CN111876525A - 用于检测SARS-CoV-2的gRNA、引物及试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及医学检测领域，具体而言，涉及一种用于检测SARS‑CoV‑2的gRNA、引物及试剂盒。该引物用于扩增包含gRNA所结合靶核酸的核酸片段。利用CRISPR/Cas技术实现新型冠状病毒病原核酸检测，检测特异性好、灵敏度高，可在25℃～37℃的室温下实现高灵敏、高精度的分子检测，具有更好的特异性和兼容性，检测成本低廉、操作方便、快捷。检测限值可达到5copies/μL，实现靶标单分子检测；同时还能实现多位点同时检测，临床检测效果优异。

Description

用于检测SARS-CoV-2的gRNA、引物及试剂盒
技术领域
本发明涉及医学检测领域，具体而言，涉及一种用于检测SARS-CoV-2的gRNA、引物及试剂盒。
背景技术
2019新型冠状病毒，2020年2月11日被国际病毒分类委员会命名为SARS-CoV-2。冠状病毒是一个大型病毒家族，已知可引起感冒以及中东呼吸综合征(MERS)和严重急性呼吸综合征(SARS)等较严重疾病。新型冠状病毒是以前从未在人体中发现的冠状病毒新毒株。
该病毒致死率约为2％到4％，但这是一个非常早期的百分比，随着更多信息的获得可能会改变。人感染了冠状病毒后出现程度不同的症状，常见体征有呼吸道症状、发热、咳嗽、气促和呼吸困难等。在较严重病例中，感染可导致肺炎、严重急性呼吸综合征、肾衰竭，甚至死亡。目前对于新型冠状病毒所致疾病没有特异治疗方法。但许多症状是可以处理的，因此需根据患者临床情况进行治疗。此外，对感染者的辅助护理可能非常有效。
重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)的反应过程，首先是重组酶与引物结合，形成蛋白-DNA复合物。接着在dsDNA中寻找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就会发生链交换反应形成并启动DNA合成，对模板上的目标区域进行指数式扩增。而被替换的DNA链与SSB(单链DNA结合蛋白)结合，防止进一步被替换。整个过程进行得非常快，一般可在十分钟内获得可检出水平的扩增产物。RPA方法的优势除了高特异性、高灵敏度外，操作十分简单，对仪器设备要求低，一台水浴锅或恒温箱就能实现反应，结果的检测也很简单，简便快捷，适合基层快速诊断。
Cas12a可在crRNA引导下与靶标双链DNA结合并完成切割，与Cas9系统相比简化了实验设计。当Cas12a特异性结合和切割目标dsDNA后，具有非特异性切割单链DNA的活性。Cas12a检测中靶标及底物均为DNA，其稳定性较强，因此该系统对实验操作环境要求低，可应用于现场的快速检测。
发明内容
本发明涉及用于检测SARS-CoV-2的gRNA，所述gRNA包括a)与Cas核酸酶相互作用的框架核酸片段，以及b)与靶核酸结合的特异性核酸片段，所述特异性核酸片段包括SEQID NO：10和/或11。
本发明还涉及用于扩增包含如上所述靶核酸的核酸片段的引物以及包含所述引物的扩增组合产品，所述引物为SEQ ID NO：5和6所示引物对；和/或；SEQ ID NO：7和8所示引物对。
本发明还是涉及如上所述的gRNA、引物、扩增组合产品、或试剂盒在检测SARS-CoV-2中的非诊断用途。
本发明还涉及载体系统，其包含一种或多种载体，所述载体包含：第一调控元件和第二调控元件，所述第一调控元件可操作地连接至编码Cas核酸酶的核苷酸片段，所述第二调控元件可操作地连接至编码如上所述gRNA的核苷酸片段。
本发明的有益效果为：
利用CRISPR/Cas技术实现新型冠状病毒病原核酸检测，检测特异性好、灵敏度高，可在25℃～37℃的室温下实现高灵敏、高精度的分子检测，具有更好的特异性和兼容性，检测成本低廉、操作方便、快捷。检测限值可达到5copies/μL，实现靶标单分子检测；同时还能实现多位点同时检测，临床检测效果优异。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为SARS-CoV-2的S基因序列种内保守性比对结果；
图2为SARS-CoV-2的ORF1ab基因序列种内保守性比对结果；
图3为SARS-CoV-2的S基因与其它冠状病毒特异性比对结果；
图4为SARS-CoV-2的ORF1ab基因与其它冠状病毒特异性比对结果；
图5为S基因的引物筛选结果；
图6为ORF1ab基因的引物筛选结果；
图7为本发明实施例1中引物组1和引物组2的RDA扩增产物琼脂凝胶成像电泳图；
图8为本发明实施例3中CRISPR/Cas12a检测体系的有效性验证；
图9为本发明实施例4中CRISPR-侧向层析法检测结果的判读标准示意图；
图10为本发明实施例4中新型冠状病毒快速检测试剂(CRISPR-侧向层析法)有效性验证结果；
图11为本发明实施例5中S基因的CRISPR-荧光法灵敏度检测结果；
图12为本发明实施例5中ORF1ab基因的CRISPR-荧光法灵敏度检测结果；
图13为本发明实施例5中S基因的CRISPR-侧向层析法灵敏度检测结果；
图14为本发明实施例5中ORF1ab基因的CRISPR-侧向层析法灵敏度检测结果；
图15为本发明实施例6中CRISPR-侧向层析法特异性检测结果(S基因)；
图16为本发明实施例6中CRISPR-侧向层析法特异性检测结果(ORF1ab基因)。
具体实施方式
现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。
因此，旨在本发明覆盖落入所附权利要求的范围及其等同范围中的此类修改和变化。本发明的其它对象、特征和方面公开于以下详细描述中或从中是显而易见的。本领域普通技术人员应理解本讨论仅是示例性实施方式的描述，而非意在限制本发明更广阔的方面。
本发明的第一方面在于提供一种用于检测SARS-CoV-2的gRNA，所述gRNA包括a)与Cas核酸酶相互作用的框架核酸片段，以及b)与靶核酸结合的特异性核酸片段，所述特异性核酸片段包括SEQ ID NO：10和/或11。
在本发明中，所述特异性核酸片段可以包括SEQ ID NO：4～6中至少一种所示的核酸片段，或者与SEQ ID NO：4～6所示核酸片段实质上相同的核酸片段。
“实质上相同的核酸片段”是指在严格条件下能够与SEQ ID NO：4～6所对应的靶序列杂交的核酸片段。这样的核酸片段可以相较于SEQ ID NO：4～6替换、增加或减少1、2、3或更多个核酸碱基或碱基类似物【例如4-乙酰胞嘧啶、8-羟基-N6-甲基腺苷、吖丙啶基胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-(羧基羟基甲基)尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、Q核苷等】，或者是部分碱基具有某些修饰(例如甲基化修饰，通常这种修饰对gRNA与靶核酸的杂交是无关紧要的)，长度优选控制在18bp～24bp的核酸片段。本发明中使用的“严格条件”是公知的，包括诸如在含400mM NaCl、40mM PIPES(pH6.4)和1mM EDTA的杂交液中于65℃杂交12～16小时，然后在65℃下用含0.1％SDS、和0.1％SSC的洗涤液洗涤15～60分钟。这对于本领域技术人员来说是熟悉的。
通常一条Cas核酸酶相互作用的框架核酸片段只与一条与靶核酸结合的特异性核酸片段连接。
本发明的第二方法在于提供一种用于扩增包含如上所述靶核酸的核酸片段的引物，所述引物为SEQ ID NO：5和6所示引物对；和/或；SEQ ID NO：7和8所示引物对。
本发明的第三方法在于提供一种扩增组合产品，其包含如上所述的引物。
在一些实施方式中，所述组合产品还含有等温核酸扩增所用试剂、阳性对照和阴性对照中的一种或多种。
在一些实施方式中，所述等温核酸扩增所用试剂包括能结合单链核酸的重组酶、单链DNA结合蛋白、链置换DNA聚合酶、辅助蛋白、核酸外切酶III、反转录酶、ATP、ATP再生体系所用试剂、pH调节剂、dNTP、各种分子量分布的BSA和/或PEG、以及DTT以及水中的一种或多种。
所述辅助蛋白用于改变重组酶-引物复合体解离及重新结合的可逆反应过程，使反应向更有利于等温核酸扩增进行。
pH调节剂可以包含不显著影响反应进行的酸和碱，以及缓冲组分(例如Tris和醋酸盐等)。进一步地，Tris缓冲液为Tris-tricine，其工作浓度可以为约80mM～120mM。
在一些实施方式中，所述重组酶选自uvsX、RecA以及KX中的至少一种，所述KX的氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示。
在一些实施方式中，所述单链DNA结合蛋白为gp32。
在一些实施方式中，所述链置换DNA聚合酶选自BSu DNA聚合酶和/或Sau DNA聚合酶。
重组酶介导的核酸恒温扩增技术中使用的DNA聚合酶是枯草芽孢杆菌DNA聚合酶I(Bacillus subtilis Pol I，Bsu)或金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus Pol I，Sau)，这两种DNA聚合酶均属于DNA聚合酶I家族。DNA聚合酶I家族是负责DNA复制过程中损伤修复的聚合酶，该家族中大部分DNA聚合酶的持续合成能力都不高，也就是说该家族的聚合酶与模板结合一次能催化的聚合反应数目较少。
在一些实施方式中，所述辅助蛋白选自uvsY和/或KY，所述KY的氨基酸序列如SEQID NO：13所示。
在一些实施方式中，所述ATP再生体系所用试剂选自镁离子、磷酸肌酸及其平衡离子、肌酸激酶、肌激酶、焦磷酸酶、蔗糖以及蔗糖磷酸化酶中的一种或多种。
当重组酶用于链插入步骤的情况下，所述系统可能要求能量来源。这些酶的大多数利用ATP作为能量来源，但是因为ATP整理(collate)酶活性必需的镁离子，因此有利的提供另外的ATP再生系统而不是提高ATP的浓度。在一些实施方式中，所述ATP再生体系所用试剂选自镁离子、磷酸肌酸及其平衡离子、肌酸激酶、肌激酶、焦磷酸酶、蔗糖以及蔗糖磷酸化酶中的一种或多种。
本发明所采用的等温核酸扩增所用试剂可以采用重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)方法，或者申请人改进得到的重组酶依赖型扩增技术(Recombinase-dependent amplification，RDA)的检测方法和检测系统，RDA技术所需引物短(18bp～30bp)，对靶标序列的长度要求低，适用性广；且对核酸靶标序列的检测特异性好、灵敏度高，可在25℃～37℃的恒温条件下实现高灵敏(可以实现单拷贝模板扩增)、高精度的快速分子检测，检测成本低廉、操作方便快捷，具有广阔的应用前景。
RDA反应体系可以主要包括重组酶KX和蛋白KY、gp32以及链置换DNA聚合酶；还可以包括Tris-缓冲液、醋酸钾或醋酸钠、PEG(例如PEG20000或PEG35000)、二硫苏糖醇、dNTPs、dATP、磷酸肌酸、引物、醋酸镁。
所述重组酶KX和蛋白KY来源于Escherichia phage phT4A噬菌体，Escherichiaphage phT4A属于Myoviridae科，Tevenvirinae亚科中Slopekvirus属。
所述重组酶KX和蛋白KY能够在大肠杆菌中实现大量可溶性表达，并且KX的稳定性好于uvsX，可以量产和长期保存。
重组酶KX可以替代重组酶uvsX或RecA参与RPA反应。该酶制备工艺简单，重组酶的产量和稳定性大幅提高，量产成本低。作为重组酶聚合酶扩增领域中的一种重要酶，在恒定温度条件下可与重组酶uvsY一起实现核酸扩增，重组酶KX的应用可以使得DNA或RNA的扩增反应灵敏、高效、经济、便捷。
同时本发明开发了重组酶KX的辅助蛋白KY，KY可以替代uvsY，使扩增反应更加灵敏、高效。
本发明提供的新型重组酶依赖型扩增(RDA)反应体系的反应原理为：(1)反应体系中重组酶KX与18bp～30bp的特异性引物结合形成的重组酶-引物复合体，在双链DNA模板中寻找靶位点；(2)重组酶-引物复合体识别模板特异性序列后，发生定位并引发链交换，单链结合蛋白随即结合被置换的DNA链形成的D-Loop结构；(3)重组酶-引物复合体水解体系中的dATP构象改变，重组酶解离后引物3'端暴露并被DNA聚合酶识别，DNA聚合酶按照模板序列在引物3'端启动DNA合成；(4)DNA聚合酶具有链置换功能，在引物延伸的同时继续解开模板的双螺旋DNA结构，DNA合成过程继续进行；(5)两条引物扩增完成即形成一个完整的扩增子；(6)在反应体系中dATP水解为重组酶供能后变成dADP，磷酸肌酸能在肌酸激酶的催化下将其磷酸基转移到dADP分子中形成dATP，从而恢复反应体系中dATP的水平。上述过程不断重复，最终实现核酸的高效扩增。
本发明提供的扩增组合产品采用RDA恒温扩增检测方法，在约37℃～42℃条件下均可实现靶基因的有效扩增，不需变温，不需复杂仪器。反应时间短，约20min～30min即可完成反应，特异性为100％，检测灵敏度高，约为10copies/μl或更高。
本发明RDA方法中，设计的高度特异性探针及其引物对，实现了对样本中新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的实时、无本底背景的高效恒温核酸扩增。
在一些实施方式中，所述等温核酸扩增所用试剂为冻干粉试剂或混合的液体试剂。
在一些实施方式中，所述等温核酸扩增所用试剂主要活性组分在扩增核酸时的工作浓度在以下范围内：
KX 60～600ng/μL、KY蛋白16～192ng/μL、单链结合蛋白gp32 100～1000ng/μL、链置换DNA聚合酶3～100ng/μL、核酸外切酶III 30～200U、肌酸激酶0.1～0.8mg/ml、磷酸肌酸25～75mM、反转录酶200U、Tris缓冲液20～100mM、PEG 2.5％～10％、醋酸钾或醋酸钠0～150mM、dATP 1～5mM、dNTPs 150～600nM、DTT 1～12mM。
在本发明中，“工作浓度”用于限定所述等温核酸扩增所用试剂在扩增核酸时主要活性组分的比例。所述试剂盒中所述等温核酸扩增所用试剂中主要活性组分的浓度可以为工作浓度，也可以为能够稀释为该浓度的母液或母液干粉(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50倍浓缩的母液或母液干粉)。
根据本发明的第四方面，本发明还提供一种用于检测SARS-CoV-2的试剂盒，其包含如上所述的gRNA。
在一些实施方式中，所述试剂盒还包含所述靶核酸的扩增组合产品、Cas12a核酸酶和/或具有与Cas12a的旁路单链DNA切割活性类似的Cas核酸酶、单链DNA探针、阳性对照和用于CRISPR检测体系的缓冲液中的至少一种。
在一些实施方式中，所述靶核酸的扩增组合产品用于执行如下任一项所述的方法：
重组酶聚合酶扩增技术、PCR扩增、NASBA等温扩增、环介导等温扩增、链置换扩增、解旋酶依赖性扩增和切口酶扩增反应；
在一些实施方式中，所述靶核酸的扩增组合产品为如上所述的组合产品(RDA扩增反应体系)。
在一些实施方式中，所述Cas12a核酸酶选自FnCas12a、AsCas12a、LbCas12a、Lb5Cas12a、HkCas12a、OsCas12a、TsCas12a、BbCas12a、BoCas12a和Lb4Cas12a中的至少一种；
在一些实施方式中，所述与Cas核酸酶相互作用的框架核酸片段为SEQ ID NO：9所示；
在一些实施方式中，所述具有与Cas12a的旁路单链DNA切割活性类似的Cas核酸酶为Cas12b核酸酶；
在一些实施方式中，所述Cas12b核酸酶选自AacCas12b、Aac2Cas12b、AkCas12b、AmCas12b、AhCas12b和AcCas12b中的至少一种。
在一些实施方式中，所述单链DNA探针的5′端标记荧光发射基团，3′端标记淬灭基团。
在一些实施方式中，所述荧光发射基团选自FAM、HEX、TET、NED、ROX、CY5、CY3、Texas Red、TFAM、SYBR Green I、VIC以及JOE中的任一种。
在一些实施方式中，所述淬灭基团选自TAMRA、BHQ、Dabcyl、Eclipse以及NFQ-MGB中的任一种。
在一些实施方式中，所述单链DNA探针的两端分别标记有不同的标记物，分别为第一标记物和第二标记物。
在一些实施方式中，所述单链DNA探针上还标记有与所述标记物不同的信号物质，且所述信号物质上还标记有所述第二标记物的抗体，如此，当所述单链DNA探针被CRISPR检测体系切割时，所述信号物质与所述第二标记物位于同一核酸片段。
在一些实施方式中，所述试剂盒还包含试剂条，所述试纸条包括样品垫、反应膜和吸收垫，所述反应膜上设置有检测区和质检区；
其中：
所述检测区固定包被有针对所述第一标记物的第一抗标记物；
所述质检区固定包被有针对所述第二标记物的抗体的二抗；
所述第一标记物与所述第一抗标记物能够形成标记物-抗标记物复合物，且所述第一抗标记物与所述第二标记物的抗体不同。
在一些实施方式中，所述标记物-抗标记物复合物中标记物/抗标记物的组合选自生物素或其衍生物/链霉亲和素，生物素或其衍生物/亲和素，生物素或其衍生物/中性抗生物素蛋白，半抗原/抗体，抗原/抗体，受体/配体，地高辛/地高辛配基，碳水化合物/凝集素和多核苷酸/互补的多核苷酸。
其中生物素的衍生物为D-生物素、活化生物素、生物胞素、乙二胺生物素、尸胺生物素及脱硫生物素中的任一种。
其中抗原和半抗原可以是多肽，也可以是蛋白或蛋白亚基，这样的蛋白或蛋白亚基本身也可以是抗体或抗体片段。
“抗体”此用语包括多克隆抗体及单克隆抗体，“抗体片段”此用语包括这些抗体的抗原化合物结合片段，包括Fab、F(ab’)2、Fd、Fv、scFv、双特异抗体和抗体最小识别单位，以及这些抗体和片段的单链衍生物，例如scFv-Fc等。抗体的类型可以选择IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE、IgD。此外，“抗体”此用语包括天然发生的抗体以及非天然发生的抗体，包括例如嵌合型(chimeric)、双功能型(bifunctional)、人源化(humanized)抗体以及人抗体，以及相关的合成异构形式(isoforms)。
反应膜通常为微孔滤膜，例如NC膜。
本发明优选生物素/生物素集合的蛋白家族，以及地高辛/地高辛配基。
生物素结合的蛋白家族包括上述的链霉亲和素(streptavidin)、亲和素(avidin)和中性抗生物素蛋白(neutravidin)，每个蛋白都能够以高度的亲和力和特异性结合四个生物素分子。其中最常使用的是链霉亲和素，它未经糖基化且具有很低的非特异性结合水平。亲和素则是一种高度阳离子化的糖蛋白，等电点在10.5左右，它的正电荷残基和低聚糖成份能够介导非特异性结合，从而在某些应用中导致本底过高的问题。中性抗生物素蛋白经过去糖基化处理和降低等电势点，从而减少了其背景着色。
地高辛配基可以为抗体。
在一些实施方式中，信号物质指可用于提供可检测的(优选可定量的)效果且可以连接至核酸的任何原子或分子。信号物质包括但不限于染料；放射性标记，诸如32P；结合部分诸如生物素；半抗原诸如地高辛；发光、发磷光或发荧光部分；和单独的荧光染料或与可以通过荧光共振能量转移(FRET)抑制或移动发射光谱的部分组合的荧光染料。信号物质可以提供可通过荧光、放射性、比色、重量测定、X射线衍射或吸收、磁性、酶活性等检测的信号。信号物质可以是带电荷的部分(正电荷或负电荷)或可选地，可以是电荷中性的。信号物质可以包括核酸或蛋白序列或由其组合，只要包含标记的序列是可检测的。在一些实施方案中，核酸在没有标记的情况下直接检测(例如，直接读取序列)。
在一些实施方式中，所述信号物质是荧光团、比色标记、胶体金、量子点、生物素以及其他可以用于探测的标签分子(如用于拉曼衍射成像的炔烃基团，用于click反应的环烯烃，用于聚合物标记的引发基团)，也可以选自多肽/蛋白分子，LNA/PNA，非天然氨基酸及其类似物(比如拟肽)，非天然核酸及其类似物(拟核苷酸)和纳米结构(包括无机纳米颗粒，NV-center，聚集/组装诱导发光分子，稀土离子配体分子，多金属氧簇等)。
在一些实施方式中，所述标记是荧光团。
在一些实施方式中，所述荧光团可选自荧光素类染料、罗丹明类染料以及菁染料。
在一些实施方式中，所述荧光素类染料包括标准荧光素及其衍生物，如异硫氰酸荧光素(FITC)、羟基荧光素(FAM)、四氯荧光素(TET)等。
在一些实施方式中，所述罗丹明类染料包括R101、四乙基罗丹明(RB200)和羧基四甲基罗丹明(TAMRA)等。
在一些实施方式中，所述菁染料主要选自两类，一类是噻唑橙(thiazole orange,TO)、噁唑橙(oxazole orange,YO)系列及其二聚体染料，另一类是多甲川系列菁染料。
在一些实施方式中，荧光团还可以选择下述染料：二苯乙烯、萘酰亚胺、香豆素类、吖啶类、芘类等。
作为优选，信号物质为胶体金。
本发明还涉及载体系统，其包含一种或多种载体，所述载体包含：第一调控元件和第二调控元件，所述第一调控元件可操作地连接至编码Cas核酸酶的核苷酸片段，所述第二调控元件可操作地连接至编码如上所述gRNA的核苷酸片段。
所述Cas核酸酶能够在所述gRNA的配合下特异性切割靶序列(DNA或RNA)。
术语“载体(vector)”是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。
Cas核酸酶可以与gRNA位于相同或不同的载体上。
根据本发明的再一方面，本发明还涉及如上所述的gRNA、如上所述的引物、如上所述的扩增组合产品、或如上所述的试剂盒在检测SARS-CoV-2中的非诊断用途。
这样的用途可以是诊断或非诊断目的。
这样的用途可以用于诊断新型冠状病毒肺炎(COVID-19)。
上述用途的受试者可以指患者或怀疑携带有SARS-CoV-2的动物，特别是哺乳动物，例如蝙蝠、果子狸；优选为灵长类动物，更优选为人。
检测SARS-CoV-2所用的样本优选为受试者的上呼吸道标本(如咽拭子、鼻拭子等)、下呼吸道标本(如呼吸道吸取物、支气管灌洗液、肺泡灌洗液、深咳痰液等)、眼结膜拭子、粪便标本、抗凝血和血清标本等。临床标本应尽量采集病例发病早期的呼吸道标本(尤其是下呼吸道标本)和发病7天内急性期血清以及发病后第3～4周的恢复期血清。
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。对于本领域技术人员来说，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
除非另有说明，本发明采用的免疫学、生物化学、化学、分子生物学、微生物学、细胞生物学、基因组学和重组DNA等是本领域的常规技能。
实施例1新型冠状病毒核酸检测靶点扩增方法建立
在本发明中，我们通过NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)查找新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的全基因序列，使用Clone manager软件和BLAST进行同源性比对和序列分析，从中选择在本病毒的种内保守、种间变异的序列作为靶标区域。经过对多种冠状病毒的全基因组序列比对和同源性分析后，最终选择保守的S基因和ORF1ab基因作为靶标基因，这2个基因的两个靶标区域种内同源性和种间特异性比对结果见图1～图4。最终，以这两种靶标基因进行RDA引物和gRNA设计。基于CRISPR/Cas12a系统，在引物设计时，扩增片段应包含5’-TTTN-3’序列，且5’-TTTN-3’序列后需至少包含20bp碱基。
本实施例采用RDA扩增技术方案进行引物设计，分别在S基因设计了共4组引物，ORF1ab基因共4组引物。将这所有8组引物进行RDA扩增和CRISPR/Cas12a系统检测，从而筛选出引物。筛选结果见图5～图6所示。在S1～S4共4组S基因引物筛选中，优选S4引物组；另外，在ORF1～ORF4共4组ORF1ab基因中，优选ORF3引物组。即S基因和ORF1ab基因各筛选出1组引物。
本实施例经过序列比对和实验验证，最终筛选出的引物序列如下所示。实验中所用的靶标序列质粒和引物委托上海捷瑞生物工程有限公司合成。
S基因引物序列(SEQ ID NO：1)
RDA-nCov-S-F2：TTTTCCAATGTTACTTGGTTCCATGCTATA(SEQ ID NO：5)
RDA-nCov-S-R2：TATTAACAATAAGTAGGGACTGGGTCTTCG(SEQ ID NO：6)
ORF1ab基因引物序列(SEQ ID NO：2)
RDA-nCov-O-F1：CTGTAGTAATTGGAACAAGCAAATTCTATGG(SEQ ID NO：7)
RDA-nCov-O-R1：GCGAGCAAGAACAAGTGAGGCCATAATTCT(SEQ ID NO：8)
本实施例中分别使用含有S基因和ORF1ab基因靶序列的质粒进行RDA扩增，37℃反应30分钟。在每组实验中以无靶核酸的样本为阴性对照(NC)，其它条件不变。
具体反应体系如下：
Figure BDA0002575110290000101
Figure BDA0002575110290000111
RDA恒温扩增反应模块反应体系包含重组酶KX 120ng/μL、KY蛋白60ng/μL、单链结合蛋白gp32 300ng/μL、链置换DNA聚合酶50ng/μL、核酸外切酶III 50U、肌酸激酶0.2mg/ml、磷酸肌酸50mM、反转录酶200U、Tris-tricine 100mM、PEG20000或PEG35000 5％、醋酸钾50mM、醋酸镁14mM、dATP 2mM、dNTPs 200nM each、DTT 2mM。
重组酶KX和重组酶辅助蛋白KY的制备可以选用如下方法：
重组酶KX的制备：
将目的基因表达片段导入pET 28a载体中，得到重组表达载体。
所述目的基因表达片段含有如SEQ ID NO：12所示的核苷酸序列，所述目的基因表达片段的5’端具有BamHI酶切位点黏性末端，所述目的基因表达片段的3’端具有Sall酶切位点黏性末端：
将所述重组表达载体转入大肠杆菌，得到重组工程菌。
对所述重组工程菌进行诱导培养，得到所述重组酶KX。
所述诱导表达的方法为：在重组工程菌的菌落OD值为0.6～0.8时，加入终浓度为0.1mM/L～0.5mM/L异丙基硫代半乳糖苷，并在16℃～22℃诱导表达20h-30h，固液分离收集沉淀，得到表达菌；将所述表达菌经超声裂解后固液分离收集上清，得到粗产物。将所述粗产物采用亲和层析后，再经阴离子层析，纯化得到所述重组酶KX。
上述制备得到的重组酶KX纯度大于95％。
重组酶辅助蛋白KY的制备：
将SEQ ID NO：13所示目的基因表达片段导入pET 28a载体中，在其编码基因C端增加TrxA和SUMO双促溶标签，得到重组表达载体。将上述重组表达载体导入大肠杆菌中实现大量可溶性表达。
双促溶表达标签的KY蛋白的制备方法，包括以下步骤：
将所述重组表达载体转入大肠杆菌，得到重组工程菌：以及对所述重组工程菌进行诱导培养，得到所述KY蛋白。
对所述重组工程菌进行诱导培养得到所述KY蛋白的步骤中，包括：
在重组工程菌的菌落OD值为0.6～0.8时，加入终浓度为0.1mM/L-0.5mM/L异丙基硫代半乳糖苷，并在16℃～22℃诱导表达20h～30h，固液分离收集沉淀，得到表达菌，将所述表达菌经超声裂解后固液分离收集上清，得到粗产物，将所述粗产物纯化，得到所述KY蛋白。
其中，将所述粗产物纯化，包括：将所述粗产物采用聚乙烯亚胺沉淀和硫酸镀盐析后经亲和层析，再用Ulp1酶切除TrxA和SUMO标签，最后经阴离子层析得到所述KY蛋白。
上述KY蛋白的纯度能达到95％以上，作为重组酶依赖型扩增技术(RDA)中的重要酶，在恒定温度条件下可与重组酶KX协同实现核酸的指数扩增。KY蛋白的应用使得DNA或RNA的扩增反应灵敏、高效。
实验结果如图7所示：引物组1～2的阳性对照(PC)和阴性对照(NC)均能正常反应。由此可见，这2套新型冠状病毒的RDA引物均能有效扩增。
实施例2新型冠状病毒CRISPR/Cas12a检测的gRNA设计及有效性验证
CRISPR/Cas12a系统在gRNA设计时，以20bp碱基为单位，在保守的S基因和ORF1ab基因序列中搜寻含有“TTTN”的序列并导出相关序列做为gRNA靶向序列的备选数据库。通过评估上述备选gRNA序列在不同病毒株间的特异性，备选gRNA序列的GC含量，碱基均一性，序列保守性等系列参数，最终筛选出最优的gRNA序列。可通过http://www.rgenome.net/cas-designer/在线软件辅助设计。
1、CRISPR/Cas12a基因克隆及蛋白表达
采用源自Lachnospiraceae bacterium的Cas12a蛋白基因，经过密码子优化，使基因更适合在哺乳动物细胞中表达。优化后的Cas12a蛋白基因克隆入带6-His组氨酸标签的pET28a质粒，方便蛋白纯化表达。Cas12a蛋白重组表达载体转化，表达菌采用BL21 star(DE3)。
具体蛋白表达条件为：在培养菌液OD600＝0.6时加入0.5mM的IPTG培养4小时。收集菌体进行蛋白纯化。纯化条件为：将菌体重悬于裂解液(50mM Tris,pH8.0，300mM NaCl，5％甘油，20mM咪唑)，进行超声破碎(70％振幅，2s On/4s Off，3分钟，Sonics 750w超声仪)，离心分离上清液，以镍柱纯化，以含250mM咪唑的裂解液洗脱，浓缩洗脱组分，以Superdex200，Tricorn 10/300凝胶色谱柱进行纯化。SDS-PAGE检测以及凝胶柱纯化，获得的纯化后的Cas12a蛋白，放-80℃保存。
2、制备gRNA
基于实施例1设计的gRNA序列，设计含T7启动子的引物进行扩增双链DNA。参照T7RNAPolymerase(Thermo)试剂盒说明书，将带T7启动子的DNA片段、T7聚合酶混合，37℃孵育过夜；再使用RNeasy mini kit(Qiagen)，获得纯化的gRNAs。
3、CRISPR/Cas12a检测体系的有效性验证
检测体系包括：取2ng靶标基因的质粒模板，45nM纯化的LbCas12a，20nM制备的gRNA，100nM在LbCas12a切割时可发出荧光的报告DNA链，即非特异单链DNA荧光探针(DNAseAlert QC System,Thermo Scientific)，及检测缓冲液(20mM Tris,60mM NaCl,10mM MgCl2,pH 7.3)。反应体系置于荧光分析仪(BioTek)，37℃反应30min，取终末荧光值进行结果判读。
分析CRISPR/Cas12a反应荧光数据：为了计算去除背景的荧光数据，方便不同条件之间的比较，样品的初始荧光被去除。背景荧光(无靶核苷酸或无gRNA的条件下)会从样品中去除，从而获得扣除背景荧光的数据。取终末荧光值进行结果判读，在去除样本背景荧光后，大于或等于阴性对照样本的荧光值的3倍定义为SARS-CoV-2阳性，小于阴性对照样本的荧光值的3倍定义为SARS-CoV-2阴性。
检测结果如表1所示，结果表明：以所述2组RDA引物的扩增产物为模板，所述Cas12a蛋白和所设计的对应gRNA为原料在CRISPR反应下，可识别靶标位点并切割荧光探针产生荧光信号，说明设计的gRNA序列可特异性识别病毒靶标序列，可用于新型冠状病毒的定性检测。
通过大量研究实验，最终筛选出针对两个靶标基因的2条gRNA，在CRISPR/Cas12a系统中对新型冠状病毒核酸的靶标具有良好的检测效果(表1)。gRNA序列如下所示：
S基因(SEQ ID NO：1)gRNA序列(SEQ ID NO：3)：
UAAUUUCUACUAAGUGUAGAU(SEQ ID NO：9)AUAACCCUGUCCUACCAUUU(SEQ ID NO：10)
ORF1ab基因(SEQ ID NO：2)gRNA序列(SEQ ID NO.4)：
UAAUUUCUACUAAGUGUAGAU(SEQ ID NO：9)UAGUGAUGUGAAAACCCUC(SEQ ID NO：11)
表1.新型冠状病毒的gRNA有效性验证剪切荧光值汇总
Figure BDA0002575110290000131
实施例3基于CRISPR/Cas12a系统构建新型冠状病毒(CRISPR-荧光法)快速检测技术
本实施例按照实施例2的方法，表达纯化Cas12a蛋白，制备靶标DNA和特异性gRNA，来验证新型冠状病毒快速检测试剂(CRISPR-荧光法)检测体系的有效性。
检测过程包括两个反应：
(1)第一个反应：恒温扩增：靶标DNA可经过重组酶依赖型扩增技术(RDA)、重组酶聚合酶扩增技术(RPA)、PCR扩增、NASBA等温扩增、环介导等温扩增(LAMP)、链置换扩增(SDA)、解旋酶依赖性扩增(HDA)和切口酶扩增反应(NEAR)等方式进行扩增。本实施例中使用RDA技术进行恒温扩增，按实施例1中的方法进行RDA配制反应液:
Figure BDA0002575110290000141
(2)第二个反应：CRISPR反应-荧光法：取2μl RDA反应产物，45nM纯化的LbCas12a，20nM制备的gRNA，100nM在LbCas12a切割时可发出荧光的报告DNA链，即非特异单链DNA荧光探针(DNAseAlert QC System,Thermo Scientific)，及检测缓冲液(20mM Tris,60mMNaCl,10mM MgCl2,pH 7.3)。反应体系置于37℃反应20min，取终末荧光值进行结果判读。
结果如图8所示，结果表明：以所述2组RDA的扩增产物为模板，所述Cas12a蛋白和所设计的对应gRNA为原料在CRISPR反应下，可识别靶标位点并切割荧光探针产生荧光信号，说明设计的gRNA序列可特异性识别病毒靶标序列，可用于新型冠状病毒的定性检测。
实施例4基于CRISPR/Cas12a系统构建新型冠状病毒(CRISPR-侧向层析法)快速检测技术
在CRISPR/Cas12a检测体系中，Cas12a蛋白在切割靶标dsDNA的同时，通过附属切割的活性对非特异单链DNA探针进行切割。运用这一特性，我们把CRISPR/Cas12a检测体系中的单链DNA探针进行特殊标记，然后通过与之配套的胶体金试纸条，在不同的划线区域固定不同的抗体进行信号捕获，从而实现通过胶体金侧向层析的方法，对CRISPR/Cas12a检测体系进行结果判读。通过搭建胶体金试纸条技术平台，筛选相应的标记蛋白及工艺优化，完成新型冠状病毒CRISPR-侧向层析法检测体系的构建。
本实施例按照实施例2的方法，表达纯化Cas12a蛋白，制备靶标DNA和特异性gRNA，来验证新型冠状病毒快速检测试剂(CRISPR-侧向层析法)检测体系的有效性。
具体检测过程包括两个反应：
(1)第一个反应：恒温扩增：靶标DNA可经过重组酶依赖型扩增技术(RDA)、重组酶聚合酶扩增技术(RPA)、PCR扩增、NASBA等温扩增、环介导等温扩增(LAMP)、链置换扩增(SDA)、解旋酶依赖性扩增(HDA)和切口酶扩增反应(NEAR)等方式进行扩增。本实施例中以RDA技术来扩增，按实施例1中的方法RDA进行靶标序列扩增；
(2)第二个反应：CRISPR反应-侧向层析法：取2μL RDA反应产物，45nM纯化的LbCas12a，20nM制备的gRNA，100nM非特异单链DNA探针(探针5端标记生物素，3端标记地高辛)，及检测缓冲液(20mM Tris,60mM NaCl,10mM MgCl2,pH 7.3)。反应体系置于37℃反应30min，然后取出胶体金检测试剂条，将红色印记端朝下，插入上一步骤的CRISPR反应试剂管中，层析反应1～2分钟，然后根据试纸条的条带变化进行结果判读。
CRISPR-侧向层析法检测的结果判读标准如图9所示：
在本实施例中，单链DNA探针5'端标记地高辛，3'端标记生物素，且胶体金颗粒上标记有地高辛单抗。质控线C上固定包被抗地高辛抗体的二抗，检测线T上固定包被有链霉亲和素。当反应体系中有靶序列时，单链DNA探针被切割完全，生物素被切割成游离状态，检测线T不会显色，此时质控线C显色而检测线T不显色，指示SARS-CoV-2为阳性；当反应体系中没有靶序列时，单链DNA探针不被切割，此时质控线C和检测线T两条线均显色，指示SARS-CoV-2为阴性；
若质控线C不显色，则提示检测失败或试纸已失效，结果无效；
若质控线C显色而检测线T信号微弱，建议重复检测；延长CRISPR剪切时间至20分钟后观察结果，若质控线C显色，而检测线T信号依然微弱，则判定为SARS-CoV-2阴性；若质控线C显色，而检测线T信号无显色，则判定为SARS-CoV-2阳性。
本实施检测结果如图10所示，所述Cas12a蛋白和所设计的gRNA可识别靶标位点并切割体系中的胶体金探针，通过胶体金检测试纸条侧向层析。结果显示，2组待检引物的阳性样本P质控线C显色，而检测线T无色，即为SARS-CoV-2阳性。同时，2组引物的阴性对照NC质控线C和检测线T均显色，为SARS-CoV-2阴性。由此可见，设计的gRNA序列可特异性识别病毒靶标序列，可用于新型冠状病毒的定性检测。
实施例5基于CRISPR/Cas12a系统构建新型冠状病毒方法灵敏度测试
为了测试RDA+Cas12a检测体系的灵敏度，我们采用了SARS-CoV-2的S基因(SEQ IDNO：1)和ORF1ab基因(SEQ ID NO：2)质粒为模板，并稀释为500copies/μL、100copies/μL、50copies/μL、5copies/μL和1copies/μL共5个梯度作为灵敏度检测的模板。
方法(1)：CRISPR-荧光法
具体操作如下：将实施例2中步骤2制备gRNA(SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4)，然后按实施例2中步骤3操作方法，以S基因(SEQ ID NO：1)和ORF1ab基因(SEQ ID NO：2)质粒浓度分别为500copies/μL、100copies/μL、50copies/μL、5copies/μL、1copies/μL作为模板，进行RDA反应。最后，按照实施例2中步骤4的方法配制CRISPR/Cas12a检测体系，来分析RDA+Cas12a检测体系的灵敏度。在实验中灭菌水做空白对照(B)，无靶核酸的样本为阴性对照(N)，其它条件不变。
结果分析时去除样本背景荧光后，大于或等于阴性对照样本的荧光值的3倍定义为阳性；否则，为阴性。
结果如图11和图12所示，在500copies/μL、100copies/μL、50copies/μL和5copies/μL质粒浓度中，S基因和ORF1ab基因的RDA产物(SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2)，在CRISPR/Cas12a检测体系(荧光法)中均有特异性荧光产生，结果为阳性；而1copies/μL、空白对照B和阴性对照N的RDA产物，CRISPR/Cas12a检测体系检测结果均无荧光值产生，为阴性。
方法(2)：CRISPR-侧向层析法
具体操作如下：以S基因(SEQ ID NO：1)和ORF1ab基因(SEQ ID NO：2)质粒浓度为500copies/μL、100copies/μL、50copies/μL、5copies/μL和1copies/μL作为模板，进行RDA反应。然后，按照实施例3中的方法配制CRISPR/Cas12a检测体系，来分析RDA+Cas12a检测体系(侧向层析法)的灵敏度。在实验中灭菌水做空白对照(B)，无靶核酸的样本为阴性对照(N)，其它条件不变。CRISPR-侧向层析法检测的结果判读标准按实施例3的判读标准进行判读。
结果如图13和图14所示，在500copies/μL、100copies/μL、50copies/μL和5copies/μL质粒浓度中，S基因和ORF1ab基因的RDA产物(SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2)，通过CRISPR/Cas12a反应和胶体金检测试纸条侧向层析，结果显示均为质控线C显色，而检测线T无色，即判断为新型冠状病毒(SARS-CoV-2)检测阳性；而1copies/μL核酸浓度、阴性对照N和空白对照B的质控线C和检测线T均显色，即判断为新型冠状病毒(SARS-CoV-2)检测阴性。
综上，表明本发明建立的新型冠状病毒CRISPR/Cas12a检测体系具有良好的灵敏度，灵敏度为5copies/反应。
实施例6基于CRISPR/Cas12a系统构建新型冠状病毒方法特异性验证
新型冠状病毒感染引起的临床症状，可与甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒等已知病毒感染引起的症状相似，需要鉴别诊断。为了验证基于CRISPR/Cas12a系统的新型冠状病毒检测方法的特异性，本实施例按照实施例1的方法，分别选出甲型流感病毒，乙型流感病毒，呼吸道合胞病毒，肺炎支原体和冠状病毒(NL63，HKU1，229E，OC43)阳性的8种临床样本，样本提取核酸后进行逆转录，然后按照实施例2步骤3的方法制备靶标DNA。
设置2组组合实验，即组合1(S基因)和组合2(ORF1ab基因)。具体为：取以上8种呼吸道常见的感染病原，按照实施例1中设计的引物组1(S基因)和引物组2(ORF1ab基因)，分别对含有S基因、ORF1ab基因的质粒进行RDA反应。然后，将RDA产物分别与新型冠状病毒的S基因和ORF1ab基因的gRNA，进行CRISPR/Cas12a反应(包括CRISPR-荧光法检测和CRISPR-侧向层析法检测)，来验证gRNA序列的特异性。在实验中，以灭菌水做空白对照，无靶核酸的样本为阴性对照，以新型冠状病毒阳性样本制备的RDA产物作为阳性对照。其它条件不变。
CRISPR-荧光法检测的判读标准按实施例2所述的标准进行判读，CRISPR-侧向层析法检测的判读标准按实施例3所述的标准进行判读。
CRISPR-荧光法检测的特异性检测结果如表2所示：gRNA(SEQ ID NO：3)与其对应的SEQ ID NO：1反应为阳性，与其非对应的甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、肺炎支原体和冠状病毒(NL63，HKU1，229E，OC43)等8种临床样本反应，检测结果均无荧光值产生，为阴性。gRNA(SEQ ID NO：4)与其对应的SEQ ID NO：2反应为阳性，与其非对应的甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、肺炎支原体和冠状病毒(NL63，HKU1，229E，OC43)等8种临床样本反应，检测结果均无荧光值产生，为阴性。
表2.CRISPR-荧光法特异性检测结果
Figure BDA0002575110290000171
Figure BDA0002575110290000181
CRISPR-侧向层析法检测的特异性检测结果如图15和图16所示：gRNA(SEQ ID NO：3)与其对应的SEQ ID NO：1反应为阳性，与其非对应的甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、肺炎支原体和冠状病毒(NL63，HKU1，229E，OC43)等8种临床样本反应，检测结果检测线T均显色，为阴性(图15)。gRNA(SEQ ID NO：4)与其对应的SEQ ID NO：2反应为阳性，与其非对应的甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、肺炎支原体和冠状病毒(NL63，HKU1，229E，OC43)等8种临床样本反应，检测结果检测线T均显色，为阴性(图16)。
综上，上述结果表明该发明设计的新型冠状病毒的S基因和ORF1ab基因的gRNA具有良好的特异性。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
序列表
<110> 广州再生医学与健康广东省实验室，广州普世利华科技有限公司
<120> 用于检测SARS-CoV-2的gRNA、引物及试剂盒
<160> 13
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 633
<212> DNA
<213> SARS-CoV-2
<400> 1
gccactagtc tctagtcagt gtgttaatct tacaaccaga actcaattac cccctgcata 60
cactaattct ttcacacgtg gtgtttatta ccctgacaaa gttttcagat cctcagtttt 120
acattcaact caggacttgt tcttaccttt cttttccaat gttacttggt tccatgctat 180
acatgtctct gggaccaatg gtactaagag gtttgataac cctgtcctac catttaatga 240
tggtgtttat tttgcttcca ctgagaagtc taacataata agaggctgga tttttggtac 300
tactttagat tcgaagaccc agtccctact tattgttaat aacgctacta atgttgttat 360
taaagtctgt gaatttcaat tttgtaatga tccatttttg ggtgtttatt accacaaaaa 420
caacaaaagt tggatggaaa gtgagttcag agtttattct agtgcgaata attgcacttt 480
tgaatatgtc tctcagcctt ttcttatgga ccttgaagga aaacagggta atttcaaaaa 540
tcttagggaa tttgtgttta agaatattga tggttatttt aaaatatatt ctaagcacac 600
gcctattaat ttagtgcgtg atctccctca ggg 633
<210> 2
<211> 206
<212> DNA
<213> SARS-CoV-2
<400> 2
ccactagagg agctactgta gtaattggaa caagcaaatt ctatggtggt tggcacaaca 60
tgttaaaaac tgtttatagt gatgtagaaa accctcacct tatgggttgg gattatccta 120
aatgtgatag agccatgcct aacatgctta gaattatggc ctcacttgtt cttgctcgca 180
aacatacaac gtgttgtagc ttgtca 206
<210> 3
<211> 41
<212> RNA
<213> artificial sequence
<400> 3
uaauuucuac uaaguguaga uauaacccug uccuaccauu u 41
<210> 4
<211> 40
<212> RNA
<213> artificial sequence
<400> 4
uaauuucuac uaaguguaga uuagugaugu gaaaacccuc 40
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 5
ttttccaatg ttacttggtt ccatgctata 30
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 6
tattaacaat aagtagggac tgggtcttcg 30
<210> 7
<211> 31
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 7
ctgtagtaat tggaacaagc aaattctatg g 31
<210> 8
<211> 30
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 8
gcgagcaaga acaagtgagg ccataattct 30
<210> 9
<211> 21
<212> RNA
<213> artificial sequence
<400> 9
uaauuucuac uaaguguaga u 21
<210> 10
<211> 20
<212> RNA
<213> artificial sequence
<400> 10
auaacccugu ccuaccauuu 20
<210> 11
<211> 19
<212> RNA
<213> artificial sequence
<400> 11
uagugaugug aaaacccuc 19
<210> 12
<211> 385
<212> PRT
<213> artificial sequence
<400> 12
Met Ser Asn Lys Ala Leu Leu Lys Lys Leu Ile Lys Asn Ser Asn Ser
1 5 10 15
Gln Thr Ala Ser Val Leu Ser Glu Ser Asp Val Phe Asn Asn Ile Thr
20 25 30
Ile Thr Arg Thr Arg Val Pro Ile Leu Asn Leu Ala Leu Ser Gly Ala
35 40 45
Phe Asn Gly Gly Leu Thr Ser Gly Leu Thr Leu Phe Ala Gly Pro Ser
50 55 60
Lys His Phe Lys Ser Asn Leu Gly Leu Leu Thr Val Ala Ala Tyr Leu
65 70 75 80
Lys Thr Tyr Glu Asp Ala Val Cys Leu Phe Tyr Asp Ser Glu Lys Gly
85 90 95
Val Thr Lys Ser Tyr Leu Lys Ser Met Gly Val Asp Pro Asp Arg Val
100 105 110
Val Tyr Thr Arg Ile Thr Thr Val Glu Gln Leu Arg Asn Asp Val Val
115 120 125
Ser Gln Leu Asn Ala Leu Glu Arg Gly Asp Lys Val Ile Val Phe Val
130 135 140
Asp Ser Val Gly Asn Thr Ala Ser Lys Lys Glu Leu Ala Asp Ala Leu
145 150 155 160
Ser Asp Asn Asp Lys Gln Asp Met Thr Arg Ala Lys Ala Leu Lys Gly
165 170 175
Met Phe Arg Met Val Thr Pro Tyr Leu Ala Asp Leu Asp Ile Pro Met
180 185 190
Val Cys Ile Cys His Thr Tyr Asp Thr Gln Glu Met Tyr Ser Lys Lys
195 200 205
Val Ile Ser Gly Gly Thr Gly Leu Met Tyr Ser Ala Asp Thr Ala Ile
210 215 220
Ile Leu Gly Lys Gln Gln Val Lys Glu Gly Thr Glu Val Val Gly Tyr
225 230 235 240
Asp Phe Ile Met Asn Ile Glu Lys Ser Arg Phe Val Lys Glu Lys Ser
245 250 255
Lys Phe Pro Leu His Val Thr Tyr Glu Gly Gly Ile Ser Met Tyr Ser
260 265 270
Gly Leu Leu Asp Leu Ala Met Glu Met Asn Phe Val Gln Thr Val Thr
275 280 285
Lys Gly Trp Arg Asn Arg Ala Phe Leu Asn Thr Glu Thr Gly Glu Leu
290 295 300
Glu Val Glu Glu Lys Lys Trp Arg Glu Ser Glu Thr Asn Ser Val Glu
305 310 315 320
Phe Trp Arg Pro Leu Phe Thr His Gln Pro Phe Leu Lys Ala Ile Glu
325 330 335
Glu Lys Tyr Lys Ile Pro Asp Arg Glu Ile Ser Asp Gly Ser Ala Leu
340 345 350
Glu Asp Leu Tyr Ser Thr Asp Ser Ile Pro Asp Pro Asp Leu Asp Asp
355 360 365
Asp Asp Ile Pro Glu Ser Phe Asp Asp Ile Glu Glu Asn Asp Glu Ile
370 375 380
Leu
385
<210> 13
<211> 139
<212> PRT
<213> artificial sequence
<400> 13
Met Ser Leu Lys Leu Glu Asp Leu Gln Asn Glu Leu Glu Lys Asp Met
1 5 10 15
Leu Ile Asp Pro Leu Lys Leu Gln Ser Glu Ser Ala Asp Ile Pro Lys
20 25 30
Ile Trp Ala Lys Trp Leu Arg Tyr His Ser Asn Ala Lys Lys Lys Leu
35 40 45
Ile Gln Leu His Ala Lys Lys Glu Ala Asp Val Lys Asp Arg Met Leu
50 55 60
Tyr Tyr Thr Gly Arg His Asp Lys Glu Met Cys Glu Val Val Tyr Thr
65 70 75 80
Gly Thr Thr Glu Ile Lys Ile Ala Ile Ala Gly Asp Pro Lys Ile Val
85 90 95
Glu Thr Asn Lys Leu Ile Gln Tyr Tyr Asp Met Val Val Asp Phe Thr
100 105 110
Ser Lys Ala Leu Asp Ile Val Lys Asn Lys Gly Tyr Ser Ile Lys Asn
115 120 125
Met Leu Glu Ile Arg Lys Leu Glu Ser Gly Ala
130 135

Claims (10)

1.用于检测SARS-CoV-2的gRNA，所述gRNA包括a)与Cas核酸酶相互作用的框架核酸片段，以及b)与靶核酸结合的特异性核酸片段，所述特异性核酸片段包括SEQ ID NO：10和/或11。
2.用于扩增包含权利要求1所述靶核酸的核酸片段的引物，所述引物为SEQ ID NO：5和6所示引物对；和/或；SEQ ID NO：7和8所示引物对。
3.扩增组合产品，其包含权利要求2所述引物；
可选的，所述组合产品还含有等温核酸扩增所用试剂、阳性对照和阴性对照中的一种或多种；
可选的，所述等温核酸扩增所用试剂包括能结合单链核酸的重组酶、单链DNA结合蛋白、链置换DNA聚合酶、辅助蛋白、核酸外切酶III、反转录酶、ATP、ATP再生体系所用试剂、pH调节剂、dNTP、各种分子量分布的BSA和/或PEG、以及DTT以及水中的一种或多种；
所述辅助蛋白用于改变重组酶-引物复合体解离及重新结合的可逆反应过程，使反应向更有利于等温核酸扩增进行；
可选地，所述重组酶选自uvsX、RecA以及KX中的至少一种，所述KX的氨基酸序列如SEQID NO：12所示；
可选地，所述单链DNA结合蛋白为gp32；
可选地，所述链置换DNA聚合酶选自BSu DNA聚合酶和/或Sau DNA聚合酶；
可选地，所述辅助蛋白选自uvsY和/或KY，所述KY的氨基酸序列如SEQ ID NO：13所示；
可选地，所述ATP再生体系所用试剂选自镁离子、磷酸肌酸及其平衡离子、肌酸激酶、肌激酶、焦磷酸酶、蔗糖以及蔗糖磷酸化酶中的一种或多种；
可选地，所述等温核酸扩增所用试剂为冻干粉试剂或混合的液体试剂；
可选地，所述等温核酸扩增所用试剂主要活性组分在扩增核酸时的工作浓度在以下范围内：
KX 60～600ng/μL、KY蛋白16～192ng/μL、单链结合蛋白gp32 100～1000ng/μL、链置换DNA聚合酶3～100ng/μL、核酸外切酶III 30～200U、肌酸激酶0.1～0.8mg/ml、磷酸肌酸25～75mM、反转录酶200U、Tris缓冲液20～100mM、PEG 2.5％～10％、醋酸钾或醋酸钠0～150mM、dATP 1～5mM、dNTPs 150～600nM、DTT 1～12mM。
4.用于检测SARS-CoV-2的试剂盒，其包含权利要求1所述的gRNA；
可选地，其还包含所述靶核酸的扩增组合产品、Cas12a核酸酶和/或具有与Cas12a的旁路单链DNA切割活性类似的Cas核酸酶、单链DNA探针、阳性对照和用于CRISPR检测体系的缓冲液中的至少一种；
可选地，所述靶核酸的扩增组合产品用于执行如下任一项所述的方法：
重组酶聚合酶扩增技术、PCR扩增、NASBA等温扩增、环介导等温扩增、链置换扩增、解旋酶依赖性扩增和切口酶扩增反应；
可选地，所述靶核酸的扩增组合产品为权利要求2所述的引物，或权利要求3所述的扩增组合产品；
可选地，所述Cas12a核酸酶选自FnCas12a、AsCas12a、LbCas12a、Lb5Cas12a、HkCas12a、OsCas12a、TsCas12a、BbCas12a、BoCas12a和Lb4Cas12a中的至少一种；
可选地，所述与Cas核酸酶相互作用的框架核酸片段为SEQ ID NO：9所示；
可选地，所述具有与Cas12a的旁路单链DNA切割活性类似的Cas核酸酶为Cas12b核酸酶；
可选地，所述Cas12b核酸酶选自AacCas12b、Aac2Cas12b、AkCas12b、AmCas12b、AhCas12b和AcCas12b中的至少一种。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，所述单链DNA探针的5′端标记荧光发射基团，3′端标记淬灭基团。
6.根据权利要求4所述的试剂盒，所述单链DNA探针的两端分别标记有不同的标记物，分别为第一标记物和第二标记物；
可选地，所述单链DNA探针上还标记有与所述标记物不同的信号物质，且所述信号物质上还标记有所述第二标记物的抗体，如此，当所述单链DNA探针被CRISPR检测体系切割时，所述信号物质与所述第二标记物位于同一核酸片段。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，所述试剂盒还包含试剂条，所述试纸条包括样品垫、反应膜和吸收垫，所述反应膜上设置有检测区和质检区；
其中：
所述检测区固定包被有针对所述第一标记物的第一抗标记物；
所述质检区固定包被有针对所述第二标记物的抗体的二抗；
所述第一标记物与所述第一抗标记物能够形成标记物-抗标记物复合物，且所述第一抗标记物与所述第二标记物的抗体不同。
8.根据权利要求6所述的试剂盒，所述信号物质选自荧光团、比色标记、量子点、胶体金、生物素、用于拉曼衍射成像的炔烃基团、用于click反应的环烯烃、用于聚合物标记的引发基团、多肽/蛋白分子、LNA/PNA、非天然氨基酸及其类似物、非天然核酸及其类似物和纳米结构；
所述纳米结构包括无机纳米颗粒、NV-center、聚集/组装诱导发光分子、稀土离子配体分子以及多金属氧簇。
9.权利要求1所述的gRNA、权利要求2所述的引物、权利要求3所述的扩增组合产品、或权利要求4～8任一项所述的试剂盒在检测SARS-CoV-2中的非诊断用途。
10.载体系统，其包含一种或多种载体，所述载体包含：第一调控元件和第二调控元件，所述第一调控元件可操作地连接至编码Cas核酸酶的核苷酸片段，所述第二调控元件可操作地连接至编码权利要求1所述gRNA的核苷酸片段。
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