JP5041580B2 - 仲介ポリヌクレオチド - Google Patents
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Tyagi S, Kramer FR. 1996. Molecular beacons: probes that fluoresce upon hybridization. Nat Biotechnol 14:303-308. Urdea MS, Horn T, Fultz TJ, Anderson M, Running JA, Hamren S, Ahle D, Chang CA. 1991. Branched DNA amplification multimers for the sensitive, direct detection of human hepatitis viruses. Nucleic Acids Symp Ser:197-200.
ΔGcut>−10
ΔGx2<−11、及び、
−20<ΔGy2<−15
を満たすように設計する。
下記RNA(バクテリオファージQβ由来;genbank:AY099114 / QbCDS, 3716-3749の相補鎖;配列番号1)を測定対象(ターゲット)とし、また、使用するニッキングエンドヌクレアーゼをNb.BbvCIA(NEB社製)として、本発明の仲介DNA(以下、L−DNAともいう)を作製した(配列番号2)。下記配列番号1で表されるRNA配列の下線部がターゲット配列であって、L−DNAのターゲット結合領域である下記配列番号2で表される配列における下線部配列と相補的である。L−DNAは、委託合成により製造した(北海道システムサイエンス社)。
測定対象:5'- gauugauuag gaccgauccg acgagggcac cauc -3' (配列番号1)
L−DNA:5'- tgccctcgtc ggatcggtcc ttgctcctca gcaaggaccg atcc -3' (配列番号2)
既知量ターゲットRNA(配列番号1、0.5nM〜10nM)を含むサンプル試料5μlに対して、15μlの下記表3の組成の検出溶液を加えて37℃で蛍光を測定した。蛍光クエンチャープローブ(FQ−プローブ;配列番号3)は、委託合成により製造した(シグマジェノシス社)。なお、下記プローブ配列の下線部が、Nb.BbvCIAの認識配列である。
FQ−プローブ:FAM−cttgctgagg agc−BHQ1 (配列番号3)
また、内部標準として、ROXリファレンスダイ(インビトロジェン社製)を使用した。
バクテリアファージQβのQβレプリカーゼに+鎖RNA(配列番号4)を加えて−鎖RNAを合成させながら、本発明の方法で合成される−鎖RNAの測定を行った。前記Qβレプリカーゼは、RNAを+鎖から−鎖を合成し、−鎖から+鎖を合成する酵素である。この測定に用いたL−DNAは、以下のとおりである(配列番号5)。なお、蛍光クエンチャープローブは、実施例2と同様のFQ−プローブを使用した。
L−DNA:5'- tttttttttgttttttttagatctcgaggcttgctcctcagcaagcctcgagat -3' (配列番号5)
実施例2と同様のL−DNA及びFQ−プローブを使用した上記表3に示す反応溶液に、ターゲットRNA(10nM)及び非ターゲットRNAである酵母トータルRNA(25μg、250μg)を加えて蛍光強度を測定し、L−DNAに対する非ターゲットRNAの影響を調べた。その測定結果を図6(A)に示す。同図において、実線がターゲットRNAが存在する場合(+)、破線がターゲットRNAが存在しない場合(−)を示す。同図に示すとおり、非ターゲットRNAである酵母トータルRNAが25ng(ターゲットの約100倍)存在してもターゲットへの特異性は失われず、しかも、反応速度もほとんど影響されなかった。また、非ターゲットRNAである酵母トータルRNAが250ng(ターゲットの約1000倍)存在する場合にも、反応速度は落ちるものの、ターゲットRNAの有無で明確な差異がありターゲットへの特異性が失われないことが示された。
2・・ターゲット
3・・プローブ
4・・蛍光物質
5・・クエンチャー
6・・ステム構造
7・・ニッキングエンドヌクレアーゼ
8・・蛍光発光
X・・ターゲット結合領域
Y・・ステムループ形成部
Z・・プローブ結合領域
x2・・ステム形成時ターゲット結合領域
x3・・ステム解離後ターゲット結合領域
y2・・ステム形成領域
y3・・ターゲット非結合ステム形成領域
z2・・ループ領域
配列番号3:プローブ
配列番号5:仲介DNA
Claims (9)
- 試料中のターゲットである一本鎖ポリヌクレオチドを検出及び/又は測定する方法であって、
前記試料中に、ターゲットとプローブとを仲介する仲介ポリヌクレオチド、ニッキングエンドヌクレアーゼ、及び、一端に蛍光物質が結合され他端にクエンチャーが結合されたプローブを添加すること、並びに、
前記試料の蛍光発光を測定することを含み、
前記仲介ポリヌクレオチドが、
ターゲット結合領域と、プローブ結合領域と、ステムループ形成領域とを備え、
前記ステムループ形成領域が、前記ターゲット結合領域の一部、及び、前記プローブ結合領域を含み、
前記プローブ結合領域が、ニッキングエンドヌクレアーゼの認識配列の切断されない側の配列を含み、
ターゲットが非存在の場合には、前記ステムループ形成領域においてステムループ構造が形成されてプローブと前記プローブ結合領域との結合が制限され、
ターゲットが存在する場合には、前記ターゲットと前記ターゲット結合領域とが結合することで前記ステムループ構造が解除されて前記プローブと前記プローブ結合領域との結合が促進されるポリヌクレオチドである、
一本鎖ポリヌクレオチドの検出及び/又は測定方法。 - 前記仲介ポリヌクレオチドが、
塩基配列x2、x3、y3、z2及びy2がこの順で連結された塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、
塩基配列x2とx3とがこの順で連結された塩基配列が、前記ターゲットとハイブリダイズ可能な塩基配列からなる前記ターゲット結合領域を形成し、
塩基配列y3の一部、z2、及び、y2の一部がこの順で連結された塩基配列が、前記プローブとハイブリダイズ可能な塩基配列からなる前記プローブ結合領域を形成し、
塩基配列x3、y3、z2及びy2がこの順で連結された塩基配列が、前記ステムループ構造を形成する前記ステムループ形成領域を形成し、
前記ステムループ形成領域において、塩基配列x3及びy3がこの順で連結する塩基配列と塩基配列y2とが互いにステム構造を形成する逆方向反復配列であって、塩基配列z2がループ構造を形成する配列であり、
前記ターゲットが非存在の場合には前記ステムループ構造が形成され、前記プローブと前記プローブ結合領域との結合が制限され、
前記ターゲットが存在する場合には、前記ターゲットと前記ターゲット結合領域とが結合することで前記ステムループ構造が解除されて前記プローブと前記プローブ結合領域との結合が促進されるポリヌクレオチドであり、
前記ターゲット領域と前記ターゲット結合領域とが二本鎖を形成することで、前記仲介ポリヌクレオチドのステムループ構造が解除される第1ステップ、
ステムループ構造の解除によりアクセス可能となった前記プローブ結合領域と前記プローブとが二本鎖形成する第2ステップ、
前記プローブ結合領域と前記プローブとの二本鎖形成領域にニッキングエンドヌクレアーゼが作用して前記プローブが切断され、切断されたプローブ断片が前記プローブ結合領域から解離するとともに蛍光を発光する第3ステップ、
プローブ断片の解離によりアクセス可能となった前記プローブ結合領域へ新たなプローブが結合して二本鎖形成する第4ステップ、及び、
前記第3ステップと前記第4ステップが繰り返される第5ステップ、を含む請求項1記載の一本鎖ポリヌクレオチドの検出及び/又は測定方法。 - 前記プローブ及び前記プローブ結合領域が二本鎖を形成した場合にニッキングエンドヌクレアーゼに認識部位が形成され、前記プローブが切断される側の配列を含み、前記プローブ結合領域が切断されない側の配列を含む、請求項2記載の一本鎖ポリヌクレオチドの検出及び/又は測定方法。
- 前記z2の長さが、4塩基である請求項2又は3に記載の一本鎖ポリヌクレオチドの検出及び/又は測定方法。
- 前記仲介ポリヌクレオチドの長さが、30〜60塩基である、請求項1から4のいずれか一項に記載の一本鎖ポリヌクレオチドの検出及び/又は測定方法。
- さらに、前記蛍光発光を経時的に測定することを含み、前記試料中の一本鎖ポリヌクレオチドの濃度をリアルタイムで検出及び/又は測定する請求項1から5のいずれか一項に記載の一本鎖ポリヌクレオチドの検出及び/又は測定方法。
- ニッキングエンドヌクレアーゼの使用方法であって、請求項1から6のいずれか一項に記載の一本鎖ポリヌクレオチドの検出及び/又は測定方法においてニッキングエンドヌクレアーゼを使用する方法。
- 請求項1から6のいずれか一項に記載の一本鎖ポリヌクレオチドの検出及び/又は測定方法を行うためのキットであって、
前記仲介ポリヌクレオチド、前記ニッキングエンドヌクレアーゼ、及び、前記一端に蛍光物質が結合され他端にクエンチャーが結合されたプローブを含む、
一本鎖ポリヌクレオチドの検出及び/又は測定用キット。 - さらに、取扱説明書を含む、請求項8記載の一本鎖ポリヌクレオチドの検出及び/又は測定用キット。
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