CN113186341B - CRISPR介导的一步式恒温扩增检测SARS-CoV-2的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了由CRISPR介导的一步式恒温扩增目的基因的方法以及基于该方法针对SARS‑CoV‑2的ORF1ab和NP基因扩增并检测的核酸分子组合，所述方法将核酸扩增与CRISPR介导的序列特异性检测整合到一个反应中，检测结果可以通过荧光或测流生物传感条。本发明提供的方法具有超灵敏、高度特异性和方便可行性，可作为临床、现场和资源贫乏地区的诊断工具。

Description

CRISPR介导的一步式恒温扩增检测SARS-CoV-2的方法
技术领域
本发明公开了一种基因恒温扩增方法，属于微生物、更为具体地属于核酸的测定或者检验的技术领域。
背景技术
冠状病毒疾病2019(Coronavirus disease 2019,COVID-2019)是由严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)感染引起的一种高度传染性疾病，已成为全球主要健康威胁之一。尽管基于PCR的检测技术具有较好的分析性能，但该技术用于检测COVID-19仍存在一定的局限性。
近年来，原核生物规律间隔成簇短回文重复序列(Clustered RegularlyInterspaced Short Palindromic Repeats,CRISPR)/CRISPR关联系统 (CRISPR-associated system,CRISPR-Cas)为生物技术应用打开了大门，例如基因组编辑和转录调控。特别是最近发现了在某些Cas效应子中附带爆发式剪切活性，如Cas12a，Cas12b，Cas13a和Cas14，这为新型诊断平台铺平了道路，这些平台可通过核酸传感提供便携式、高度特异性和超灵敏的测试。与基于PCR的检测技术相比，基于CRISPR的诊断降低了对专用仪器的依赖性，并且可以在生理温度，甚至室温下进行。当前，已经设计并验证了几种非常有前景的基于CRISPR的检测技术。据报道，基于CRISPR-Cas12a的靶向DNA核酸内切酶的CRISPR Tans报告子(DNA Endonuclease Targeted CRISPR Tans Reporter,DETECTR)和一小时低成本的多功能高效系统(One-Hour-Low cost Multipurpose highly Efficient System,HOLMES)可检测人乳头瘤病毒(Human Papillomavirus, HPV)和单核苷酸多态性(Singlenucleotide polymorphism,SNPs)。同时，开发了一种基于CRISPR-Cas14的DETECTR检测方法来诊断HPV，以及针对登革病毒(Dengue virus,DENV)、寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)和HPV设计了基于CRISPR-Cas13a的特异的高灵敏性酶促报告解锁 (Specific High-Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing,SHERLOCK) 检测方法，其具有单碱基错配特异性和attomolar敏感性。
已开发的基于CRISPR的检测方法通过两个连续步骤来实现核酸检测：(1)使用PCR或等温扩增测定法，如重组聚合酶扩增和环介导的等温扩增技术扩增靶核酸。(2)通过基于CRISPR剪切活性的检测结果报告。因此，所有基于CRISPR的检测开发都涉及两个独立的反应步骤(预扩增和CRISPR介导的检测)和多个手动操作及扩增产物的处理。这些步骤不仅使过程复杂化，而且增加了交叉污染的风险，这阻碍了其在各个领域的广泛应用。此外，为了激活Cas效应蛋白，gRNA识别靶序列必须设置在适当的位置，该位置含有前间区序列邻近基序(Protospacer adjacent motif,PAM)位点。因此，这些开发的基于CRISPR的检测技术不足以检测不含PAM位点的核酸。
快速、经济、准确的核酸检测技术在病原菌检测、疾病诊断和环境检测中具有重要应用价值。为了克服传统CRSPIR检测方法的缺陷，本发明的目的是提供一种新的CRISPR介导一步式检测方法(简称 CRISPR-top)，并将其应用于SARS-CoV-2的检测。
发明内容
基于上述发明目的，本发明首先提供了一种由CRISPR介导的一步式恒温扩增目的基因的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)使用前向外引物、后向外引物、前向内引物、后向内引物、前向环状引物、后向环状引物对待扩增的靶基因模板进行环介导的恒温扩增，其中在前向内引物或后向环状引物中引入PAM位点；
(2)将步骤(1)获得扩增产物与由特异性识别PAM位点的gRNA 和AapCas12b因子组成的复合物、末端标记荧光基团的单链DNA探针进行CRISPR-CAS核酸切割反应；
(3)检测步骤(2)的核酸切割反应的结果。
本申请提供的上述CRISPR介导一步式检测平台(CRISPR-top)的特点是：将预扩增和CRISPR介导的序列特异性检测整合在一起，并且仅需要一个流体处理步骤。CRISPR-top可在单一温度下工作，检测结果可通过简单的横流传感条或荧光检测。通过使用工程引物在待检测序列中引入PAM位点并使用CRISPR-top方法来检测。
在一个优选的实施方案中，所述PAM位点为TTC。
在另一个优选的实施方案中，所述步骤(1)和步骤(2)的工作温度均为56℃-61℃之间。
更为优选地，所述步骤(1)和步骤(2)的工作温度均在58℃或59℃。
本发明提供的CRISPR-top可以用于新型冠状病毒SARS-CoV-2的检测，称为COVID-19 CRISPR-top(检测原理见图1和图2)。在一个优选的实施方案中，所述CRISPR-top可以用于检测SARS-CoV-2的开放阅读框1a/b序列(Opening reading frame 1a/b,OFR1a/b)；所述步骤(1)中所述前向外引物的序列如SEQ ID NO.1所示，后向外引物的序列如SEQ ID NO.2所示，前向内引物的序列如SEQ ID NO.3所示，后向内引物的序列如SEQ ID NO.4所示，前向环状引物的序列如SEQ ID NO.5所示，后向环状引物的序列如SEQ ID NO.6所示，所述gRNA的序列如SEQ ID NO.7所示；
或者，用于检测SARS-CoV-2的核蛋白(Nucleoprotein,N)基因，所述前向外引物的序列如SEQ ID NO.8所示，后向外引物的序列如SEQ ID NO.9所示，前向内引物的序列如SEQID NO.10所示，后向内引物的序列如SEQ ID NO.11所示，前向环状引物的序列如SEQ IDNO.12所示，后向环状引物的序列如SEQ ID NO.13所示，所述gRNA的序列如SEQ ID NO.14所示。
在一个优选的实施方案中，所述步骤(3)检测的方法为实时荧光法检测，所述单链DNA探针的序列如SEQ ID NO.15所示，在所述单链DNA 探针标记荧光集团的相对方向的末端标记有荧光淬灭基团。
在另一个优选的实施方案中，所述步骤(3)检测的方法为测流生物传感器检测，在所述单链DNA探针标记荧光集团的相对方向的末端标记有生物素，所述测流生物传感器为一平板状结构的背板，包括用于滴加待检测样品的一样品区、一共轭区、一硝酸纤维素膜和一吸收垫，所述共轭区沉积有作为指示试剂的链霉亲和素固定金纳米粒子，所述硝酸纤维素膜设置有两个带：沉积有兔抗荧光素抗体的对照线(Control line,CL) 和沉积有生物素化牛血清白蛋白的测试线(Test line,TL)。
更为优选地，所述单链DNA探针的序列如SEQ ID NO.15所示。
其次，本发明提供了一组用于上述方法的核酸分子，所述分子包括序列如SEQ IDNO.1所示的前向外引物，序列如SEQ ID NO.2所示的后向外引物，序列如SEQ ID NO.3所示的前向内引物，序列如SEQ ID NO.4所示的后向内引物，序列如SEQ ID NO.5所示的前向环状引物，序列如SEQ ID NO.6所示的后向环状引物，序列如SEQ ID NO.7所示的gRNA，本组核酸分子用于检测SARS-CoV-2的OFR1a/b，或者
序列如SEQ ID NO.8所示的前向外引物，序列如SEQ ID NO.9所示的后向外引物，序列如SEQ ID NO.10所示的前向内引物，序列如SEQ ID NO.11所示的后向内引物，序列如SEQ ID NO.12所示的前向环状引物，序列如SEQ ID NO.13所示的后向环状引物，序列如SEQID NO.14所示的gRNA，本组核酸分子用于检测SARS-CoV-2的核蛋白基因。
最后，本发明提供了一种含有上述核酸分子组合的检测试剂盒，所述核酸分子包括用于检测SARS-CoV-2的OFR1a/b的组合和/或用于检测 SARS-CoV-2的核蛋白基因的组合。
本发明提供了一种独特设计的新型CRISPR介导的检测平台(CRISPR-top，在一个反应管中进行CRISPR介导的检测)，该平台将核酸扩增与CRISPR介导的序列特异性检测整合到一个反应中。为了满足 CRISPR-top检测的要求，在ORF1ab-FIP(FIP：前向内引物)和/或NP-FIP 的核心引物上用PAM位点(TTC)在连接区进行了修饰。COVID-19 CRISPR-top检测系统同时将逆转录、LAMP反应和CRISPR-Cas12b介导的核酸检测整合到一个混合体系中进行一步式反应。COVID-19 CRISPR-top的检测结果可以通过荧光或测流生物传感条来显示。
本发明在CRISPR-top检测的基础上提供了一种针对SARS-CoV-2的 ORF1ab和NP基因的SARS-CoV-2检测试验。该CRISPR-top技术已成功应用于检测SARS-CoV-2，并已使用标准质粒和临床样品进行了初步验证。使用COVID-19 CRISPR-top方法可检测SARS-CoV-2的ORF1ab和 NP基因，并且无需使用复杂的仪器。COVID-19 CRISPR-top在1小时内通过荧光或测流生物传感条检测易于结果的解释。敏感性和特异性的数据表明，COVID-19 CRISPR-top方法是一种诊断COVID-19的超灵敏、高度特异性和可行的方法，可作为临床、现场和资源贫乏地区的诊断工具。作为概念验证技术，可以通过重新设计引物和gRNA来将CRISPR-top 重新配置为检测各种目的序列。
实时荧光法COVID-19 CRISPR-top在临床样本检测方面表现出更好的性能(38/52)，而测流生物传感条COVID-19 CRISPR-top也具有相似的性能(35/52)。因此，实时荧光法COVID-19 CRISPR-top法作为 SARS-CoV-2检测的快速筛选工具拥有更高检测效率。而生物传感器使用方便，不依赖于特定的设备，也可用于大规模的测试，适用于现场和一线实验室。
与之前开发的基于CRISPR的SARS-CoV-2检测平台相比，本发明提供的COVID-19CRISPR-top方法只需要一个液体处理步骤，有效地降低了样本交叉污染的风险。与等温检测方法类似，COVID-19 CRISPR-top 试验在恒温下进行，只需要简单的仪器。因此，COVID-19 CRISPR-top 减少了复杂仪器的使用，特别适用于现场检测和在一些基层实验室开展。
附图说明
图1.CRISPR-top设计和反应原理图(一)；
图2.CRISPR-top设计和反应原理图(二)；
图3.CRISPR-top检测流程图；
图4..CRISPR-top检测所用引物及gRNA位置分布图；
图5.ORF1ab引物及gRNA序列比较图；
图6.N基因引物及gRNA序列比较图；
图7.COVID-19 CRISPR-top试验检测步骤及耗时示意图；
图8.测流生物传感条结构设置示意图；
图9.测流生物传感条结果示意图；
图10.ORF1ab-和NP-LAMP引物对的可行性分析图；
图11.CRISPR-top方法的最佳扩增温度分析图；
图12.荧光COVID-19 CRISPR-top方法的特异性分析图；
图13.荧光和测流生物传感条特异性检测结果对照图；
注：Positive control：阳性对照；NTC：阴性对照；HUK1：冠状HUK1 病毒；H1N1：H1N1流感病毒；H1N2：H1N2流感病毒；H4N6：H4N6 型流感病毒；H5：H5型禽流感病毒；H5N8：H5N8型禽流感病毒；H7N9： H7N9型禽流感病毒；Infuenza Virus B：乙型流感病毒；Syncytial Virus：合胞病毒；Human Adenovirus：人腺病毒；Parainfluenza Virus：副流感病毒；Bocavirus：博卡病毒；Coxsackievirus：柯萨奇病毒；Human enterovirus：人肠道病毒；Porcine circovirus：猪圆环病毒；Swine fever virus：猪瘟病毒；Lelysted Virus：莱利斯塔病毒；Neisseria meningitidis：脑膜炎奈瑟菌； Streptococcus pneumona：肺炎链球菌；Mycoplasma：支原体；Chlamydia：沙眼衣原体；L.pneumophila：嗜肺军团菌；Pseudomonas aeruginosa：铜绿假单胞菌；Staphylococcus aureus：金黄色葡萄球菌；Klebsiella pneumoniae：肺炎克雷伯菌；Acinetobacter baumannii：鲍曼不动杆菌；Enterococcus faecalis：粪肠球菌；Listeria monocytogenes：单核细胞增生李斯特菌；Bacillus cereus：蜡样芽孢杆菌；Enterotoxigenic E.coli：产肠毒素大肠杆菌；Candidatropicalis：热带假丝酵母；Cryptoccus neo formas：新形式隐球菌；Candida albicans：白色念珠菌；Blank control：空白对照。
图14.荧光方法特异性检测结果图；
注：1：阳性对照；2：阴性对照；3：冠状病毒；4：甲型流感病毒；5：甲型流感病毒；6：甲型流感病毒；7：甲型流感病毒；8：甲型流感病毒； 9：甲型流感病毒；10：乙型流感病毒B；11：合胞病毒；12：人腺病毒； 13：副流感病毒；14：博卡病毒；15：柯萨奇病毒；16：人肠道病毒； 17：猪圆环病毒；18：猪瘟病毒；19：莱利斯塔病毒；20：脑膜炎奈瑟菌；21：肺炎链球菌；22：支原体；23：沙眼衣原体；24：嗜肺军团菌； 25：铜绿假单胞菌；26：金黄色葡萄球菌；27：肺炎克雷伯菌；28：鲍曼不动杆菌；29：粪肠球菌；30：单核细胞增生李斯特菌；31：蜡样芽孢杆菌；32：大肠埃希氏菌；33：热带假丝酵母；34：新形式隐球菌； 35：白色念珠菌；36：空白对照。
图15.测流生物传感条特异性实际检测结果图；
注：1：阳性对照；2：阴性对照；3：冠状HUK1病毒；4：H1N1流感病毒；5：H1N2流感病毒；6：H4N6型流感病毒；7：H5型禽流感病毒；8： H5N8型禽流感病毒；9：H7N9型禽流感病毒；10：乙型流感病毒11：合胞病毒；12：人腺病毒；13：副流感病毒；14：博卡病毒；15：柯萨奇病毒；16：人肠道病毒；17：猪圆环病毒；18：猪瘟病毒；19：莱利斯塔病毒；20：脑膜炎奈瑟菌；21：肺炎链球菌；22：支原体；23：沙眼衣原体；24：嗜肺军团菌；25：铜绿假单胞菌；26：金黄色葡萄球菌； 27：肺炎克雷伯菌；28：鲍曼不动杆菌；29：粪肠球菌；30：单核细胞增生李斯特菌；31：蜡样芽孢杆菌；32：产肠毒素大肠杆菌；33：热带假丝酵母；34：新形式隐球菌；35：白色念珠菌；36：空白对照。
图16.临床样本OCT和RT-PCR结果对照图。OCT(一步式CRISPR 检测法)
注：Samples：样本；Fluorescent ORF1ab-OTC：荧光ORF1ab-OTC； FluorescentNP-OTC：荧光NP-OTC；interpretation：结果判定。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的权利要求所限定的保护范围构成任何限制。
实施例1.CRISPR-top反应体系的建立
1.CRISPR-top试验设计及原理
CRISPR-top设计和反应原理如图1和图2所示。CRISPR-top检测平台结合了LAMP和基于CRISPR的检测(Cas12b trans-cleavage检测)，实现了单温度(58-59℃)一步反应的核酸检测。在CRISPR-top体系中，利用PAM-sit(TTC)在连接子区域(图1和图2)设计常规的核心LAMP 引物FIP(前向内引物)或BIP(后向内引物)。图2中，在本发明的 CRISPR-top体系中，FIP或BIP的0-4bp的连接子区域(图2中为FIP，实际应用中也可以为BIP)被设计导入了可以为CRISPR-Cas12b/gRNA 复合物识别的PAM位点(TTC)；而在现有技术的常规体系中如果存在该连接子区域(0-4bp)，也是仅仅作为独立的扩增模板存在。修饰的FIP 引物在靶序列的F2c位点引发LAMP反应(步骤1)。通过上游合成从F3置换新链，并将3个引物(包括LF，BIP，B3)分别退火至新合成的 LFc，B2c和B3c位点(步骤2)。LF(步骤3)和BIP(步骤5)衍生的产物可以用作模板，因此修饰的FIP引物与这些产物退火(步骤4和6)。结果，使用工程化的FIP引物通过LAMP测定，形成了许多靶产物，这些靶产物含有新获得的Cas12b效应子的TTCPAM(原间隔子相邻基序) 位点。
通过使用设计的FIP或BIP，LAMP扩增产物将包含新获得的TTC PAM位点(图1，步骤1和2)，从而可以定位相应的Cas12b/sgRNA系统(图1，步骤3和4)。因此，Cas12b效应器被激活(图1，步骤5)，从而反式切割报告分子(single-strand DNA,ssDNA)(图1，步骤6)。利用设计的FIP或BIP引物进行的CRISPR-top试验可以检测到任何序列(即使这些序列不包含CRISPR-Cas12b/gRNA复合物的PAM位点)，只要它们满足LAMP的设计要求。
AapCas12b因子(原名C2cl)是嗜酸链球菌V-B型CRISPR-Cas系统中的一种嗜热RNA引导的核酸内切酶，可在45℃～62℃的温度范围内识别和切割靶DNA。因此，AapCas12b酶可以适应多种55℃到70℃之间的核酸扩增方法，如LAMP和多重交叉置换扩增(MultipleCross Displacement Amplification,MCDA)。本研究中，将最常用的等温扩增技术(LAMP)与CRISPR-AapCas12b介导的诊断试验相结合，开发出 CRISPR-top方法，即在一个反应体系中进行一步试验从而达到检测目的核酸的目的(图1)。通过用PAM位点(TTC)修饰核心引物(FIP或BIP) 的连接区来设计LAMP引物，因此LAMP产物将包含新获得的PAM位点，这些位点可用于AapCas12b/gRNA复合物的识别和切割(图1和图2)，使LAMP结合CRISPR-top技术可以检测任何序列(即使这些序列不包含可用的PAM位点)，只要它们满足LAMP设计的要求。尤其是CRISPR-top 分析与荧光(图3B)和测流生物传感条检测的(图3A)兼容，提高了其有效检测的能力。
CRISPR-top检测结果可在测流生物传感条上显示(图8A)，因此整个试验，包括步骤1：模板制备(15分钟)、步骤2：CRISPR-top反应(40 分钟)和步骤3：测流可视化检测结果(约3分钟)，整个检测可在1小时内完成。CRISPR-top检测方法的结果也可使用实时荧光检测(图11A)，荧光CRISPR-top试验，包括步骤1：模板提取(15min)和荧光CRISPR-top 反应(40min)，也在1h内完成。
为了检验CRISRP-top检测方法是否足能够快速、准确地检测 SARS-CoV-2，实验中使用SARS-CoV-2的两个基因(ORF1ab和N)设计引物组，ORF1ab-FIP和NP-FIP引物在连接区用PAM位点(TTC)修饰，以满足CRISPR-top的检测要求(表1)，把这个试验命名为COVID-19CRISPR-top。
2.引物与gRNA的设计
利用引物在线设计软件Version 4 (https://primerexplorer.jp/lamp4.0.0/index.html)，分别针对SARS-CoV-2 的开放阅读框1a/b(Opening reading frame 1a/b,OFR1a/b GenBank MN908947,Wuhan-Hu-1)和核蛋白(Nucleoprotein,N)基因(GenBankMN908947,Wuhan-Hu-1)，设计了两套基于环介导恒温扩增 (Loop-mediated isothermalamplification,LAMP)技术和CRISPR-top原理的特异性引物(图4、图5和图6)。利用美国国家生物技术信息中心 (National Center for Biotechnology Information,NCBI)对两组引物的特异性进行了比对。通过OligoAnalyzer 3.1在线软件(Integrated DNATechnologies,IA)研究了两个引物组的二级结构和引物二聚体。根据 CRISPR-top原理设计了两个向导RNA(guide RNA,gRNA)。引物设计、位置、序列和gRNA的详细信息见图4、图5、图6和表1，图4为引物及gRNA位置分布图，图5为在LAMP引物靶向的位点SARS-CoV-2， SARS-CoV，MERS-CoV，Human-CoV-229E，Human-CoV-NL63， Human-CoV-OC43和Human-Cov-HKU1之间的ORF1ab序列比较和本报告中使用的gRNA，引物序列的位点在黑色下划线，而gRNA用灰色标注；图6为在LAMP引物靶向的位点SARS-CoV-2，SARS-CoV， MERS-CoV，Human-CoV-229E，Human-CoV-NL63，Human-CoV-OC43 和Human-Cov-HKU1中N基因的比较和本报告中使用的gRNA，引物序列的位点在黑色下划线，而gRNA用灰色标注。LAMP引物由北京天一辉远生物科技有限公司合成和纯化。gRNAs采用HPLC纯化级由GeneScript Biotech公司合成和纯化。
表1.引物及gRNAs序列
Figure RE-GDA0003108672820000101
3.CRISPR-top反应体系
CRISPR-top试验25μL反应体系包含：12.5μL 2x恒温反应缓冲液(天津惠德信生物技术有限公司)，1μL 2.0Bst DNA聚合酶(8U)，FIP和 BIP各为1.6μM，LF和LB各为0.8μM，F3和B3各为0.4μM，4.5μl ApaCas12b-gRNA复合物，0.5μL探针(100μM， 5'-FAM-TTATTATTAT-BHQ1-3'(SEQ ID NO.15，FAM为6-羧基荧光素， BHQ1为荧光淬灭基团1)用于实时荧光监测，5'-FAM-TTATTATTAT-Biotin-3'(SEQ ID NO.15，Biotin为生物素)用于横流生物传感条)和模板DNA(纯模板1μL，样品5μL)。CRISPR-top 反应条件为59℃反应40分钟。用TOLOBuffer(上海汇成生物技术有限公司)在37℃下孵育20分钟制备100nM Cas12b蛋白和150nM gRNA组成的Cas12b-gRNA混合物，制备完成后应立即使用或在4℃下保存(12 小时内使用)。
COVID-19 CRISPR-top试验在恒温(59℃)的单管反应中使用LAMP 反应和基于CRISPR-Cas12b的检测进行同步反转录、等温扩增(图7)。在快速提取SARS-CoV-2 RNA(图7，步骤1)后，首先在逆转录酶的帮助下将RNA模板转化为cDNA，并作为后续等温扩增的模板(图7，步骤2)。通过使用设计的ORF1ab-FIP和NP-FIP引物，ORF1ab-FIP和 NP-LAMP产物包含获得的PAM位点(TTC)，该位点被相应的 Cas12b/gRNA复合物用于定位，并激活了Cas12b效应器的反式切割活性 (顺势切割活性直接切割gRNA识别的靶序列，反式切割是在顺势剪切的基础上，剪切非靶向的单链的DNA)(图7，步骤2)。因此，在COVID-19 CRISPR-top反应中报告ssDNA分子被迅速剪切，由此产生的信号可以通过实时荧光仪(图7A)或测流生物传感条(图7B)可视化。在实时荧光检测时，CRISPR-top通过反式剪切活性，将ssDNA剪碎，实现将荧光基团和淬灭基团分开，从而导致荧光基团发光，实现荧光检测。同样在测流检测时，CRISPR-top通过反式剪切活性，将ssDNA剪碎，实现将生物素和半抗原(FITC或FAM)分开，从而检测基团和质控基团分开，实现荧光检测。因此，实时COIVD-19 CRISPR-top检测只需快速RNA提取(15分钟)和实时CRISPR-top反应(40分钟)两个步骤，即可在1h 内检测出SARS-CoV-2(图3B)。
4.CRISPR-top测流生物传感条试验
测流生物传感器(Lateral flow biosensor,LFB)设计用于直观地显示 CRISPR-top试验结果(图8)。如图8之A所示，LFB包含一背板1，背板上依次设置有样品区2、共轭区3、硝酸纤维素膜4和吸收区5，衬以硝酸纤维素膜4为反应区，其上设置有控制线41、检测线42。这些部件组装在一个衬靶纸上。图8中图例标识：i:金纳米粒子(gold nanoparticles, SA-GNPs),ii:链霉亲和素(Streptavidin，SA)，iii:链霉亲和素固定金纳米粒子(Streptavidin-immobilized gold nanoparticles,SA-GPNs)iv:生物素， v:抗荧光素FITC抗体，vi:牛血清白蛋白(BSA)，vii:生物素化牛血清白蛋白(Bio-BSA),viii:FITC/生物素标记的探针，ix:被切割的探针。将链霉亲和素固定金纳米粒子(SA-GNPs)作为指示试剂沉积在LFB的共轭区。然后，将兔抗荧光素抗体(Anti-fluorescein antibody,anti-FITC)和生物素化牛血清白蛋白(Biotinylated bovine serum albumin,B-BSA)分散到硝酸纤维素膜上。因此，有两个带：对照线(Control line,CL)与anti-FITC 偶联，测试线(Test line,TL)与B-BSA结合。LFB传感条由天津汇德鑫科技发展有限公司设计并生产。
使用LFB进行目视检测时，将小量(0.42μl)CRISPR-top产物添加到LFB的样品垫中，随后滴加3滴的流动缓冲液(100mM PBS，PH7.4， 1％with 1％Tween 20)至样品垫中，CRISPR-top反应结果可以在2min内以红色条带的形式出现在硝酸纤维素膜区。
生物传感条的详细信息如图8所示。向样品区域添加体积为0.9μL 的CRISPR-top反应产物(图8B，步骤1)，并在同一区域滴加2滴检测缓冲液(图8B，步骤2)。检测缓冲液通过毛细管作用沿生物传感条移动，在共轭区对功能纳米颗粒(SA-GNPs)进行再水化。对于阴性反应，固定在对照线(CL)上的抗FITC抗体可以捕获报告分子末端标记的FAM 分子，而报告分子另一端标记的生物素可以结合SA-GNPs进行可视化(图 8B，步骤3)。对于阳性反应，报告分子被活化的Cas12b效应器裂解，成功地分离了FAM和生物素。因此，固定在测试线(TL)上的B-BSA 可以捕获生物素/SA-GNPs复合物，这表明信号是阳性的(图8B，步骤3)。图8C和图9显示了使用生物传感器的CRISPR-top方法的说明。图9中， A为示意图，B为实例。第1种情形判定为阳性结果，检测线(TL)有明显的信号，同时控制线(CL)也出现红色条带；第2种情形判定为阴性结果，检测线(TL)无信号，只有控制线(CL)出现红色条带；第3 种情形判定为阴性，生物传感条在室温下持续7-10分钟以上时，检测线 (TL)可能会显示微弱的信号。但是，它比真正的阳性信号要微弱得多。
5.CRISPR-top试验反应条件优化
在上述试验中首先确认了LAMP反应的可行性。如图10所示， ORF1ab-LAMP和NP-LAMP引物组能成功扩增出相应的模板(ORF1ab 质粒和NP质粒)，非靶模板无假阳性结果。图10中，ORF1ab-LAMP(A) 和NP-LAMP(B)反应在58℃下进行40分钟，并通过实时测量浊度(LA-320C)进行监控。阈值为0.1，浊度>0.1视为阳性反应。图中标出了模板病原体的相应曲线。图10的A中，信号CH1，ORF1ab-LAMP 阳性扩增(1×104份OFR1ab质粒)，信号CH2-CH8，ORF1ab-LAMP阴性扩增。图10的B中，信号CH1，阳性NP-LAMP扩增(1×104份NP 质粒)，信号CH2-CH8，阴性NP-LAMP扩增。NTC：阴性对照；BC：空白对照。因此，ORF1ab-LAMP和NP-LAMP引物组可用于开发检测 SARS-CoV-2的CRISPR-top方法。采用实时ORF1ab-CRISPR-top反应来确定CRISPR-top试验的最佳扩增温度，共测试了6个温度(从56℃到 61℃，间隔1℃)(图11)。图11中，A；从荧光ORF1ab CRISPR-top反应获得的结果。B；从荧光NP CRISPR-top反应获得的结果。在所有包含非SARS-CoV-2模板(病毒、细菌和真菌)的样品中均观察到阴性结果。条件优化实验结果显示，当模板(ORF1ab质粒)出现时，CRISPR-top 试验在所有反应温度下都产生了一个信号(图11A)。CRISPR-top方法在较低反应温度(56℃至59℃)下产生较强的荧光信号(>10000AU)(图 11B)，而在较高反应温度(59℃至61℃)下产生更快的阳性信号(<15 分钟)(图11C)。结果表明，CRISPR-top检测方法不仅能快速地获得阳性结果，而且在58℃和59℃的反应温度下产生了更充足的荧光信号。58℃和59℃的反应温度更适合CRISPR-top分析(图11之A3和A4)。在本研究中，选择了59℃的反应温度进行后续的CRISPR-top反应。因为59℃下的实时ORF1ab-CRISPR-top方法可以获得比60℃和61℃更充分的信号，并且比56℃、57℃和58℃产生更快的阳性结果(图11之B和C)。为实现可靠和快速的检测，该研究最终选择59℃作为COVID-19 CRISPR-top 试验的最佳反应温度(图11)。
实施例2.COVID-19 CRISPR-top敏感性试验及检测时间分析
使用北京天一辉远生物技术有限公司已在市场上提供的分别含有 ORF1ab和NP序列的两种标准质粒(ORF1ab plamid和NP质粒)，验证 COVID-19 CRISPR-top试验的敏感性。制备10倍系列稀释的ORF1ab和 NP质粒(从1×106拷贝/μl到1×10-1拷贝/μl)，并将等份(1μl)质粒模板加入CRISPR-top反应。分别进行实时CRISPR-top检测和测流生物传感条CRISPR-top检测，确定COVID-19 CRISPR-top的试验的最低检测限。
使用不同稀释梯度的模板(ORF1ab和NP质粒)，COVID-19 CRISPR-top检测方法的分析灵敏度为每个反应管10个拷贝(每个靶模板) (图12，NTC阴性对照，BC空白对照)。对于实时荧光COVID-19 CRISPR-top试验，从1×106到1×101拷贝的ORF1ab-和NP质粒模板获得猝灭释放(图12A和12B)。通过测流生物传感条确认了COVID-19 CRISPR-top试验的最低检测限(LoD)为10个拷贝(对于ORF1ab-和 NP质粒)(图12C和12D)，这与荧光COVID-19CRISPR-top法一致。尤其是生物传感器在可检测水平(图12C和12D)下产生的视觉信号易于解释目标模板的存在与否。
COVID-19 CRISPR-top方法可检测到10个拷贝数的ORF1ab-和NP 质粒(图12)，分析LoD类似于基于COVID-19-LAMP检测方法。 COVID-19CRISPRr-top具有较高的灵敏度，这可能是因为它采用逆转录 LAMP(RT-LAMP)进行RNA扩增。文献报告表明，基于LAMP的检测比基于PCR的检测更敏感，甚至比其他等温扩增技术更敏感。 COVID-19 CRISPR-top在15分钟内即可获得阳性信号(图12A和12B，信号1)，仅需25分钟就可在LoD水平上生成阳性结果(图12A和12B，信号6)，为了产生足够的、有鉴别力的阳性信号，在COVID-19 CRISPR-top方法中检测临床样品的反应时间为40min。因此，基于荧光的COVID-19CRISPR-top检测过程，包括SARS-CoV-2rna的快速提取 (15min)和荧光CRISPR-top反应(40min)。同时，基于测流生物传感条COVID-19CRISPR-top检测也可在1h内完成，包括快速RNA制备 (15min)、CRISPR-top反应(40min)和测流生物传感条检测(约3min)。测流生物传感条COVID-19 CRISPR-top检测方法的灵敏度为10个拷贝数的OFR1ab-和NP质粒，与荧光COVID-19CRISPR-to试验完全一致(图 12)。
实施例3.COVID-19 CRISPR-top特异性试验
通过检测包括病毒、细菌和真菌在内的各种模板DNA来检测 COVID-19 CRISPR-top的特异性(表2)。
表2.试验中使用的病原体
Figure RE-GDA0003108672820000151
Figure RE-GDA0003108672820000161
P：阳性；N：阴性。通过COVID-19 CRISPR-top技术只能检测到阳性对照(ORF1ab-质粒和NP-质粒各1x104拷贝)，这表明COVID-19 CRISPR-top 具有极高的特异性。
从病毒、细菌和真菌中提取的各种模板进行特异性试验。如图13所示，所有阳性结果均来自阳性对照(ORF1ab-和NP质粒模板)，而所有阴性结果均来自非ORF1ab和NP质粒模板(图14、15和表2)。荧光 COVID-19 CRISPR-top试验(图13和图14)的检测结果完全符合测流 COVID-19 CRISPR top方法(图13和图15)。这些数据表明，用COVID-19 CRISPR-top检测方法(包括荧光法和测流生物传感条)与非SARS-CoV-2 样品没有交叉反应，因此本研究报告的诊断试验对SARS-CoV-2的检测具有高度特异性。
本实施例的数据表明，COVID-19 CRISPR-top方法是一种针对 SARS-CoV-2检测的高度特异性诊断试验，当用于检测从病毒、细菌和真菌中提取的各种模板时，实现了100％的特异性(图13、14、15和表2)。在ORF1ab-和NP质粒的检测中只观察到阳性信号，而对非OFR1ab-和 NP质粒则没有观察到阳性信号。在CRISPR-top反应体系中，CRISPR-top 提供了两轮对目的序列特异性检测。首先，LAMP法作为一种经过验证的具有极高特异性的分子技术，用于靶模板的高特异性扩增(图1、图2、图3)，保证了CRISPR-top第一轮检测的可靠性。CRISPR介导的序列特异性检测是一种通过靶依赖性gRNA和PAM位点进行靶序列检测的高精度技术(甚至是单核苷酸靶向特异性)，进一步保证了CRISPR-top第二轮检测的可靠性。因此，本研究设计的CRISPR-top检测方法是一种有效的核酸检测工具，COVID-19的特异性数据也证明了CRISPR-top是一种可靠的SARS-CoV-2检测方法。
试验中共检测了132个样本，其中52个样本来自COVID-19患者(咽拭子、鼻拭子和肛拭子)和80个非COVID-19个体的样本，以证明 COVID-19 CRISPR-top在临床上的可行性(图16，表3和4)。
表3.COVID-19 CRISPR-top对52个临床样品的检测结果
Figure RE-GDA0003108672820000171
Figure RE-GDA0003108672820000181
Figure RE-GDA0003108672820000191
*S19：该样品是从无症状个体收集的。P：阳性；N：阴性；荧光：荧光COVID-19CRISPR-top检测；测流法，测流生物传感条OCIVD-19 CRISPR-top检测。
表4.非COVID-19样品的COVID-19 CRISPR-top方法检测结果。
Figure RE-GDA0003108672820000192
Figure RE-GDA0003108672820000201
Figure RE-GDA0003108672820000211
Figure RE-GDA0003108672820000221
*N；阴性。荧光法：荧光COVID-19 CRISPR-top检测；测流法：测流生物传感条OCIVD-19 CRISPR-top检测。
荧光COVID-19 CRISPR-top法检测出38份RNA样品呈阳性，测流生物传感条COVID-19 CRISPR-top检测结果为35份阳性，而广州市疾病预防控制中心(GZ-CDC)只有34份RNA样品经RT-PCR检测呈阳性(图 16和表3)。这些数据表明，CRISPR-top法对COVID-19患者的诊断更为有效，尤其是对病毒载量很低的样本。RT-PCR的较低检测率可能是由于存在对RT-PCR方法有特异性影响的抑制剂或模板(SARS-CoV-2 RNA) 的较低拷贝数导致的，该模板的拷贝数超出了PCR检测方法范围。此外，使用LAMP扩增靶核酸的CRISPR-top方法可能与等温扩增技术共有一些优势，如，CRISPR-top检测可能对那些抑制剂不敏感(对基于PCR的检测敏感)，可以耐受各种核酸的抑制作用或受样品缓冲液中大量盐的存在时的影响较小。该研究的一些局限性包括从COVID-19个人收集的临床样品数量少，并且未测试其他类型的样品(例如尿液和血液)。因此，进一步评估COVID-19 CRISPR-top使用更多或不同类型临床样本的可行性是有必要的。
实施例4.COVID-19 CRISPR-top试验在临床标本中的应用
为验证COVID-19 CRISPR-top方法的可行性，从贵州省疾病预防控制中心收集了52份无症状个体、急性期和恢复期的COVID-19临床标本 (表3)，其中包含括咽、鼻、肛拭、粪便和痰标本。用COIVD-19CRISPR-top 方法检测这批RNA模板得到了GZ-CDC的批准。特别是从临床标本中提取的RNA模板，是在广州市疾控中心进行RT-PCR后，用官方认可的临床RT-PCR试剂盒进行的。使用5μl RNA模板的等分试样进行RT-PCR 和COVID-19 CRISPR-top试验。此外，80份咽拭子样本(表4)取自非 COVID-19个体，用于测试COVID-19 CRISPR-top方法的临床特异性。
为了验证COVID-19 CRISPR-top检测方法作为SARS-CoV-2诊断工具的可行性，我们从52个COVID-19个体和80个非COVID-19呼吸拭子样本中检测了提取的RNA(表3和4)。使用荧光COVID-19 CRISPR-top，在52个临床样本中的38个(73.1％)检测到SARS-CoV-2 RNA(图16)，测流生物传感条COVID-19 CRISPR-top有35个(67.5％)阳性结果(表 3)。临床标本中COVID-19 CRISPR-top方法的灵敏度(图16，表3)与 RT-PCR检测的灵敏度相似(34/52，65.4％)。在COVID-19 CRISPR-top 试验中，非SARS-CoV-2感染患者未产生阳性信号(表4)。这些结果初步表明，COVID-19 CRISPR-top试验可作为SARS-CoV-2检测的一种有价值的诊断工具。
序 列 表
<110> 贵州省疾病预防控制中心
<120> CRISPR介导的一步式恒温扩增检测SARS-CoV-2的方法
<160> 15
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> SARS-Cov-2
<400> 1
caaataccta caacttgtgc taa 23
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> SARS-Cov-2
<400> 2
catcagtact agtgcctgtg 20
<210> 3
<211> 44
<212> DNA
<213> SARS-Cov-2
<400> 3
ataacctttc cacataccgc agttcaccct gtgggtttta cact 44
<210> 4
<211> 40
<212> DNA
<213> SARS-Cov-2
<400> 4
tagttgtgat caactccgcg aatgcactta caccgcaaac 40
<210> 5
<211> 16
<212> DNA
<213> SARS-Cov-2
<400> 5
cggtacagac tgtgtt 16
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> SARS-Cov-2
<400> 6
agctgatgca caatcgtt 18
<210> 7
<211> 111
<212> RNA
<213> SARS-Cov-2
<400> 7
gucuagagga cagaauuuuu caacgggugu gccaauggcc acuuuccagg uggcaaagcc 60
cguugagcuu cucaaaucug agaaguggca cacccugugg guuuuacacu u 111
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> SARS-Cov-2
<400> 8
ccaaatttca aagatcaagt cat 23
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> SARS-Cov-2
<400> 9
tgttgcaatt gtttggagaa 20
<210> 10
<211> 49
<212> DNA
<213> SARS-Cov-2
<400> 10
tctttttgtc ctttttaggc tctgtttctg ctgaataagc atattgacg 49
<210> 11
<211> 43
<212> DNA
<213> SARS-Cov-2
<400> 11
atacaaaaca ttcccaccaa cagattctgt ctctgcggta agg 43
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> SARS-Cov-2
<400> 12
tggatctttg tcatccaa 18
<210> 13
<211> 18
<212> DNA
<213> SARS-Cov-2
<400> 13
agaaggctga tgaaactc 18
<210> 14
<211> 111
<212> RNA
<213> SARS-Cov-2
<400> 14
gucuagagga cagaauuuuu caacgggugu gccaauggcc acuuuccagg uggcaaagcc 60
cguugagcuu cucaaaucug agaaguggca cugcugaaua agcauauuga c 111
<210> 15
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 15
ttattattat 10

Claims (8)

1.一种非诊断目的的由CRISPR介导的一步式恒温扩增目的基因的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
（1）使用前向外引物、后向外引物、前向内引物、后向内引物、前向环状引物、后向环状引物对待扩增的靶基因模板进行环介导的恒温扩增，其中，在前向内引物或后向内引物中引入PAM位点；
（2）将步骤（1）获得扩增产物与由特异性识别PAM位点的gRNA和AapCas12b因子组成的复合物、末端标记荧光基团的单链DNA探针进行CRISPR-CAS核酸切割反应；
（3）检测步骤（2）的核酸切割反应的结果；
其中，步骤（1）中所述前向外引物的序列如SEQ ID NO.1所示，后向外引物的序列如SEQID NO.2所示，前向内引物的序列如SEQ ID NO.3所示，后向内引物的序列如SEQ ID NO.4所示，前向环状引物的序列如SEQ ID NO.5所示，后向环状引物的序列如SEQ ID NO.6所示，所述gRNA的序列如SEQ ID NO.7所示；或者
所述前向外引物的序列如SEQ ID NO.8所示，后向外引物的序列如SEQ ID NO.9所示，前向内引物的序列如SEQ ID NO.10所示，后向内引物的序列如SEQ ID NO.11所示，前向环状引物的序列如SEQ ID NO.12所示，后向环状引物的序列如SEQ ID NO.13所示，所述gRNA的序列如SEQ ID NO.14所示。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）和步骤（2）的工作温度均在56ºC-61ºC之间。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）和步骤（2）的工作温度均为58ºC或59ºC。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（3）检测的方法为实时荧光法检测，所述单链DNA探针的序列如SEQ ID NO.15所示，在所述单链DNA探针标记荧光基 团的相对方向的末端标记有荧光淬灭基团。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（3）检测的方法为测流生物传感器检测，在所述单链DNA探针标记荧光基 团的相对方向的末端标记有生物素，所述测流生物传感器为一平板状结构的背板，包括用于滴加待检测样品的一样品区、一共轭区、一硝酸纤维素膜和一吸收垫，所述共轭区沉积有作为指示试剂的链霉亲和素固定金纳米粒子，所述硝酸纤维素膜设置有两个带：沉积有兔抗荧光素抗体的对照线和沉积有生物素化牛血清白蛋白的测试线。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述单链DNA探针的序列如SEQ ID NO.15所示。
7.一组用于权利要求1-3任一所述方法的核酸分子，其特征在于，所述分子包括序列如SEQ ID NO.1所示的前向外引物，序列如SEQ ID NO.2所示的后向外引物，序列如SEQ IDNO.3所示的前向内引物，序列如SEQ ID NO.4所示的后向内引物，序列如SEQ ID NO.5所示的前向环状引物，序列如SEQ ID NO.6所示的后向环状引物，序列如SEQ ID NO.7所示的gRNA，或者
序列如SEQ ID NO.8所示的前向外引物，序列如SEQ ID NO.9所示的后向外引物，序列如SEQ ID NO.10所示的前向内引物，序列如SEQ ID NO.11所示的后向内引物，序列如SEQID NO.12所示的前向环状引物，序列如SEQ ID NO.13所示的后向环状引物，序列如SEQ IDNO.14所示的gRNA。
8.一种含有权利要求7所述核酸分子的检测试剂盒。
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