CN116590387B - 一种基于CRISPR系统的ssDNA检测方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种基于CRISPR系统的ssDNA检测方法及应用。所述ssDNA检测方法将Cas13a蛋白直接用于ssDNA的检测：待检测的靶标ssDNA能够与Cas13a蛋白、crRNA形成核糖核蛋白复合物，并激活Cas13a蛋白的反式切割活性，快速切割RNA核酸探针产生荧光信号。由于Cas13a的活性区域仅包含RNA切割活性，所以ssDNA激活Cas13a后并不会被顺式切割，因此本发明提供的检测方法实现了对于靶标ssDNA的无破坏检测，并显著提高了ssDNA检测灵敏度和单碱基错配识别能力，而且设计灵活性高，成本低廉，操作简便，未来在分子诊断、病毒示踪、DNA表达干扰等领域具有广阔的应用前景。

Description

一种基于CRISPR系统的ssDNA检测方法及应用
技术领域
本发明涉及生物检测领域，尤其涉及一种基于CRISPR系统的ssDNA检测方法及应用。
背景技术
快速精准的分子诊断技术在临床检验、慢性病监测、传染病监测、检验检疫、食品安全等公共卫生领域具有重要的使用价值。近些年，CRISPR (Clustered RegularlyInterspaced Short Palindromic Repeats)系统反式切割性质的发现促使基于CRISPR的分子诊断方法迅速发展，如张锋团队基于Cas13a开发出的SHERLOCK (Specific HighSensitivity Enzymatic Reporter unLOCKing)，Jennifer Doudna团队基于Cas12a、Cas14开发的DETECTR (DNA Endonuclease-Targeted CRISPR Trans Reporter)，以及王金团队基于Cas12a开发的HOLMES (an one-HOur Low-cost Multipurpose highly EfficientSystem)。利用Cas蛋白的活性、高灵敏度和特异性检测目标DNA或RNA序列，已经成为CRISPR系统快速和高灵敏度的检测方法。
虽然基于CRISPR/Cas的核酸检测技术发展迅速，但目前依然存在诸多问题，现有的技术方案通常使用Cas12a检测DNA样品，Cas13a检测RNA样品，Cas12a/Cas14a检测ssDNA样品。
现有的基于Cas12a的ssDNA检测技术无法区分单碱基错配的ssDNA，基于CRISPR系统的核酸检测方法的单碱基识别能力依赖于单碱基错配对其反式切割活性影响。然而，研究表明单碱基错配的ssDNA对Cas12a的反式切割活性几乎没有影响。因此，基于Cas12a的ssDNA检测技术无法区分单碱基错配的ssDNA。
而基于Cas14a的ssDNA检测方法灵敏度和信号强度较低，基于CRISPR系统的核酸检测方法的灵敏度依赖其反式切割活性的强弱。然而，研究表明Cas14a靶向ssDNA后的反式切割活性较弱，这使得基于Cas14a的ssDNA检测方法的灵敏度和信号强度较低。
此外，现有的核酸检测技术都会破坏待测靶标，样品的复检尤为困难。Cas蛋白与crRNA形成的复合物在靶向靶标核酸后，其顺式切割活性和反式切割活性被激活，Cas蛋白的顺式切割活性会将靶标核酸切断。而反式切割活性则会无差别地将附近的ssRNA或ssDNA切割成寡核苷酸碎片。已有检测ssDNA的方法包括DETECTR和HOLMES，使用Cas12a/Cas14a靶向DNA，Cas12a/Cas14a在靶向DNA后，激活的反式切割活性会无差别地切割附近所有的DNA片段。SHERLOCK技术中， Cas13a在靶向RNA后，激活的反式切割活性会无差别地切割附近所有的RNA片段也包括RNA靶标。这对于核酸检测来说是不利的，在检测的同时破坏了靶标分子，这使得样品的复检尤为困难。
综上，现有的ssDNA检测方法中，基于CRISPR/Cas核酸检测技术都会破坏其核酸靶标，难以实现复检。基于Cas12a的ssDNA检测方法缺乏单碱基错配识别能力，基于Cas14a的ssDNA检测方法灵敏度和信号强度较低。因此，现有技术还有待改进，亟需开发出既保护原有样品，而且具有高灵敏度和单碱基错配识别能力的ssDNA检测方法。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种基于CRISPR系统的ssDNA检测方法及应用，旨在解决目前的ssDNA检测方法无法避免对ssDNA靶标的破坏，灵敏度和信号强度较低，且缺乏单碱基错配识别能力的问题。
本发明的技术方案如下：
一种基于CRISPR系统的ssDNA检测方法，其中，包括步骤：
提供ssDNA检测体系，所述ssDNA检测体系包括crRNA、Cas13a蛋白以及RNA核酸探针；
将待检测的靶标ssDNA加入到所述ssDNA检测体系中发生反应，得到反应混合液；
对所述反应混合液进行检测，并根据检测结果对所述靶标ssDNA进行定性或者定量；
其中，所述的ssDNA检测方法为非诊断目的，所述crRNA的核苷酸序列与待检测的靶标ssDNA的核苷酸序列特异性互补。
所述的基于CRISPR系统的ssDNA检测方法，其中，所述RNA核酸探针为带有荧光标记的单链RNA探针或者RNA电化学探针。
所述的基于CRISPR系统的ssDNA检测方法，其中，所述带有荧光标记的单链RNA探针的5’端为FAM标记、ROX标记、HEX标记、FITC标记、Cy5标记、Cy3标记中的任一种，3’端为BHQ1标记、BHQ2标记、BHQ3标记中的任一种，所述带有荧光标记的单链RNA探针长度为5nt~20nt。
所述的基于CRISPR系统的ssDNA检测方法，其中，所述Cas13a蛋白包括LshCas13a蛋白、LwaCas13a蛋白、LbaCas13a蛋白、LbuCas13a蛋白中的一种或多种。
一种基于CRISPR系统的ssDNA检测体系，其中，所述ssDNA检测体系包括crRNA、Cas13a蛋白、RNA核酸探针以及缓冲液；所述crRNA的核苷酸序列与待检测的靶标ssDNA的核苷酸序列特异性互补；所述RNA核酸探针为带有荧光标记的单链RNA探针或者RNA电化学探针。
所述的基于CRISPR系统的ssDNA检测体系，其中，所述带有荧光标记的单链RNA探针的5’端为FAM标记、ROX标记、HEX标记、FITC标记、Cy5标记、Cy3标记中的任一种，3’端为BHQ1标记、BHQ2标记、BHQ3标记中的任一种，所述带有荧光标记的单链RNA探针长度为5nt~20nt。
所述的基于CRISPR系统的ssDNA检测体系，其中，所述Cas13a蛋白包括LshCas13a蛋白、LwaCas13a蛋白、LbaCas13a蛋白、LbuCas13a蛋白中的一种或多种。
一种基于CRISPR系统的ssDNA检测方法的应用，其中，将如上任一所述的基于CRISPR系统的ssDNA检测方法或者如上任一所述的基于CRISPR系统的ssDNA检测体系应用于单链DNA的检测，或者应用于靶标ssDNA的点突变检测，所述应用为非诊断目的。
一种基于CRISPR系统的ssDNA检测试剂盒，其中，所述ssDNA检测试剂盒包括如上任一所述的基于CRISPR系统的ssDNA检测体系。
所述的ssDNA检测试剂盒的应用，其中，将所述ssDNA检测试剂盒应用于生物样本的定量检测或者基因突变的检测，所述生物样本包括病原微生物、细胞、组织或血液，所述应用为非诊断目的。
有益效果：本发明提供了一种基于CRISPR系统的ssDNA检测方法及应用。所述ssDNA检测方法将Cas13a蛋白直接用于ssDNA的检测：待检测的靶标ssDNA能够与Cas13a蛋白、crRNA形成核糖核蛋白复合物（RNP），并激活Cas13a蛋白的反式切割活性，快速切割RNA核酸探针产生荧光信号。由于Cas13a的活性区域仅包含RNA切割活性，所以ssDNA激活Cas13a后并不会被顺式切割，因此本发明提供的ssDNA检测方法实现了对于靶标ssDNA的无破坏检测，并显著提高了ssDNA检测灵敏度和单碱基错配识别能力，丰富了现有的CRISPR/Cas核酸检测体系，而且设计灵活性高，成本低廉，操作简便，未来在分子诊断、病毒示踪、DNA表达干扰等领域具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为本发明实施例中基于CRISPR系统的ssDNA检测方法的原理示意图。
图2为本发明实施例中检测方法的应用流程图。
图3为本发明实施例中Cas13a蛋白优选结果示意图。
图4为本发明实施例中多带有荧光标记的单链RNA探针优选结果示意图。
图5为本发明实施例中切割RNA核酸探针效果测试结果示意图。
图6为本发明实施例中不切割DNA带有荧光标记的单链RNA探针效果测试结果示意图。
图7为本发明实施例中几乎不切割ssDNA靶标效果测试结果示意图。
图8为本发明实施例中Cas12a与Cas13a检测ssDNA灵敏度测试结果示意图。
图9为本发明实施例中单碱基突变靶标能力的测试结果示意图。
图10为本发明实施例中对人类微小病毒B19（B19）的检测结果示意图。
图11为本发明实施例中结合电化学平台检测人类微小病毒B19（B19）的检测结果示意图。
图12为本发明实施例中对人乳头瘤病毒16（HPV16）的检测结果示意图。
图13为本发明实施例中LHON相关致病基因点突变（m.14484T>C）检测结果示意图。
图14为本发明实施例中CYP2C19*3基因点突变检测结果示意图。
具体实施方式
本发明提供一种基于CRISPR系统的ssDNA检测方法及应用，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明实施例提供一种基于CRISPR系统的ssDNA检测方法，包括步骤：
S10、提供ssDNA检测体系，所述ssDNA检测体系包括crRNA、Cas13a蛋白以及RNA核酸探针；
S20、将待检测的靶标ssDNA加入到所述ssDNA检测体系中发生反应，得到反应混合液；
S30、对所述反应混合液进行检测，并根据检测结果对所述靶标ssDNA进行定性或者定量。
其中，所述的ssDNA检测方法为非诊断目的。
在一些实施方式中，所述crRNA的核苷酸序列与待检测的靶标ssDNA的核苷酸序列特异性互补。
本发明提供的基于CRISPR系统的ssDNA检测方法，将Cas13a蛋白直接用于ssDNA的检测：待检测的靶标ssDNA能够与Cas13a蛋白、crRNA形成核糖核蛋白复合物（RNP），并激活Cas13a蛋白的反式切割活性，快速切割RNA核酸探针产生荧光信号。同时，由于Cas13a的活性区域仅包含RNA切割活性，所以ssDNA激活Cas13a后并不会被顺式切割，因此本发明提供的ssDNA检测方法几乎不切割DNA靶标，实现了对于靶标ssDNA的无破坏检测。而且，本发明的检测方法具有极高的单碱基突变敏感性，显著提高了ssDNA检测灵敏度和单碱基错配识别能力，极大的丰富了现有的CRISPR/Cas核酸检测体系。
在一些实施方式中，所述RNA核酸探针为带有荧光标记的单链RNA探针或者RNA电化学探针。相应的，结果可以采用荧光检测，也可以采用电化学方法检测。
具体的，所述带有荧光标记的单链RNA探针的5’端为FAM/ROX/HEX/FITC/Cy5/Cy3标记，3’端为BHQ1/BHQ2/BHQ3标记。所述RNA探针的两端标记可以从上述标记中任意组合，也可以采用其他任何合适的荧光标记。
具体的，所述带有荧光标记的单链RNA探针的长度为5nt~20nt。
在一些实施方式中，所述Cas13a蛋白包括LshCas13a蛋白、LwaCas13a蛋白、LbaCas13a蛋白、LbuCas13a蛋白中的一种或多种。常见的Cas13a蛋白都可以合理应用于本发明。
在一些实施方式中，所述ssDNA检测体系还包括缓冲液。缓冲液可以为CRISPR/Cas核酸检测体系中常规使用的缓冲液，在此不做任何限制。
在一些实施方式中，检测所述反应混合液的荧光信号，并根据检测结果对所述靶标ssDNA进行定性或者定量；或者，检测所述反应混合液的电化学信号，并根据检测结果对所述靶标ssDNA进行定性或者定量。还可以使用其他信号检测方法来表征检测结果，如免疫层析分析法（LFA），金纳米粒子的比色分析方法，基于电子读出系统的分析法，凝胶电泳等。
在一些实施方式中，检测完成之后还可以通过使用或者不使用Cas13a变性的方法，保留检测样品。
图1所示为本发明实施例基于CRISPR系统的ssDNA检测方法的原理示意图。在现有的研究中Cas13a蛋白（也称Cas13a核酸酶）仅被用于识别RNA，本发明发现Cas13a蛋白同样可以被直接用于ssDNA的检测：与RNA激活的Cas13a系统类似，ssDNA也能够与Cas13a蛋白、crRNA形成核糖核蛋白复合物（RNP），并激活Cas13a蛋白的反式切割活性，快速切割RNA报告子产生荧光信号；而由于Cas13a的活性区域仅具有RNA切割活性，其并不会切割DNA报告子，所以ssDNA激活Cas13a后并不会被顺式切割，因此本发明提供的ssDNA检测方法实现了对于样品的无破坏检测，并显著提高了ssDNA检测灵敏度和单碱基错配识别能力，丰富了现有的CRISPR/Cas核酸检测体系，未来在分子诊断、病毒示踪、DNA表达干扰等领域具有广阔的应用前景。
本发明提供的检测方法中，首先向含有待检测的靶标ssDNA核酸分子的体系中加入crRNA、Cas13a蛋白、核酸探针以及缓冲液，然后对核酸探针进行检测。其中，crRNA是指引Cas蛋白特异性结合靶标DNA的RNA，其包括通用序列和靶向序列，通用序列能自主形成发卡结构，可以与Cas蛋白特异性识别；靶向序列与待检测的靶标ssDNA的核苷酸序列互补，可以特异性识别靶标DNA序列。核酸探针为带有荧光标记的ssRNA（例如FAM-U6-BHQ1，即6nt的ssRNA，其5’端为FAM标记，3’端为BHQ1标记），或者RNA电化学探针。
本发明提供的新型的CRISPR检测ssDNA的方法，将与待检测靶标ssDNA序列互补的crRNA以及Cas13蛋白混合得到核糖核蛋白（RNP），并将上述材料一起组成反应体系，直接检测ssDNA核酸靶标，设计灵活性高，成本低廉，操作简便。而且，本发明检测方法中使用Cas13a，其特异性切割ssRNA，因此不会破坏ssDNA靶标，而基于Cas12a/Cas14a的核酸检测方法都会破坏，因此使用本发明检测方法便于样品复检。不仅如此，本发明中使用Cas13a，其反式切割ssRNA活性显著强于Cas12a，因此信号放大能力优于基于Cas12a/Cas14a的核酸检测方法。本发明方法实现了对于ssDNA单碱基突变的特异性识别，相较于Cas12a有较大提升。
本发明实施例还提供一种基于CRISPR系统的ssDNA检测体系，所述ssDNA检测体系包括crRNA、Cas13a蛋白、RNA核酸探针以及缓冲液。
在一些实施方式中，所述crRNA的核苷酸序列与待检测的靶标ssDNA的核苷酸序列特异性互补。
在一些实施方式中，所述RNA核酸探针为带有荧光标记的单链RNA探针或者RNA电化学探针。
具体的，所述带有荧光标记的单链RNA探针的5’端为FAM标记、ROX标记、HEX标记、FITC标记、Cy5标记、Cy3标记中的任一种，3’端为BHQ1标记、BHQ2标记、BHQ3标记中的任一种。
更具体的，所述带有荧光标记的单链RNA探针的5’端为FAM标记，3’端为BHQ1标记。
具体的，所述带有荧光标记的单链RNA探针的长度为5nt~20nt。
更为具体的，所述带有荧光标记的单链RNA探针为FAM-U6-BHQ1，即6nt的带有荧光标记的ssRNA，其5’端为FAM标记，3’端为BHQ1标记。
在一些实施方式中，所述Cas13a蛋白包括LshCas13a蛋白、LwaCas13a蛋白、LbaCas13a蛋白、LbuCas13a蛋白中的一种或多种。
本发明实施例还提供一种基于CRISPR系统的ssDNA检测方法的应用，将上文所述的基于CRISPR系统的ssDNA检测方法或者上文所述的基于CRISPR系统的ssDNA检测体系应用于单链DNA的检测，所述应用为非诊断目的。
本发明实施例的检测方法还可以广泛应用于双链DNA/单链DNA/双链RNA/单链RNA的检测。如图2的流程图所示，首先使用不对称扩增或其他产生ssDNA的方式，例如随机引物扩增、剪切与切割、Phi29 DNA聚合酶扩增、碱性条件下的热变性、热解、化学合成、逆转录、利用蛋白质结合、碱基修饰等等方法获得ssDNA之后，再利用上文所述方法检测ssDNA。因此，上述检测方法除ssDNA之外，还可广泛用于检测dsDNA、dsRNA、ssRNA、RNA与DNA的复合物等核酸靶标分子。该检测方法可应用于生物样本的检测，所述生物样本包括病原微生物、细胞、组织或血液，但不限于此。待测生物样本可经过核酸提取处理，例如，使用核酸提取试剂盒，根据核酸提取试剂盒说明书提供的核酸提取技术提取获得的总核酸样品。待测生物样本可以来源于包括人类在内的哺乳动物或植物，但不限于此。
在一些实施方式中，待测生物样品还可以为细菌、病毒等微生物。例如：非洲猪瘟病毒(ASFV)、狂犬病病毒(pseudorabies virus)、人乳头瘤病毒-18(HPV-18)、艾滋病病毒(HIV)、金黄色葡萄球菌(Streptococcus aureus)、大肠杆菌(E.coli)或单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)等等。
在一些实施方式中，上述检测方法还可以应用于检测ssDNA的类似物，如靶向修饰了锁核酸、桥接核酸、RNA的ssDNA，或靶向不完全是单链的DNA，如一部分是双链、一部分是单链的DNA。
本发明实施例还提供一种基于CRISPR系统的ssDNA检测方法的应用，将上文所述的基于CRISPR系统的ssDNA检测方法或者上文所述的基于CRISPR系统的ssDNA检测体系应用于靶标ssDNA的点突变检测，所述应用为非诊断目的。
本发明检测方法还可以使用Cas13a检测靶标ssDNA点突变。具体的，可以由dsDNA、RNA等核酸产生对应的靶标ssDNA，从而进行基因点突变检测。本申请实施例提供的检测方法能够对基因点突变进行快速分型，该基因分型检测方法同样适用于其他碱基突变、缺失、替换、增加检测对象等。本发明的检测方法具有极高的单碱基突变敏感性，显著提高了ssDNA检测灵敏度和单碱基错配识别能力，极大的丰富了现有的CRISPR/Cas核酸检测体系。
本发明实施例还提供一种基于CRISPR系统的ssDNA检测试剂盒，所述试剂盒包括上文所述的基于CRISPR系统的ssDNA检测体系，所述ssDNA检测体系包括crRNA、Cas13a蛋白、RNA核酸探针以及缓冲液；所述crRNA的核苷酸序列与待检测的靶标ssDNA的核苷酸序列特异性互补；所述RNA核酸探针为带有荧光标记的单链RNA探针或者RNA电化学探针。
具体的，所述带有荧光标记的单链RNA探针的5’端为FAM标记、ROX标记、HEX标记、FITC标记、Cy5标记、Cy3标记中的任一种，3’端为BHQ1标记、BHQ2标记、BHQ3标记中的任一种，探针长度为5nt~20nt。
具体的，所述Cas13a蛋白包括LshCas13a蛋白、LwaCas13a蛋白、LbaCas13a蛋白、LbuCas13a蛋白中的一种或多种。
试剂盒中还可以包括其他有必要的试剂或材料，例如缓冲液、试纸等等，在此不做任何限制。
本发明实施例还一种上述的ssDNA检测试剂盒的应用，将所述ssDNA检测试剂盒应用于生物样本的定量检测或者基因突变的检测，所述生物样本包括病原微生物、细胞、组织或血液，所述应用为非诊断目的。
本发明实施例提供的试剂盒可广泛用于检测ssDNA、dsDNA、dsRNA、ssRNA、RNA与DNA的复合物等核酸靶标分子。该试剂盒可应用于生物样本的定量检测，所述生物样本包括病原微生物、细胞、组织或血液，但不限于此。待测生物样本可经过核酸提取处理，例如，使用核酸提取试剂盒，根据核酸提取试剂盒说明书提供的核酸提取技术提取获得的总核酸样品。待测生物样本可以来源于包括人类在内的哺乳动物或植物，但不限于此。
所述试剂盒还可以应用于生物样本的靶标ssDNA的点突变检测，所述应用为非诊断目的。具体的，可以由dsDNA、RNA等核酸产生对应的靶标ssDNA，从而进行基因点突变检测。所述生物样本包括病原微生物、细胞、组织或血液，但不限于此。待测生物样本可经过核酸提取处理，例如，使用核酸提取试剂盒，根据核酸提取试剂盒说明书提供的核酸提取技术提取获得的总核酸样品。待测生物样本可以来源于包括人类在内的哺乳动物或植物，但不限于此。
下面通过具体实施例对本发明一种基于CRISPR系统的ssDNA检测方法及应用做进一步的解释说明：
若无特别说明，实施例中使用的化学试剂均为市售试剂。
实施例1 两种Cas13a蛋白优选
本实施例选用不同的ssDNA（DNA-1-29nt、DNA-1-59nt）作为靶标序列，测试不同Cas13a蛋白对其检测的响应值。其中，DNA-1-29nt的序列如SEQ. ID NO 1所示，DNA-1-59nt的序列如SEQ. ID NO 2所示：
SEQ. ID NO 1: CAGTCAAGCCTCTTCTCGTTCCTCATCAC
SEQ. ID NO 2: CCATATCTACTTCACAGTCAAGCCTCTTCTCGTTCCTCATCACTATGTCATTATGTGCT
相关crRNA序列crRNA-1如SEQ. ID NO 3所示：
SEQ. ID NO 3: GAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACGUGAUGAGGAACGAGAAGAGGCUUGACUG
Cas13a反应体系：20μL反应体系中，加入纯化的5nM crRNA-1，5nM Cas13a， 10nMssDNA靶标， 500nM带有荧光标记的单链RNA探针 FAM-U6-BHQ1（即6nt的ssRNA，其5’端为FAM标记，3’端为BHQ1标记，下同），1× Cas13a reaction buffer，1U/μL Murine RNaseInhibitor。对照组中其他成分都加，仅不加ssDNA靶标序列。在33℃反应30min，同时在qPCR中每30s检测一次荧光信号。此时带有荧光标记的单链RNA探针被切割，同时通过荧光检测仪的检测FAM荧光基团会发出荧光（激发光465和490nm，发射光515nm）。
不同的Cas13a蛋白对检测的30min时响应值结果如图3所示，其中29DNA代表靶标ssDNA为DNA-1-29nt DNA，59DNA代表靶标ssDNA为DNA-1-59nt DNA。由图可知，靶标ssDNA与Cas13a蛋白组成的复合体结合ssDNA靶标都能够实现单链RNA的切割，但不同Cas13a对靶标检测效果不同，如LwaCas13a只有很弱的反式切割活性，而LbuCas13a表现出更好反式切割活性，证明LbuCas13a是较好的候选Cas13a蛋白，后续实施例中选择使用LbuCas13a。
实施例2 多种带有荧光标记的单链RNA探针优选
本实施例选用不同的RNA探针（FAM-UUUUU-BHQ1/ROX- UGGUUUUGGU- BHQ2/ HEX-UUUCCCUUUUUUUCCCUUU- BHQ3）作为探针序列，测试不同RNA探针对其检测相同浓度的相同靶标的响应值。其中，Cas13a蛋白为LbuCas13a，crRNA为crRNA-1，靶标为DNA-1-59nt。
Cas13a反应体系：20μL反应体系中，加入纯化的5nM crRNA-1，5nM Cas13a，5nM 靶标ssDNA，500nM带有荧光标记的单链RNA探针， 1× Cas13a reaction buffer，1U/μLMurine RNase Inhibitor。对照组中其他成分都加，仅不加ssDNA靶标序列。在33℃反应20min，同时在qPCR中每30s检测一次荧光信号。此时带有荧光标记的单链RNA探针被切割，同时通过荧光检测仪的检测FAM/ ROX/ HEX荧光基团会发出荧光。
不同的Cas13a蛋白对检测的响应值结果如图4所示，其中FAM代表FAM荧光标记探针，ROX代表ROX荧光标记探针，HEX代表HEX荧光标记探针。由图可知，不同荧光标记探针对靶标检测无明显差异。
实施例3切割RNA核酸探针效果测试
选用RNA核酸探针测试LbuCas13a蛋白对其检测的响应值。选用DNA-HPV-50nt作为靶标DNA，crRNA为crRNA-HPV16-13，选用RNA核酸探针。其中，DNA-HPV-50nt的序列如SEQ.ID NO 4所示，crRNA-HPV16-13的序列如SEQ. ID NO 5所示，RNA核酸探针的序列如SEQ. IDNO 6所示：
SEQ. ID NO 4：
AATATGTCATTATGTGCTGCCATATCTACTTCAGAAACTACATATAAAAA
SEQ. ID NO 5：
GACCACCCCAAAAAUGAAGGGGACUAAAACAGUUUCUGAAGUAGAUAUGGCAGCACAU
SEQ. ID NO 6：AUCUUUACAU
Cas13a反应体系：20μL反应体系中，加入纯化的10nM crRNA-HPV16-13，10nMCas13a，10nM靶标ssDNA(DNA-HPV-50nt)， 20nM RNA核酸探针， 1× Cas13a reactionbuffer，1U/μL Murine RNase Inhibitor，在33℃反应50min后跑胶，对照条带为ssDNA靶标和RNA核酸探针。
跑胶结果如图5所示，由图可知为RNA条带消失，证明Cas13a被靶标ssDNA结合并激活后，非特异性切割RNA核酸探针。
实施例4 不切割DNA带有荧光标记的单链RNA探针效果测试
本实施例选用DNA-HPV-50nt作为靶标DNA，选用不同报告子（FAM-U6-BHQ1或FAM-T6-BHQ1）测试LbuCas13a蛋白对其检测的响应值。选用DNA-HPV-50nt作为靶标DNA，crRNA为crRNA-HPV16-13。
Cas13a反应体系：20μL反应体系中，加入纯化的2nM crRNA-HPV16-13，2nMCas13a，靶标10nM ssDNA(DNA-HPV-50nt)，500nM带有荧光标记的单链RNA探针FAM-U6-BHQ1或FAM-T6-BHQ1（即6nt的ssRNA或ssDNA，其5’端为FAM标记，3’端为BHQ1标记），1× Cas13areaction buffer，1U/μL Murine RNase Inhibitor。对照组反应其他成分都加，仅不加ssDNA靶标序列。在33℃反应40min，同时在qPCR中每30s检测一次荧光信号。
结果如图6中A所示，由图可知6U 报告子被有效切割，6T 报告子不能被有效切割，图6中B为反应实时荧光曲线，这说明本发明可实现特异性切割ssRNA reporter，而不切割ssDNA reporter，可以有效保护ssDNA样品，保护原待检测样品。
实施例5 几乎不切割ssDNA靶标效果测试
本实施例选用DNA-HPV-50nt作为靶标DNA，crRNA为crRNA-HPV16-13，测试LbuCas13a蛋白检测后靶标DNA留存情况。
选用100nM DNA-HPV-50nt作为靶标DNA，不加带有荧光标记的单链RNA探针，测试LbuCas13a蛋白对其是否有切割。20μL反应体系中，加入纯化的300nM crRNA-HPV16-13，300nM Cas13a，300nM靶标ssDNA(DNA-HPV-50nt)， 1× Cas13a reaction buffer，1U/μLMurine RNase Inhibitor，33℃反应50min。并将反应过后的20μL反应体系通过尿素-丙烯酰胺凝胶电泳(Urea-PAGE)电泳，然后用荧光发光成像仪检测。
结果如图7所示，由图可知DNA条带反应后依然明显，这说明本发明可实现特异性切割ssRNA，而几乎不切割靶标ssDNA，可以有效保护ssDNA样品，保护原待检测样品90%以上。
实施例6 Cas12a与Cas13a检测ssDNA灵敏度测试
本实施例为了检测不同浓度靶标的灵敏度，选用DNA-HPV-50nt作为靶标DNA，然后梯度稀释成不同浓度，测试LbuCas13a/LbCas12a对其响应灵敏度。其中，crRNA分别为crRNA-HPV16-13以及crRNA-HPV16-12，crRNA-HPV16-13的序列如SEQ. ID NO 5所示，crRNA-HPV16-12的序列如SEQ. ID NO 7所示。
SEQ. ID NO 7：UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUUGAAGUAGAUAUGGCAGCAC
Cas12a反应体系：20μL反应体系中，加入纯化的5nM crRNA-HPV16-12，5nMLbCas12a，靶标ssDNA (DNA-HPV-50nt)浓度梯度稀释（10nM、1nM、100pM、10pM、1pM），500nM带有荧光标记的单链RNA探针FAM-T6-BHQ1， 1× Cas12a reaction buffer，1U/μL MurineRNase Inhibitor。对照组反应其他成分都加，仅不加ssDNA靶标序列。在37℃反应30min，同时在qPCR中每30s检测一次荧光信号。
Cas13a反应体系：20μL反应体系中，加入纯化的5nM crRNA-HPV16-13，5nMCas13a，靶标ssDNA (DNA-HPV-50nt)浓度梯度稀释（10nM、1nM、100pM、10pM、1pM），500nM带有荧光标记的单链RNA探针FAM-U6-BHQ1， 1× Cas13a reaction buffer，1U/μL MurineRNase Inhibitor。对照组反应其他成分都加，仅不加ssDNA靶标序列。在33℃反应40min，同时在qPCR中每30s检测一次荧光信号。
检测结果如图8所示。由图8中A可知，Cas12a反应体系中，当直接加入测试靶标时(DNA-HPV-50nt)，100p浓度及以上的靶标DNA能够响应，而且浓度1nM以上时响应显著。由图8中B可知，Cas13a反应体系中，当直接加入测试靶标时(DNA-HPV-50nt)，1pM浓度及以上的靶标DNA能够响应，而且浓度10pM以上时响应显著。图8中C为不同浓度靶标之下Cas12a以及Cas13a的对比结果图。由上述结果可知，本实施例中的检测方法灵敏度显著优于现有的基于Cas12a的核酸检测技术。
实施例7 单碱基突变靶标能力的测试
本实施例选用DNA-HPV-28nt-DNA-SNV-4作为靶标DNA/RNA，测试LbuCas13a蛋白和LbCas12a对单碱基突变靶标检测的响应值。
其中，DNA-HPV-28nt-DNA-SNV-4的序列如表1所示：
表1
Cas13a反应体系：20μL反应体系中，加入纯化的5nM crRNA-HPV16-13，5nMLbuCas13a，10nM靶标ssDNA (DNA-HPV-28nt-DNA-SNV-4)，（DNA-SNV-4对应为Cas13a突变-4，DNA-SNV-8对应为Cas13a突变-8，DNA-SNV-12对应为Cas13a突变-12，DNA-SNV-16对应为Cas13a突变-16，DNA-SNV-20对应为Cas13a突变-20，DNA-SNV-24对应为Cas13a突变-24），500nM带有荧光标记的单链RNA探针FAM-U6-BHQ1，1× Cas13a reaction buffer，1U/μLMurine RNase Inhibitor。对照组反应其他成分都加，仅不加ssDNA靶标序列。在33℃反应50min，同时在qPCR中每30s检测一次荧光信号。
Cas12a反应体系：20μL反应体系中，加入纯化的50nM crRNA-HPV16-12，50nMLbuCas13a，靶标10nM ssDNA(DNA-HPV-28nt-DNA-SNV-8)，DNA-SNV-8对应为Cas12a突变-2，DNA-SNV-12对应为Cas12a突变-6，DNA-SNV-16对应为Cas12a突变-10，DNA-SNV-20对应为Cas12a突变-14，DNA-SNV-24对应为Cas12a突变-18，500nM带有荧光标记的单链RNA探针FAM-U6-BHQ1， 1× Cas13a reaction buffer，1U/μL Murine RNase Inhibitor。对照组反应其他成分都加，仅不加ssDNA靶标序列。在33℃反应30min，同时在qPCR中每30s检测一次荧光信号。
测试结果如图9所示。由图可知，Cas13a反应体系中，DNA-SNV-20-DNA-SNV-4，突变4-20位的单碱基突变都有较好的识别能力，都显示出很好的单碱基识别特异性，尤其DNA-SNV-8，20mins响应值归一化处理仅为DNA-HPV-28nt响应值的2.46%；Cas12a反应体系中，选取特异性最好的位点DNA-SNV-16，响应值归一化处理后，DNA-SNV-16响应值为WT的27.47%。由上述结果可知，本实施例方法与基于LbCas12a的ssDNA检测方法相比有较好的单碱基识别特异性。
实施例8 对人类微小病毒B19（B19）的检测
本实施例设计了靶标单链DNA病毒B19基因组的靶标向导RNA(B19-crRNA)，B19-crRNA靶向B19基因组的正向序列，B19基因组的正向序列源于B19基因组。B19-crRNA的正向序列见表2。
待测样本的核酸由第三方合成公司合成，选取的片段为B19基因片段（NCBIReference Sequence: NC_000883.2），其正向序列见表2。
表2
检测反应体系：总体积为20μL，其中包括5nM Lbucas13a，5nM B19-crRNA，1×Cas13a reaction buffer，1U/μL Murine RNase Inhibitor，500nM带有荧光标记的单链RNA探针FAM-U6-BHQ1，500pM待测样本ssDNA，恒温33℃反应10min，然后进行终点荧光检测，结果见图10中A。恒温33℃反应，然后进行30min实时荧光检测，结果如图10中B所示，可以看出，本实施例提供的核酸检测方法能够对B19进行快速检测。参照本实施例所述内容，所述的核酸检测方法同样适用于各种不同检测对象的核酸检测。
实施例9 结合电化学平台检测人类微小病毒B19（B19）
本实施例设计了靶标单链DNA病毒B19基因组的靶标向导RNA(B19-crRNA)，B19-crRNA靶向B19基因组的正向序列，B19基因组的正向序列源于B19基因组。B19-crRNA的正向序列见表3。设计富含有U序列且5’修饰有巯基（SH），3’修饰有电化学信号分子亚甲基蓝（MB）的MB-RNA探针。MB-RNA的正向序列见表3。
待测样本的核酸由第三方合成公司合成，选取的片段为B19基因片段（NCBIReference Sequence: NC_000883.2），其正向序列见表3。
表3
检测反应体系：总体积为15μL，其中包括5nM Lbucas13a，5nM B19-crRNA，1×Cas13a reaction buffer，1U/μL Murine RNase Inhibitor，1nM待测样本ssDNA恒温33℃反应10min。
检测步骤：①采用传统的三电极系统，其中以Au电极作为工作电极，以铂丝作为辅助电极，以Ag/AgCl电极作为参比电极。在对电化学生物传感器的Au电极进行处理后，将富含有U序列且修饰有电化学信号分子亚甲基蓝（MB）的MB-RNA探针通过Au-S键固定在Au电极上，并使用MCH（6-巯基-1-己醇）封闭活性位点以减少后续检测程序中的非特异性吸附。②将上述检测反应体系混合物恒温33℃反应10min后滴加在金电极上，切割金电极上MB-RNA探针，使MB从电极上脱落，产生电化学信号的改变。③ 通过电化学传感器差分脉冲伏安法（DPV）响应进行检测。DPV测量在20mM PBS缓冲液（50mM NaCl，2.5mM MgCl2，pH 7.4）中进行，振幅和脉冲周期分别为50mV和0.5s，电压在-0.5V~-0.1V范围。检测结果如图11所示，可以看出，本实施例提供的核酸检测方法能够结合电化学传感平台对B19进行快速检测。参照本实施例所述内容，所述的核酸检测方法同样适用于各种不同检测对象的核酸检测。
实施例10 对人乳头瘤病毒16（HPV16）的检测
本实施例设计了靶标HPV16基因组的靶标向导RNA(HPV16-crRNA-13)，HPV16-crRNA靶向HPV16基因组的正向序列，HPV16基因组的正向序列源于HPV16基因组。设计PCR不对称扩增的引物，上游引物HPV16-Primer-F，下游引物HPV16-Primer-R。HPV16-crRNA的正向序列及引物序列见表3。
待测样本的核酸及PCR引物由第三方合成公司合成，选取的片段为HPV16基因片段（NCBI Reference Sequence: NC_001526.4），将其整合到pUC57-Simple上即得到模拟质粒样本，其正向序列见表4。
表4
ssDNA生成体系（PCR不对称扩增）：总体积为50μL，其中400nM HPV16-Primer-F，200nM HPV16-Primer-R，1fM （100aM、10aM、1aM、0.3aM）HPV16基因模板，1× PCR MasterMix。PCR反应程序为：95℃持续2分钟；40次循环：95℃持续15秒，60℃持续15秒，72℃持续15秒。
检测反应体系：总体积为20μL，其中包括5nM LbuCas13a，5nM HPV16-crRNA-13，1× Cas13a reaction buffer，1U/μL Murine RNase Inhibitor，500nM带有荧光标记的单链RNA探针FAM-U6-BHQ1，2μL待测样本（不对称PCR产物），恒温33℃反应10min，然后进行终点荧光检测，结果如图12中A所示。恒温33℃反应，然后进行30min实时荧光检测，结果如图12中B所示，本实施例提供的核酸检测方法能够对HPV16进行快速检测，可实现低至0.3aM的样本检出。参照本实施例所述内容，所述的核酸检测方法同样适用于各种不同检测对象的核酸检测。
实施例11 LHON相关致病基因点突变（m.14484T>C）检测
本实施例设计了靶标LHON（Leber’s Hereditary Optic Neuropathy，Leber遗传性视神经病变）致病基因点突变（m.14484T>C，rs199476104）的靶标crRNA(U-crRNA与野生型互补，C-crRNA与突变型互补)，U-crRNA靶向m.14484T>C野生型基因的反向序列，C-crRNA靶向m.14484T>C突变型基因的反向序列，m.14484T>C基因的反向序列源于人类线粒体基因组。设计PCR不对称扩增的引物，上游引物LHON-Primer-F，下游引物LHON-Primer-R。相关核酸序列见表4。
待测样本的核酸由第三方合成公司合成，选取的片段为m.14484T>C基因片段（NCBI Reference Sequence: NC_012920.1），分别将野生型序列和突变型序列整合到pUC57-Simple上即得到模拟质粒样本，其正向序列见表5。
表5
ssDNA生成体系（PCR不对称扩增）：总体积为50μL，其中200nM LHON-Primer-F，400nM LHON-Primer-R，1fM m.14484T>C基因模板，1× PCR Master Mix。PCR反应程序为：95℃持续2分钟；40次循环：95℃持续15秒，60℃持续15秒，72℃持续15秒。
检测反应体系：总体积为20μL，其中包括5nM Lbucas13a，5nM U-crRNA（5nM C-crRNA），1× Cas13a reaction buffer，1U/μL Murine RNase Inhibitor，500nM带有荧光标记的单链RNA探针FAM-U6-BHQ1，2μL待测样本（不对称PCR产物），恒温33℃反应10min然后进行终点荧光检测，结果如图13中A所示。恒温33℃反应，然后进行30min实时荧光检测，结果如图13中B和图13中C所示，本实施例提供的核酸检测方法能够对基因点突变进行快速分型。图13中A为两种crRNA均具有良好的分型效果，图13中B和C为不同crRNA检测突变型与野生型的实时荧光动力学曲线。参照本实施例所述内容，基因分型检测方法同样适用于其他碱基突变、缺失、替换、增加检测对象，也适用于各种不同检测对象的基因点突变检测。
实施例12 CYP2C19*3基因点突变检测
本实施例设计了靶标CYP2C19*3（rs4986893）基因点突变的靶标crRNA(G-crRNA与野生型互补，A-crRNA与突变型互补)，G-crRNA靶向CYP2C19*3野生型基因的反向序列，A-crRNA靶向CYP2C19*3突变型基因的反向序列，CYP2C19*3基因的反向序列源于人类基因组第10号染色体。设计PCR不对称扩增的引物，上游引物CYP2C19-Primer-F，下游引物CYP2C19-Primer-R。相关核酸序列见表5。
待测样本的核酸由第三方合成公司合成，选取的片段为CYP2C19*3基因片段（NCBIReference Sequence: NC_000010.11），分别将野生型序列和突变型序列整合到pUC57-Simple质粒载体上即得到模拟质粒样本，其正向序列见表6。
表6
ssDNA生成体系（PCR不对称扩增）：总体积为50μL，其中200nM CYP2C19-Primer-F，400nM CYP2C19-Primer-R，1fM CYP2C19*3基因模板，1× PCR Master Mix。PCR反应程序为：95℃持续2分钟；40次循环：95℃持续15秒，60℃持续15秒，72℃持续15秒。
检测反应体系：总体积为20μL，其中包括5nM Lbucas13a，5nM U-crRNA（5nM C-crRNA），1× Cas13a reaction buffer，1U/μL Murine RNase Inhibitor，500nM带有荧光标记的单链RNA探针FAM-U6-BHQ1，2μL待测样本（不对称PCR产物），恒温33℃反应10min，然后进行终点荧光检测，结果如图14中A所示。恒温33℃反应，然后进行30min实时荧光检测，结果如图14中B、C和D所示，可以看出，本实施例提供的核酸检测方法能够对基因点突变进行快速分型。参照本实施例所述内容，基因分型检测方法同样适用于其他碱基突变、缺失、替换、增加检测对象，也适用于各种不同检测对象的基因点突变检测。
综上所述，本发明提供了一种基于CRISPR系统的ssDNA检测方法及应用。所述ssDNA检测方法将Cas13a蛋白直接用于ssDNA的检测：待检测的靶标ssDNA能够与Cas13a蛋白、crRNA形成核糖核蛋白复合物（RNP），并激活Cas13a蛋白的反式切割活性，快速切割RNA核酸探针产生荧光信号。由于Cas13a的活性区域仅包含RNA酶，所以ssDNA激活Cas13a后并不会被顺式切割，因此本发明提供的ssDNA检测方法实现了对于靶标ssDNA的无破坏检测，而基于Cas12a/Cas14a的核酸检测方法都会破坏，因此使用本发明检测方法便于样品复检。不仅如此，本发明中使用Cas13a，其反式切割ssRNA活性显著强于Cas12a，因此信号放大能力优于基于Cas12a/Cas14a的核酸检测方法。本发明方法实现了对于ssDNA单碱基突变的特异性识别，相较于Cas12a有较大提升。最终，本发明提供的检测方法显著提高了ssDNA检测灵敏度和单碱基错配识别能力，丰富了现有的CRISPR/Cas核酸检测体系，而且设计灵活性高，成本低廉，操作简便，未来在分子诊断、病毒示踪、DNA表达干扰等领域具有广阔的应用前景。
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (5)

1.一种基于检测ssDNA的CRISPR/Cas13a系统检测基因点突变的方法，其特征在于，包括如下步骤：
同时提供野生型和突变型ssDNA检测体系，所述野生型ssDNA检测体系包括Cas13a蛋白、带有荧光标记的单链RNA探针和野生型crRNA；所述突变型ssDNA检测体系包括Cas13a蛋白、带有荧光标记的单链RNA探针和突变型crRNA；
采用PCR不对称扩增将待检测样品制备成ssDNA后分别加入到所述野生型和突变型ssDNA检测体系中，并根据荧光信号检测结果对所述待检测样品进行基因型鉴定；
其中，所述点突变为rs199476104或rs4986893，
当所述点突变为rs199476104时，野生型crRNA的序列如SEQ ID NO.26所示，突变型crRNA的序列如SEQ ID NO.27所示，所述PCR不对称扩增的引物对序列如SEQ ID NO.28和SEQ ID NO.29所示；
所述点突变为rs4986893时，野生型crRNA的序列如SEQ ID NO.32所示，突变型crRNA的序列如SEQ ID NO.33所示，所述PCR不对称扩增的引物对序列如SEQ ID NO.34和SEQ IDNO.35所示；
所述Cas13a蛋白为LbuCas13a，所述方法为非疾病诊断治疗目的。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述带有荧光标记的单链RNA探针的5’端为FAM标记、ROX标记、HEX标记、FITC标记、Cy5标记、Cy3标记中的任一种，3’端为BHQ1标记、BHQ2标记、BHQ3标记中的任一种，所述带有荧光标记的单链RNA探针长度为5nt~20nt。
3.一种基于检测ssDNA的CRISPR/Cas13a系统检测基因点突变的检测体系，其特征在于，包括ssDNA检测体系和采用PCR不对称扩增将待检测样品制备成ssDNA的引物对，所述ssDNA检测体系包括Cas13a蛋白、带有荧光标记的单链RNA探针、野生型crRNA和突变型crRNA；
其中，所述点突变为rs199476104或rs4986893，
当所述点突变为rs199476104时，野生型crRNA的序列如SEQ ID NO.26所示，突变型crRNA的序列如SEQ ID NO.27所示，所述PCR不对称扩增的引物对序列如SEQ ID NO.28和SEQ ID NO.29所示；
所述点突变为rs4986893时，野生型crRNA的序列如SEQ ID NO.32所示，突变型crRNA的序列如SEQ ID NO.33所示，所述PCR不对称扩增的引物对序列如SEQ ID NO.34和SEQ IDNO.35所示；
所述Cas13a蛋白为LbuCas13a。
4.根据权利要求3所述的基于检测ssDNA的CRISPR/Cas13a系统检测基因点突变的检测体系，其特征在于，所述带有荧光标记的单链RNA探针的5’端为FAM标记、ROX标记、HEX标记、FITC标记、Cy5标记、Cy3标记中的任一种，3’端为BHQ1标记、BHQ2标记、BHQ3标记中的任一种，所述带有荧光标记的单链RNA探针长度为5nt~20nt。
5.一种基于检测ssDNA的CRISPR/Cas13a系统检测基因点突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求3或4所述的基于检测ssDNA的CRISPR/Cas13a系统检测基因点突变的检测体系。
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117305484A (zh) * 2023-10-25 2023-12-29 四川省畜牧科学研究院 一种同时检测多杀性巴氏杆菌和溶血性曼氏杆菌的检测体系和方法
CN117512076B (zh) * 2023-12-25 2024-04-12 中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所 一种基于劈裂式Cas9系统的RNA免反转录的检测方法

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113684320A (zh) * 2021-09-23 2021-11-23 佛山病原微生物研究院 用于扩增或检测新型冠状病毒SARS-CoV-2核酸的引物组及其应用
WO2021238556A1 (zh) * 2020-05-29 2021-12-02 山东舜丰生物科技有限公司 基于crispr技术进行靶核酸检测的方法
CN114058679A (zh) * 2022-01-11 2022-02-18 深圳大学 一种crispr级联核酸检测系统及其检测方法与应用
CN114650883A (zh) * 2019-06-18 2022-06-21 猛犸生物科学公司 用于检测核酸的测定和方法
CN114703258A (zh) * 2022-06-06 2022-07-05 深圳大学 一种基于光激活的一锅式rpa-crispr核酸检测方法及系统
CN115820934A (zh) * 2022-10-28 2023-03-21 中国科学院精密测量科学与技术创新研究院 一种基于CRISPR/Cas13a的核酸检测试剂盒、检测方法及应用
CN116083541A (zh) * 2022-12-29 2023-05-09 深圳大学 一种富集低丰度单核苷酸变异体的方法
CN116287125A (zh) * 2022-12-15 2023-06-23 大连理工大学 一种基于VPCR-Cas13a的CRP2C19基因多态性检测方法
CN116287129A (zh) * 2023-01-13 2023-06-23 深圳大学 一种基于回折crRNA的超短链miRNA检测方法及系统

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114650883A (zh) * 2019-06-18 2022-06-21 猛犸生物科学公司 用于检测核酸的测定和方法
WO2021238556A1 (zh) * 2020-05-29 2021-12-02 山东舜丰生物科技有限公司 基于crispr技术进行靶核酸检测的方法
CN113684320A (zh) * 2021-09-23 2021-11-23 佛山病原微生物研究院 用于扩增或检测新型冠状病毒SARS-CoV-2核酸的引物组及其应用
CN114058679A (zh) * 2022-01-11 2022-02-18 深圳大学 一种crispr级联核酸检测系统及其检测方法与应用
CN114703258A (zh) * 2022-06-06 2022-07-05 深圳大学 一种基于光激活的一锅式rpa-crispr核酸检测方法及系统
CN115820934A (zh) * 2022-10-28 2023-03-21 中国科学院精密测量科学与技术创新研究院 一种基于CRISPR/Cas13a的核酸检测试剂盒、检测方法及应用
CN116287125A (zh) * 2022-12-15 2023-06-23 大连理工大学 一种基于VPCR-Cas13a的CRP2C19基因多态性检测方法
CN116083541A (zh) * 2022-12-29 2023-05-09 深圳大学 一种富集低丰度单核苷酸变异体的方法
CN116287129A (zh) * 2023-01-13 2023-06-23 深圳大学 一种基于回折crRNA的超短链miRNA检测方法及系统

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
An aM-level sensitive cascade CRISPR-Dx system (ASCas) for rapid detection of RNA without pre-amplification;Yibin Zhang 等;《Biosens Bioelectron》;第230卷;第1-5页 *
与众不同的核酸酶Cas13a:编辑RNA的新CRISPR平台及其进展;刘贵生 等;《湖北农业科学》;第57卷(第2期);第5-8页 *

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