CN1634963A - 一种冠心病相关基因及其检测方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种启动子区域突变的C反应蛋白基因，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明还涉及检测启动子区域突变的C反应蛋白基因的方法，检测冠心病相关基因的方法。本发明进一步涉及体外检测待测样品中是否存在本发明的冠心病相关基因的方法及体外预测个体冠心病相对危险性的方法。本发明最后涉及检测启动子区域多态性的C反应蛋白基因的试剂盒。

Description

一种冠心病相关基因及其检测方法和用途

技术领域

本发明涉及一种冠心病相关基因及其检测方法和用途，更特别地，本发明涉及一种启动子区域突变的C反应蛋白基因，及其检测方法和用途。本发明还涉及一种冠心病相关基因及其检测方法和用途。本发明进一步涉及体外检测冠心病相对危险性的方法。本发明还涉及检测本发明启动子区域多态性的基因的试剂盒。

背景技术

冠状动脉粥样硬化性心脏病是由于动脉粥样硬化造成的冠状动脉管腔狭窄，从而使冠状动脉供血不足并导致心肌缺血，从而引起各种临床症状，简称冠心病。世界范围内，冠心病已日益成为威胁人类生命健康的头号杀手。它是西方发达国家人群中最主要的死因。2002年美国心脏病协会报告：在美国每3个人死亡中就有一个死于冠心病，每年冠心病死亡68万人，为此美国政府花费了106亿美元。在我国，冠心病年发病率在10/10万-110/10万；年龄在40-74岁的人群心肌梗塞粗年发病率：124.7/10万；死亡率：58.4/10万。尽管我国冠心病发病率和死亡率低于多数发达国家，但上升速度很快，患者和死亡的绝对人数巨大。疾病监测和死因统计显示，今后20年在我国及世界范围内冠心病死亡率和发病率仍将呈上升趋势。预计到2020年，冠心病仍是世界范围内威胁人类健康的首要疾病，这必将成为社会一笔巨大的开支，目前迫切需要预防、诊断甚至治疗冠心病的有效手段。

冠心病的发生具有明显的遗传倾向，同时又受到环境因素的密切影响，因此它是典型的多因子疾病。从基础到临床，人们对此进行了大量的研究，并在冠心病的危险因素和冠心病发生的病理生理学方面积累了大量的知识，但是关于冠心病发生的确切分子机制却知之甚少。随着人类基因组计划的实施，分子生物学在理论和技术方面都取得了巨大的进步，然而对于冠心病发生的遗传基础的分析仍未取得重大突破。

内皮细胞损伤、炎症反应和氧化胁迫是动脉粥样硬化形成的三个重要方面，而炎症反应在由动脉粥样硬化的触发、发展以及斑块破裂而导致的急性冠脉综合症过程起着十分重要的作用。炎症反应伴随着一系列的急性期蛋白质的产生，C反应蛋白属急性期蛋白之一，由Tillett and Francis(1930)发现并由Abernethy and Avery(1941)得到研究。最早发现它结合在肺炎球菌细胞壁上多聚糖的碳端，所以把它命名为C反应蛋白。它的蛋白质分子的三级结构由五个相同的亚基组成，每个亚基的分子量为21,500。正常情况下存在于大约在4％的外周血淋巴细胞的表面并且由这些细胞产生，当受到外界应激发生炎症反应时，肌体内的C反应蛋白含量会比正常情况下高出上千倍，此时的C反应蛋白主要由肝脏产生并且其表达的量受到白介素6的调节。决定C反应蛋白的含量除了环境因素之外，最为重要的就是遗传的因素。C反应蛋白的基因位于第一号染色体的长臂一区二段和二区三段(1q12-q23)，其基因组结构由两个外显子以及一个内含子组成，全长约为11Kb，结构示意见图1；其mRNA长约为1.7Kb。C反应蛋白基因在Genbank中的登记号是：X56214，蛋白质的编号是：AA40964.1。

至少有十几项流行病学调查资料显示血清C-反应蛋白可用来预测心血管预发事件，由于C-反应蛋白相对于其它炎症介质在血清中含量更稳定、含量因炎症反应变化显著等优点，临床上该蛋白质最有可能被优先应用于患有心脏病的危险性的检测指标(Ross R.Atherosclerosis：aninflammatory disease.N Eng1 J Med.1999，340：115-126；Libby P，RidkerPM.Novel inflammatory markers of coronary risk：theory versuspractice.Circulation.1999，100：1148-1150；Rader DJ.Inflammatorymarkers of coronary risk. N Eng1 J Med 2000，343：1179-1182；GaryTaubes.Does inf lammation cut to the heart of the matter？Science.2000，296(5566)：242)。

发明内容

针对上述问题，本发明的一个目的是提供一种启动子区域突变的C反应蛋白基因。

本发明的一个目的是提供一种检测本发明的启动子区域突变的C反应蛋白基因的方法。

本发明的一个目的是提供一种体外检测冠心病相关基因的方法。

本发明的一个目的是提供一种体外检测待测样品中是否存在冠心病相关基因的方法。

本发明的另一目的是提供一种体外预测待测个体冠心病危险性的方法。

本发明的另一目的是提供一种体外检测启动子区域多态性的C反应蛋白基因的试剂盒。

本发明通过大量的实验研究，提供了一种启动子区域突变的C反应蛋白基因，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明的基因与在Genbank中登记号为X56214的C反应蛋白基因相比，为启动子区域突变，具体地，为-717A/G多态性位点的等位基因为A。-717A/G多态性位点为按照在C反应蛋白基因组中的位置定义的，具体来说是从C反应蛋白基因的转录起始位点算起，前面的命名为负数，即-717A/G，因为该位点没有改变氨基酸的编码，因此它无氨基酸的编码。

所谓“基因多态性”指的是在人群中，各个体基因的核苷酸序列存在的差异。本领域普通技术人员已知，本发明所述的多态性位点为单核苷酸多态性(SNP)位点，即基因组序列中单个核苷酸发生改变；核苷酸序列的差异可以体现在DNA水平上或者RNA水平上，所以，本发明的C反应蛋白基因可以体现在DNA水平，RNA水平上，优选DNA水平，更优选基因组DNA。

目前关于复杂性状疾病的研究有两种策略，连锁分析的方法和病例对照研究。而由于冠心病自身的特点，导致连锁分析困难。从遗传的角度分析，冠心病属复杂遗传性状疾病。对该疾病的发生起作用的因素中，除环境因素外，起作用的基因总数估计多达上百，各个基因之间又存在着相互作用，基因又和环境之间存在相互作用。冠心病的发生具有一定的家族聚集性，但更多的是一些散发病例。发生冠心病的大都是一些高龄病人，往往等知道的时候病人已经死亡，因此很不容易收集到冠心病的家系资料，家系资料一则又少，一则又很难收集，因此这对基于家系资料的连锁分析是很不利的。虽然国际上有一些连锁分析的结果，但往往无实质性的指导作用。所以本发明采用病例对照研究。所述病例对照研究就是在采用随机挑选的两组人群中(疾病和对照)比较某等位基因的频率。

本发明通过大样本的统计分析(619例男性冠心病患者和相应的615对照)，经过大量的实验，最后以确凿的证据证明了具有本发明的-717A/G多态性位点的C反应蛋白基因为冠心病相关基因。在本发明的一个实施方式中，发明人运用国际通行的聚合酶链式反应与限制性片段长度多态性分析相结合(PCR-RFLP)的基因分型方法，在收集到的619例男性冠心病患者和相应的615对照中，分析-717A/G在冠心病患者和正常对照人群的分布差异，结果单因素分析发现，多态位点-717A/G的三种基因型个体在病例组和对照组中的分布有明显差异(P＝0.01)，A/G显隐性遗传模式进一步分析发现，A等位基因的携带者相对G等位基因的携带者在病例组和对照组中有显著差别(P＝0.005)，其中A等位基因的携带者患冠心病的危险性是G等位基因的携带者患冠心病的危险性的4.6倍(具体参见实施例5)。在本发明的一个实施方式中，进一步分析-717A/G位点对冠心病危险度的贡献，在调整了年龄、生化指标、高血压、糖尿病等冠心病其它危险因素的影响后，多变量logistic回归模型分析表明-717A/G仍然保持为冠心病的危险因素，其OR值达到6.77，超过了传统的冠心病危险因素高血压，在所有的危险因素中居于首位，这与国外同类研究的结果相一致，并且统计学意义达到P＝0.006(参见实施例5)。

本发明同时也为获得冠心病相关基因提供了一个新的思路。目前寻找疾病相关疾病的方法多为寻找结构基因的变化。而本发明从一个侧面说明不仅基因的编码区突变可以导致蛋白质水平的突变，进而导致患冠心病的危险因素增大，而且在非编码区的突变，也可以导致患冠心病的危险因素增大。在本发明中就是C反应蛋白基因的启动子区域发生突变。

本发明还提供了一种体外检测冠心病相关基因的方法，该方法包括检测C反应蛋白基因-717A/G位点的多态性。

本领域技术人员已知，可以用多种技术在DNA水平上体外检测C反应蛋白基因序列的多态性位点。可以经与用放射性标记的反义RNA或DNA探针与扩增后的DNA序列杂交，以鉴别点突变。也可以基于已知的核苷酸顺序的改变，合成正常的和突变的聚合酶链式反应(PCR)引物，在PCR反应的底物中加入荧光标记的核苷酸，根据反应产物中有无荧光出现，确定在扩增所用的引物中有无碱基变化，从而检测突变。通过DNA直接测序可以直接揭示对照基因和携带突变基因之间的序列差异。当与PCR结合使用时，这种方法的灵敏性大大提高。各种DNA及DNA片段的核苷酸序列的测定也可用常规方法如双脱氧链终止法(Sanger等人，PNAS，1977，74：5463-5467)。此外，核苷酸序列测定也可使用商业测序试剂盒或自动测序仪等。常规的自动测序法用放射性标记或荧光标记来确定核酸序列。也可以采用限制性片段多态性分析(RFLP)来体外检测C反应蛋白基因序列的多态性位点。

限制性片段长度多态性分析方法的原理为：由于基因突变，导致限制性内切酶酶切位点改变、消失或产生新的位点，若用某种限制性内切酶酶切基因组DNA，则酶切后产生与正常基因组不同长度的DNA片段，检测DNA片段的大小和数量，判断是否产生突变。优选该方法与PCR技术结合(PCR-RFLP)，方法是：在设计PCR扩增实验时，引物位于基因突变部位的两侧，先将目的基因扩增，使其易于检测，由于突变引起已有的限制性内切酶位点改变，则可先用相应的限制性内切酶酶切扩增产物，再进行琼脂糖凝胶电泳观察，根据产物片段大小或数量，与正常对照作出判断。本发明中优选检测所述C反应蛋白基因-717A/G位点的多态性的方法为聚合酶链式反应与限制性片段长度多态性分析相结合或聚合酶链式反应与直接测序法相结合。

另一方面，本发明还提供了一种体外检测待测样品中是否存在冠心病相关基因的方法，该方法包括：

1)提取待测样品的DNA，针对C反应蛋白基因-717A/G位点设计引物进行PCR扩增；

2)对所述的PCR产物进行分析；

3)鉴定C反应蛋白基因-717A/G位点是否为A。

含有本发明的基因的待测样品可以从来自试验者的细胞获得，如来自血液、尿、唾液、胃液、头发，活组织检查和尸体解剖材料的细胞。优选来自血液。

在本发明的一个实施方式中，对所述PCR产物进行分析的方法为聚合酶链式反应与限制性片段长度多态性分析相结合。将包含目的SNP位点的PCR产物用特定的限制性内切酶作酶切，则包含有该SNP位点的个体会产生切成两个或三个或切不动三种情况。在本发明中对-717A/G位点，发明人选用了Bsp 1236I限制性内切酶产生的376碱基长的片段切割后产生了201和175两种长度的片段；产生的两个片段长度差约为20个碱基长，然后在3％的琼脂糖胶上电泳后用紫外透射仪观察长度(具体参见实施例3)。

在本发明的一个实施方式中，对所述PCR产物进行分析的方法为聚合酶链式反应与直接测序法相结合。在本发明的实施例2中，所述方法包括：

1)提取待测样品的DNA，针对C反应蛋白基因-717A/G位点设计引物进行PCR扩增；

2)对所述的PCR产物进行直接测序；

3)鉴定C反应蛋白基因-717A/G位点是否为A。

另一方面，本发明提供了一种体外预测待测个体冠心病危险性的方法，该方法包括体外检测来自待测个体的样品中-717A/G位点的多态性，其中携带A等位基因个体患冠心病的危险性明显高于携带G等位基因的个体。优选所述待测个体为中国汉族。本发明通过大样本的统计分析，在排除实验误差的基础上，以确凿的实验证据证明了携带A等位基因个体患冠心病的危险性是携带G等位基因的个体患冠心病的危险性的4.6倍。在本发明的实施例5中，单因素分析发现，多态位点-717A/G的三种基因型个体在病例组和对照组中的分布有明显差异(P＝0.01)，A/G显隐性遗传模式进一步分析发现，A等位基因的携带者相对G等位基因的携带者在病例组和对照组中有显著差别(P＝0.005)，其中A等位基因的携带者患冠心病的危险性是G等位基因的携带者患冠心病的危险性的4.6倍(分析结果见表3)。在此基础上，本发明在调整了年龄、生化指标、高血压、糖尿病等冠心病其它危险因素的影响后，多变量logistic回归模型分析表明-717A/G仍然保持为冠心病的危险因素，其OR值达到6.77，超过了传统的冠心病危险因素高血压，在所有的危险因素中居于首位。

本领域普通技术人员已知，可以采用前述任何能够检测-717A/G位点多态性的方法检测来自待测个体的样品中-717A/G位点的多态性。在本发明的一个实施方式中，检测来自待测个体的样品中-717A/G位点的多态性方法为聚合酶链式反应与限制性片段长度多态性分析相结合或聚合酶链式反应与直接测序法相结合。

在本发明大样本的统计分析的基础上，可以单独使用本发明的方法，即检测来自待测个体的样品中-717A/G位点的多态性，以体外预测待测个体患冠心病危险性。同时，本领域技术人员已知，冠心病的发生、发展是多因素共同作用的结果，所以本发明也可以与本领域已知的其它方法，例如脂质检验，联合使用，而常规脂质检验在临床上是应用得最广泛和最普通的一种检验方法，不仅可用于预测冠心病临床检验，也可用于其他疾病的预测预报，是一项常规检验，以达到体外预测待测个体患冠心病危险性的目的。

另一方面，本发明提供一种体外检测启动子区域多态性的C反应蛋白基因的试剂盒。所述试剂盒内可以装有一个或多个容器，容器内装有用以检测含有-717A/G多态性位点的C反应蛋白基因的一种或多种组分。按照具体检测方法及检测多态性位点的不同，试剂盒可含有不同组分。与之同时提供的可以是经政府药物管理机构审核的、有关药品或生物制品制造、使用及销售的信息。在本发明的一个实施方式中，提供一种体外检测启动子区域多态性的C反应蛋白基因的试剂盒，该试剂盒包含：

(1)扩增-717A/G位点的引物；

(2)PCR扩增酶及相应缓冲液；

(3)检测-717A/G位点多态性的试剂。

本领域普通技术人员已知，所述扩增多态性位点的引物，可以依据本发明已知的核苷酸序列设计，通常为15-30个碱基，GC含量为45％-50％左右，在适当的温度下与模板特异性结合，其可以利用专门的计算机程序设计，例如(Oligo 6.53软件)。如本发明实施例2所示，提供一种扩增-717A/G位点的引物：

5’-TTGTTTGCCACATGGACAGAGACT-3’(SEQ ID No 2)

5’-AGAGTACTAAAACCCCCACAACTG-3’(SEQ ID No 3)

本领域普通技术人员已知，PCR扩增的酶可以为Tag DNA聚合酶、Klenow片段，Tth DNA聚合酶，VENT DNA聚合酶等能够用于PCR扩增的酶。试剂盒中检测-717A/G位点的试剂根据检测方法的不同而不同。例如，采用聚合酶链式反应与限制性片段长度多态性分析相结合方法来检测-717A/G多态性位点时，试剂盒中可以含有限制性内切酶和相应的酶切图谱，例如Bsp1236I限制性内切酶和相应的酶切图谱。

本发明的检测启动子区域多态性的C反应蛋白基因的试剂盒可以用于体外检测冠心病相关基因的多态性。

本发明的启动子区域突变的C反应蛋白基因可以用于检测、预防、诊断或治疗冠心病。

本发明的检测本发明的启动子区域突变的C反应蛋白基因的方法可以用于检测、预防、诊断或治疗冠心病。

本发明的体外检测冠心病相关基因的方法可以用于检测、预防、诊断或治疗冠心病。

本发明的体外检测待测样品中是否存在冠心病相关基因的方法可以用于检测、预防、诊断或治疗冠心病。

本发明的体外预测待测个体冠心病危险性的方法可以用于检测、预防、诊断或治疗冠心病。

本发明的体外检测启动子区域多态性的C反应蛋白基因的试剂盒可以用于检测、预防、诊断或治疗冠心病。

附图说明

图1为C反应蛋白基因的基因组结构详细图，从图中可以看出C反应蛋白基因位于染色体的1q21-q23，由两个外显子和一个内含子构成。

图2为C反应蛋白基因序列变异的筛查流程示意图。

图3为本发明的部分测序图谱。

图4A和图4B分别为Phred/Phrap/consed程序识别本发明的-717A/G多态性位点及待测个体的基因型，其中图4B中1显示待测个体的-717A/G多态性位点为A/G杂合子；2显示待测个体的-717A/G多态性位点为A/A纯合子；3显示待测个体的-717A/G多态性位点为G/G纯合子。

图5为本发明的-717A/G多态性位点的酶切图谱。其中如泳道1、2、5、10、11、15和17显示待测个体-717A/G位点的基因型为A/G杂合子；泳道3、4、6、8、9、12、13、14、19和20显示待测个体的-717A/G位点为A/A纯合子；泳道7显示待测个体的-717A/G位点为G/G纯合子。

具体实施方式

为了更清楚地理解本发明，现参照下列实施例及附图进一步描述本发明。实施例仅用于解释而不以任何方式限制本发明。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，《分子克隆：实验手册)》(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

1、研究对象的选取

冠心病病例对照研究的入选诊断标准有两个。第一个是急性心肌梗塞诊断标准(根据WHO 1979年的诊断标准)：即典型胸痛症状持续30分钟以上；心电图连续2个导联ST段抬高(肢体导联0.1mv，胸导联0.2mv)并有系列动态变化；心肌坏死的血清标记物浓度升高，如肌钙蛋白(TNT/TNI)升高，心肌同工酶(CK-MB)升高大于正常值高限的2倍。第二个标准是冠状动脉造影阳性标准：即主要冠状动脉之一横截面狭窄超过70％或左主干狭窄超过50％。

根据严格的冠心病病例对照研究的入选诊断标准，并经各项检查除外心脏瓣膜疾病、先天性心脏病、心力衰竭、严重的肾脏及肝脏疾病、继发性高血压、心肌病、家族性高胆固醇血症及可疑冠心病患者。从1997年10月到2000年9月期间，随机选择在中国医学科学院阜外心血管病医院住院的北京地区的男性冠心病患者一共619例；同时随机选取居住在北京，年龄(±2)和性别(频数匹配)与病例匹配的社区男性人群615例。对照组入选标准：既往无冠心病或其他动脉粥样硬化病史，无胸痛、胸闷等心脏病症状，心电图无明显缺血性改变。病例组和对照组均为中国汉族人，且无血缘关系。

实施例2 C反应蛋白基因序列变异筛查

整个C反应蛋白基因序列变异筛查流程见图2。从病例组中随机挑选48例冠心病患者作为筛查对象，构成96条染色体，这个样本量可提供95％的把握度检测到少见等位基因频率大于1％的序列变异。所有个体均为汉族，且无任何血缘关系。根据NCBI中公布的C反应蛋白基因外显子序列，通过Blast数据库比较获得C反应蛋白基因序列。检测多态性的方法是利用PCR产物直接测序。利用Oligo6.53软件设计PCR引物，扩增C反应蛋白基因全部外显子、外显子-内含子交界区、5’UTR和调控区(以转录起始位点上游大约1kb区域为推测的启动子区)及3’UTR。引物序列见表1。

表1引物序列

引物类别   5’引物                                        3’引物

基因筛查                                                  5’-TGGACCTAGGCAGTCTGATTC-3’

           5’-AGTGCCAAGATGTCTAGAGAGTT-3’(SEQ ID No 4)

引物                                                      (SEQ ID No 5)

           5’-AGTGCCAAGATGTCTAGAGAGTT-3’(SEQ ID No 6)

           5’-CAGATGGCCACTCGTTTAAT-3’(SEQ ID No 7)

           5’-TCAATCTTAAATTCTATAC-3’(SEQ ID No 8)

测序

           5’-TGGGTGGGTCTGAAATATTA-3’(SEQ ID No 9)

引物

           5’-TCTGTCTCTGGGCCTTTGTT-3’(SEQ ID No 10)

           5’-TTAGAATTGCCCCAGCAGAG-3’(SEQ ID No 11)

           3’-CTTAGTCTGACGGATCCAGGT-5’(SEQ ID No 12)

基因分型                                                  5’-AGAGTACTAAAACCCCCACAACTG-3’

           5’-TTGTTTGCCACATGGACAGAGACT-3’(SEQ ID No 2)

引物                                                      (SEQ ID No 3)

表1中的测序引物，即将前面的带有C反应蛋白基因片段的PCR产物扩增出来的引物，因为测序仪只能达到500碱基左右，而带有C反应蛋白基因片段的PCR产物总长约为4K，所以用了表1中的测序引物(测序引物为单向)。在普通PCR仪上反应。测序反应后的产物在ABI3700测序仪(美国PE公司)上读取序列。

PCR反应体系(25μl)：基因组模板DNA50ng(来自血液标本，按照常规方法将白细胞内的DNA用苯酚-氯仿法或者用盐析法提取出来即可)、dNTPs200μmol/L、Taq酶(Takara公司)1U、MgCl₂ 2.0mmol/L、Tris-HCl10mmol/L、KCl 50mmol/L及引物200pmol/L。在96孔PCR自动循环仪9700(美国PE公司)上进行PCR反应，PCR循环参数：95℃预变性5分钟；经94℃，1分钟；61.5-65℃，50秒；72℃，1分钟；循环30周后于72℃延伸10分钟。应用Millipore公司生产的纯化板对PCR产物纯化，纯化2遍后进行测序反应，以PCR引物作为测序引物，大于1kb的PCR产物需在中间大约450bp左右增加一条测序引物(表1)，以保证测序质量。测序在ABI3700测序仪上完成。图3显示部分测序图谱。在SUN工作站上应用Phred/Phrap/consed程序进行序列拼接和DNA序列变异的识别(图4)。Polypred是一个用于序列拼接的程序，可以用它来对DNA测序的结果进行分析，也可以用于寻找SNP位点。其工作平台是SUN工作站，远程用户可以在Linux界面下操作。它的看图原理就是分别将四种碱基赋予不同的颜色：A是绿色；T是红色；G是橙色；C是蓝色。Phred/Phrap/consed是其中的四个命令。具体操作如下：

登录进入Linux；

创建四个文件夹：edit_dir；phd_dir；chromat_dir；poly_dir；

将测序结果(图谱文件)输入到chromat_dir文件夹；

转入到edit-dir文件夹，运行Polyphrad和Consed命令；

图谱分析结果出来，直接用目测可以看到系统用红色表出的SNP位点。

结果：以中国汉族北方人群为研究对象，经过系统的序列筛查工作，从C反应蛋白基因序列中发现新的SNP位点，测序的总长度为3682个碱基，根据通行的命名规则命名为-717A/G，位于C反应蛋白基因序列的启动子区域。

实施例3 采用PCR-RFLP方法检测本发明的C反应蛋白-717A/G多态性

方法：PCR反应体系(25μl)：基因组模板DNA50ng(来自血液标本，按照常规方法将白细胞内的DNA用苯酚-氯仿法或者用盐析法提取出来即可)、dNTPs200μmol/L、Taq酶(Takara公司)1U、MgCl₂ 2.0mmol/L、Tris-HCl10mmol/L、KCl 50mmol/L及引物200pmol/L；引物如下：

5’-TTGTTTGCCACATGGACAGAGACT-3’(SEQ ID No 2)

5’-AGAGTACTAAAACCCCCACAACTG-3’(SEQ ID No 3)

在96孔PCR自动循环仪9700(美国PE公司)上进行PCR反应，PCR循环参数：95℃预变性5分钟；经94℃，1分钟；61.5-65℃，50秒；72℃，1分钟；循环30周后于72℃延伸10分钟。应用Millipore公司生产的纯化板对PCR产物纯化，纯化2遍后，对376碱基长的PCR产物选用Bsp1236I限制性内切酶(立陶宛MBI公司)进行酶切。酶切条件参见生产厂家的操作手册。然后在3％的琼脂糖胶上电泳后用紫外透射仪观察长度。

结果：如图5所示，当376碱基长的PCR产物切割后产生了201和175两种长度的片段时，说明-717A/G位点的等位基因为G，当只有376碱基长的PCR产物时，说明-717A/G位点的等位基因为A。由于图5所示的待测样品为来自待测个体的DNA，所以，如泳道1、2、5、10、11、15和17所示，产生3种片段，则该待测个体-717A/G位点的基因型为A/G杂合子，携带A等位基因和G等位基因；如泳道3、4、6、8、9、12、13、14、19和20所示，只有一个片段，该待测个体的-717A/G位点为A/A纯合子，携带A等位基因；如泳道7所示，只产生2条有用的片段，待测个体的-717A/G位点为G/G纯合子，携带G等位基因。

实施例4 利用PCR与直接测序法检测本发明的C反应蛋白-717A/G多态性

方法：首先对-717A/G位点进行PCR反应，具体条件及引物参见实施例3。对PCR产物在ABI3700测序仪上直接读取序列。

结果：如图3所示，为本发明的部分测序图。如图4A和图4B所示，分别为Phred/Phrap/consed程序识别本发明的-717A/G多态性位点及待测个体的基因型，其中图4B的测序图中1至3分别显示本发明待测个体的-717A/G多态性位点为A/G杂合子，A/A纯合子及G/G纯合子。

实施例5 多态位点与冠心病的关联研究

为进一步从遗传的角度探讨C反应蛋白基因和冠心病发病之间的关系，并为国内外已有的同类研究提供遗传流行病学的证据，运用PCR-RFLP的国际通行的基因分型方法，在收集到的619例男性冠心病患者和相应的615对照中，体外检测来自待测个体的样品中-717A/G位点的多态性，从而分析-717A/G位点在冠心病患者和正常对照人群的分布差异。

首先运用Hardy-Weinberg平衡检验。Hardy-Weinberg平衡是一种群体遗传学的概念：主要(Population)是指一民族生活在某一地区、能相互随机杂交的一群人体，这个群体所具有的全部遗传信息称为该群体的基因库(Gene pool)，它直接反映本地区，本民族的遗传特征。这些遗传信息的表达形式基因频率(Gene frequency)和基因型频率(Genotypefrequency)，在没有突变、迁移和遗传漂变的条件下，群体中基因频率和基因型频率遵守保持不变即为Hardy-Weinberg平衡。这样既有遗传多态性，又具备遗传的稳定性。

对基因分型结果分析发现，基因分型结果符合Hardy-Weinberg平衡，因此可以排除实验误差，该基因分型结果比较可靠。分析结果见表2。

表2.-717A/G多态的等位基因和基因型频率在病例组与对照组中的分析

SNP         变量名           病例(619)        对照(615)        P

-717G/A     GG/AG/AA         4/163/452        18/158/439       0.01

            GG/(AG+AA)       4/615            18/597           0.005

            A/G              0.138/0.862      0.158/0.842      NS*

NS*指在病例组和对照组中无显著差异

结论：单因素分析发现，多态位点-717A/G的三种基因型个体在病例组和对照组中的分布有明显差异(P＝0.01)，A/G显隐性遗传模式进一步分析发现，A等位基因的携带者相对G等位基因的携带者在病例组和对照组中有显著差别(P＝0.005)，其中A等位基因的携带者患冠心病的危险性是G等位基因的携带者患冠心病的危险性的4.6倍。

干扰病例对照研究最严重的因素包括人群在遗传基础上的混杂、病例入选时因为标准不严格产生的疾病混杂等，在排除了以上几个混杂因素的基础上，发明人挑选了619个研究样本和相应的对照，这在国际同类研究中属于比较大的研究样本，为了进一步分析-717A/G位点对冠心病危险度的贡献，在调整了年龄、生化指标、高血压、糖尿病等冠心病其它危险因素的影响后，进行多变量logistic回归模型分析。logistic回归模型分析是统计学上的一种普通的分析方法，它主要用于二分变量的分析，可以用来调整对整个分析造成混杂的因素。结果见表3。

表3.多变量logistic回归模型分析结果：最后留在方程中的变量

变量           优势率            P                95％CI

               (Odds ratio)

年龄，y        1.350             0.000            1.173-1.553

HDL-C，mg/dL   0.719             0.000            0.666-0.777

高血压，y/n    3.469             0.000            2.553-4.713

糖尿病，y/n    3.597             0.000            2.170-5.961

LDL-C，mg/dL   1.004             0.035            1.000-1.008

饮酒，y/n      0.452             0.000            0.341-0.598

BMI，kg/m²    1.073             0.002            1.026-1.123

-717G/A，      6.765             0.006            1.729-26.462

GG/(AG+AA)

进行分析但未进入方程的变量有：TC，TG，吸烟。

结果：如表3所示，多变量logistic回归模型分析表明-717A/G仍然保持为冠心病的危险因素，其OR值达到6.77，超过了传统的冠心病危险因素高血压，在所有的危险因素中居于首位，这于国外同类研究的结果相一致，并且统计学意义达到P＝0.006。

结论：说明启动子区域突变的C反应蛋白基因为冠心病相关基因，并且对于C反应蛋白-717A/G位点，携带A等位基因个体患冠心病的危险性比携带G等位基因的个体患冠心病的危险性显著升高。

实施例6 多态位点-717A/G是冠心病的一个遗传易感因素的功能上的证据

-717A/G本身位于C反应蛋白基因的启动子区域，该位点的突变很有可能会影响C反应蛋白基因的转录，从而影响个体体内的C反应蛋白的含量，使不同的个体产生对冠心病的遗传易感性。针对该位点设计药物特定的靶位点可以有效抑制体内的炎症反应，延缓动脉粥样硬化病变过程，从而产生巨大的效益。运用生物信息学的手段，分析该位点突变有可能造成的转录活性的改变发现：由A到G的突变产生了一个新的转录因子GR(编号为T00333，该编号是做预测时，系统给出的。网站名http://www.cbil.upenn.edu/cgi-bin/tess/tess？RQ＝WELCOME，由美国的宾夕法尼亚大学维护)的结合位点，该转录因子是一个糖皮质激素受体，其性质与C反应蛋白最初被发现时在细胞上的结合位点一致。

结论：进一步说明启动子区域突变的C反应蛋白基因为冠心病相关基因。该位点发现对新药研制具有十分重要的意义。在校正了其他的传统危险因素后，相对于G/G基因型个体的携带者，A等位基因的携带者患冠心病的危险性增大了6.77倍。

实施例7 体外检测冠心病相关基因的试剂盒

一种体外检测冠心病相关基因的试剂盒，该试剂盒包含：

1)扩增-717A/G位点的引物

5’-TTGTTTGCCACATGGACAGAGACT-3’(SEQ ID No 2)

5’-AGAGTACTAAAACCCCCACAACTG-3’(SEQ ID No 3)

2)PCR扩增酶及相应缓冲液；

3)Bsp 1236I限制性内切酶和相应的酶切图谱。

应理解，在阅读了本发明的上述描述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，但改动或修改的等价形式同样落在本申请权利要求书所限定的范围内。

                               序列表

<110>中国医学科学院阜外心血管病医院

     北京诺赛基因组研究中心有限公司

     中国科学院生物物理研究所

<120>一种冠心病相关基因及其检测方法和用途

<130>D0312061F

<160>12

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>11334

<212>DNA

<213>Homo sapiens(智人)

<400>1

tcagattatc ctgactcctg cctgaagctt tacatattca gagaaaaatg ttggaagaaa     60

ctttgatata atgctatgtc tgtgatcagg cacacatttt actggacttt tactgtcagg    120

gccgtcattt agtgccaaga tgtctagaga gttcttaata agtgtactca attggctgag    180

aaaatgtgtc catgcaaaaa accaaacacc gcgtgttctc actcatagat gggaattgaa    240

caatgagaat acttggacac aggaagggga acatcacact ctggggactg ttgtggggtg    300

gggggagggg ggagggatag cattagaaga tatacctaat gctaaatgat gagttaatgg    360

gtgcagcaca ccagcatggc acatgtatac atatgtaact aacctgcaca ttgtgcacat    420

gtaccctaaa acttaaagta taataataat aaaaaaatgt gtccatggct ctgggaggag    480

catgtttgtt ttcctcattt cccagtctgt aaataagcaa attgaaaggg gttagtgata    540

atgtccatct ccagaagctg tcagatttcc tttgtcaaac tctatgattt gggctgaagt    600

aggtgttgga gaggcagcta ccacgtgcac ccagatggcc actcgtttaa tatgttacca    660

tttcccatta ttttcgcagg atagatagcc aaagtggagc cctgagagat ttcttcattt    720

ttcctgtcat aaagaattgg taattcagta gtcataggag tttgtaataa ataactcaca    780

ttgatttctc tgttctgaaa taattttgct tcccctcttc ccgaagctct gacacctgcc    840

ccaacaagca atgttggaaa attatttaca tagtggcgca aactccctta ctgctttgga    900

tataaatcca ggcaggagga ggtagctcta aggcaagaga tctaggactt ctagcccctg    960

aactttcagc cgaatacatc ttttccaaag gagtgaattc aggcccttgt atcactggca   1020

gcaggacgtg accatggaga agctgttgtg tttcttggtc ttgaccagcc tctctcatgc   1080

ttttggccag acaggtaagg gccaccccag gctatgggag agatttgatc tgaggtatgg   1140

gggtggggtc taagactgca tgaacagtct caaaaaaaaa aaaaaaagac tgtatgaaca   1200

gaacagtgga gcatccttca tggtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt   1260

ggtgtgtaac tggagaaggg gtcagtctgt ttctcaatct taaattctat acgtaagtga   1320

ggggatagat ctgtgtgatc tgagaaacct ctcacatttg cttgtttttc tggctcacag   1380

acatgtcgag gaaggctttt gtgtttccca aagagtcgga tacttcctat gtatccctca   1440

aagcaccgtt aacgaagcct ctcaaagcct tcactgtgtg cctccacttc tacacggaac   1500

tgtcctcgac ccgtgggtac agtattttct cgtatgccac caagagacaa gacaatgaga   1560

ttctcatatt ttggtctaag gatataggat acagttttac agtgggtggg tctgaaatat   1620

tattcgaggt tcctgaagtc acagtagctc cagtacacat ttgtacaagc tgggagtccg   1680

cctcagggat cgtggagttc tgggtagatg ggaagcccag ggtgaggaag agtctgaaga   1740

agggatacac tgtgggggca gaagcaagca tcatcttggg gcaggagcag gattccttcg   1800

gtgggaactt tgaaggaagc cagtccctgg tgggagacat tggaaatgtg aacatgtggg   1860

actttgtgct gtcaccagat gagattaaca ccatctatct tggcgggccc ttcagtccta   1920

atgtcctgaa ctggcgggca ctgaagtatg aagtgcaagg cgaagtgttc accaaacccc   1980

agctgtggcc ctgaggccca gctgtgggtc ctgaaggtac ctcccggttt tttacaccgc   2040

atgggcccca cgtctctgtc tctggtacct cccgcttttt tacactgcat ggttcccacg   2100

tctctgtctc tgggcctttg ttcccctata tgcattgcag gcctgctcca ccctcctcag   2160

cgcctgagaa tggaggtaaa gtgtctggtc tgggagctcg ttaactatgc tgggaaacgg   2220

tccaaaagaa tcagaatttg aggtgttttg ttttcatttt tatttcaagt tggacagatc   2280

ttggagataa tttcttacct cacatagatg agaaaactaa cacccagaaa ggagaaatga   2340

tgttataaaa aactcataag gcaagagctg agaaggaagc gctgatcttc tatttaattc   2400

cccacccatg acccccagaa agcaggaggg cattgcccac attcacaggg ctcttcagtc   2460

tcagaatcag gacactggcc aggtgtctgg tttgggtcca gagtgctcat catcatgtca   2520

tagaactgct gggcccaggt ctcctgaaat gggaagccca gcaataccac gcagtccctc   2580

cactttctca aagcacactg gaaaggccat tagaattgcc ccagcagagc agatctgctt   2640

tttttccaga gcaaaatgaa gcactaggta taaatatgtt gttactgcca agaacttaaa   2700

tgactggttt ttgtttgctt gcagtgcttt cttaatttta tggctcttct gggaaactcc   2760

tccccttttc cacacgaacc ttgtggggct gtgaattctt tcttcatccc cgcattccca   2820

atatacccag gccacaagag tggacgtgaa ccacagggtg tcctgtcaga ggagcccatc   2880

tcccatctcc ccagctccct atctggagga tagttggata gttacgtgtt cctagcagga   2940

ccaactacag tcttcccaag gattgagtta tggactttgg gagtgagaca tcttcttgct   3000

gctggatttc caagctgaga ggacgtgaac ctgggaccac cagtagccat cttgtttgcc   3060

acatggagag agactatgag gacagaagcc aaactggaag tggaggagcc aagggattga   3120

caaacaacag agccttgacc acgtggagtc tctgaatcag ccttgtctgg aaccagatct   3180

acacctggac tgcccaggtc tataagccaa taaagcccct gtttacttga gtgagtccaa   3240

gctgttttct gatagttgct ttagaagttg tgactaactt ctctaatgac ctttgaaatc   3300

aagtccctgt aagtttacac ttcccattac acaacatatc catggcactt taacctgtcc   3360

aagagtcccc tgaagggatt ccctctgaca agcacagtcc ctcttttgag atagctggcc   3420

attcatgtag ggccagttgt gggggtttta gtactctcat tctatcatta ttccaatttg   3480

aggagcaaaa actaaagatc attgagatcc atggatctgc tgccaggttc agtgactgga   3540

atgcacttgc cccagcgggt tcaagttctt tgtagaaaca gacccctcaa agatgacagc   3600

agctggcttc ctccagaagt gtccttcaac actgtctttc agtactaagt gaccagtaga   3660

agttactcca taaagaccat agccaggaat gaattatggg gcttcctgca tatcaaatgg   3720

ttacctaggg aaggcatatg gtaaactagt taagcacaga ggttctggaa tcagactgcc   3780

taggtccaaa tcctggcttt acaacttact agctatgtga ccttaggtga tataacctct   3840

ttacgcctca gttttcttac ctacaaagca ggagaaataa tagtaattag ctcaaagggt   3900

tgctataaga atcaaagaaa atcatgcaag caaagcactt actacagtgc ctggcacata   3960

gtaagctctt ataacagttt tctggtatta ttcttattaa gccattttgt attatatcca   4020

taaatgtaga ttcataaaat acataaaaat acaacttggt agaatttgtc ttggttggca   4080

gcagttgaag cttctcattt gctaagaatt aggtttagaa tgttagaagg gtgaacaaca   4140

agtctttgaa gccattattt atgaatattg acttctctaa ttgacttttg ataaccattt   4200

gtaagcatag aagctaagga tacattctca gacaaaaatg agagtgcaaa tactctctgt   4260

tgtccaatta gggcagatcc atccatcctc acattcagct aagcagaaga gaggattgac   4320

actcttttct agttaaataa tccagatacg tcttaattat agaaggccat cccaactccc   4380

cagggatgta ggttgagcta atattttctt cagaattcag ttgcttgcat cttactatac   4440

gtagtctggt agacagcctc tggccttaat aatttgagcc aggaaaatct taacagctgg   4500

tatttgcatt cagagaacat taaaaaatct taacaaagca ttcgtaggat gtttagattt   4560

aagcaattta gcctactggt gggtacatca atgtaaactt gttggaaaat gtatttccag   4620

gtaactggtg aattgtcata ccatatagag ctattagatg taatccaatt aaatgttaga   4680

tgacatctgc caaagaagat gattctgatt tgggcatgtt ggttctaagc aatgcttttt   4740

tttttttgca gtaagtggag agtaagatca aacatccacc gtggccactt ctagctgatg   4800

ctaataaaac catgttgtca ggactggttt tctgttagag tagggaccat ggatccaatt   4860

tttccagaag tagaatcagg cctcaaggaa tgagttaaaa agacataggg acaaatggtc   4920

tataaaacct ataatagaaa ggaggtgaaa gcggggtggt ggcccagtgc ctgaagagat   4980

actgtagtgc atttacaggc caaataagag aaagtagaac aatagtatga atcagagatg   5040

atggaggctg ctacttgata gaacactttc tttttggaac tgaaaatagc catgttggta   5100

taagggttag ggccaggcct gaccctaatg taagcgcctt agcatgggat gtgatatgga   5160

gatgtgcaga tcagaaacct aaaatctccc tgtgtcagaa aaaaatgtta gctcactggc   5220

caggcaacaa gacttgcaca ctttccaaaa agaggtggtc atggagagag cattgttaag   5280

aatgggctgc atgtcaggcc aggtgagtgg atgagaagcc acctctgtga tgagacttgg   5340

tctatccagg ccctggagga gagagtacag gctgcctcaa aagtgaggct gggacctgat   5400

ggaaatggat ttggagtccc agctgacaaa gtaagtagaa tgttaaatct gtgatattct   5460

cccccatgct ttcactatcc tcaagtttga tgtgccccag gcaagcaaag attgacaaag   5520

gaagcaaatg actctagatg attgagcacc accaccacgt agatcaaatt tccaaagtat   5580

agatttctga tcactagaat cccagggaaa agagaagcac tgctttgatt tctaggtagc   5640

ttatcctagg acaactgccc actagtctca gatgggttgt cgtacttgcc tggattcctt   5700

ctcttcagct ccctgtctct atttcaaata tgcatctttt catttcctct gcactagaac   5760

gtaggttaag cgggcttgtt agccttttcc ttctgaaaat gcagactcct agctcaaatt   5820

tcctggatca cctggcccag tgatcactta tagtctgctg attacaggca tcattttcct   5880

ctggggtgtt tgagtataga ttcattgacc ccagtcctcc tagagtagat tctctggggt   5940

tagtgctcag gaatatgcaa gatcacaagc tcttttgtac catgtgcttt tagagctatc   6000

actgtagtgt tttcctgaca gctcagattt cttatctcag ggacatgcct ggctcccact   6060

aagcttgcag gcaggtggtc accttttttt ttttttttcc gagacggagt ctcgctcttt   6120

tgcgcaggcc aggctgcagt ggcgctatct cggctcactg caagctccgc ctcccgggtt   6180

caggccattc tcctgcctca gcctcctgcg tagttgggga ctacaggcgc ccgccaccgc   6240

gcccggctaa ttttttttgt atttatagta gagataggat ttcaccgtgt tagccaggat   6300

ggtctcgttt tcctgacctc gtgatctgcc cgcctcggcc tcccaaagtg ctgggattac   6360

aggcgtgagc caccaggccc ggccaggtgg tcacgtttaa agaagcatct agtgcatctg   6420

tatgtaccca ggtcttcccc ttagcctact tctggtgcat tctttcaggc ctcattcagt   6480

gtggacccgt ctgtcctatg cccttcatac acacagataa gtgatctccc aacgtctcat   6540

cactgccccc aggatgataa ttgcttaatc acacagggaa gatcacacat agtcttaaaa   6600

caaaacaaaa acaaaaacaa aaacttctta cacttactga gctcttacca tgtgccaggt   6660

actgttgtga gtcttttaca tatatttact tgtttaatga caatcctatg atttatgtaa   6720

tattttatag tcctcatttt acagatgaga aaactgaggt ttggagaggt taattaactt   6780

gctcagagct aggatttgaa cctaggcagt ctggctactc agttctatgc ttctaaccac   6840

tgtattctac tgccacattc aacagaagct tacaccctac acttataccc ctagtgcaag   6900

acggagggtg tggggatgtg tgtgtttttt cttatgggga agccattcca ggatgccgta   6960

tattcagtgt tagctaccat tgcaggtcca ctggcaatca ccctactttt tattttgttc   7020

ttatgtgctt agcagaatgg cttgcacata gaaatcctat tcagccttag catgaataca   7080

attgtgccat attgtcaaag ttcttctctg acctccatct cttctacagt catgcacacc   7140

cttagatgta actttacatc gtagtggcat tcaccaaaga catagaatca tacaagggac   7200

tctaggccag caattctcaa cttcgattat gaatattgga accacctgga gagttttcaa   7260

aaatccagtt gcttaggcca taaccagata attatgttga ttatctggcg gtgagactca   7320

ggcatcatta tttttaaacc tccttagtga ttacaatgta cagccatgtc tccaacagcc   7380

actcttctag gtgccactct tctagggtga gtgatagttt agaaaagatt gcagagtcac   7440

agctgtggtc cctgacagtt catgtggtta tttctgatgg atatgcccct gtttcttaat   7500

tttcttatgt tatagtagtt tccgtttgag tcaggggagc atatcaaact ccatttcagc   7560

actggagttt taagtcatag ctctaggatt aaataaagcg acagccctgt atttagtgtg   7620

ttcttattta ttcagtaaag cctcactgtg atgacaaata ttgtatttgt tttagagtgt   7680

tctctttttt ccccaattaa tactttgtat ctctgtagtg tggagaaacc aaagtgccaa   7740

gatatttgaa aagctgaaat ccttcagtat ttttatcaga gcatcacaga tataggagga   7800

agagagaaga ggcttcccaa acaaacatat ctgagggaag ggtaaaggtt gcattgcaag   7860

cttattacac ttctctcctg ataaagttca ctgaatgctc tgtgatatgc tgcaagcagt   7920

tatagagctg tactggcggg ttgctggagc caggggtggg ttgtaaaatg gtttgtggga   7980

aggtctttca ttctgtctct cgcgcttttc tttcttttgc tttagctctt gctctctcca   8040

tctctatttc tctctgcctc tccctctctt tttcaatttt aggccttctt tacagcatat   8100

ccattttgga ggtagttcta taatgtagtg ggctccatga aatcaataaa attaccagtg   8160

ttcacctatt gcattggtag ctgcattctt ttaacttacc taaggagccc agacagacac   8220

taacaagaag gcaatttggc attggaaaaa catcttcttc cttctttgta ccaatctttt   8280

cacctatatg atttattttt gtttaaatta tacatgtacc ttttattggg caaatggtta   8340

gaatgagaga acaaaagctt ttggagcaat tactttaagc cagtcatata attaaaaaaa   8400

tagatgcaaa aagtttgtaa aaggatatta aaaattttaa aactatacat cattaaaata   8460

caaaccagtc cagaaatgta ccaccatttg taatagtcct ttttctcttg cgcgtttcga   8520

atatgctgcc cacatgttag ctggttctcc tagtcaatgg agaaacagcc tctattatca   8580

atttctcatt ggatatcaat gtgaaaactc atgataagat catgatgaat aagctccaga   8640

ttctttttac atgaaatgat gtcttatatg ggaattaata tattgtgaaa tactttggta   8700

cctaaatgta tacatagctt aggatgtcca actgatattg ttctgtttta ggcattctgg   8760

gcataaagcc aaataaccac agtgagactg ggtgtcctat tcataaaatg ggatcttcat   8820

tccctcttcc cttggttctt aattacacat gcacacacac acacactcac gtaaacacac   8880

acacttcatt ttagaagcaa tacaatccca ttatgaaaag ttagtgagga aaaaaatcct   8940

ccataattcc attattataa taagaacata ttgtctggaa gcattcctta cacttttttt   9000

ctaaaatagt cacttctttt aaaaatagtg tatatacaag tctgttattt tttcttttat   9060

caaaagcatt tttatttaca tgttatagta taaaattcac cactaacatt taaatggcta   9120

tctattctat ttggtggatg tagacatata cagtttactt aaacatgccc catttttctc   9180

tttgctatcc taagtaattt taagtggttg tctttgtgaa aaaggttccc cctcccaata   9240

ttttgcatca tttccctaga acggattctc aaaatgtgac tgtcttaatt caccaggcga   9300

tgccacacag agttgttgga gcagcagcag gcatcacaca ttctctaata aataacccat   9360

attgatctct cattttgtga tttatcttgc tctctttgct cttagagctt tgattcatgg   9420

ctccaagggg gcaattttgg aaaatcattt accagctgag acatcctgac tgctgcacat   9480

atgaggtcga ggtggggcag acttgaaaca gagggatctc agatgtgcaa acccagaatc   9540

tcagccactg atactttttt tcaagagaat gatccaaatt ccaggcacac caatagcagg   9600

gagggaacac ggagtttcct ggtctctaaa catggagttt tccatgtttc ctggttttca   9660

tcagcttccc agtgctttcc ctcagacagg gaggcattgc ttccgctgat ggctgagatc   9720

ttgtcctgta aatatgactg tgcaaagcca agttagggaa aagggccagc atgggtgaga   9780

ggttgtggcc tggggcagag ttcaggctgt ggtttctaag tccaatctct tggtacattg   9840

cgaggaatac atctttgtgg cctgacaagc ttaactgatg accttttttc tctctgcttt   9900

ctatcctaca gatgtgaaca aaaagggttt tgtgttttcc cagagtcaga caattccttt   9960

gtgatcctga ctgcagagct aaagaaggca ctcaaggcct ttattgtgtg tctccatgtc  10020

tatatgcacc tgacctgtga acatagcctt tttttcttat gccatgagga ctagataatg  10080

aatcctcctc tctaaggaaa agaccggagg ctacagcaca tccgtgggtg gaagtgggat  10140

agttttcaag tctcctaaga gttctcctgc actgtgtacc tccgtgtaaa ctggagtccg  10200

cctcagggat catggcgttc tgggtggatg ggaagcccat gatgaggagg agtctgaaga  10260

agggatacac tgtggggaca gaggcaggca tcatcctggg gcaggagcag gattccttca  10320

ctgagagctt tgacacaaac cagtccttgg tgggagatat tgaagatgtg aacatgtggg  10380

actttgtgag attagatatt aggttagatt agacagccag atgagattaa tgccatctat  10440

gttggtgcgg ccttcagtcc taatgtccca gactggtgga tgctgacata tgaagtgcac  10500

ggtgaagagt tcaccaagcc ctagtggtgg ccctgaggcc tgactgcagg tcccaaaggt  10560

tcctcctggg attacacctg acatttccct gactttggct ctgaggtctt tttgtcctgc  10620

atacatggct gtctcacccc aagggtcctg tatttatttc ccttctttct tcaccctgct  10680

ttcatcagca caagggccag tgcagagcag agggtcccac tcatggctta gaatcaccag  10740

gctacatccc aggccaatta aatctgattt cctggaggtg agacccaagc atccatgttt  10800

taaaagctct tcaagtgatt ccaatgttct gccaaagctg acagctgttg cctttatgtc  10860

taagagcaaa tgagccagaa tttctctcct aaaaaagaca gcacgtgtcc aactatagtt  10920

ctgccaatat tttcatttgc ctttatccat atacctacca tagtttattg tgctttattg  10980

tattaactaa ggaatacagg agtattttcc agcattctgc cctcatcatt agaatgaggt  11040

cattataaat tagaattatc tttaactttt ttaatccttt ctatttgaag attcaataaa  11100

tctaagacat gttttgtagt tgttgtttaa tttgttctat tttctttctt aaggctggcc  11160

aattttcatt aggtgaaatt tctattggtt tttgttttct tatttatcat ccctcaggtc  11220

acttttttct atgtcctgca tccttatatt ttaagctttt attttttcaa atctctcttc  11280

catattactg atttattttc tgctttgcat attgggatcc ttactttttc taat        11334

<210>2

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>2

ttgtttgcca catggacaga gact                                            24

<210>3

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>3

agagtactaa aacccccaca actg                                            24

<210>4

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>4

agtgccaaga tgtctagaga gtt                                             23

<210>5

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>5

tggacctagg cagtctgatt c                                               21

<210>6

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>6

agtgccaaga tgtctagaga gtt                                             23

<210>7

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>7

cagatggcca ctcgtttaat                                                 20

<210>8

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>8

tcaatcttaa attctatac                                                  19

<210>9

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>9

tgggtgggtc tgaaatatta                                                 20

<210>10

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>10

tctgtctctg ggcctttgtt                                                 20

<210>11

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>11

ttagaattgc cccagcagag                                                 20

<210>12

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>12

cttagtctga cggatccagg t                                               21

Claims (10)

1、一种启动子区域突变的C反应蛋白基因，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2、如权利要求1所述的启动子区域突变的C反应蛋白基因，该基因为冠心病相关基因。

3、一种检测如权利要求1所述的启动子区域突变的C反应蛋白基因的方法，该方法为聚合酶链式反应与限制性片段长度多态性分析相结合或聚合酶链式反应与直接测序法相结合。

4、一种体外检测冠心病相关基因的方法，该方法包括检测C反应蛋白基因-717A/G位点的多态性。

5、如权利要求4所述的检测冠心病相关基因的方法，所述检测C反应蛋白基因-717A/G位点的多态性的方法为聚合酶链式反应与限制性片段长度多态性分析相结合或聚合酶链式反应与直接测序法相结合。

6、一种体外检测待测样品中是否存在冠心病相关基因的方法，该方法包括：

1)提取待测样品的DNA，针对C反应蛋白基因-717A/G位点设计引物进行PCR扩增；

2)对所述的PCR产物进行分析；

3)鉴定C反应蛋白基因-717A/G位点是否为A。

7、如权利要求6所述的体外检测待测样品中是否存在冠心病相关基因的方法，其中对所述的PCR产物进行分析的方法为聚合酶链式反应与限制性片段长度多态性分析相结合或聚合酶链式反应与直接测序法相结合。

8、一种体外预测待测个体冠心病危险性的方法，该方法包括体外检测来自待测个体的样品中C反应蛋白-717A/G位点的多态性，其中携带A等位基因个体患冠心病的危险性比携带G等位基因的个体患冠心病的危险性显著升高。

9、如权利要求8所述的体外预测待测个体冠心病危险性的方法，其中检测来自待测个体的样品中-717A/G位点的多态性的方法为聚合酶链式反应与限制性片段长度多态性分析相结合或聚合酶链式反应与直接测序法相结合。

10、一种体外检测启动子区域多态性的C反应蛋白基因的试剂盒，该试剂盒包含：

1)扩增-717A/G位点的引物；

2)PCR扩增酶及相应缓冲液；

3)检测-717A/G位点多态性的试剂。

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