CN101048504A - 对干扰素治疗肾细胞癌反应的鉴定标记 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了对IFN治疗肾细胞癌反应的鉴定标记，以及检测该标记的方法。即，该方法包括从肾细胞癌病人的标本中制备人基因的基因组DNA或其互补链，分析基因组DNA或其互补链的DNA序列以确定人基因的基因多态性，以及利用该多态性作为指示物评估IFN治疗对肾细胞癌的肿瘤抑制效果。

Description

对干扰素治疗肾细胞癌反应的鉴定标记
技术领域
本发明涉及利用人基因多态性作为指示物(标记)，评估使用干扰素对肾细胞癌的肿瘤抑制效果的方法，在这种方法中使用的寡核苷酸，以及这种基因多态性的检测试剂盒。
背景技术
肾细胞癌是对目前实施的任何治疗，例如，使用化学治疗药物、免疫治疗药物等的药物治疗、放射治疗、外科手术和/或类似方法的反应率都较低的难治性疾病。此外，据报道，到诊断出患有肾细胞癌时已经发展为远程转移的病例高达大约30％。除外科手术外，上述药物治疗中使用干扰素(IFNs)的免疫治疗被认为特别有效；但是，单独施用IFN-α时，通过这种治疗获得的反应率低到只有大约15％，单独施用IFN-γ时，反应率只达到10-15％。即使与抗癌剂组合使用，也没有获得产生的效果比IFN-α单一疗法更高的其他治疗方法。目前实施的使用IFN的免疫疗法主要是单独使用IFN-α或联合使用IFN-γ的长期维持治疗。
与此同时，基因组科学的发展正在快速阐明与药物反应性有关的药物动力学、酶和蛋白质的基因多态性等等。在人基因组分析中，因为最经常发现基因多态性标记，因此单核苷酸多态性(SNPs)已经引起大家注意。已知这种SNPs可用于分析与常见疾病、药物反应等等相关的人基因组(参见非专利文件1、2和3)。也已经已知利用多种SNPs的单倍体分析可用于分析对疾病的易感性(参见非专利文献4)。
近来，为了建立所谓的个体病人定制医学，已经提议研究揭示给定的基因多态性和病人的药物敏感性/药物反应性之间的关系。
预测IFN治疗效果的已知方法是分析HCV(人丙型肝炎病毒(人HCV))感染病人的基因组上的MxA-8/MxA123 MBL-221/MBL-CLD密码子54 SNPs与IFN-α应答者(对该治疗反应性的病人)和非应答者(对该治疗没反应性的病人)之间的关系，从而预测和评估HCV感染的病人对IFN治疗的反应程度(专利文献1)。另一个已知方法利用IFN-α受体2基因的启动子区域和位置134处的SNP作为基因多态性标记来预测IFN治疗反应(专利文献2)。该文件公开的靶疾病从由乙型肝炎、丙型肝炎、恶性胶质瘤、成神经管细胞瘤、星形细胞瘤、皮肤恶性黑色素瘤，类肝炎、肾癌、多发性骨髓瘤、毛细胞白血病、慢性髓细胞性性白血病、亚急性硬化性全脑炎、病毒性脑炎、免疫抑制病人的全身性带状疱疹和水痘、未分化鼻咽癌、伴随听力减退的内耳病毒感染性疾病、疱疹性角膜炎、扁平湿疣、尖锐湿疣、由腺病毒和/或疱疹病毒感染引起的结膜炎、生殖器疱疹、感冒疮、子宫颈癌、癌性胸膜积水、角化棘皮瘤、基底细胞癌和δ型慢性活动型肝炎。
此外，评估IFN-α治疗丙型肝炎的反应的已知方法是测量IRF-1基因启动子区域位置196处的鸟嘌呤(G)被置换成腺嘌呤(A)(参见专利文献3)。
但是迄今为止，还没有文件具体报告IFN对肾细胞癌的治疗反应与给定SNPs之间的关系。
已经报道IFN-α应答者和非应答者的几百个基因表达图谱(参见非专利文献4和专利文献4)。这些图谱是利用如DNA芯片(高密度寡核苷酸或微阵列)、差异显示、差异cDNA阵列、SAGE(基因表达系列分析)、表达序列标签数据库比较等技术产生的。这些方法可用来分析结肠癌、乳癌、卵巢癌、多发性硬化病变、白血病和肾细胞癌中的基因表达。此外非专利文献4还包括了如IRF2、STAT1、STAT2、STAT4、STAT5、STAT6等的基因；但是，没有公开用于本发明的具体基因的SNPs。
[专利文献1]未审查的日本专利出版物No.2003-88382
[专利文献2]未审查的日本专利出版物No.2003-339380
[专利文献3]未审查的日本专利出版物No.2001-136973
[专利文献4]未审查的日本专利出版物No.2004-507253
[非专利文献1]Brookes，A.J.，″The essence of SNPs″，Gene，USA，(1999)，234，177-186
[非专利文献2]Cargill，M，等，″Characterization of single-nucleotidepolymorphisms in coding regions of human genes″，Nature Genet.，USA，(1999)，22，231-238
[非专利文献3]Evans，W.E.，&Relling，M.V.，″Pharmacogenomics：translating functional genomics into rational therapeutics″，Science，USA，(1999)，286，487-491
[非专利文献4]Schlaak，J.F.，et.al.，″Cell-type and Donor-specificTranscriptional Responses to Interferon-α″，J.Biol.Chem.，(2002)277，51，49428-49437
发明公开的内容
发明解决的问题
本发明的主要目标是提供评估使用干扰素对肾细胞癌的治疗反应(肿瘤抑制效果)的方法。
解决问题的方法
为了解决上述问题，本发明的发明人任意挑选了33个基因作为基因多态性分析的候选基因，这些基因包括IFN相关基因、据报道与IFN-γ信号转导有关的基因，以及据报道添加/施用IFN时其表达发生改变的基因。发明人利用公共的多态性数据库搜索了这些候选基因上的SNPs，最终选择出了463个候选SNPs。然后，利用来源于两个病人组：施用IFN-α在肾细胞癌诱导出肿瘤抑制效果的IFN应答者组(对该治疗起反应的病人)和IFN非应答者组(对该治疗不起反应的病人)的基因组DNA样品，确定选择的这些SNPs的频率差异。结果，发明人发现下列8个基因上SNPs在上述两个组之间存在统计学上有意义的差异。
(1)STAT3基因(转录的信号转导物和激活因子3：STAT3(GenBank登记入册号NT_010755))(以下简称″STAT3基因″)、
(2)SSI3基因(细胞因子信号抑制剂3：SSI3(GenBank登记入册号NT_010641))(以下简称″SSI3基因″)、
(3)IL-4R基因(白细胞介素4受体(GenBank登记入册号NT_010393))(以下简称″IL-4R″)、
(4)IRF2基因(干扰素调节因子2：IRF2(GenBank登记入册号NT_022792))(以下简称″IRF2基因″)、
(5)ICSBP基因(干扰素共有序列结合蛋白：ICSBP1(GenBank登记入册号NT_019609)(以下简称″ICSBP1基因″)、
(6)PTGS1基因(前列腺素内过氧化物合酶1：PTGS1(GenBank登记入册号NT_008470)(以下简称″PTGS1基因″)、
(7)PTGS2基因(前列腺素内过氧化物合酶2：PTGS2(GenBank登记入册号NT_004487)(以下简称″PTGS2基因″)、
(8)TAP2基因(转运蛋白，ATP结合盒，主要组织相容性复合物2：TAP2(GenBank登记入册号NT_007592)(以下简称″TAP2基因″)
本发明的发明人更进一步地研究了上述基因上存在的SNPs与IFN治疗肾细胞癌的反应之间的关系。结果，发明人已经证实16个SNPs与施用IFN-α对肾细胞癌的肿瘤抑制效果密切相关，而且发明人也意识到这些SNPs可以作为评估IFN治疗后的肿瘤抑制效果的标记。更具体地说，发明人已经发现检测这些SNPs能够预测施用的IFN对肾细胞癌的肿瘤抑制效果(治疗反应)(预测性诊断)。发明人以这些发现为基础，通过更进一步的研究完成了本发明。
本发明提供了如下文1-11条所描述的评估对肾细胞癌病人进行IFN治疗后的肿瘤抑制效果的方法。
条款1.一种评估IFN治疗对肾细胞癌病人的肿瘤抑制效果的方法，该方法包括下列步骤(i)到(iv)；
(i)获取来源于肾细胞癌病人的基因样品(基因组DNA样品)的步骤、
(ii)利用在上述步骤(i)中获得的基因样品，制备选自STAT3基因、SSI3基因、IL-4R基因、IRF2基因、ICSBP基因、PTGS1基因、PTGS2基因和TAP2基因中的至少一个基因的基因组DNA或其互补链的步骤、
(iii)分析基因组DNA或其互补链的DNA序列，并确定其基因多态性、和
(iv)利用上述步骤(iii)中确定的至少一个基因多态性作为标记，评估IFN治疗对肾细胞癌病人的肿瘤抑制效果。
条款2.一种依照条款1的评估IFN治疗对肾细胞癌病人的肿瘤抑制效果的方法，其中基因多态性是选自STAT3基因、IL-4R基因、IRF2基因和TAP2基因中的至少一个基因的多态性。
条款3.一种依照条款1的评估IFN治疗对肾细胞癌病人的肿瘤抑制效果的方法，其中基因多态性是选自下列(a)到(p)的至少一种多态性：
(a)在STAT3基因的位置4243095处具有基因型C/T或T/T的基因多态性(STAT3-2)，用参考的SNP ID编号：rs1905341表示、
(b)在STAT3基因的位置4264926处具有基因型C/C的基因多态性(STAT3-3)，用参考的SNP ID编号：rs4796793表示、
(c)在STAT3基因的位置4204027处具有基因型G/G的基因多态性(STAT3-17)，用参考的SNP ID编号：rs2293152表示、
(d)在STAT3(KCNH4)基因的位置4050541处具有基因型C/T的基因多态性(STAT3-18)，用参考的SNP ID编号：rs2293153表示、
(e)在SSI3基因的位置10246541处具有基因型A/C的基因多态性(SSI3-1)，用参考的SNP ID编号：rs2280148表示、
(f)在IL-4R基因的位置18686025处具有基因型A/A的基因多态性(IL-4R-22)，用参考的SNP ID编号：rs1805011表示、
(g)在IRF2基因的位置17736877处具有基因型A/A的基因多态性(IRF2-67)，用参考的SNP ID编号：rs2797507表示、
(h)在IRF2基因的位置17744613处具有基因型C/C的基因多态性(IRF2-82)，用参考的SNP ID编号：rs796988表示、
(i)在ICSBP基因的位置390141处具有基因型A/A或A/C的基因多态性(ICSBP-38)，用参考的SNP ID编号：rs2292982表示、
(j)在PTGS1基因的位置26793813处具有基因型C/T的基因多态性(PTGS1-3)，用参考的SNP ID编号：rs1213264表示、
(k)在PTGS1基因的位置26794182处具有基因型C/T的基因多态性(PTGS1-4)，用参考的SNP ID编号：rs1213265表示、
(l)在PTGS1基因的位置26794619处具有基因型A/G的基因多态性(PTGS1-5)，用参考的SNP ID编号：rs1213266表示、
(m)在PTGS2基因的位置15697329处具有基因型G/G的基因多态性(PTGS2-12)，用参考的SNP ID编号：rs2745557表示、
(n)在TAP2基因的位置23602539处具有基因型G/G的基因多态性(TAP2-5)，用参考的SNP ID编号：rs2071466表示、
(o)在IL-4R基因的位置18686068处具有基因型C/C的基因多态性(IL-4R-14)，用参考的SNP ID编号：rs2234898表示、
(p)在IL-4R基因的位置18686553处具有基因型T/T的基因多态性(IL-4R-29)，用参考的SNP ID编号：rs1801275表示。
条款4.一种依照条款3的评估IFN治疗对肾细胞癌病人的肿瘤抑制效果的方法，其中基因多态性是条款3的(a)、(f)、(h)、(n)、(o)和(p)中的任何一种。
条款5.一种依照条款1-4中任何一项的评估IFN治疗对肾细胞癌病人的肿瘤抑制效果的方法，其中IFN选自IFN-α、重组IFN-α和重组IFN-γ。
条款6.一种依照条款1-5中任何一项的方法，其中基因多态性是通过选自直接测序、等位基因特异的寡核苷酸(ASO)-斑点印迹分析、单核苷酸引物延伸法、PCR单链构象多态性(SSCP)分析、PCR限制性片断长度多态性(RFLP)分析、侵入方法、定量实时PCR和使用质谱仪的质谱阵列中的至少一种方法确定的。
条款7.依照条款6的方法，其中通过侵入方法或直接测序确定基因多态性。
条款8.依照条款6的方法，其中通过PCR-RFLP分析确定基因多态性。
条款9.依照条款8的方法，其中利用限制性内切酶Mspl，用PCR-RFLP分析检测人STAT3基因内含子4204027处的G到C突变：rs2293152。
条款10.依照条款6的方法，其中利用选自下列(a)到(p)中的至少一种寡核苷酸作为基因多态性检测探针或引物确定基因多态性：
(a)具有由包含基因多态性位点的至少10个连续碱基组成的序列的寡核苷酸，其中基因多态性位点是在STAT3基因的位置4243095具有基因型C/T或T/T的由参考SNP ID编号：rs1905341表示的基因多态性位点，
(b)具有由包含基因多态性位点的至少10个连续碱基组成的序列的寡核苷酸，其中基因多态性位点是在STAT3基因的位置4264926具有基因型C/C的由参考SNP ID编号：rs4796793表示的基因多态性位点，
(c)具有由包含基因多态性位点的至少10个连续碱基组成的序列的寡核苷酸，其中基因多态性位点是在STAT3基因的位置4204027具有基因型G/G的由参考SNP ID编号：rs2293152表示的基因多态性位点，
(d)具有由包含基因多态性位点的至少10个连续碱基组成的序列的寡核苷酸，其中基因多态性位点是在STAT3(KCNH4)基因的位置4050541具有基因型C/T的由参考SNP ID编号：rs2293153表示的基因多态性位点，
(e)具有由包含基因多态性位点的至少10个连续碱基组成的序列的寡核苷酸，其中基因多态性位点是在SSI3基因的位置10246541具有基因型A/C的由参考SNP ID编号：rs2280148表示的基因多态性位点，
(f)具有由包含基因多态性位点的至少10个连续碱基组成的序列的寡核苷酸，其中基因多态性位点是在IL-4R基因的位置18686025具有基因型A/A的由参考SNP ID编号：rs1805011表示的基因多态性位点，
(g)具有由包含基因多态性位点的至少10个连续碱基组成的序列的寡核苷酸，其中基因多态性位点是在IRF2基因的位置17736877具有基因型A/A的由参考SNP ID编号：rs2797507表示的基因多态性位点，
(h)具有由包含基因多态性位点的至少10个连续碱基组成的序列的寡核苷酸，其中基因多态性位点是在IRF2基因的位置17744613具有基因型C/C的由参考SNP ID编号：rs796988表示的基因多态性位点，
(i)具有由包含基因多态性位点的至少10个连续碱基组成的序列的寡核苷酸，其中基因多态性位点是在ICSBP基因的位置390141具有基因型A/A或A/C的由参考SNP ID编号：rs2292982表示的基因多态性位点，
(j)具有由包含基因多态性位点的至少10个连续碱基组成的序列的寡核苷酸，其中基因多态性位点是在PTGS1基因的位置26793813具有基因型C/T的由参考SNP ID编号：rs1213264表示的基因多态性位点，
(k)具有由包含基因多态性位点的至少10个连续碱基组成的序列的寡核苷酸，其中基因多态性位点是在PTGS1基因的位置26794182具有基因型C/T的由参考SNP ID编号：rs1213265表示的基因多态性位点，
(l)具有由包含基因多态性位点的至少10个连续碱基组成的序列的寡核苷酸，其中基因多态性位点是在PTGS1基因的位置26794619具有基因型A/G的由参考SNP ID编号：rs1213266表示的基因多态性位点，
(m)具有由包含基因多态性位点的至少10个连续碱基组成的序列的寡核苷酸，其中基因多态性位点是在PTGS2基因的位置15697329具有基因型G/G的由参考SNP ID编号：rs2745557表示的基因多态性位点，
(n)具有由包含基因多态性位点的至少10个连续碱基组成的序列的寡核苷酸，其中基因多态性位点是在TAP2基因的位置23602539具有基因型G/G的由参考SNP ID编号：rs2071466表示的基因多态性位点，
(o)具有由包含基因多态性位点的至少10个连续碱基组成的序列的寡核苷酸，其中基因多态性位点是在IL-4R基因的位置18686068具有基因型C/C的由参考SNP ID编号：rs2234898表示的基因多态性位点，和
(p)具有由包含基因多态性位点的至少10个连续碱基组成的序列的寡核苷酸，其中基因多态性位点是在IL-4R基因的位置18686553具有基因型T/T的由参考SNP ID编号：rs1801275表示的基因多态性位点。
条款11.依照条款6的方法，其中基因多态性检测引物对是下列(a)到(p)中的任何一个：
(a)由SEQ ID Nos.1和17代表的序列组成的寡核苷酸引物对，
(b)由SEQ ID Nos.2和18代表的序列组成的寡核苷酸引物对，
(c)由SEQ ID Nos.3和19代表的序列组成的寡核苷酸引物对，
(d)由SEQ ID Nos.4和20代表的序列组成的寡核苷酸引物对，
(e)由SEQ ID Nos.5和21代表的序列组成的寡核苷酸引物对，
(f)由SEQ ID Nos.6和22代表的序列组成的寡核苷酸引物对，
(g)由SEQ ID Nos.7和23代表的序列组成的寡核苷酸引物对，
(h)由SEQ ID Nos.8和24代表的序列组成的寡核苷酸引物对，
(i)由SEQ ID Nos.9和25代表的序列组成的寡核苷酸引物对，
(j)由SEQ ID Nos.10和26代表的序列组成的寡核苷酸引物对，
(k)由SEQ ID Nos.11和27代表的序列组成的寡核苷酸引物对，
(l)由SEQ ID Nos.12和28代表的序列组成的寡核苷酸引物对，
(m)由SEQ ID Nos.13和29代表的序列组成的寡核苷酸引物对，
(n)由SEQ ID Nos.14和30代表的序列组成的寡核苷酸引物对，
(o)由SEQ ID Nos.15和31代表的序列组成的寡核苷酸引物对，以及
(p)由SEQ ID Nos.16和30代表的序列组成的寡核苷酸引物对。
发明的效果
本发明提供了检测对IFN治疗肾细胞癌反应的鉴定标记的方法，特别是包括检测来自肾细胞癌病人标本的特定的人基因多态性或基因型和评估所述病人的IFN治疗反应(肿瘤抑制效果)的方法，用于该方法的试剂盒、基因多态性、基因型和用于该方法和试剂盒的基因型检测探针和引物。他们在实施个体病人定制医学中可用于确定药物选择优先级。
实施本发明的最佳方式
在本说明书中使用的氨基酸、肽、碱基序列、核酸等等的缩写与IUPAC-IUB规则(IUPAC-IUB  communication on BiologicalNomenclature，Eur.J.Biochem.，138：9(1984))，(″Enki-hairetsu matahaaminosan-hairetsu wo fukumu meisaisho nado no sakusei no tamenogaidorain″(准备含有碱基序列或氨基酸序列的说明书的指南Guidelinesfor preparation of specifications containing base sequences or amino acidsequences″(由日本专利局汇编)和相关领域使用的标准符号一致。
本说明书中使用的″基因多态性″和″多态性″指占据一个位点的多种等位基因群或这种群中的个体等位基因。在这些多态性中，只有一个核苷酸不同的那些多态性被定义为单核苷酸多态性或SNP。单核苷酸多态性在本说明书中缩写为″SNP″。
单倍体标明了上述基因多态性(SNPs)的种类，以在连续的基因区域或基因群组中的多个SNP位点中的等位基因的种类和数量为基础表示。
在本说明书中，基因型指给定基因多态性位点中的基因位点的等位基因状况。例如，在STAT3基因的位置4243095处的SNP基因型(STAT3-2)表示为C/T杂合型或T/T纯合型。这也可以表示为″STAT3-2 C/T或T/T″。当病人具有基因型STAT3-2 C/T或T/T时，预计病人可能对IFN治疗肾细胞癌(肿瘤抑制效果)作出响应(PR：部分响应)或作出很好的响应(CR：完全响应)。因此，基因型STAT3-2C/T或T/T可用作鉴定对IFN治疗肾细胞癌反应的鉴定标记。
本说明书中标明的人基因的基因组序列与在核酸序列数据库NCBI(国家生物技术信息中心)(National Center for BiotechnologyInformation)登记的GenBank登录号(e.g.：NT_010641)下的核酸序列一致。同样，在NCBI的SNP数据库中的参考SNP ID编号(例如rs1213265)(参见参考SNP(refSNP)群报告，在<http//www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP>中可找到)下也可以发现在本发明中被称为人基因多态性的SNPs的位点信息和核酸突变信息。也可以依照参考SNP ID编号标明本说明书中使用的SNP信息。
表1显示从GenBank中获得的关于基因序列、mRNA序列、SNP位点和核酸突变的基本信息。
表1
  基因   Rs#   核酸 毗连群登记   毗连群位置   mRNA mRNA方向 蛋白质 位点 dbSNP等位基因 氨基酸残基 密码子位置 氨基酸序列信息   备注
  STAT3-2   rs1905341   C/T NT_010755   4243095   NM_003150 反向 未翻译的
  STAT3-3   rs4796793   G/C NT_010755   4264708 基因座
  STAT3-18   rs2293153   C/T NT_010755   4050541   NM_012285 反向 NP_036417 内含子   KCNH4
  STAT3-17   rs2293152   G/C NT_010755   4204027   NM_003150 反向 NP_003141 内含子
  SSI3-1   rs2280148   A/C NT_010641   10246541 基因座
  IL-4R-14   rs2234898   A/C NT_010393   18686068   NM_000418 正向 NP_000409 同义毗连群参考 TT Leu[L]Leu[L] 33 414433
  IL-4R-29   rs1801275   C/T NT_010393   18686553   NM_000418 正向 NP_000409 非同义毗连群参考 GA Arg[R]Gln[Q] 22 576576
  IL-4R-22   rs1805011   C/A NT_010393   18686025   NM_000418 正向 NP_000409 非同义毗连群参考 CA Ala[A]Glu[E] 22 400400
  IRF2-67   rs2797507   A/C NT_022792   17736877   NM_002199 反向 NP_002190 内含子
  IRF2-82   rs796988   C/T NT_022792   17744613   NM_002199 反向 NP_002190 内含子
  ICSBP-38   Rs2292982   A/C NT_019609   390141   NM_002163 正向 NP_002154 内含子
  PTGS1-3   Rs1213264   C/T NT_008470   26793813   NM_080591 正向 NP_542158 内含子
  PTGS1-4   Rs1213265   C/T NT_008470   26794182   NM_080591 正向 NP_542158 内含子
  PTGS1-5   Rs1213266   A/G NT_008470   26794619   NM_080591 正向 NP_542158 内含子
  PTGS2-12   Rs2745557   A/G NT_004487   15697329   NM_000963 反向 NP_000954 内含子
  TAP2-5   Rs2071466   G/A NT_007592   23602539   NM_018833 反向 NP_061313 内含子
在表1中，基因下的那列显示其中包含本发明的发明人发现的SNPs的基因的名称，后面是发明人任意分配的SNP编号。在该表中，″rs#_″表示参考SNPs的登录号，″核酸″表示核酸突变(A/G指其中A转变为G的SNP)，″毗连群登记″表示基因组重叠群序列的登录号，″毗连群位置″表示表明基因组序列中核酸突变的位置的位置编号，″mRNA″表示mRNA序列号的登录号，″mRNA方向″表示包含基因多态性序列的mRNA的方向。更进一步地，″蛋白质″表示蛋白质序列的登录号，″位置″表示其上存在基因多态性的位点的信息，″dbSNP等位基因″表示互补双链上的等位基因的核酸信息，″氨基酸残基″表示那些被改变(被替换)的氨基酸残基，″密码子位点″表示核酸编码的氨基酸的密码子位点信息，“氨基酸序列信息”表示氨基酸序列的位点上的信息，以及″备注″表示基因的同义词。
如表1所示，仅仅在与IL-4R有关的基因多态性中鉴定到用于本发明的方法的由特定的人基因多态性引起的氨基酸替换，其他基因的基因多态性没有引起氨基酸替换。
用于本说明书的术语″基因″不仅包括双链DNAs，而且包括组成双链DNAs的单链DNAs(有义链和反义链)。更具体地说就是，除非另作说明，否则依照本发明的基因(DNAs)包括包含人基因组DNAs的双链DNAs、包含cDNAs的单链DNAs(有义链)、具有与所述有义链互补的序列的单链DNAs，以及其片段。更进一步地，所述基因(DNAs)可以包含调节区域、编码区域、外显子和内含子。多核苷酸包括RNA和DNA。DNA包括cDNA、基因组DNA和合成DNA。多肽包括其片段、同源物、衍生物和变异体。更进一步地，变异体指天然发生的等位基因变异体、非天然发生的那些等位基因变异体、被修饰(缺失、替换、添加和插入)的那些变异体，以及基本上不改变编码多肽功能的多核苷酸序列。例如，氨基酸序列的修饰可以通过突变和翻译后修饰天然地发生，或者可以利用天然发生的遗传元件人工促成这种修饰。
本发明的实现是基于发现在人基因(IFN基因，据报道与IFN-γ信号转导系统有关的基因，以及据报道添加/施用IFN时其表达发生改变的基因)的给定位点处包含基因型的基因多态性，特别是SNP或SNPs与IFN治疗对肾细胞癌病人的肿瘤抑制效果密切相关，以及检测这种基因多态性(给定位点的基因型)能够评价肾细胞癌病人对IFN治疗的反应。换句话说，本发明是基于发现某些人基因多态性，特别是特定的SNPs可用作评价对肾细胞癌的IFN治疗的反应的标记而实现的。依照本发明，检测来自肾细胞癌病人的标本的特定SNPs能够预测肾细胞癌病人对IFN治疗的反应。
本发明基本上需要检测来自肾细胞癌病人标本的特定的人基因多态性，即由STAT3-2、STAT3-3、STAT3-17、STAT3-18、SSI3-1、IL-4R-14、IL-4R-22、L-4R-29、IRF2-67、IRF2-82、ICSBP-38、PTGS1-3、PTGS1-4、PTGS1-5、PTGS2-12和TAP2-5组成的基因多态性(基因型)。
待通过本发明的方法检测(分型)的SNPs，即与IFN治疗对肾细胞癌病人的肿瘤抑制效果有关的基因多态性(或基因型)更具体地显示在下列的(a)到(p)中。
(a)在STAT3基因的位置4243095处具有基因型C/T或T/T的基因多态性(STAT3-2)，用参考的SNP ID编号：rs1905341表示、
(b)在STAT3基因的位置4264926处具有基因型C/C的基因多态性(STAT3-3)，用参考的SNP ID编号：rs4796793表示、
(c)在STAT3基因的位置4204027处具有基因型G/G的基因多态性(STAT3-17)，用参考的SNP ID编号：rs2293152表示、
(d)在STAT3(KCNH4)基因的位置4050541处具有基因型C/T的基因多态性(STAT3-18)，用参考的SNP ID编号：rs2293153表示、
(e)在SSI3基因的位置10246541处具有基因型A/C的基因多态性(SSI3-1)，用参考的SNP ID编号：rs2280148表示、
(f)在IL-4R基因的位置18686025处具有基因型A/A的基因多态性(IL-4R-22)，用参考的SNP ID编号：rs1805011表示、
(g)在IRF2基因的位置17736877处具有基因型A/A的基因多态性(IRF2-67)，用参考的SNP ID编号：rs2797507表示、
(h)在IRF2基因的位置17744613处具有基因型C/C的基因多态性(IRF2-82)，用参考的SNP ID编号：rs796988表示、
(i)在ICSBP基因的位置390141处具有基因型A/A或A/C的基因多态性(ICSBP-38)，用参考的SNP ID编号：rs2292982表示、
(j)在PTGS1基因的位置26793813处具有基因型C/T的基因多态性(PTGS1-3)，用参考的SNP ID编号：rs1213264表示、
(k)在PTGS1基因的位置26794182处具有基因型C/T的基因多态性(PTGS1-4)，用参考的SNP ID编号：rs1213265表示、
(l)在PTGS1基因的位置26794619处具有基因型A/G的基因多态性(PTGS1-5)，用参考的SNP ID编号：rs1213266表示、
(m)在PTGS2基因的位置15697329处具有基因型G/G的基因多态性(PTGS2-12)，用参考的SNP ID编号：rs2745557表示、
(n)在TAP2基因的位置23602539处具有基因型G/G的基因多态性(TAP2-5)，用参考的SNP ID编号：rs2071466表示、
(o)在IL-4R基因的位置18686068处具有基因型C/C的基因多态性(IL-4R-14)，用参考的SNP ID编号：rs2234898表示、和
(p)在IL-4R基因的位置1868553处具有基因型T/T的基因多态性(IL-4R-29)，用参考的SNP ID编号：rs1801275表示。
依照本发明，检测特定的人基因多态性(SNPs和单倍体)和/或基因型可以提供对理解和阐明肾细胞癌的肿瘤抑制效果和机制(IFN的肿瘤抑制效果)有用的的信息和方法，其可预测诊断肾细胞癌治疗等等。更进一步地，依照本发明的这种检测可以提供确定肾细胞癌病人治疗方案的有效信息，特别是确定在实施适合个体肾细胞癌病人的定制医学的过程中是否应当施用IFN作为治疗方案的重要信息。
在本发明中，用于肾细胞癌病人的IFN治疗的IFN实例包含天然IFN-α、重组IFN-α和重组IFN-γ等等。这些IFNs可以包括在本发明的方法中，不仅可以单独使用，而且可以与免疫治疗药物、化疗药物等等组合使用。
获取包含基因多态性(SNPs)的人基因
下文详细描述了本发明。在本发明中，首先获取来自肾细胞癌病人的基因样品作为标本(步骤i)。获取的基因样品包含特定的基因多态性(SNPs)，更具体地包含上述(a)到(p)的基因多态性中的任何一种。这种样品的可用实例有通过常规方法从肾细胞癌病人中提取的cDNA和基因组DNA。样品可以是包含上述基因多态性的DNA的互补链。
cDNA或基因组DNA样品来源的实例包括各种细胞、组织、从其中衍生的培养细胞等等。更具体的实例包括体液，例如血液、唾液、淋巴、呼吸道粘液、尿、精液等等。来源于上述来源的作为标本的样品优选来源于施用IFN(除已经施用IFN以外的药物的病例以外，还特别包括施用任何药物的病例)之前的病人的DNA或基因组DNA。可以依照标准方法实施从这些原始样品中分离RNA、分离和纯化mRNA、合成cDNA和克隆的过程。
在本发明的方法中，制备来自上述基因样品的特定人基因的基因组序列或其互补链(例如包含上述(a)到(p)的基因多态性中的任何一种的基因或其互补链))(步骤ii)。
按照常规的基因工程技术，参考本说明书中公开的包含上述SNPs(a)到(p)中任何一种的基因的具体序列信息可以很容易地实施这一制备过程[Molecular Cloning，2nd edition，Cold Spring Harbor Lab.Press(1989)；Zoku Seikagaku Jikken Koza：Idenshi Kenkyuho I，II，III(″Biochemistry Experiment Lecture Part II：Gene Studies I，II，III″)，由日本生物化学协会1986年汇编等]。特别地，依据标准方法(例如参见Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.，78，6613(1981)；Science，222，778(1983)))))等)，利用针对(a)到(p)中任何具体基因型的适当探针或限制性内切酶可以实施从肾细胞癌病人提取包含如上所述(a)到(p)的任何基因多态性的cDNA或基因组DNA的制备过程。更具体地说，通过制备包含基因型位点、能选择性结合想要SNPs的DNA序列的探针，并使用这种探针实施单核苷酸引物延伸、侵入方法、实时定量PCR等等可以实现这一制备过程。
可用的筛选引物有基于目的基因的核酸序列信息设计的正向和反向引物。可以遵循标准方法，使用例如自动合成器合成这些引物。典型地可以标记这种筛选探针；但是，也可以使用非标记探针，只要他们能直接或间接地特异结合标记的配体就可以。探针和配体的标记试剂和标记技术在相关技术领域是公知的。实例包括可以通过切口平移、随机引物法、激酶处理等等转移的放射性试剂、生物素、荧光染料、化学发光试剂、萤光素酶和类似的酶、抗体等等。
可以通过基因扩增方法扩增提取的DNA或mRNA。通过扩增本发明的方法能够实现更容易和更准确的检测。基因扩增方法的实例包括PCR方法(Saiki，R.K.，Bugawan，T.L.等，Nature，324，163-166(1986))，NASBA方法(Comptom，J.，Nature，650，91-92(1991))，TMA方法(Kacian，D.L.，and Fultz，T.J.，美国专利No.5,399,491(1995))，SDA方法(Walker，G.T.，Little，M.C.等，Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.，89，392-396(1992))。
通过凝胶电泳或使用柱可以实现PCR方法扩增的基因片段的分离和纯化。通过，例如：质谱法或凝胶琼脂糖电泳可以证实这些性能。依照扩增基因的特性，可以对利用这些方法扩增的基因检测本发明的(a)到(p)的基因多态性(SNPs)(SNP分型)。
SNP分型
依照本发明的方法，对上述标本的给定基因区域中的DNA进行测序和分析，并检测其SNPs(SNP分型)(步骤iii)。可以通过下列(1)到(8)的方法进行分型。
(1)核苷酸直接测序
采用用于确定这类基因的核酸序列通常使用的核苷酸直接测序法，例如双脱氧法(Sanger等，Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.，74，5463-5467(1977))、Maxim-Gilbert方法(Methods in Enzymology，65，499(1980))等，通过对给定基因进行DNA测序可以检测基因多态性。通过将核苷酸直接测序法与DNA扩增法，例如PCR方法组合也可以有效检测基因多态性。特别优选实施PCR方法或与其等同的DNA扩增方法与该直接测序法组合的方法，因为这种组合方法方便，而且容易操作，尽管只需要少量的DNA样品，但仍然可以实现灵敏准确的检测。
例如，依照双脱氧法、Maxum-Gilbert法等对PCR方法扩增的基因片段或其纯化产物进行直接测序，基本上可以实施这种优选方法。或者，可以通过使用商品化的序列分析试剂盒确定核苷酸序列很容易地实施这种方法。因此，可以检测具体人基因的上述给定位置存在/缺少SNPs。
在上下文的方法中通过PCR扩增的DNA片段是不受限制的，只要他们包含至少一个特殊位点就可以，其中推测会在该特殊位点发现以前提到的变异。可使用的DNA片段典型地由大约50到大约数千个碱基组成，更优选由大约50到大约几百个碱基组成。
(2)等位基因特异的寡核苷酸(ASO)斑点印迹分析
检测特定基因上的多态性的另一个方法是进行等位基因特异的寡核苷酸(ASO)斑点印迹分析(Conner，B.J.等，Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.，80，278-282(1983))。利用设计将靶SNP夹在中间的正向和反向引物，通过让可与PCR扩增基因片段的等位基因特异的寡核苷酸探针杂交的DNA片段进行斑点印迹分析可以实施该方法。用这种方式可以检测这种DNA片段上的SNP。
(3)单核苷酸引物延伸法
通过单核苷酸引物延伸法，例如SNaPshot法、焦磷酸测序(pyrosequencing)和未审查的日本专利出版物No.2000-279197中公开的点突变检测为基础的方法也可以实现对特定基因的多态性检测。在这些方法中，设计探针使其正好与紧接在靶SNP前的序列或靶SNP几个碱基前的序列匹配，即设计探针使其3′末端位于检测靶突变上游一个碱基或靠近检测靶突变，该探针与DNA标本进行退火。可以利用市场上的SNPs检测试剂盒和其随附的软件实施这些方法。
例如：利用ABI PRISM SnaPshot ddNTP引物延伸试剂盒(AppliedBiosystems制造)可以实施SnaPshot方法。在ABIPRISM310/377/3100/3700 DNA分析器(全部由Applied Biosystems制造)和GeneScan软件上，通过利用反应后产生的荧光片段可以对SNPs进行分型。
可以按照如下描述进行焦磷酸测序。遵循标准方式从血液样品等中分离基因组DNA，利用生物素标记的引物PCR扩增包含突变的几十到数百个碱基，利用磁珠纯化单链DNA并将纯化的DNA用作标本。将该标本与设计用于从靶基因多态性上游的几个碱基进行测序的引物退火，然后依照靠近进入软件分析中的基因多态性的序列每次添加一种dNTP以引发反应。因为DNA聚合酶延伸核酸时会形成焦磷酸盐(PPi)，PPi通过硫酸化酶会产生ATP。利用发光检测器、CCD摄像机等可以确定萤光素酶与ATP底物反应发射的光。因此，依照添加的dNTPs，通过发射光的峰值分析进行靶基因分型是可能的。该方法在大约15分钟可以对96个样品进行分型。
常见的试剂和设备都可用于上述方法。可使用的试剂实例包括由DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、萤光素酶，腺苷三磷酸双磷酸酶组成的酶混合物、由萤光素和APS(腺苷5′磷酸盐硫酸盐)组成的底物液体、市场上买到的包含dNTP作为成分的SNP试剂盒，其中dNTP由dATP(脱氧腺苷三磷酸)、dCTP、dGTP和dTTP组成(Pyrosequending AB制造)等等。可使用的设备实例包括用于自动DNA序列分析的PSQ96系统(Pyrosequending AB)和使用该系统的SNP软件(PyrosequendingAB)。
可以依照美国专利No.6,159,693说明书中的描述实施焦磷酸测序，即分离核酸并通过PCR进行扩增，纯化扩增的PCR产物，利用READITTM系统(Promega Corporation)与焦磷酸盐反应，然后分析获得的数据。可以使用利用READIT技术(Promega Corporation)的市场上可买到的Excel程序进行这种数据分析。
(4)PCR单链构象多态性(SSCP)分析
更进一步地，可以通过PCR-SSCP分析实现用本发明方法检测基因多态性的过程(Orita，M.，Iwahara，H.等，Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.，86，2776-2770(1989))。在该方法中，让PCR扩增产物(单链DNA)进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，从而以每个PCR产物迁移的差异为基础鉴定存在或缺少单核苷酸多态性。
(5)PCR限制性片段长度多态性(RFLP)分析
为了检测本发明的特异基因上的SNPs或单倍体，当包含待检测的靶多态性的核酸序列也包含限制性内切酶识别部位时，也可以通过限制性片断长度多态性(RFLP)分析完成检测(Botstein，D.R.等，Am.J.Hum.Gen.，32，314-331(1980))。
更具体地说，可以按照如下描述对如上所述基因多态性(a)到(p)的给定位点上的基因型实施RFLP分析。取如上所述的基因(c)上的给定位点的基因型作为一个例子，为了检测STAT3基因的基因组序列位置4204027具有基因型G/G的基因多态性[STAT3-17]，可以利用不仅识别靶基因型位点，而且也识别该位点上下游的限制性内切酶进行RFLP分析。用于RFLP分析的酶可以是能识别靶基因型位点和该位点上下游序列的各种已知的限制性内切酶。象这样的具体实例有Mspl。
更优选通过PCR-RFLP法实施RFLP分析，即预先通过PCR或其修饰的方法扩增和制备DNA标本，并对大量制备的浓缩DNA样本进行RFLP分析。因此，可以检测其中位点被特异切割的靶基因多态性。
依据这种基因多态性检测方法，首先从人标本中提取基因组DNA，通过PCR等扩增包含所述基因的基因多态性位点的DNA片段，从而获得大量浓缩的基因样品。然后利用特定的限制性内切酶切割扩增的DNA样本，并遵循标准方法研究切割的DNA(存在或缺少切割，切割片段的碱基长度)。
(6)侵入方法
还可以通过侵入方法(invader method)实施对本发明特异基因的SNPs的检测。可以参考下列文件实施侵入方法；
Lyamichev，V.等，Nat.Bioltechnol.，17(3)292-296(1999)和国际专利出版物No.WO9823774(未审查的专利出版物No.2001-526526)。
这些出版物中公开的方法分析基因组DNA上的SNPs时不需要预先扩增靶DNA，它是按照如下描述实施的。
为了检测具体靶基因，例如(a)、(b)，以及(d)到(p)中描述的基因中SNPs的存在，首先分离基因组DNA，然后利用，例如自动化合成器合成探针。首先设计待合成的由30到几百个碱基组成的靶寡核苷酸探针，使其具有15到50个碱基的5′翼，在所述5′翼的3′末端侧面上具有待检测的核酸(本发明中的SNP)，并与除靶基因型核酸外的靶基因组DNA互补。由15或更多碱基组成的侵入寡核苷酸探针被设计成与靶基因组DNA互补，而且在其3′末端具有与待检测核酸的互补的核酸。分离的基因组DNA和切割第一个探针5′翼(翼核酸内切酶)的酶同时添加到这些探针中，在适当的反应混合物中进行反应。
当标本中的基因组DNA包含想要的SNP时，完成其中3′末端具有基因型的核酸的5′翼被分离的第一反应。当标本中的基因组DNA不包含该基因型核酸序列时，上述酶不发生切割。
通过酶切割从第一探针分离的5′翼互补结合作为靶的荧光共振能量传递(FRET)探针，5′翼的3′末端侵入到FRET探针当中。同样，上述酶可以引起反应，从而分离已经被淬灭的荧光染料。
尽管第二个反应中使用的FRET探针是待检测的靶，但它包含相同的序列，而且构建的这种探针基本上包含下列两个元件。
(1)与第一个反应中的分离产物互补的3′区域，和
(2)包含报告荧光染料和淬灭荧光染料的自身互补区域，其形成双链体以模仿单链探针与靶杂交。
当上述报告荧光染料附着于其上也附着有上述淬灭荧光染料的探针上时，由于荧光共振能量传递报告染料被淬灭。当它不附着于具有上述淬灭荧光染料的探针上时，报告染料不被淬灭。因此，当通过切割从第一探针分离的5′翼与FRET探针杂交时，所述翼在第二反应中作为侵入寡核苷酸起作用，因此产生被酶特异识别的被入侵复合物。因此，上述特定酶切割FRET探针可以分离两种荧光染料，并产生可检测的荧光信号。通过在标准荧光微量滴定板读数器上读出这种荧光信号可以检测包含想要SNPs的基因多态性。通过组合第一和第二反应可以将荧光信号放大1至106倍。更具体地说，使用不同荧光染料的两个FRET探针可以实施SNP分型。
(7)实时定量PCR
本发明通过实时定量PCR(TaqMan方法)可以很容易地对特定基因上的基因多态性进行检测。
可以按照如下描述实施该方法。为了检测包含靶SNP的基因多态性，制备用于检测其上适当区域包含多态性(核酸位点)的DNA片段的正向和反向引物，每个引物由15到39个碱基组成。但是，设计的正向和反向引物不包含靶核酸位点(单核苷酸基因型)。然后制备探针，探针是具有由15到50个碱基组成的碱基序列的其上附着有报告荧光染料和淬灭荧光染料的寡核苷酸。必须挑选这种探针的碱基序列使正向引物的杂交区域不与探针的杂交区域重叠。设计探针使其具有与等位基因特异序列互补的序列，以检测存在/缺少靶单核苷酸基因型。使用这种探针，通过PCR扩增标本中待测的给定基因，例如上述(a)到(p)描述的基因中的目的DNA片段，并实时测量反应混合物产生的荧光量。这样就能实现SNP分型了。更具体地说，可以使用不同荧光染料的两种探针实施SNP检测(分型)。
在上述侵入分析和TaqMan方法中使用的报告荧光染料的优选实例包括荧光素型荧光染料，例如FAM(6-羧基荧光素)，淬灭荧光染料的优选实例包括若丹明型荧光染料，例如TAMRA(6-羧基-四甲基-若丹明)。这些荧光染料为大家所熟知，为方便使用可将他们包括在市场上可买到的实时PCR试剂盒中。报告荧光染料和淬灭荧光染料的结合部位不受限制，但是报告荧光染料典型地结合寡核苷酸探针的一端(优选5′末端)，淬灭荧光染料结合另一端。将荧光染料结合到寡核苷酸上的方法是已知的，而且在出版物，例如Noble等，(1984)，Nuc.Acids Res.，12：3387-3403和lyer等，(1990)，J.Ame.Chem.Soc.，112：1253-1254中已经公开。
TaqMan方法本身是一种已知的方法，设计的用于该方法的装置和试剂盒已经上市销售。在本发明中，也可以使用这些市场上买到的装置和试剂盒。当使用这些市场上买到的装置和试剂盒时，可遵循专利No.2,825,976中公开的程序，或PE Biosystems制造的ABI PRISM 7700序列检测系统用户手册实施本发明的方法。
(8)使用质谱仪的质谱阵列
质谱阵列法检测由多态性引起的质量差。更具体地说，通过PCR扩增包含待检测的多态性的区域，延伸引物正好杂交在SNP位置前，利用包含ddNTP/dNTP混合物的反应混合物，例如包含ddATP、dCTP、dGTP和dTTP的反应混合物进行延伸反应，从而依照SNPs产生具有不同3′端的片段。纯化这些产物，并用MALDI-TOF质谱仪进行分析，从而确定分子量和基因型之间的相互关系(Pusch，W.，Wurmbach，JH.，Thiele，H.，Kostrzewa，M.，MALDI-TOF mass spectrometry-based SNPgenotyping，Pharmacogenomics，3(4)：537-48(2002))。利用，例如Sequenom′s MassArray高通量SNP检测系统可以很容易地实施该方法。
(9)其他分型方法
也可以通过各种已知的方法，包括对DNA进行测序的方法和检测基因多态性和基因突变的方法对本发明的方法中使用的基因进行SNPs分型。这些方法的实例如下。
(9-1)PCR-SSO(序列特异的寡核苷酸)分型
载体上的对应SNP的固相探针与标本(基因扩增产物)杂交，从而确定基于存在/缺少错配而产生的杂交效率差异。
(9-2)用于检测点突变的PCR-SSP分型
使用在3′末端设计有与点突变匹配的碱基、基因扩增用序列特异的引物，这种分型利用由引物3′末端是否互补引起的PCR扩增效率的显著差异。
(9-3)PCR-DGGE(变性梯度凝胶电泳)分析
混合包含基因多态性的DNA片段和野生型DNA片段进行杂交，随后在聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳，聚丙烯酰胺凝胶中变性剂，例如尿素、甲酰胺等等的浓度逐步增高。与没有错配的同源双链相比，产生的DNA片段会在变性剂浓度较低的位置离解成单链DNAs。因为单链DNA比双链DNA具有更快的电泳迁移率，基于DNA链之间的迁移率差异可以检测单碱基多态性(差异)。
(9-4)PCR-DGGE/GC钳(Shefield，V.C.等，Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.，86，232-236(1989))
除上述PCR-DGGE分析之外，这种方法通过将GC含量高的区域偶联到包含待检测的基因多态性核酸的DNA片段上，弥补了发生多个碱基替换、缺失、添加或插入时检测不完全的缺点。该方法需要添加GC钳到包含待检测基因多态性的DNA片段上的步骤。
(9-5)RNase保护分析(Finkelstein，J.等，Genomics，7，167-172(1990))
(9-6)原位RT-PCR(Nucl.Acids Res.，21，3159-3166(1993))
(9-7)原位杂交
(9-8)Southern印迹(Sambrook，J.等，Molecular Cloning aLaboratory Manual.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY(1989)
(9-9)点杂交分析(Southern，E.M.，J.Mol.Biol.，98：503-517(1975)，etc.)
(9-10)荧光原位杂交(FISH：Takahashi，E.等，Hum.Genet.，86，1416(1990))
(9-11)比较基因组杂交(CGH：Kallioneimi，A.等，Science，258，818-821(1992))，和光谱核型分析(SKY：Rowley，J.D.等，Blood，93，2038-2042(1999))。
(9-12)使用酵母人工染色体载体克隆作为探针的方法(Lengauer，C.等，Cancer Res.，52，2590-2596(1992))。
因此通过本发明的方法可以检测人基因SNPs和单倍体。
依照本发明的预测肾细胞癌病人对IFN治疗反应的方法，当通过上述方法在标本中检测的人基因多态性-指示物(标记)被鉴定出来时，预期标本对IFN治疗高度敏感(步骤iv)。
因为预计对IFN治疗的反应被确定为高的病人能产生优良的治疗效果，因此在药物选择阶段优先选择IFN来治疗肾细胞癌。这样可以抑制给病人施用不必要的药物，因此能减少药物引起的副作用。
特别地，依照本发明的方法检测的人基因的基因多态性或基因型与IFN对肾细胞癌的治疗效果(肿瘤抑制效果)高度相关。因此，检测结果可以实施肾细胞癌病人的个体定制医学，即适当选择对个体病人最有效的药物的医学治疗。
寡核苷酸
本发明更进一步地提供在本发明的评估(检测)方法中用作检测基因多态性的探针或引物的寡核苷酸。这种核苷酸不受限制，只要他们能特异扩增包含给定人基因多态性或基因型区域的序列就可以。可以以给定基因多态性或基因型的序列信息为基础，依照标准方式合成和构建这种核苷酸。
更具体地说，使用市场上买到的自动寡核苷酸合成器，例如GeneAssembler Plus：Pharmacia LKB)等等，通过典型的化学合成，例如亚磷酰胺方法、磷酸盐三酯方法等等可以进行合成。通过合成化学合成的单链产物和其互补链，并让它们在适当的条件下退火，或者使用适当的引物序列和DNA聚合成酶将互补链附着到所述单链产物上可以获得双链片段。
用作上述探针或引物的寡核苷酸的优选实例包括与设计含有给定基因的基因多态性序列的DNA片段部分匹配，并由至少10个，典型地大约10到大约35个连续碱基组成的寡核苷酸。引物对的实例包括被设计和合成为将基因DNA序列中的SNP夹合的两种寡核苷酸序列。包含基因多态性序列的DNA片段本身可以用作寡核苷酸探针。
用作上述探针的寡核苷酸的优选实例包括下列(a)到(p)描述的那些寡核苷酸。在下列寡核苷酸中，优选的探针是那些具有由至少15个连续碱基组成的序列的包含给定基因的多态性区域的探针。
(a)具有由包含基因多态性位点的至少10个连续碱基组成的序列的寡核苷酸，其中基因多态性位点是在STAT3基因的位置4243095具有基因型C/T或T/T的由参考SNP ID编号：rs1905341表示的基因多态性位点，
(b)具有由包含基因多态性位点的至少10个连续碱基组成的序列的寡核苷酸，其中基因多态性位点是在STAT3基因的位置4264926具有基因型C/C的由参考SNP ID编号：rs4796793表示的基因多态性位点，
(c)具有由包含基因多态性位点的至少10个连续碱基组成的序列的寡核苷酸，其中基因多态性位点是在STAT3基因的位置4204027具有基因型G/G的由参考SNP ID编号：rs2293152表示的基因多态性位点，
(d)具有由包含基因多态性位点的至少10个连续碱基组成的序列的寡核苷酸，其中基因多态性位点是在STAT3基因的位置4050541具有基因型C/T的由参考SNP ID编号：rs2293153表示的基因多态性位点，
(e)具有由包含基因多态性位点的至少10个连续碱基组成的序列的寡核苷酸，其中基因多态性位点是在SSI3基因的位置10246541具有基因型A/G的由参考SNP ID编号：rs2280148表示的基因多态性位点，
(f)具有由包含基因多态性位点的至少10个连续碱基组成的序列的寡核苷酸，其中基因多态性位点是在IL-4R基因的位置18686025具有基因型A/A的由参考SNP ID编号rs1805011表示的基因多态性位点，
(g)具有由包含基因多态性位点的至少10个连续碱基组成的序列的寡核苷酸，其中基因多态性位点是在IRF2基因的位置17736877具有基因型A/A的由参考SNP ID编号：rs2797507表示的基因多态性位点，
(h)具有由包含基因多态性位点的至少10个连续碱基组成的序列的寡核苷酸，其中基因多态性位点是在IRF2基因的位置17744613具有基因型C/C的由参考SNP ID编号：rs796988表示的基因多态性位点，
(i)具有由包含基因多态性位点的至少10个连续碱基组成的序列的寡核苷酸，其中基因多态性位点是在ICSBP基因的位置390141具有基因型A/A或A/C的由参考SNP ID编号：rs2292982表示的基因多态性位点，
(j)具有由包含基因多态性位点的至少10个连续碱基组成的序列的寡核苷酸，其中基因多态性位点是在PTGS1基因的位置26793813具有基因型C/T的由参考SNP ID编号rs1213264表示的基因多态性位点，
(k)具有由包含基因多态性位点的至少10个连续碱基组成的序列的寡核苷酸，其中基因多态性位点是在PTGS1基因的位置26794182具有基因型C/T的由参考SNP ID编号：rs1213265表示的基因多态性位点，
(l)具有由包含基因多态性位点的至少10个连续碱基组成的序列的寡核苷酸，其中基因多态性位点是在PTGS1基因的位置26794619具有基因型A/G的由参考SNP ID编号：rs1213266表示的基因多态性位点，
(m)具有由包含基因多态性位点的至少10个连续碱基组成的序列的寡核苷酸，其中基因多态性位点是在PTGS2基因的位置15697329具有基因型G/G的由参考SNP ID编号：rs2745557表示的基因多态性位点，
(n)具有由包含基因多态性位点的至少10个连续碱基组成的序列的寡核苷酸，其中基因多态性位点是在TAP2基因的位置23602539具有基因型G/G的由参考SNP ID编号：rs2071466表示的基因多态性位点，
(o)具有由包含基因多态性位点的至少10个连续碱基组成的序列的寡核苷酸，其中基因多态性位点是在IL-4R基因的位置18686068具有基因型C/C的由参考SNP ID编号：rs2234898表示的基因多态性位点，和
(p)具有由包含基因多态性位点的至少10个连续碱基组成的序列的寡核苷酸，其中基因多态性位点是在IL-4R基因的位置1868553具有基因型T/T的由参考SNP ID编号：rs1801275表示的基因多态性位点。
本发明的用作上述引物对的寡核苷酸的具体实例包括在下文实施例中描述的分别针对上述基因的作为正向引物的序列号为1到16的那些引物和作为反向引物的序列号为17到32的引物。
检测试剂盒
使用试剂盒检测标本中给定人基因的基因多态性或基因型的可以更容易地实施本发明的检测(评估)方法。本发明更进一步地提供了这种试剂盒。
依照本发明的试剂盒的实施例包括作为关键成分的至少一种DNA片段，该片段部分或完全与包含给定人基因的上述任何基因多态性或基因型的DNA片段的碱基序列或其互补碱基序列杂交、或者包括作为关键成分的至少一种DNA片段，该片段与包含上述特定基因多态性位点或基因型位点中任何一个的上游的一到几个碱基的碱基序列杂交。依照本发明的试剂盒的另一个实施例包括识别包含作为关键成分的上述任何特定基因多态性位点或基因型位点的几个核酸的序列的限制性内切酶，例如Mspl。
包含在本发明的试剂盒中的其他成分包括标记试剂，实施PCR需要的试剂(例如TaqDNA聚合成酶、脱氧核苷酸三磷酸、DNA扩增引物等等)。标记试剂的实例包括化学修饰物质，例如放射性同位素、发光物质、荧光物质等等，DNA片段本身可以预先与这种标记试剂结合。为了方便测量，本发明的试剂盒可以更进一步地包含适当的反应稀释剂、标准抗体、缓冲液、冲洗液、反应终止溶液等等。
因为本发明的发明人发现给定基因的基因多态性或基因型与IFN对肾细胞癌的治疗效果(肿瘤抑制效果)高度相关，因此依照本发明，在实施定制医学的过程中为个体肾细胞癌病人合适地选择更有效的药物成为可能。本发明提供了检测作为与IFN治疗对肾细胞癌的效果相关的标记的给定人基因多态性或基因型的方法，即检测肾细胞癌病人的标本中的给定基因多态性或基因型作为对IFN治疗肾细胞癌反应的鉴定标记的方法、用于这种方法的诊断试剂和诊断试剂盒。
实施例
本发明更进一步地详细描述了下列实施例，但不局限于这些实施例。
[实施例1]
(1)分析样本
用于该测试中分析的样本是在参与机构获得受试者的知情同意后从非可追踪的匿名血样提取的基因组DNA样品，以及来自已经在参与机构被提取的基因组DNAs的样品。没有经过同意的样品和非匿名样品不用来进行分析。更进一步，受试者信息(病人背景等等)不传输给实验室工人或合作者Otsuka Pharmaceutical有限公司治疗诊断学研究中心(以下简称″TRC″)。
有86个注册样品用于这项测试，其中76个样品源自于血样，而且已经制备10个样品作为DNA。以Otsuka制药有限公司伦理委员会(Ethical Committee of Otsuka Pharmaceutical Co.，Ltd)批准的申请发展小组实施的研究项目″旨在研究IFN治疗肾细胞癌效果的预测因子的干扰素相关基因中的SNPs分析(伦理委员会接收号：010724-1)″为基础收集这些样品。
遵照教育、文化、运动、科技部；卫生、劳动和福利部；以及经济、贸易和工业部在2001年3月宣布的″人基因组/基因分折研究道德准则″(第一通告)来实施这一项目。
收集的血样是在参与机构制备为不可追踪的匿名血样，将血样冷冻运输到TRC。在TRC从这些血样中提取基因组DNAs用作分析样品。
已经从中提取基因组DNAs的样品也是在参与机构制备的不可追踪的匿名样品，将样品冷冻运输到TRC备用。
在研究期间，严格处理用于这项研究的所有基因组DNA样品，并将其保存在TRC实验室的指定存储器中(冷冻在4℃)。
(2)基因分析
用于在这项测试中进行分析的基因有下列基因簇。
(2a)IFN-α受体和信号转导系统
IFNAR1(α链)(干扰素α受体1)、IFNAR2(β链)(干扰素β受体2)、JAK1(Janus激酶1、一种酪氨酸激酶蛋白质)、Tyk2、STAT1(转录信号转导物和活化因子1，91kda)、STAT2(转录信号转导物和活化因子2，113kda)、STAT3(转录信号转导物和活化因子3、急性期反应因子)、p48(ISGF3γ，干扰素刺激转录因子3、γ、48kda)、SOCS-1(细胞因子信号抑制剂1/SSI-1)(别名：JAB，CIS-1，SSI-1、)、SOCS-2(细胞因子信号抑制剂2/STATI2)(别名：CIS-2，SSI-2、STATI2)、SOCS-3(细胞因子信号抑制剂3/SSI-3)(别名：CIS-3，SSI-3)、Shp-2(别名：PTPN11：蛋白质酪氨酸磷酸酶，非受体型11(Noonan综合征1))。
(2b)Th1/Th2系统
STAT4(转录信号转导物和活化因子4)、IL-2(白细胞介素2)、IFN-γ(干扰素γ)、TNF-α(肿瘤坏死因子α)、TNF-β(肿瘤坏死因子β)(LTA：淋巴细胞毒素α，TNF超家族，成员1)、IL-4(白细胞介素4)、IL-4受体-α、IL-4受体-β、IL-5(白细胞介素5、集落刺激因子、嗜酸性粒细胞)、IL-6(白细胞介素6、干扰素β2)、IL-10(白细胞介素10)、IL-13(白细胞介素13)。
(2c)据报道其表达被IFN-α改变的基因
PKR(PRKR、蛋白激酶、干扰素诱导的双链RNA依赖的)、IRF1(IFN-调节因子1)、IRF2(IFN-调节因子2)、ICSBP(IFN共有序列结合蛋白)、Cox-1(PTGS1；前列腺素内过氧化物合酶1、前列腺素G/H合酶和环加氧酶)、Cox-2(PTGS2；前列腺素内过氧化物合酶2、前列腺素G/H合酶和环加氧酶)、MxA(Mx-1；肌尾病毒(流感病毒)抗性1、干扰素诱导蛋白p78(小白鼠))
(2d)其他基因
TAP1(运载体1、ATP结合盒、B亚家族(MDR/TAP))、TAP-2(运载体2、ATP结合盒、B亚家族(MDR/TAP))、LMP7(PSMβ8；蛋白酶体(prosome、macropain)亚单位、β型、8(大的多功能蛋白酶7)、CTLA-4(细胞毒性T淋巴细胞联合蛋白质4)、GSTT1(谷胱甘肽S转移酶θ1)、VHL、HIF-1α、HLF、VEGF(血管内皮生长因子)。
(3)分析SNPs
在上述基因簇之中，在测试开始时在NCBI dbSNPs中注册的SNPs与注册的基因序列在Otsuka制药有限公司的生物信息室(以下简称″BI室″)进行比较分析。进行比较的结果就是选择作图靠近注册序列的那些SNPs用于本次测试分析，那些作图不靠近注册序列的SNPs在分析时被排除。最终分析的SNPs的数目是1167。
(4)检测过程
(4a)基因组DNA提取
利用基因组提取试剂盒(PUREGENETM，Gentra Systems，Inc.)实施从全血中提取基因组DNA。遵照PUREGENETM附带的标准规程实施提取过程。提取的基因组DNA在试剂盒包含的裂解溶液中裂解，测定吸光度以计算提取的总量。
(4b)PCR(用于侵入分析)
通过PCR扩增用于分析的包含SNPs的基因组区域。用ExTaqTM(TaKaRa)作为DNA聚合酶，附送的10×Ex Taq缓冲液用作反应缓冲液。
在下列条件下进行反应。
模板量(基因组DNA)：1-10ng
引物浓度：0.1-0.2uM
总反应混合物体积：15ul
PCR循环：(1)95℃2min.、(2)95℃30sec.、(3)50-64℃30sec.、(4)72℃1.5min.、(5)(2)到(4)×50个循环，和(6)维持在15℃
PCR产物用作下列侵入分析的反应模板。
用于上述反应的正向引物的核酸序列由序列号1-16代表的序列显示，反向引物的核酸序列由序列号17-32代表的序列显示。表2显示了引物、给定的人基因基因组和其中包含的SNPs之间的关系。
表2
  基因   SNPs(rs#)     SNPs(TRC#)   产物大小(bp)   L引物     R引物   RFLP     限制性内切酶(识别的序列)
  STAT3   Rs1905341     STAT3-2   470   Seq.No.：1     Seq.No.：17   ×
  Rs4796793     STAT3-3   806   Seq.No.：2     Seq.No.：18   ×
  Rs2293152     STAT3-17   461   Seq.No.：3     Seq.No.：19   RFLP     Msp I          (TGCSGGA)
  Rs2293153     STAT3-18   276   Seq.No.：4     Seq.No.：20   ×
  SSI3   Rs2280148     SSI3-1   456   Seq.No.：5     Seq.No.：21   ×
  IL-4R   Rs1805011     IL4R-22   378   Seq.No.：6     Seq.No.：22   ×
  IRF2   Rs2797507     IRF2-67   382   Seq.No.：7     Seq.No.：23   ×
  Rs796988     IRF2-82   434   Seq.No.：8     Seq.No.：24   ×
  ICSBP   Rs2292982     ICSBP-38   427   Seq.No.：9     Seq.No.：25   ×
  PTGS1   Rs1213264     PTGS1-3   476   Seq.No.：10     Seq.No.：26   ×
  Rs1213265     PTGS1-4   436   Seq.No.：11     Seq.No.：27   ×
  Rs1213266     PTGS1-5   411   Seq.No.：12     Seq.No.：28   ×
  PTGS2   Rs2745557     PTGS2-12   486   Seq.No.：13     Seq.No.：29   ×
  TAP2   Rs2071466     TAP2-5   475   Seq.No.：14     Seq.No.：30   ×
  IL-4R   Rs2234898     IL4R-14   432   Seq.No.：15     Seq.No.：31   ×
  Rs1801275     IL4R-29   491   Seq.No.：16     Seq.No.：32   ×
(5)侵入分析
在蒸馏水中稀释包含扩增的SNP区域的PCR产物10-1000倍，通过95℃加热5分钟使稀释的PCR产物变性以获得单链DNAs，然后立即在冰上冷却。将得到的用作反应模板的DNAs与试剂混合制备侵入分析的反应混合物。反应混合物的组成与384孔反应板形式的附加规程一致。
在63℃孵育反应混合物30-60分钟，并与酶发生反应。反应之后，利用荧光微板读数器Safire(TECAN)，通过两个波长(红色和绿色)的光，485±6nm的激发光，530±6nm的发射光(FAM染料)，以及560±6nm的激发光，620±6nm的发射光测量荧光强度。
利用基于Biomek FX/SAMI(Beckman Coulter)的SNPs自动化分型系统实施除稀释之外的全部分型过程。
荧光强度的测量结果输入配备了自动分型校正1.0版的BARCODE实验室系统(BLABSTM，Mitsui Knowledge Industry Co.，Ltd.)，通过自动分型确定SNP基因型。研究员可以利用散点图再一次确定分型结果。
(6)PCR-RFLP
可以通过PCR-RFLP对不能通过侵入分析进行分型的SNPs进行分型。在这种方法中，通过限制性内切酶切割包含SNP的区域为基础对SNPs进行分型。当SNP区域不包含限制性内切酶识别的适当位点时，通过设计靠近SNP的扩增引物并有意改变引物的序列可以形成限制性内切酶识别位点。
在该方法中，可以用限制性内切酶Nspl检测STAT3-17上的SNPs。
实施PCR可以使用Vogelstein缓冲液，其他条件如下。
模板量(基因组DNA)：5ng
引物浓度：0.1-0.2uM
总反应混合物体积：15uL
PCR循环：(i)95℃2min.、(ii)95℃30sec.、(iii)50-60℃30sec.、(iv)72℃1min.、(v)(ii)到(iv)的步骤进行35-45个循环，和(vi)维持在15℃
用限制性内切酶处理PCR产物，并利用4％琼脂糖凝胶电泳分析切割后的产物片段的长度以进行分型。
(7)基因分型
基于对上文(5)中描述的侵入分析反应产生的两种颜色的萤光强度的检测可以确定基因型。因此，通过侵入分析可以对病人33个基因上的463个SNPs进行基因型分型。更进一步地，通过上文(6)中描述的PCR-RFLP同样也可以对13个基因上的26个SNPs进行基因型分型。
(8)结果1(对鉴定CR+PR组和PD组有用的SNPs调查研究)
在累积的86个病例中，3例被评估为无反应型，8例没有转移灶，24例具有恒定反应评价(NC组＝无变化组))(包括没有转移灶的一个病例)。除这34个病例外，剩余的52个病例用于分析。他们是CR组(完全反应组)、PR组(部分反应组)，以及PD组(进行性疾病组)。这些处理反应的评价与1999年四月第三版的肾癌的一般规则一致。在下文中更进一步地提到了这些规则：″Guidelines to Evaluate theresponse to Chemotherapy in Solid Tumors″(J.Jpn.Soc.Cancer Ther.，21(5)：929-924，June，1986)，由日本临床肿瘤学协会出版
通过统计学判别分析研究了每个SNP的鉴定能力，以判断待分析的463个SNPs是否都是这些病例的鉴定因子。通过皮尔森卡方检验确定的显著性p＞0.1的SNPs推测具有低的鉴定能力，因此被排除在分析外。
这样就从463个SNPs中排除了445个SNPs，只留下18个SNPs作为候选SNPs。此外，当存在彼此间有密切相互关系的多个变量时，由于多变量分析的特性，需要调查多变量之中仅仅一个单变量的鉴定能力。因此，在实施逻辑回归分析之前，利用Cramer′s V统计(L.D.Fisher and G.V.Belle，Biostatistics，A Methodology for the HealthSciences，278，1993，John Wiley&Sons，Inc.，New York)调查了彼此有密切相互关系的SNPs，这样就将待分析的SNPs的数目由18减少到了16。
在利用逐步的逻辑回归模型(L.D.Fisher and G.V.Belle，Biostatistics，A Methodology for the Health Sciences，638-647，1993，JohnWiley&Sons，Inc.，New York)调整与肿瘤抑制有关的背景因素的影响之后，假定通过上述分析最后剩下的SNPs具有鉴定能力。
调整的背景因素有性别、年龄、组织发现(细胞类型、等级、pT、pM、发作和复发、肺转移、肝转移、大脑转移、骨转移、淋巴结转移)。使用的显著性水平是0.05。
结果显示在表3和表4中。
[表3]
  总数     NC+PD组     CR+PR组     χ2检验
    N     ％     N   ％     P值
    STAT1-18   AAAG   732     460     63.010.00     272   36.99100.00     0.0710
  总数   75     46     61.33     29   38.67
    STAT3-2   CCCTTT   224211     18253     81.8259.5227.27     4178   18.1840.4872.73     0.0094
  总数   75     46     61.33     29   38.67
    STAT3-3   GGGCCC   254711     21303     84.0063.8327.27     4178   16.0036.1772.73     0.0033
  总数   83     54     65.06     29   34.94
    STAT3-18   CTTT   966     343     33.3365.15     623   66.6734.85     0.0660
  总数   75     46     61.33     29   38.67
    STAT3-21   AAAGGG   124122     42418     33.3358.5481.82     8174   66.6741.4618.18     0.0184
  总数   75     46     61.33     29   38.67
    STAT3-25   CCCTTT   124122     42418     33.3358.5481.82     8174   66.6741.4618.18     0.0184
  总数   75     46     61.33     29   38.67
    STAT3-31   CTTT   1065     343     30.0066.15     722   70.0033.85     0.0288
  总数   75     46     61.33     29   38.67
    STAT3-52   AAACCC   124122     42418     33.3358.5481.82     8174   66.6741.4618.18     0.0184
  总数   75     46     61.33     29   38.67
    STAT3-17   CCCGGG   83631     72514     87.5069.4445.16     11117   12.5030.5654.84     0.0346
  总数   75     46     61.33     29   38.67
    SSI3-1   AAACCC   52203     3772     71.1535.0066.67     15131   28.8565.0033.33     0.0183
  总数   75     46     61.33     29   38.67
[表4]
  总数     NC+PD组     CR+PR组     χ2检验
  N   ％     N   ％     P值
    IL4R-14   ACCC   966   838   88.8957.58     128   11.1142.42     0.0704
  总数   75   46   61.33     29   38.67
    IL4R-29   CTTT   1758   1432   82.3555.17     326   17.6544.83     0.0430
  总数   75   46   61.33     29   38.67
    IL4R-22   AAAC   6114   3412   55.7485.71     272   44.2614.29     0.0378
  总数   75   46   61.33     29   38.67
    IRF2-82   CCCTTT   112318   4712   36.3630.4366.67     7166   63.6469.5733.33     0.0572
  总数   52   23   44.23     29   55.77
    IRF2-67   AAACCC   63137   12025   16.6764.5267.57     51112   83.3335.4832.43     0.0547
  总数   74   46   62.16     28   37.84
    ICSBP-38   AAACCC   36327   20197   55.5659.38100.00     16130   44.4440.630.00     0.0833
  总数   75   46   61.33     29   38.67
    PTGS1-3   CCCT   705   451   64.2920.00     254   35.7180.00     0.0495
  总数   75   46   61.33     29   38.67
    PTGS1-4   CTTT   768   145   14.2966.18     623   85.7133.82     0.0073
  总数   75   46   61.33     29   38.67
    PTGS1-5   AGGG   966   244   22.2266.67     722   77.7833.33     0.0102
  总数   75   46   61.33     29   38.67
    PTGS2-12   AGGG   966   838   88.8957.58     128   11.1142.42     0.0704
  总数   75   46   61.33     29   38.67
    TAP2-5   AAAGGG   31854   31429   100.0077.7853.70     0425   0.0022.2246.30     0.0717
  总数   75   46   61.33     29   38.67
因为通过逻辑回归分析被确定为能进行有效评估的唯一背景因素是存在/缺少肺转移，因此该因素被强制合并到模型中，借此采用逐步逻辑回归分析分析13种SNPs。结果显示在表5中。
表5
步骤0.肺转移进入                                              步骤1.肺转移&IL4R-29组合
                   Wald
效果 DF   卡方   Pr＞ChiSq
肺转移 1   5.7899   0.0161
                   Score
效果STAT3-2IL4R-14IL4R-29IL4R-22IRF2-67IRF2-82PTGS1-4PTGS1-5TAP2-5 DF211122112   卡方7.34001.90235.66135.36913.18166.42421.68002.31967.6356   Pr＞ChiSq0.02550.16780.01730.02050.20380.04030.19490.12780.0220
                   Wald
效果 DF   卡方   Pr＞ChiSq
肺转移IL4R-29 11   5.06975.0220   0.02430.0250
                   Score
效果STAT3-2IL4R-14IL4R-22IRF2-67IRF2-82PTGS1-4PTGS1-5TAP2-5 DF21122112   卡方6.23500.00691.72773.49737.26901.44492.99709.7880   Pr＞ChiSq0.04430.93370.18870.17400.02640.22940.08340.0075
在表5中，″效果″下的项目是测试的SNPs。″DF″指自由度。
Wald卡方指Wald′s卡方统计检验，Score卡方指Score′s卡方(χ2)统计检验，Pr＞ChiSq是Wald′s卡方检验或Score′s卡方检验的P值。
如表5所示，步骤0显示调整存在肺转移的影响之后的SNPs鉴定能力。SNPs的P值小于0.05表示即使在调整存在肺转移的影响后对鉴定仍然有用。
结果显示发现对鉴定有用的SNPs有STAT3-2、IL-4R-29、IL-4r-22、IRF2-82和TAP2-5。在这六个SNPs之中显示出具有最高鉴定能力的IL-4R-29被合并到逻辑回归分析模型(肺转移调整)中。
表5的步骤1中的P值显示剩余SNPs在存在/缺乏肺转移和组合了IL-4R-29时的鉴定能力。SNPs的P值小于0.05表明其具有独立于IL-4R-29的鉴定信息。  这种SNPs有STAT3-2、IRF2-82和TAP2-5。在调整存在/缺少肺转移的影响之后，结果表明IL-4R-29和TAP2-5组合具有最高的鉴定能力。当在这一步骤中与IL-4R-29组合时，没有SNPs新变成显著性。
总之表5中显示的结果表明除最好的候选SNPs IL-4R-29之外，显示作为肾细胞癌病人的原发病灶和迁徙性病灶的预期肿瘤抑制的鉴定标记的SNPs是STAT3-2、IRF2-82、IL-4R-22和TAP2-5，其在步骤0中变得显著。
将这阶段的分类整合到模型中可以防止由病人的不均匀背景因素引起的统计学检测倾斜，调整两个组之间的病人的这种不均匀背景因素，以及证实两个组之间的显著性差异值。
[实施例2]对确定CR+PR组和NC+PD组有用的SNPs调查研究
利用来自实施例1中描述的受试者的样品，分析其中NC组被添加到PD组的病例的与IFN对治疗肾细胞癌的效果有关的给定的基因多态性。
推测NC组中肿瘤大小不变的原因是肿瘤对IFN治疗不起反应，或者虽然肿瘤对IFN起反应，但因为肿瘤大小太大，因此他们的外观没有变化。IFN反应评价依赖于考虑的原因，但在实施例中，NC组因为其恒定的肿瘤大小被认为是无反应组。基于这一考虑，按照如上所述将NC组添加到PD组中以进行基因多态性分型。
在收集的86个病例中，3例被评价为无反应，8例没有转移灶。将除去这11例后剩余的75例用于分析。
采用和实施例1相同的方式，通过统计学判别分析分析463个SNPs的个体鉴定能力，将推测具有低鉴定能力的SNPs从分析候选SNPs中除去。作为这种筛选的结果，从463个SNPs中排除了441个SNPs，只留下23个SNPs作为候选SNPs。
此外，在实施逻辑回归分析之前，利用Cramer′s V调查了彼此有密切相互关系的SNPs的组合，这样就将待分析的SNPs的数目由23减少到了17。
在调整与肿瘤抑制有关的背景因素的影响之后，利用逐步的逻辑回归模型评估最后17个SNPs的鉴定能力。
只调整在上文的实施例1中发现的可能与肿瘤抑制相关的背景因素--肺转移。显著性水平是0.05。表6和7显示了显著性水平p≤0.1的23个SNPs作为个体SNP鉴定能力的的分析结果。
表6
  总数     NC+PD组     CR+PR组     χ2检验
  N     ％     N     ％     P值
    STAT1-18   AAAG   732   460     63.010.00     272     36.99100.00     0.0710
  总数   75   46     61.33     29     38.67
    STAT3-2   CCCTTT   224211   18253     81.8259.5227.27     4178     18.1840.4872.73     0.0094
  总数   75   46     61.33     29     38.67
    STAT3-18   CTTT   966   343     33.3365.15     623     66.6734.85     0.0660
  总数   75   46     61.33     29     38.67
    STAT3-21   AAAGGG   124122   42418     33.3358.5481.82     8174     66.6741.4618.18     0.0184
  总数   75   46     61.33     29     38.67
    STAT3-25   CCCTTT   124122   42418     33.3358.5481.82     8174     66.6741.4618.18     0.0184
  总数   75   46     61.33     29     38.67
    STAT3-31   CTTT   1065   343     30.0066.15     722     70.0033.85     0.0288
  总数   75   46     61.33     29     38.67
    STAT3-52   AAACCC   124122   42418     33.3358.5481.82     8174     66.6741.4618.18     0.0184
  总数   75   46     61.33     29     38.67
    STAT3-17   CCCGGG   83631   72514     87.5069.4445.16     11117     12.5030.5654.84     0.0346
  总数   75   46     61.33     29     38.67
    SSI3-1   AAACCC   52203   3772     71.1535.0066.67     15131     28.8565.0033.33     0.0183
  总数   75   46     61.33     29     38.67
    IL4R-14   ACCC   966   838     88.8957.58     128     11.1142.42     0.0704
  总数   75   46     61.33     29     38.67
表7
  总数     NC+PD组     CR+PR组     χ2检验
  N     ％     N     ％     P值
    IL4R-29   CTTT   1758   1432     82.3555.17     326     17.6544.83     0.0430
  总数   75   46     61.33     29     38.67
    IL4R-22   AAAC   6114   3412     55.7485.71     272     44.2614.29     0.0378
  总数   75   46     61.33     29     38.67
    IRF2-8   CCCGGG   41286   26191     63.4167.8616.67     1595     36.5932.1483.33     0.0601
  总数   75   46     61.33     29     38.67
    IRF2-67   AAACCC   63137   12025     16.6764.5267.57     51112     83.3335.4832.43     0.0547
  总数   74   46     62.16     28     37.84
    ICSBP-38   AAACCC   36327   20197     55.5659.38100.00     16130     44.4440.630.00     0.0833
  总数   75   46     61.33     29     38.67
    PTGS1-3   CCCT   705   451     64.2920.00     254     35.7180.00     0.0495
  总数   75   46     61.33     29     38.67
    PTGS1-4   CTTT   768   145     14.2966.18     623     85.7133.82     0.0073
  总数   75   46     61.33     29     38.67
    PTGS1-5   AGGG   966   244     22.2266.67     722     77.7833.33     0.0102
  总数   75   46     61.33     29     38.67
    PTGS2-12   AGGG   966   838     88.8957.58     128     11.1142.42     0.0704
  总数   75   46     61.33     29     38.67
    TAP2-5   AAAGGG   31854   31429     100.0077.7853.70     0425     0.0022.2246.30     0.0717
  总数   75   46     61.33     29     38.67
获得表示这23个SNPs之间的相关度的Cramer′s V值，结果显示STAT3-2、STAT3-21、STAT3-25和STAT3-52的鉴定能力被认为大致相同。同样，STAT3-18和STAT3-31鉴定能力相等，而且IL-4R-14、IL-4R-18和IL-4R-26的鉴定能力也相等。因此，STATA3-2、STAT3-18和IL-4R-14被作为来自每个组的代表用于多变量分析。结果，只剩下17个SNPs用于分析。
在75例已经证实存在或缺少肺转移的病例中，2例部分缺失SNP分析数据的病例被排除，剩下73例作为最后的候选者用于分析。
存在或缺少肺转移被强制进入模型，并对17个SNPs进行逐步逻辑回归分析。以与上文表5相同的方式将结果显示在表8中。
表8步骤0.肺转移合并                               步骤1.       肺转移                                            肺转移
                                                       与STAT3-2组合                      步骤2    与STAT-3-2和PTGS1-4组合
                   Wald
效果 DF 卡方 Pr＞ChiSq
肺转移 1 3.8108 0.0509
                   Score
效果 DF 卡方 Pr＞ChiSq
STAT3-2STAT3-18STAT3-17SSI3-1IL4R-14IL4R-29IL4R-22IRF2-82IRF2-67ICSBP-38PTGS1-3PTGS1-4PTGS1-5PTGS2-12TAP2-5 212211122211112 10.14942.35687.32178.69952.18523.05385.56553.11714.76534.46453.11136.00395.33533.51205.8287 0.00630.12470.02570.01290.13930.08060.01830.21040.09230.10730.07780.01430.02090.06090.0542
                   Wald
效果 DF 卡方 Pr＞ChiSq
肺转移STAT3-2 12 5.13898.5747 0.02340.0137
                   Score
效果 DF 卡方 Pr＞ChiSq
STAT3-18STAT3-17SSI3-1IL4R-14IL4R-29IL4R-22IRF2-82IRF2-67ICSBP-38PTGS1-3PTGS1-4PTGS1-5PTGS2-12TAP2-5 12211122211112 0.84082.55098.02911.37081.42594.39392.72414.58908.77893.85198.30826.58184.50647.1057 0.35920.27930.01810.24170.23240.03610.25610.10080.01240.04970.00390.01030.03380.0286
                   Wald
效果 DF 卡方 Pr＞ChiSq
肺转移STAT3-2PTGS1-4 121 4.31949.53035.8760 0.03770.00850.0153
                   Score
效果 DF 卡方 Pr＞ChiSq
STAT3-18STAT3-17SSI3-1IL4R-14IL4R-29IL4R-22IRF2-82IRF2-67ICSBP-38PTGS1-3PTGS1-5PTGS2-12TAP2-5 1221112221112 1.39144.00855.15402.26971.07584.99854.90906.77748.89300.64130.87213.42985.2362 0.23820.13480.07600.13190.29960.02540.08590.03380.01170.42320.35040.06400.0729
表8中的步骤0显示调整存在或缺少肺转移影响之后的SNPs鉴定能力。SNPs的P值小于0.05表示即使在调整存在/缺少肺转移影响后对鉴定仍然有效。发现能进行有效鉴定的SNPs有STAT3-2、STAT3-17、SSI3-1、IL-4R-22、PTGS1-4和PTGS1-5。在这六个SNPs之中显示出最高鉴定能力的STAT3-2被合并到模型中。
步骤1的P值表示存在或缺少肺转移与STAT3-2组合时，剩余的每个SNPs的鉴定能力。SNPs的P值小于0.05表明其具有独立于STAT3-2的鉴定信息。这种SNPs有SSI3-1、IL-4R-22、ICSBP-38、PTGS1-3、PTGS1-4、PTGS1-5、PTGS2-12和TAP2-5。在调整存在或缺少肺转移的影响之后，结果表明在这些SNP之中STAT3-2和PTGS1-4组合具有最高的鉴定能力。与STAT3-2组合时，第一次显示出对鉴定有用的SNPs有ICSBP-38、PTGS1-3、PTGS2-12和TAP2-5。
步骤2表示存在/缺少肺转移与STAT3-2和PTGS1-4组合时，剩余的每个SNPs的鉴定能力。当与STAT3-2和PTGS1-4组合时，显示具有独立于STAT3-2和PTGS1-4的信息的有用变量有IL-4R-22、IRF2-67和ICSBP-38。结果显示在这一阶段IRF2-67是首次鉴定有用的SNP。
总之表8中显示的结果表明除最好的候选SNPs STAT3-2之外，在肾细胞癌病人的原发病灶和迁徙性病灶的预期肿瘤抑制的鉴定标记的SNPs有STAT3-17、SSI3-1、IL-4R-22、PTGS1-4和PTGS1-5，其在步骤0中变得重要；在步骤1中变成新的重要SNPs的ICSBP-38、PTGS1-3、PTGS2-12和TAP2-5；在步骤2中变成新的重要SNPs的IRF2-67。
实施例1和2进行的在CR+PR组和PD组之间的比较分析显示STAT3-2、IL-4R-29、IL-4R-14、IL-4R-22、IRF2-82和TAP2-5是与IFN对肾细胞癌的治疗效果(肿瘤抑制效果)相关的基因多态性，而且TAP2-5、STAT3-17、SSI3-1、IL-4R-22、PTGS1-4、PTGS1-5、ICSBP-38、PTGS1-3、PTGS2-12、TAP2-5和IRF2-67在CR+PR组和NC+PD组之间的比较中也被认为是这种基因多态性。
在CR+PR组和PD组之间的比较中，结果显示STAT3-2具有最高的鉴定能力，在CR+PR组和NC+PD组之间的比较中，结果显示IL-4R-29具有最高的鉴定能力。在单独的实验中发现STAT3-3一样与STAT3-18有关。
依照上文获得的结果，本发明提供了预测肾细胞癌病人对干扰素治疗反应的方法，通过从肾细胞癌病人标本制备基因组序列或其互补链，作为与IFN对肾细胞癌的治疗效果(肿瘤抑制效果)有关的基因多态性、、确定基因组DNA序列或其互补DNA序列，利用至少一种选自STAT3-2、STAT3-3、STAT3-17、STAT3-18、SSI3-1、IL-4R-22、IRF2-67、IRF2-82、ICSBP-38、PTGS1-3、PTGS1-4、PTGS1-5、PTGS2-12、TAP2-5、IL-4R-14、IL-4R-29和IRF2-67的基因的基因多态性或基因型的存在作为鉴定标记。
工业实用性
依照本发明，检测是否存在与IFN对治疗肾细胞癌的效果(肿瘤抑制效果)有关的基因多态性，检测的多态性作为指示物可以方便地用作对IFN治疗肾细胞癌反应的鉴定标记。
序列表自由文本
序列号1-32显示引物序列。
序列表
                            序列表
<110>大塚制药株式会社(Otsuka Pharmaceutical Co.，Ltd.)
<120>对干扰素治疗肾细胞癌反应的鉴定标记(Identification marker responsive to interferontherapy for renal cell cancer)
<130>SCT071777-47
<150>JP 2004-314160
<151>2004-10-28
<160>32
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
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<213>Artificial
<220>
<223>Primer sequence(forward)for PTGS1-5
<400>12
gaagggatgg aaagggagag                                      20
<210>13
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Primer sequence(forward)for PTGS2-12
<400>13
tcagacagca aagcctaccc                                      20
<210>14
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Primer sequence(forward)for TAP2-5
<400>14
gggtaggagg taggaggcag                                      20
<210>15
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Primer sequence(forward)for IL-4R-14
<400>15
ctctctggga cacggtgact                                      20
<210>16
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Primer sequence(forward)for IL-4R-29
<400>16
tgtcctctac cttttccccc                                      20
<210>17
<211>21
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Primer sequence(reverse)for STAT3-2
<400>17
tcccaaagtg acaggttttt g                                    21
<210>18
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Primer sequence(reverse)for STAT3-3
<400>18
cacatggttc cccagatacc                                      20
<210>19
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Primer sequence(reverse)for STAT3-17
<400>19
aggcttcctt ttgttccgtt                                      20
<210>20
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Primer sequence(reverse)for STAT3-18
<400>20
accgtcccct acaatgtctg                                      20
<210>21
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Primer sequence(reverse)for SSI3-1
<400>21
attacatcta ctccgggggc                                      20
<210>22
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
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<400>22
tgcgatgtgt ggagttgttt                                      20
<210>23
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Primer sequence(reverse)for IRF2-67
<400>23
gtagcctcca tctgtgccat                                      20
<210>24
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Primer sequence(reverse)for IRF2-82
<400>24
gtcaatgttt ggcggagttc                                      20
<210>25
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Primer sequence(reverse)for ICSBP-38
<400>25
ttgggaaagg cacagaattt                                      20
<210>26
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Primer sequence(reverse)for PTGS1-3
<400>26
ggacttgact cagtgcccat                                      20
<210>27
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Primer sequence(reverse)for PTGS1-4
<400>27
aatcttgcag cctgacacct                                      20
<210>28
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Primer sequence(reverse)for PTGS1-5
<400>28
ggagggactc acccaagaat                                      20
<210>29
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
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<400>29
tgggagcagg aaagaactga                                      20
<210>30
<211>21
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Primer sequence(reverse)for TAP2-5
<400>30
ttttcatgcc tctttcaggt g                                    21
<210>31
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Primer sequence(reverse)for IL-4R-14
<400>31
gtggagtgtg aggaggagga                                      20
<210>32
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Primer sequence(reverse)for IL-4R-29
<400>32
agtagaaccc gagatgccct                                      20

Claims (11)

1.一种评估IFN治疗对肾细胞癌病人的肿瘤抑制的方法，该方法包括下列步骤(i)到(iv)：
(i)获取来源于肾细胞癌病人的DNA样品的步骤，
(ii)利用在上述步骤(i)中获得的DNA样品，制备选自STAT3基因、SSI3基因、IL-4R基因、IRF2基因、ICSBP基因、PTGS1基因、PTGS2基因和TAP2基因的至少一种基因的基因组DNA或者其互补链的步骤，
(iii)分析基因组DNA或其互补链的DNA序列并确定其基因多态性的步骤，和
(iv)利用上述步骤(iii)中确定的至少一种基因多态性作为标记评估IFN治疗对肾细胞癌病人的肿瘤抑制的步骤。
2.权利要求1的评估IFN治疗对肾细胞癌病人的肿瘤抑制的方法，其中基因多态性是选自STAT3基因、IL-4R基因、IRF2基因和TAP2基因的至少一种基因的多态性。
3.权利要求1的评估IFN治疗对肾细胞癌病人的肿瘤抑制的方法，其中基因多态性是选自下列(a)到(p)的至少一种多态性：
(a)在STAT3基因的位置4243095处具有基因型C/T或T/T的基因多态性(STAT3-2)，用参考的SNP ID编号：rs1905341表示，
(b)在STAT3基因的位置4264926处具有基因型C/C的基因多态性(STAT3-3)，用参考的SNP ID编号：rs4796793表示，
(c)在STAT3基因的位置4204027处具有基因型G/G的基因多态性(STAT3-17)，用参考的SNP ID编号：rs2293152表示，
(d)在STAT3(KCNH4)基因的位置4050541处具有基因型C/T的基因多态性(STAT3-18)，用参考的SNP ID编号：rs2293153表示，
(e)在SSI3基因的位置10246541处具有基因型A/C的基因多态性(SSI3-1)，用参考的SNP ID编号：rs2280148表示，
(f)在IL-4R基因的位置18686025处具有基因型A/A的基因多态性(IL-4R-22)，用参考的SNP ID编号：rs1805011表示，
(g)在IRF2基因的位置17736877处具有基因型A/A的基因多态性(IRF2-67)，用参考的SNP ID编号：rs2797507表示，
(h)在IRF2基因的位置17744613处具有基因型C/C的基因多态性(IRF2-82)，用参考的SNP ID编号：rs796988表示，
(i)在ICSBP基因的位置390141处具有基因型A/A或A/C的基因多态性(ICSBP-38)，用参考的SNP ID编号：rs2292982表示，
(j)在PTGS1基因的位置26793813处具有基因型C/T的基因多态性(PTGS1-3)，用参考的SNP ID编号：rs1213264表示，
(k)在PTGS1基因的位置26794182处具有基因型C/T的基因多态性(PTGS1-4)，用参考的SNP ID编号：rs1213265表示，
(l)在PTGS1基因的位置26794619处具有基因型A/G的基因多态性(PTGS1-5)，用参考的SNP ID编号：rs1213266表示，
(m)在PTGS2基因的位置15697329处具有基因型G/G的基因多态性(PTGS2-12)，用参考的SNP ID编号：rs2745557表示，
(n)在TAP2基因的位置23602539处具有基因型G/G的基因多态性(TAP2-5)，用参考的SNP ID编号：rs2071466表示，
(o)在IL-4R基因的位置18686068处具有基因型C/C的基因多态性(IL-4R-14)，用参考的SNP ID编号：rs2234898表示，
(p)在IL-4R基因的位置1868553处具有基因型T/T的基因多态性(IL-4R-29)，用参考的SNP ID编号：rs1801275表示。
4.权利要求3的评估IFN治疗对肾细胞癌病人的肿瘤抑制的方法，其中基因多态性是权利要求3的(a)、(f)、(h)、(n)、(o)和(p)中的任何一个。
5.权利要求1的评估IFN治疗对肾细胞癌病人的肿瘤抑制的方法，其中IFN选自天然IFN-α、重组IFN-α和重组IFN-γ。
6.权利要求1的评估IFN治疗对肾细胞癌病人的肿瘤抑制的方法，其中基因多态性是通过选自直接测序、等位基因特异的寡核苷酸(ASO)-斑点印迹分析、单核苷酸引物延伸法、PCR单链构象多态性(SSCP)分析、PCR限制性片断长度多态性(RFLP)分析、侵入方法、定量实时PCR和使用质谱仪的质量阵列中的至少一种方法确定的。
7.权利要求6的方法，其中通过侵入方法或直接测序确定基因多态性。
8.权利要求6的方法，其中通过PCR-RFLP分析确定基因多态性。
9.权利要求8的方法，其中PCR-RFLP分析是利用限制性内切酶Msp1检测人STAT3基因内含子4204027处的G到C突变：rs2293152。
10.权利要求6的方法，其中利用选自下列(a)到(p)的至少一种寡核苷酸确定基因多态性：
(a)具有由包含基因多态性位点的至少10个连续碱基组成的序列的寡核苷酸，其中基因多态性位点是在STAT3基因的位置4243095处具有基因型C/T或T/T的由参考SNP ID编号：rs1905341表示的基因多态性位点，
(b)具有由包含基因多态性位点的至少10个连续碱基组成的序列的寡核苷酸，其中基因多态性位点是在STAT3基因的位置4264926处具有基因型C/C的由参考SNP ID编号：rs4796793表示的基因多态性位点，
(c)具有由包含基因多态性位点的至少10个连续碱基组成的序列的寡核苷酸，其中基因多态性位点是在STAT3基因的位置4204027处具有基因型G/G的由参考SNP ID编号：rs2293152表示的基因多态性位点，
(d)具有由包含基因多态性位点的至少10个连续碱基组成的序列的寡核苷酸，其中基因多态性位点是在STAT3(KCNH4)基因的位置4050541处具有基因型C/T的由参考SNP ID编号：rs2293153表示的基因多态性位点，
(e)具有由包含基因多态性位点的至少10个连续碱基组成的序列的寡核苷酸，其中基因多态性位点是在SSI3基因的位置10246541处具有基因型A/C的由参考SNP ID编号：rs2280148表示的基因多态性位点，
(f)具有由包含基因多态性位点的至少10个连续碱基组成的序列的寡核苷酸，其中基因多态性位点是在IL-4R基因的位置18686025处具有基因型A/A的由参考SNP ID编号：rs1805011表示的基因多态性位点，
(g)具有由包含基因多态性位点的至少10个连续碱基组成的序列的寡核苷酸，其中基因多态性位点是在IRF2基因的位置17736877处具有基因型A/A的由参考SNP ID编号：rs2797507表示的基因多态性位点，
(h)具有由包含基因多态性位点的至少10个连续碱基组成的序列的寡核苷酸，其中基因多态性位点是在IRF2基因的位置17744613处具有基因型C/C的由参考SNP ID编号：rs796988表示的基因多态性位点，
(i)具有由包含基因多态性位点的至少10个连续碱基组成的序列的寡核苷酸，其中基因多态性位点是在ICSBP基因的位置390141处具有基因型A/A或A/C的由参考SNP ID编号：rs2292982表示的基因多态性位点，
(j)具有由包含基因多态性位点的至少10个连续碱基组成的序列的寡核苷酸，其中基因多态性位点是在PTGS1基因的位置26793813处具有基因型C/T的由参考SNP ID编号：rs 1213264表示的基因多态性位点，
(k)具有由包含基因多态性位点的至少10个连续碱基组成的序列的寡核苷酸，其中基因多态性位点是在PTGS1基因的位置26794182处具有基因型C/T的由参考SNP ID编号rs1213265表示的基因多态性位点，
(l)具有由包含基因多态性位点的至少10个连续碱基组成的序列的寡核苷酸，其中基因多态性位点是在PTGS1基因的位置26794619处具有基因型A/G的由参考SNP ID编号：rs1213266表示的基因多态性位点，
(m)具有由包含基因多态性位点的至少10个连续碱基组成的序列的寡核苷酸，其中基因多态性位点是在PTGS2基因的位置15697329处具有基因型G/G的由参考SNP ID编号：rs2745557表示的基因多态性位点，
(n)具有由包含基因多态性位点的至少10个连续碱基组成的序列的寡核苷酸，其中基因多态性位点是在TAP2基因的位置23602539处具有基因型G/G的由参考SNP ID编号：rs2071466表示的基因多态性位点，
(o)具有由包含基因多态性位点的至少10个连续碱基组成的序列的寡核苷酸，其中基因多态性位点是在IL-4R基因的位置18686068处具有基因型C/C的由参考SNP ID编号：rs2234898表示的基因多态性位点，和
(p)具有由包含基因多态性位点的至少10个连续碱基组成的序列的寡核苷酸，其中基因多态性位点是在IL-4R基因的位置1868553处具有基因型T/T的由参考SNP ID编号：rs1801275表示的基因多态性位点。
11.权利要求6的方法，其中基因多态性检测引物对是下列(a)到(p)中的任何一对：
(a)由SEQ ID Nos.1和17代表的序列组成的寡核苷酸引物对，
(b)由SEQ ID Nos.2和18代表的序列组成的寡核苷酸引物对，
(c)由SEQ ID Nos.3和19代表的序列组成的寡核苷酸引物对，
(d)由SEQ ID Nos.4和20代表的序列组成的寡核苷酸引物对，
(e)由SEQ ID Nos.5和21代表的序列组成的寡核苷酸引物对，
(f)由SEQ ID Nos.6和22代表的序列组成的寡核苷酸引物对，
(g)由SEQ ID Nos.7和23代表的序列组成的寡核苷酸引物对，
(h)由SEQ ID Nos.8和24代表的序列组成的寡核苷酸引物对，
(i)由SEQ ID Nos.9和25代表的序列组成的寡核苷酸引物对，
(j)由SEQ ID Nos.10和26代表的序列组成的寡核苷酸引物对，
(k)由SEQ ID Nos.11和27代表的序列组成的寡核苷酸引物对，
(l)由SEQ ID Nos.12和28代表的序列组成的寡核苷酸引物对，
(m)由SEQ ID Nos.13和29代表的序列组成的寡核苷酸引物对，
(n)由SEQ ID Nos.14和30代表的序列组成的寡核苷酸引物对，
(o)由SEQ ID Nos.15和31代表的序列组成的寡核苷酸引物对，和
(p)由SEQ ID Nos.16和30代表的序列组成的寡核苷酸引物对。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013056396A1 (zh) * 2011-10-19 2013-04-25 深圳华大基因科技有限公司 用于肾癌诊断评估的序列、使用方法及其应用

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5041580B2 (ja) * 2006-10-17 2012-10-03 一般財団法人化学及血清療法研究所 仲介ポリヌクレオチド
JP2013180090A (ja) 2012-03-02 2013-09-12 Gc Corp 下顎用の印象用トレー
JP5876356B2 (ja) 2012-03-30 2016-03-02 株式会社ジーシー 局部用印象用トレー
JP5778611B2 (ja) 2012-03-30 2015-09-16 株式会社ジーシー 上顎用の印象用トレー

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2825976A (en) 1956-05-28 1958-03-11 Frank J Radencic Repeat apparatus for holding negatives used in lithography
CA2020958C (en) 1989-07-11 2005-01-11 Daniel L. Kacian Nucleic acid sequence amplification methods
US5210015A (en) 1990-08-06 1993-05-11 Hoffman-La Roche Inc. Homogeneous assay system using the nuclease activity of a nucleic acid polymerase
US6562611B1 (en) 1996-11-29 2003-05-13 Third Wave Technologies, Ins. FEN-1 endonucleases, mixtures and cleavage methods
US6159693A (en) 1998-03-13 2000-12-12 Promega Corporation Nucleic acid detection
JP2000279197A (ja) 1999-03-31 2000-10-10 Genome Science Laboratories Co Ltd Ｈｉｖの変異の検出方法
JP2001136973A (ja) 1999-11-16 2001-05-22 Otsuka Pharmaceut Co Ltd Ｉｒｆ−１遺伝子異常の検出方法
US20030096237A1 (en) 2000-08-28 2003-05-22 Ulrich Certa Determination of the ability of patients to respond to a tumor treatment
JP2002125683A (ja) * 2000-10-27 2002-05-08 Tokyoto Igaku Kenkyu Kiko インターフェロンの有効性を予測する方法並びにそれに用いられるプライマー及びプローブ
RU2229719C2 (ru) * 2001-03-27 2004-05-27 Кабусики Кайся Тосиба Обнаружение имеющей отношение к заболеванию нуклеиновой кислоты
JP3751867B2 (ja) 2001-09-18 2006-03-01 株式会社東芝 インターフェロンを投与されるべき個体においてインターフェロン療法の有効性を予測する方法、その方法をコンピュータにより実行させるためのプログラム、インターフェロン感受性に関連する多型部位の遺伝子型を検出するための核酸プローブ、およびその核酸プローブを具備する塩基配列検出用チップ
JP4295955B2 (ja) 2002-05-24 2009-07-15 株式会社東芝 インターフェロンαレセプター２型遺伝子の多型およびその使用
AU2003288924A1 (en) * 2002-10-08 2004-05-04 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Diagnostic assay and related products

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013056396A1 (zh) * 2011-10-19 2013-04-25 深圳华大基因科技有限公司 用于肾癌诊断评估的序列、使用方法及其应用
CN104080923A (zh) * 2011-10-19 2014-10-01 深圳华大基因科技有限公司 用于肾癌诊断评估的序列、使用方法及其应用

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