     60

tgcagtagtg atataaagaa ttatatccaa ggtaatataa aagccattac gtatgaactc    120

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ctttcatttc aatcaataaa aagcttttat aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaagctt    300

gtac                                                                 304

<210>2

<211>373

<212>DNA

<213>人属人(Homo sapiens)

<400>2

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ctgagaagct ctc                                                       373

<210>3

<211>301

<212>DNA

<213>人属人((Homo sapiens)

<400>3

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c                                                                    301

<210>4

<211>203

<212>DNA

<213>人属人((Homo sapiens)

<400>4

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agttgggtgg ttggtgtaaa tga                                            203

<210>5

<211>378

<212>DNA

<213>人属人(Homo sapiens)

<400>5

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<210>6

<211>530

<212>DNA

<213>人属人(Homo sapiens)

<400>6

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gagtccgaac tagtctcagg cttcaacatc gaatacgccg caggcccctt cgccctattc    420

ttcatagccg aatacacaaa cattattata ataaacaccc tcaccactac aatcttccta    480

ggaagattgt agtggtgagg gtgtttatta taataatgtt tgtgtattcg               530

<210>7

<211>703

<212>DNA

<213>人属人(Homo sapiens)

<400>7

gtcttggcta tgatcctttc cttctacacc cttttggttt tagagagcag actaacccag     60

ctcttcatac tttctgcagg ggacaggcaa atggtatgaa ttacaagacc tccaggtgac    120

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agataatgat gaaaccaacc agcagggagc ttgaaggagg cgtctagggc tttgctccca    240

agggctgtgg ctgatgatgg taaataagaa cacagaagct gtagctgaac acaggctggc    300

tggtgggctt cctaggccag cccagcttgt atgggttctg gctacaccag agcaccaaga    360

gcccacttgc ctgggatggc cccacactgt cactcagctg ttctttgatc atttttttct    420

agattgatgc tcctttctcc catgcattga gctcccatct agcttcagca gggcagaacc    480

cttctccaga tgtgtgtaac ttatgtctga gtatctggga gtagttgaag aacagataat    540

tccttccaaa catcaagcct tgggattctt ggaacaagca gaaagccagt aacttcgctc    600

tgttagaggt ggaggatttt cctatggttc cccccatttc ctgatttgta tttttagatg    660

gattaaatag tctcctgttt ttaaaaaaaa aaaagaaaaa aaa                      703

<210>8

<211>297

<212>DNA

<213>人属人(Homo sapiens)

<400>8

actctgaggc ttgtaggagg gtaaaataga gacccagtaa aattgtaata agcagtgctt     60

gaattatttg gtttcggttg ttttctatta gactatggtg agctcaggtg attgatactc    120

ctgatgcgag taatacggat gtgtttagga gtgggacttc taggggattt agcggggtga    180

tgcctgttgg gggccagtgc cctcctaatt ggggggtagg ggctaggctg gagtggtaaa    240

aggctcagaa aaatcctgcg aagaaaaaaa cttctgaggt aataaatagg attatcc       297

<210>9

<211>414

<212>DNA

<213>人属人(Homo sapiens)

<400>9

acattccaca agcattgcct tcttatttta cttcttttag ctgtttaact ttgtaagatg     60

caaagaggtt ggatcaagtt taaatgactg tgctgcccct ttcacatcaa agaactactg    120

acaacgaagg ccgcgcctgc ctttcccatc tgtctatcta tctggctggc agggaaggaa    180

agaacttgca tgttggtgaa ggaagaagtg gggtggaaga agtggggtgg gacgacagtg    240

aaatctagag taaaaccaag ctggcccaag gtgtcctgca ggctgtaatg cagtttaatc    300

agagtgccat tttttttttg ttcaaatgat tttaattatt ggaatgcaca atttttttaa    360

tatgcaaata aaaagtttaa aaacttaaaa aaaagaaaaa aaaaaaaaaa aaaa          414

<210>10

<211>260

<212>DNA

<213>人属人(Homo sapiens)

<400>10

cagagcccca attcctactt catggatgtg aaatgcccag gatgctataa aatcaccacg     60

gtctttagcc atgcacaaac ggtagttttg tgtgttggct gccccactgt cctctgccag    120

cctacaggag gaaaagcaag gcttacagaa ggatgttcct tcaggaggaa gcagcactaa    180

aagcactctg agtcaagatg agtgggaaac catctcaata aacacatttt ggcaaaaaaa    240

aaaaaaaaaa aaaaaaaagc                                                260

<210>11

<211>411

<212>DNA

<213>人属人(Homo sapiens)

<400>11

acggccaggg ctattggttg aatgagtagg ctgatggttt cgataataac tagtatgggg     60

ataaggggtg taggtgtgcc ttgtggtaag aagtgggcta gggcattttt aatcttagag    120

cgaaagccta taatcactgc gcccgctcat aaggggatgg ccatggctag gtttatagat    180

agttgggtgg ttggtgtaaa tgagtgaggc aggagtccga ggaggttagt tgtggcaata    240

aaaatgatta aggatactag tataagagat caggttcgtc ctttagtgtt gtgtatggtt    300

atcatttgtt ttgaggttag tttgattagt cattgttggg tggtgattag tcggttgttg    360

atgagatatt tggaggtggg gatcaataga gggggaaata gaatgatcag t             411

<210>12

<211>521

<212>DNA

<213>人属人((Homo sapiens)

<400>12

ctatcatata gtaaaaccca gcccatgacc cctaacaggg gccctctcag ccctcctaat     60

gacctccggc ctagccatgt gatttcactt ccactccata acgctcctca tactaggcct    120

actaaccaac acactaacca tataccaatg atggcgcgat gtaacacgag aaagcacata    180

ccaaggccac cacacaccac ctgtccaaaa aggccttcga tacgggataa tcctatttat    240

tacctcagaa gtttttttct tcgcaggatt tttctgagcc ttttaccact ccagcctagc    300

ccctaccccc caattaggag ggcactggcc cccaacaggc atcaccccgc taaatcccct    360

agaagtccca ctcctaaaca catccgtatt actcgcatca ggagtatcaa tcacctgagc    420

tcaccatagt ctaatagaaa acaaccgaaa ccaaataatt caagcactgc ttattacaat    480

tttactgggt ctctatttta ccctcctaca agcctcagag t                        521

<210>13

<211>444

<212>DNA

<213>人属人(Homo sapiens)

<400>13

actgttgtgt tactttttac caacctccaa tcattataca aaatgttaaa aaatacacaa     60

acacacacac acactcacag ccatagaggt tatcgcaaaa gatcaaccca gaatctttca    120

gaatatgaca gatgcactga gaaggcagat aaattgattc aatatacaaa aggcctcttt    180

cctatggaat ttcattagat taaataaggt gttccctcct cacagcctca tccttatgag    240

caatcatata aataatctat ttaaagtcct tgaactataa cttgtataat ttttagtttt    300

ccccctttga aggggcctaa gagaaaggtt tgagaaacca gctcttgagg ggggcagggg    360

tgaggggtaa gaggtcctgt gcctttcatt catcctggga gcttctcagg attgcagcat    420

ttccacctga gtgttcattc ttgt                                           444

<210>14

<211>494

<212>DNA

<213>人属人(Homo sapiens)

<400>14

actgcaataa caaaatacag caataaaaca actggacact cctaggggac accaaagata     60

aagggcccat taatcaggtg taggccagag aaacccaacc tgttggcaat atgacgctct    120

ttcccaactg ggtcttggtg agacacgtgg cacagcaaga ctgtcagtgc atgtgcataa    180

attgtagacc aggtcccact atgctacttc aggattcagc cagcccttct atgagtcaca    240

gaggtccctt ggtccttatt catcttgata tactcatggg atgtttggaa ttaaggagcc    300

caaactacct tacttgcatt tgaagtcttt cacttcatat cctaccccat cagtctaaga    360

gcccacccaa caagggtagc tacacataga tgctcacact ctataggctg cctgatcctg    420

gaaccagcct ggggccctga ttatgatctc cacggggctg tcagtggcta gggaaagctc    480

tttaagaccc agcg                                                      494

<210>15

<211>861

<212>DNA

<213>人属人(Homo sapiens)

<400>15

cttgcagaaa ggatggccct gatgcagcag cagcgccagc tgtaataaaa aataattcac     60

actatcagac tagcaaggca ctagaactgg aaaagaccac agaaaacaaa gaatccaacc   -120

ctttcatctt acaggtgaac aaactgtgat gatgcacatg tatgtgtttt gtaagctgtg    180

agcaccgtaa caaaatgtaa atttgccatt attaggaagt gctggtggca gtgaagaagc    240

acccaggcca cttgactccc agtctggtgc cctgtctaca ccagacaaca caggagctgg    300

gtcagattcc cctcagctgc ttaacaaagt tcctcgaaca gaaagtgctt acaaagctgc    360

cttctcggat actgaaaggt cgagttttct gaactgcact gattttattg cagttggaaa    420

aaaaaaaaag ctattccaaa gatttcaagc tgttctgaga catcttctga tggctttact    480

tcctgagagg caatgttttt actttatgca taattcattg gtgccaagga ataaagtgaa    540

gaaacagcac cttttaatat ataggtctct ctggaagaga cctaaattag aaagagaaaa    600

ctgtgacaat tttcatattc tcattcttaa aaaacactaa tcttaactaa caaaagttct    660

tttgagaata agttacacac aatggccaca gcagtttgtc tttaatagta tagtgcctat    720

actcatgtaa tcggttactc actactgcct ttaaaaaaaa aaccagcata tttattgaaa    780

acatgagaca ggattatagt gccttaaccg atatattttg tgacttaaaa aatacattta    840

aaactgctct tctgctctag t                                              861

<210>16

<211>234

<212>DNA

<213>人属人(Homo sapiens)

<400>16

caggggagtt ctgaggctcc tgctctccca tccacctgtc tgtcctggcc taatgccagg     60

ctctgagttc tgtgaccaaa gccaggtggg ttccctttcc ttcccacccc tgtggccaca    120

gctctggagt gggagggttg gttgcccctc acctcagagc tcccccaaag gccagtaatg    180

gatccccggc ctcagtccct actctgcttt gggatagtgt gagcttcatt ttgt          234

<210>17

<211>143

<212>DNA

<213>人属人(Homo sapiens)

<400>17

acataaggtg taagcaagtt gtttttcttt tgtggagagg tcttaaactc cccatttcct     60

tgttttgctg caataaactg catttgaaat tctcaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa    120

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaa                                            143

<210>18

<211>318

<212>DNA

<213>人属人(Homo sapiens)

<400>18

acaaaaccaa aacagcacag agataagatg ctaaggagct gtccacaccc tgggtctaac     60

tggtcctact ctggctggct taaggaggtg ctttgaaatg tcatgtgggt ggtggtcact    120

gctgaactgt ttctcaggga aagaacaaag cagggtcata gccaggggac tgagattgcc    180

actgatctga aaacttcatt gggaaacagc agaaaagaaa gagctggggg aataggatga    240

gctaatgtaa ctaaccatag ctcttttctc cggtaaggct gggacaaatc gacctcggtc    300

ttgccaagca tatttgtt                                                  318

<210>19

<211>301

<212>DNA

<213>人属人(Homo sapiens)

<400>19

acacatgaag cagaagggaa agaagtaggc agaaatgagc agttcgctcc tccctgataa     60

gagttgtccc aaagggtcgc ttaaggaatc tgccccacag cttcccccat agaaggattt    120

catgagcaga tcaggacact tagcaaatgt aaaaataaaa tctaactctc atttgacaag    180

cagagaaaga aaagttaaat accagataag cttttgattt ttgtattgtt tgcatcccct    240

tgccctcaat aaataaagtt cttttttagt tccaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa    300

a                                                                    301

<210>20

<211>256

<212>DNA

<213>人属人(hs

<400>20

ggttagttac actagctcat cctattcccc cagctctttc ttttctgctg tttcccaatg     60

aagttttcag atcagtggca atctcagtcc cctggctatg accctgcttt gttctttccc    120

tgagaaacag ttcagcagtg accaccaccc acatgacatt tcaaagcacc tccttaagcc    180

agccagagta ggaccagtta gacccagggt gtggacagct ccttagcatc ttatctctgt    240

gctgttttgg ttttgt                                                    256

<210>21

<211>488

<212>DNA

<213>人属人(Homo sapiens)

<400>21

acaggctgac agagaagatt cccgagagta aatcatcttt ccaatccaga ggaacaagca     60

tgtctctctg ccaagatcca tctaaactgg agtgatgtta gcagacccag cttagagttc    120

ttctttcttt cttaagccct ttgctctgga ggaagttctc cagcttcagc tcaactcaca    180

gcttctccaa gcatcaccct gggagtttcc tgagggtttt ctcataaatg agggctgcac    240

attgcctgtt ctgcttcgaa gtattcaata ccgctcagta ttttaaatga agtgattcta    300

agatttggtt tgggatcaat aggaaagcat atgcagccaa ccaagatgca aatgttttga    360

aatgatatga ccaaaatttt aagtaggaaa gtcacccaaa cacttctgct ttcacttaag    420

tgtctggccc gcaatactgt aggaacaagc atgatcttgt tactgtgata ttttaaaata    480

tccacagt                                                             488

<210>22

<211>290

<212>DNA

<213>人属人(Homo sapiens)

<400>22

ggaggatggg ctgcagctgt ggaggagggt ttcagaggag agaggtcgga gagcagaggc     60

ctgagaagcc agaggcaggt ggagagaggg tggaaagtga gcagcgggct gggctggagc    120

cgcacacgct ctcctcccat gttaaatagc acctttagaa aaattcacaa gtccccatcc    180

acaaaaaaaa aaaaaaaaga aagaaaaata tcaaggaata aaaatagact ttgaacaaaa    240

aggaacattt gctggcctgg gggggcatct caatttctat agcaccagtg               290

<210>23

<211>215

<212>DNA

<213>人属人(hs

<400>23

actttaatag ctcaaactca gagtcatcgt gctcccaatt ccaaagagat tcctaaaaga     60

ggcaacttcg gccgtttgag aagccagcgc tcacccaccc ggggtctctg tgcattgacc    120

tttgggtgct gacttggaga aaagcacaaa cacgaccagt cccatcctgg ctcccgtggg    180

gcttcttcta tctacgcatt gtatcgactg catta                               215

<210>24

<211>394

<212>DNA

<213>人属人(Homo sapiens)

<400>24

gtttaaacta cctcaaaaca ctttcccatg agtgtgatcc acattgttag gtgctgacct     60

agacagagat gaactgaggt ccttgttttg ttttgttcat aatacaaagg tgctaattaa    120

tagtatttca gatacttgaa gaatgttgat ggtgctagaa gaatttgaga agaaatactc    180

ctgtattgag ttgtatcgtg tggtgtattt tttaaaaaat ttgatttagc attcatattt    240

tccatcttat tcccaattaa aagtatgcag attatttgcc caaagttgtc ctcttcttca    300

gattcagcat ttgttctttg ccagtctcat tttcatcttc ttccatggtt ccacagaagc    360

tttgtttctt gggcaagcag aaaaattaaa ttgt                                394

<210>25

<211>355

<212>DNA

<213>人属人(hs

<400>25

aaaacctggt ttattgggaa aacttcataa tgaaaactac aattagcttt ttccacaact     60

tacaaaataa taatctgata tttaaaatga attggttttc attatgtaag tcgaaatggt    120

aaaaaatcat aatgacctat ccgatgcatc atatatatgc tattcagaga aactcaaatc    180

cccgaattct cctggggcat gttttatatc agacatttaa aatctgttta ccaagaaaga    240

ccaggatttt aactatatgt aggtttctgc ttacagttgc aaactatcag aagcctgtct    300

atatgataga gcccagataa acctgagatt tagaaaagca agtcatttat tctcc         355

<210>26

<211>485

<212>DNA

<213>人属人(Homo sapiens)

<400>26

aagggaaggt cgttctcagt gaaaatccaa aaaccagaaa aaaatgttta tacaacccta     60

agtcaataac ctgaccttag aaaattgtga gagccaagtt gacttcagga actgaaacat    120

cagcacaaag aagcaatcat caaataattc tgaacacaaa tttaatattt ttttttctga    180

atgagaaaca tgagggaaat tgtggagtta gcctcctgtg gagttagcct cctgtggtaa    240

aggaattgaa gaaaatataa cgccttacac cctttttcat cttgacatta aaagttctgg    300

ctaactttgg aatccattag agaaaaatcc ttgtcaccag attcattaca attcaaatcg    360

aagagttgtg aactgttatc ccattgaaaa gaccgagcct tgtatgtatg ttatggatac    420

ataaaatgca cgcaagccat tatctctcca tgggaagcta agttataaaa ataggtgctt    480

ggtgt                                                                485

<210>27

<211>359

<212>DNA

<213>人属人(Homo sapiens)

<400>27

actatttcaa gtctgtgttt atagtgactg agtaggaagc tgatagaaaa ttatgccata     60

tatgatcaac tattaccatt aaacataaaa ccacaggact ttctacttgg ggctaatcaa    120

tagagggtca tgtggcccct gtcttgttta gcttctgagc atcaccctct tcttccccct    180

caaggtaaca ttggatgtgg ctgattaact cccacaagaa cctgagcatt aagggtcaag    240

agacaacatt aaaaacccaa cataaacaaa acaaaacaaa acttattttg acaataataa    300

acccttcaga actgtgctca caacaggact gaaaatgaac tgggaacgtt tccaagttg     359

<210>28

<211>440

<212>DNA

<213>人属人(Homo sapiens)

<400>28

cttgacgagg ctgcggtgtc tgctgctatt ctccgagctt cgcaatgccg cctaaggacg     60

acaagaagaa gaaggacgct ggaaagtcgg ccaagaaaga caaagaccca gtgaacaaat    120

ccgggggcaa ggccaaaaag aagaagtggt ccaaaggcaa agttcgggac aagctcaata    180

acttagtctt gtttgacaaa gctacctatg ataaactctg taaggaagtt cccaactata    240

aacttataac cccagctgtg gtctctgaga gactgaagat tcgaggctcc ctggccaggg    300

cagcccttca ggagctcctt agtaaaggac ttatcaaact ggtttcaaag cacagagctc    360

aagtaattta caccagaaat actaagggtg gagatgctcc agctgctggt gaagatgcat    420

gaataggtcc aaccagctgt                                                440

<210>29

<211>479

<212>DNA

<213>人属人(hs

<400>29

acacaactta gaaaccaaat tacaagtatt cagttccaat acttcattaa tttcaatcaa     60

ccaaagttag ttcagtagct tatctcagtt atgagtataa tacattacat gtaaattaag    120

tgtgtgtata ctgtaatcgt gctatttttt atcattgaaa catttataaa ctagaataat    180

aatgccctta atgtgagggt ttgtaatggt gcttattaag accaaagact tgttaaatgt    240

atacaccaag tggtaatgaa atttcggtga ctggcccaca cgtgcataga ggtctgggag    300

gaccaggaaa cagcctcagt ggccagagga tcaccagtgc atccttcatc acagcatgtg    360

caatatgcca agattaccct cggtcattcc tgtcaacaag gggtcaatgt cataaatgtc    420

acaataaaac aatctcttct tttttttagt ttaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa     479

<210>30

<211>139

<212>DNA

<213>人属人(Homo sapiens)

<400>30

gctatagcat ggtaatattc tatgcaacta tagttatact ttttggtttg acactgtatt     60

ttttcacatt gatttactgg ttgatgatag attttataac ctaacggttc tcatgcggtg    120

cgtaattgta gatgcatgt                                                 139

<210>31

<211>175

<212>DNA

<213>人属人(Homo sapiens)

<400>31

actctttgga gatgcccatt ctacttttga atttagcttt tactaattcg catctggaag     60

ctcagcaagt gcacaagcct tactttggtt accgtggaaa ccactgccgc ccctccccga    120

tgtggtgcgc tcaataaaaa tgctggaatc caaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa         175

<210>32

<211>446

<212>DNA

<213>人属人(Homo sapiens)

<400>32

ccgacatctt gacgaggctg cggtgtctgc tgctattctc cgagcttcgc aatgccgcct     60

aaggacgaca agaagaagaa ggacgctgga aagtcggcca agaaagacaa agacccagtg    120

aacaaatccg ggggcaaggc caaaaagaag aagtggtcca aaggcaaagt tcgggacaag    180

ctcaataact tagtcttgtt tgacaaagct acctatgata aactctgtaa ggaagttccc    240

aactataaac ttataacccc agctgtggtc tctgagagac tgaagattcg aggctccctg    300

gccagggcag cccttcagga gctccttagt aaaggactta tcaaactggt ttcaaagcac    360

agagctcaag taatttacac cagaaatacc aagggtggag atgctccagc tgctggtgaa    420

gatgcatgaa taggtccaac cagctg                                         446

<210>33

<211>456

<212>DNA

<213>人属人(Homo sapiens)

<400>33

atggttactt gcttcgtctg ttctgtgttg gttttactaa aaaacgcaac aatcagatac     60

ggaagacctc ttatgctcag caccaacagg tccgccaaat ccggaagaag atgatggaaa    120

tcatgacccg agaggtgcag acaaatgact tgaaagaagt ggtcaataaa ttgattccag    180

acagcattgg aaaagacata gaaaaggctt gccaatctat ttatcctctc catgatgtct    240

tcgttagaaa agtaaaaatg ctgaagaagc ccaagtttga attgggaaag ctcatggagc    300

ttcatggtga aggcagtagt tctggaaaag ccactgggga cgagacaggt gctaaagttg    360

aacgagctga tggatatgaa ccaccagtcc aagaatctgt ttaaagttca gacttcaaat    420

agtggcaaat aaaaagtgct atttgtggga aaaaaa                              456

<210>34

<211>476

<212>DNA

<213>人属人(hs

<400>34

ggaccatggc ttacctttcc tgcctttgac ccatcacacc ccatttcctc ctctttccct     60

ctccccgcta ccaaaaaaaa aaaaaaggaa acgtttatca tgaatcaaca gggtttcagt    120

ccttatcaaa gagagatgtg gaaagagcta aagaaaccac cctttgttcc caactccact    180

ttacccatat tttatgcaac acaaacactg tccttttggg tccctttctt acagatggac    240

ctcttgagaa gaattatcgt attccacgtt tttagccctc aggttaccaa gataaatata    300

tgtatatata acctttatta ttgctatatc tttgtggata atacattcag gtggtgctgg    360

gtgatttatt ataatctgaa cctaggtata tcctttggtc ttccacagtc atgttgaggt    420

gggctccctg gtatggtaaa aagccaggta taatgtaact tcaccccagc ctttgt        476

<210>35

<211>494

<212>DNA

<213>人属人(Homo sapiens)

<400>35

actgcttaac gaaacactat cagcttgttt taaatggatc ttttaaatat caactgtagc     60

ctggttggct aattctttct aatcttcccc attactttcg cctagatttc ccatagatca    120

acaggcatag taaaatgcct catcagaaca cacttctcca cacaattcaa aaagggagct    180

cctgtgggct caaagcaacc atcagtccag caatgcccat gatttatctg aaactgcttc    240

ccaagagaca ggagtgcaga tctgagtagc tgtgctgcca atacagatag gtttagcact    300

agatatttag tgattgtggc aaggaagaat cggtgatgat gggggtggtg ggtgaaggaa    360

gggccagggg acctgaagga tcttcagttg ccttctcctg cttcttcatc ctgctggtcg    420

ctcgtccaga gggtgaggtt gtctcgcagc aactgcatga tcagcgtgga gtccttatag    480

gaatcctcgt ttag                                                      494

<210>36

<211>1083

<212>DNA

<213>人属人(Homo sapiens)

<400>36

actttactag aaaaagcaga gtaagagaaa ctaacgttgc cttagcttca gccattcaaa     60

atagacagtt tcttttttcc attatgtaaa gaatccagag tatatcgcaa taacaggaat    120

aaattcttac aacagaatat acaaaaacat tttgaaattt ttttcatcta ctgatttttt    180

atataaacag gattttttag gaataattta tacacagaaa gtcattttat gtaacaaatt    240

ggccatgtta ttaccttttt tttttcttac ttaaaaaaat ttttttttta acaagaaaac    300

tcagaagatg cattatttgc ggtgcatcca ttccatcccg ccttctggtt tgattttttt    360

tatcccagac aaagggatac ccagaggtag acaaactctg gcaaacctct cacctcaacc    420

tcactggctt agaaagcaga caggtgtttt caccgggcgt ctcttccacc ggtggatgtg     480

tgtgtgcaac gccaaacatc caaatgaaaa gttgaaaaca aaacccaaat agtttccaga     540

tcttttctcc tatggtagcg gcaaaaaccc ccagggtggt ttccccatga tagagatatt     600

gtggagttgg gaagacaatg gccaacaatc cactggagtt agaggaagtg gagtcaactt     660

taaaaccaat ttttgtgtat gttatagttt ttattaaaaa ttcttttctg tattggaaat     720

acgtatcttc ggggttctgc cttaaataaa atagggtctc ttctgtgttc taacaaagca     780

gtaatcaatc atgatacgag gcatgtaagc aaatggcctg tgtgccccat agctgtcatc     840

gtttatgtga tcactgtgta tgctgtaatc atcatgaaaa ccattggctg tgcagtcaag     900

tcttcccatg tccatggcac tgtgctgaca atgacgacag ccagaccaat caagccagat     960

gccgaacggt gccatgcact gctgggctcc aacacctcgg ctgtttccat ggccaatgag    1020

gttctttcca tctgttaaag tagctacact ccaaagggaa atgaccagta aaaaatgatc    1080

ccc                                                                  1083

<210>37

<211>206

<212>DNA

<213>人属人(Homo sapiens)

<400>37

acattgttga gtagaggatt aaaggagtga cgaccctttc taaagtgggg tctcccatcc     60

cggatcccta agactgtaac atctgctaca tacattaaaa acaaaacaaa acaaaagcaa    120

acatgaaact tatgacctga cttcactcca cccttcatgc ctgcattatg acagaaacac    180

gtcccgctgc tcctacttat gtatgt                                         206

<210>38

<211>720

<212>DNA

<213>人属人(Homo sapiens)

<400>38

ggtggatttg gaggagatgg tggccttctc tctggaaatg aaaaagtaac catgcagaat     60

ctgaatgacc gcctggcttc ctacttggac aaagttcggg ctctggaaga atcaaactat    120

gagctggaag gcaaaatcaa ggagtggtat gaaaagcatg gcaactcaca tcagggggag    180

cctcgtgact acagcaaata ctacaaaacc atcgatgacc ttaaaaatca gattctcaac    240

ctaacaactg ataatgccaa catcctgctt cagatcgaca atgccaggct ggcagctgat    300

gacttcaggc tgaagtatga gaatgaggta gctctgcgcc agagcgtgga ggctgacatc    360

aacggcctgc gtagggtgct ggatgagctg accctgacca aggctgacct ggagatgcaa    420

attgagagcc tgactgaaga gctggcctat ctgaagaaga accaccagga ggaaatgaaa    480

gaccttcgaa atgtgtccac tggtgatgtg aatgtggaaa tgaatgcttg ccccgggtgt    540

tgatctgact caacttctga ataacatgag aagccaatat gaacaacttg ctgaacaaaa    600

ccgcaaagat gctgaagcct ggttcaatga aaagagcaag gaactgacta cagaaattga    660

taataacatt gaacagatat ccagctataa atctgagatt actgaattga gacgtaatgt    720

<210>39

<211>356

<212>DNA

<213>人属人(Homo sapiens)

<400>39

gccatgctga ggcctgggcc gctgccacgt tggagaagcc cgtgtgagaa gtgaatgctg     60

ggactcagcc ttcagacaga gaggactgta gggagggcgg caggggcctg gagatcctcc    120

tgcagaccac gcccgtcctg cctgtggcgc cgtctccagg ggctgcttcc tcctggaaat    180

tgacgagggg tgtcttgggc agagctggct ctgagcgcct ccatccaagg ccaggttctc    240

cgttagctcc tgtggcccca ccctgggccc tgggctggaa tcaggaatat tttccaaaga    300

gtgatagtct tttgcttttg gcaaaactct acttaatcca atgggttttt ccctgt        356

Claims (6)

1、瘢痕疙瘩与增生性瘢痕差异表达基因文库，由序列表中的SEQ ID №：1-39组成；其中SEQ ID №.1-15是在增生性瘢痕组织中表达高于瘢痕疙瘩的基因，SEQ ID№.16-39是在瘢痕疙瘩组织中表达高于增生性瘢痕的基因。

2、瘢痕疙瘩与增生性瘢痕差异表达基因文库的构建方法，包括以下步骤：

1)提取瘢痕疙瘩与增生性瘢痕组织的mRNA；

2)消减杂交，得到瘢痕疙瘩与增生性瘢痕组织候选差异表达基因；

3)扩增后的候选差异表达基因连接载体后转化到表达菌株中，经蓝白斑筛选出阳性克隆，得到消减文库；

4)消减文库的菌落回复杂交筛选，进行细菌斑点杂交，得到含有在瘢痕疙瘩组织中表达高而在增生性瘢痕组织中表达低的基因的转化菌落及含有在瘢痕疙瘩组织中表达低而在增生性瘢痕组织中表达高的基因的转化菌落；

5)将阳性菌落提取质粒DNA进行Southern杂交，确认阳性克隆；

6)测序得到瘢痕疙瘩与增生性瘢痕差异表达基因文库。

3、根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述瘢痕疙瘩与增生性瘢痕组织的mRNA来自特征性瘢痕疙瘩与增生性瘢痕组织的总RNA。

4、根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述消减杂交包括以下步骤：

1)合成双链cDNA；

2)限制性内切酶进行消化；

3)连接接头；

4)第一次杂交；

5)第二次杂交。

5、根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述候选差异表达基因转化到表达菌株中后，经蓝白斑筛选出阳性克隆，得到消减文库。

6、根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述表达菌株为JM 109菌。

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