CN111363847A

CN111363847A - 基于CRISPR技术的2019-nCoV快速检测引物组及其用途

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Publication number: CN111363847A
Application number: CN202010088777.3A
Authority: CN
Inventors: 许腾; 曾伟奇; 杨敏玲; 陈文景; 徐学中; 李永军; 王小锐; 苏杭
Original assignee: Guangzhou Weiyuan Medical Equipment Co Ltd; Guangzhou Weiyuan Medical Laboratory Co Ltd; Shenzhen Weiyuan Medical Technology Co Ltd; Guangzhou Vision Gene Technology Co ltd
Current assignee: Guangzhou Vision Gene Technology Co ltd; Guangzhou Weiyuan Medical Equipment Co ltd; Guangzhou Weiyuan Medical Laboratory Co ltd; Shenzhen Weiyuan Medical Technology Co ltd
Priority date: 2020-02-12
Filing date: 2020-02-12
Publication date: 2020-07-03
Anticipated expiration: 2040-02-12
Also published as: CN111363847B

Abstract

本发明涉及一种基于CRISPR技术的2019‑nCoV快速检测引物组及其用途，属于CRISPR技术的基因检测技术领域。该引物组包括：Orf1ab基因扩增引物对和Orf1ab基因crRNA，N基因扩增引物对和N基因crRNA。采用该引物组以CRISPR技术检测2019‑nCoV，缩短了2019‑nCoV的检测时间，可在40‑60min内完成检测。本发明通过筛选得到了特定的序列组合作为引物组进行检测，具有灵敏性高、特异性强的优势，其检测限可达7.5copies。并且采用该引物组对2019‑nCoV进行CRISPR检测，摆脱了对qPCR仪等复杂变温扩增仪器的依赖，使得CRISPR‑Cas技术在2019‑nCoV的即时诊断方面具有广阔的应用前景。

Description

基于CRISPR技术的2019-nCoV快速检测引物组及其用途

技术领域

本发明涉及基于CRISPR技术的基因检测技术领域，特别是涉及一种基于CRISPR技术的2019-nCoV快速检测引物组及其用途。

背景技术

冠状病毒是一大类RNA病毒，目前已知的可感染人的冠状病毒共七种。其中四种冠状病毒，包括Human coronavirus 229E，Human coronavirus OC43，Human coronavirusNL63，Human coronavirus HKU1在人群中较为常见，但致病性较低，一般仅引起类似普通感冒的轻微呼吸道综合症状。另外两种严重急性呼吸综合征病毒(SARS)和中东呼吸综合征冠状病毒(MERS) 可引起严重的呼吸系统疾病。2019-nCoV是目前发现的第七种可感染人的冠状病毒。

2019-nCoV是一种类似于MERS和SARS的β冠状病毒，它们都起源于蝙蝠。2019-nCoV的潜伏期为1～14天，主要症状为发热，多为>38℃的高烧，少数为>37.5℃的低烧，个别病例甚至无发热症状。在最初患病住院的40多人当中，病死率高达15％，重症监护的比例超过30％，都已经超过了SARS的水平。但是如果综合考虑更多症状轻微的患者的话，综合病死率目前在3％左右，低于SARS(10％)和MERS(35％)的水平。

考虑到2019-nCoV有较强的感染与传播能力，如何实现对其快速准确的诊断，从而对感染病患实现有效的隔离防治，保障公共卫生安全是目前最为重要紧迫的事情。因此，一种针对2019-nCoV有效的快速、灵敏、准确的检测方法急需建立。

重组酶-聚合酶扩增(RPA)是一种快速兴起的恒温扩增技术，通过能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和具有链置换功能的DNA聚合酶，在室温(最适反应温度为37℃～42℃)下即可获得可检测级别的扩增核酸，并且通过加入逆转录酶(RT酶)，可以实现对模板RNA的扩增。但是，原理上其单级扩增反应的本质并未改变，相较于目前市场上多数的qPCR检测方式，并无实质性的灵敏度提升。

发明内容

基于此，有必要针对上述问题，提供一种基于CRISPR技术的2019-nCoV快速检测引物组及其用途，采用该引物组以CRISPR技术检测2019-nCoV，能够针对2019-nCoV传播广，传播快的特点，进行特异、灵敏、简易、快速的现场检测，有助于临床诊断。

一种基于CRISPR技术的2019-nCoV快速检测引物组，包括：Orf1ab基因扩增引物对和 Orf1ab基因crRNA，N基因扩增引物对和N基因crRNA；所述Orf1ab基因扩增引物对和N 基因扩增引物对分别用于扩增2019-nCoV如SEQ ID NO.1所示Orf1ab基因序列和SEQ ID NO.2所示N基因序列；所述Orf1ab基因crRNA和N基因crRNA均包括锚定序列和向导序列，锚定序列与Cas蛋白特异性识别，Orf1ab基因crRNA的向导序列与所述SEQ ID NO.1 序列中的靶向序列片段相匹配，N基因crRNA的向导序列与所述SEQ ID NO.2序列中的靶向序列片段相匹配。

可以理解的，上述SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2序列，以DNA序列为基础，用以表示与该序列匹配对应的RNA序列，及该上述序列的互补序列等，均与上述SEQ ID NO.1和SEQID NO.2序列等同。

上述引物组可应用于CRISPR-Cas系统中，其检测原理为：Cas蛋白在向导RNA的引导下，靶向目标序列后启动其自身的“附带切割”活性，如果同时在体系中加入荧光报告分子(常用的报告分子是一段寡核苷酸序列，一端带有一个发光基团，一端带有一个淬灭基团，正常情况下由于淬灭作用，完整的报告分子不会被检测到，当寡核苷酸分子被水解后，游离的荧光信号可以被检测到)，借用Cas酶附带切割活性，可以实现待检序列信息向荧光信号的转化。并且通过RPA与CRISPR-Cas的偶联，能够实现“序列扩增”(RPA完成)加上“酶促级联” (Cas酶完成)的两级放大，从而超越qPCR这种单级扩增的灵敏度。

此外，因为RPA扩增方式无需复杂的温度改变，从而摆脱了对qPCR仪等复杂变温扩增仪器的依赖，使得CRISPR-Cas技术在2019-nCoV的即时诊断方面具有广阔的应用前景，最快可实现40分钟检测出结果，大大缩短了检测时间，能避免更大范围的疫病传染，有着巨大的应用优势。

本发明人针对2019-nCoV的序列进行分析，认为Orf1ab基因和N基因为2019-nCoV保守的基因，可根据该保守序列进行设计，从而将CRISPR技术应用于快速检测2019-nCoV中，与传统检测方法相比，缩短了2019-nCoV的检测时间，可在40min内完成检测。

在其中一个实施例中，所述Orf1ab基因扩增引物对选自：SEQ ID NO.3-4所示序列的引物对1，SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.5所示序列的引物对2，SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6所示序列的引物对3，SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.7所示序列的引物对4，SEQ ID NO.3和 SEQID NO.8所示序列的引物对5，SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.4所示序列的引物对6；

所述Orf1ab基因crRNA选自：SEQ ID NO.10-12所示序列；

所述N基因扩增引物对选自：SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示序列的引物对7，SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.15所示序列的引物对8，SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17所示序列的引物对9，SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.14所示序列的引物对10，SEQ ID NO.16和SEQ IDNO.18所示序列的引物对11，SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.14所示序列的引物对12；

所述N基因crRNA选自：SEQ ID NO.20-22所示序列。

在CRISPR检测技术中，crRNA和扩增引物的组合性能对检测效果影响非常大，crRNA 和扩增引物设计时需要考虑引物常规设计要点的同时，还要考虑引物扩增片段范围是否有合适的可用于crRNA设计的序列，目前常用的引物设计指引难以根据常规参数要求设计出较好的crRNA和扩增引物组合，更多时候需要在经验和实验尝试的基础上进行手动调整设计。发明人在前期研究基础上，经过多番筛选和比对，发现以上述crRNA和扩增引物对组合，具有较好的检测效果。

在其中一个实施例中，所述Orf1ab基因扩增引物对选自：SEQ ID NO.3-4所示序列的引物对1；

所述Orf1ab基因crRNA选自：SEQ ID NO.10所示序列；

所述N基因扩增引物对选自：SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17所示序列的引物对9；

所述N基因crRNA选自：SEQ ID NO.21所示序列。

以上述crRNA和扩增引物对组合，具有最佳检测效果。

在其中一个实施例中，所述Orf1ab基因扩增引物对和N基因扩增引物对的工作浓度为 0.1～0.6μmol/L，所述Orf1ab基因crRNA和N基因crRNA的工作浓度为20～200nmol/L。本发明人在实践中发现，在使用上述引物组进行2019-nCoV检测时，使用的引物浓度对检测效果有一定的影响，如引物浓度不适合，会出现灵敏度降低或特异性不好的问题，采用上述工作浓度的引物组具有较好的灵敏度和特异性。

可以理解的，上述工作浓度指引物序列在反应体系中的浓度，而对于该引物组在制备、保存和运输中的浓度，可根据具体要求调整，仅需确保在反应体系中保持上述浓度，即可达到较好的检测效果。

本发明还公开了上述的基于CRISPR技术的2019-nCoV快速检测引物组在开发和/或制备具有2019-nCoV感染诊断和/或预后评估用途的产品中的应用。

可以理解的，上述产品可以是试剂盒，也可以是一体化检测设备等。

本发明还公开了一种用于快速检测2019-nCoV的试剂盒，包括上述的基于CRISPR技术的2019-nCoV快速检测引物组。

在其中一个实施例中，该试剂盒还包括逆转录酶，LwCas13a蛋白，信号报告探针和RNA 聚合酶。

上述信号报告探针又称信号报告试剂，其特点为在序列的5’标记荧光报告基团，3’标记淬灭基团。信号报告试剂的阳性信号有多种选择，包括荧光、吸光值、显色反应等，但信号报告的条件都是基于Cas蛋白的酶活性。具体信号报告探针的选择可根据其它试剂进行调整选择。

本发明还公开了一种非诊断治疗目的2019-nCoV快速检测方法，包括以下步骤：

样本提取：取待测样本，提取其中基因组；

一步检测：向上述提取得到的待测样本基因组中加入上述的Orf1ab基因扩增引物对和N 基因扩增引物对，逆转录酶、上述的Orf1ab基因crRNA和N基因crRNA、LwCas13a蛋白、信号报告探针、RNA聚合酶和信号报告探针，同时进行RT-RPA扩增和CRISPR反应检测，读取检测信号，即得。

上述检测步骤均在恒温条件完成，无需复杂的温度改变，从而摆脱了对Q-PCR仪等精密仪器的依赖，具有较为广阔的应用前景。

在其中一个实施例中，所述一步检测的条件为：恒温42±1℃反应40-60min。

可以理解的，上述荧光信号的读取，可使用具体FAM荧光读取功能的荧光检测仪，可选 Thermo Fisher Qubit^TM 4荧光计，荧光PCR仪，酶标仪等。

如使用Thermo Fisher Qubit^TM 4荧光计，42℃反应40-60min后，往每管加入70μL1×TE Buffer，振荡混匀后分别在Thermo Fisher Qubit^TM 4荧光计上读取荧光，在“Fluorometer”模式下，选择蓝光(Blue 470nm)，读取并记录样品和阴阳性对照的绿光发射值。

使用荧光PCR仪，如(ABI 7500(Thermo Fisher)，ABI ViiA7Dx(Thermo Fisher)，SLAN-96P(上海宏石)或酶标仪(BioTek)时，反应条件和时间为：42℃反应40-60min，每1min读取FAM荧光值。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明的一种基于CRISPR技术的2019-nCoV快速检测引物组，采用该引物组以CRISPR 技术检测2019-nCoV，缩短了2019-nCoV的检测时间，可在40-60min内完成检测。并且，本发明通过筛选得到了特定的序列组合作为引物组进行检测，同时对检测条件进行了筛选，通过该引物组合条件检测2019-nCoV，具有灵敏性高、特异性强的优势，其检测限可以达7.5 copies，且在特异性实验中仅有2019-nCoVDNA能够被特异性检出，符合临床检测要求。

并且，采用该引物组对2019-nCoV进行CRISPR检测，无需复杂的温度改变，从而摆脱了对qPCR仪等复杂变温扩增仪器的依赖，使得CRISPR-Cas技术在2019-nCoV的即时诊断方面具有广阔的应用前景，能够快速、灵敏、准确检出2019-nCoV。

附图说明

图1为实施例2中Orf1ab基因靶点引物筛选结果图；

图2为实施例2中N基因靶点引物筛选结果图；

图3为实施例2中Orf1ab基因靶点crRNA的筛选结果图；

图4为实施例2中N基因靶点crRNA的筛选结果图；

图5为实施例3中Orf1ab基因靶点灵敏度检测结果；

图6为实施例3中N基因靶点灵敏度检测结果；

图7为实施例4中Orf1ab基因靶点特异性检测结果；

图8为实施例4中N基因靶点特异性检测结果。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

以下实施例所涉及材料及仪器如下：

1、实验材料：

引物及插入了目标序列的质粒载体由艾基生物技术有限公司合成，信号报告探针由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，向导RNA(crRNA)由金斯瑞生物科技有限公司合成， LwCas13a蛋白由金斯瑞生物科技有限公司表达纯化。RPA酶预混液购自杭州众测生物科技有限公司，

ⅡReverse Transcriptase第二代耐热逆转录酶购自上海翊圣生物科技有限公司，其他生化试剂均为进口分装或国产分析纯。

2、实验仪器

金属浴，离心机，涡旋混合仪，ABI 7500荧光检测仪器等。

实施例1

2019-nCoVCRISPR检测引物序列的设计。

1、靶标序列选定。

新型冠状病毒(2019-nCoV)是新发现的一个冠状病毒，发明人针对2019-nCoV的序列进行分析，认为Orf1ab基因和N基因为冠状病毒保守的基因，可根据该保守序列进行设计, 根据靶点Orf1ab基因和N基因序列区域，设计crRNA和RPA扩增引物，并测试该检测方法的灵敏度。

本实施例的待检样本为分别插入了一段2019-nCoV所选靶点序列区域的质粒(艾基生物技术有限公司合成)，其中。Orf1ab基因插入的序列如下：

5’-ATGCCTTCAAACTCAACATTAAATTGTTGGGTGTTGGTGGCAAACCTTGTATCAAAGT AGCCACTGTACAGTCTAAAATGTCAGATGTAAAGTGCACATCAGTAGTCTTACTCTCAGT TTTGCAACAACTCAGAGTAGAATCATCATCTAAATTGTGGGCTCAATGTGTCCAGTTACA CAATGACATTCTCTTAGCTAAAGATACTACTGAAGCCTTTGAAAAAATGGTTTCACTACT TTCTGTTTTGCTTTCCATGCAGGGTGCTGTAGACATAAACAAGCTTTGTGAAGAAATGCT GGACAACAGGGCAACCTTACAAGCTATAGCCTCAGAGTTTAGTTCCCTTCCATCATATGC AGCTTTTGCTACTGCTCAAGAAGCTTATGAGCAGGCTGTTGCTAATGGTGATTCTGAAGT TG-3’(SEQ ID NO.1)。

N基因插入的序列为：

5’-GAAGAGTCACAGTTTGCTGTTTCTTCTGTCTCTGCGGTAAGGCTTGAGTTTCATCAGC CTTCTTCTTTTTGTCCTTTTTAGGCTCTGTTGGTGGGAATGTTTTGTATGCGTCAATATGCT TATTCAGCAAAATGACTTGATCTTTGAAATTTGGATCTTTGTCATCCAATTTGATGGCACC TGTGTAGGTCAACCACGTTCCCGAAGGTGTGACTTCCATGCCAATGCGCGACATTCCGA AGAACGCTGAAGCGCTGGGGGCAAATTGTGCAATTTGCGGCCAATGTTTGTAATCAGTT CCTTGTCTGATTAGTTCCTGGTCCCCAAAATTTCCTTGGGTTTGTTCTGGACCACGTCTG CCGAAAGCTTGTGTTACATTGTATGCTTTAGTGGCAGTACG-3’(SEQ ID NO.2)。

2、扩增引物对和crRNA的设计。

实验中需要针对两个不同的基因分别设计多对RPA引物扩增靶标序列并进行筛选优化。所设计的引物扩增产物长度介于110～260bp，分别为Orf1ab基因设计上游扩增引物6条，下游扩增引物6条；N基因设计上游扩增引物6条，下游扩增引物6条。引物序列如下表1.Orf1ab基因的crRNA和扩增引物对

注：上表中F表示上游引物，R表示下游引物表2.N基因的crRNA和扩增引物对

注：上表中F表示上游引物，R表示下游引物

实施例2

1、RPA扩增引物的扩增效率筛选。

为了筛选Cas13a的RPA扩增引物，以上述实施例1中插入了上述2019-nCoV两个靶点 Orf1ab基因和N基因的基因序列的质粒作为标准待检样本，按照常规方法提取得到标准待检样本基因，分别针对靶点Orf1ab基因的引物(上表1中所示的引物)两两组合并配合Orf1ab-crRNA-1，针对靶点N基因的引物(上表2中所示的引物)两两组合，并配合N-crRNA-1进行了检测筛选，其中模板浓度为1000copies/μl。

1.1方法。

反应体系：上游引物(0.1-0.6μM)0.5-2.5μL，下游引物(0.1-0.6μM)0.5-2.5μL，RPA酶预混液21μL，醋酸镁(10-20mM)0.5-2μL，信号报告探针(50-400nM)1μl，NTP混合液(0.2-6mM)1-10μL，T7 RNA聚合酶预混液(NEB公司)1μl，LwCas13a蛋白(1-5μM)1μL， crRNA(浓度20～200nmol/L)1μL，RNA酶抑制剂(NEB公司)0.5μl，待测样本基因组2-5μL, 用灭菌的去离子水补齐至30μl。。

上述RPA酶预混液中含有：磷酸肌酸(浓度20-80mM)、肌酸激酶(浓度50-150mM)、dNTPs(浓度100-300μM)、ATP(浓度20-80mM)、DTT(浓度1-10mM)、醋酸钾(浓度50-200mM)、重组酶uxsX(50-300ng/μL)、uxsY(10-100ng/μL)、单链结合蛋白(200-1000ng/μL)、Bsu聚合酶(10-100ng/μL)。

反应条件：42℃反应30-60min，每1min读取FAM荧光值。

本实施例中阳性信号为荧光信号(选用来自生工生物工程(上海)股份有限公司的RNase Alert)，信号报告探针的序列特点为带有荧光基团和淬灭基团的RNA，当Cas13a蛋白在crRNA 的帮助下，识别具有靶向序列的靶向RNA后，被激活的Cas13a酶可以降解该带有信号的信号报告探针，从而释放荧光信号，实现检测。

结果判读：得到的累积荧光值作为信号强度，按照以下标准进行分析判定：

阴性判断标准：荧光量小于或等于阴性对照荧光量的3倍。

阳性判断标准：荧光量大于阴性对照荧光量的3倍。

其中，阴性对照组为每个实验组对应设置的以加入同时以DEPC处理水(生工生物工程 (上海)股份有限公司)的阴性信号组。

1.2结果。

本实施例使用ABI7500荧光检测仪，分别针对靶点Orf1ab基因的引物(上表1中引物所示的引物)和N基因的引物(上表2中引物所示的引物)两两组合进行了检测筛选，最终每个基因靶点分别选出一组扩增效率好的引物对。

筛选结果如图1和图2所示，图中横坐标为不同引物组合，纵坐标为Fold-change值(即 Fold-change值＝临床样本的荧光信号值/阴性对照的荧光信号值)。

结果表示，Orf1ab基因采用引物对F1/R1具有最佳的扩增效率，即SEQ ID NO.3-4所示序列的引物对1，N基因采用引物对F3/R2具有最佳的扩增效率，即SEQ ID NO.16和SEQID NO.17所示序列的引物对9。

2、crRNA优化

2.1方法

本实验中从两个基因靶标序列内分别设计多条crRNA进行优化、筛选。根据新型冠状病毒Orf1ab基因包括表1所列多条特异性crRNA并以最佳引物对F1/R1(SEQ ID NO.3-4所示序列的引物对1)配合RPA筛选最佳crRNA。根据N基因包括表2所列多条特异性crRNA 并以最佳引物对F3/R2(SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17所示序列的引物对9)配合RPA筛选最佳crRNA。

具体操作参照上述方法进行。

2.2结果。

使用ABI7500荧光检测仪进行检测，结果如图3和图4所示，图中纵坐标为荧光信号强度，显示Orf1ab-crRNA-1和N-crRNA-2的信号最理想。

本实施例中，以插入了新型冠状病毒基因的质粒DNA为模板对不同引物及crRNA进行了检测筛选，最终针对不同的基因靶点分别选出一组扩增效率高，特异性强的引物与crRNA 组合，用于新型冠状病毒的检测。序列分别为：

Orf1ab基因：SEQ ID NO:10所示的Orf1ab-crRNA-1、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的RPA扩增引物对F1/R1；

N基因：SEQ ID NO:21所示的N-crRNA-2、SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17所示的RPA扩增引物对F3/R2。

实施例3

本实施例基于RPA扩增、T7体外转录和Cas13a进行灵敏度检测。

以分别带有nCoV-Orf1ab基因保守序列和nCoV-N基因保守序列的质粒为模板，并计算稀释为3000copies/μL、300copies/μL、30copies/μL、3copies/μL、1copy/μL、0.4copy/μL、 0.16copy/μL共7个梯度作为灵敏度检测的模板，每反应加入模板量为2.5μL。

1、方法。

参照上述实施例2中的方法，分别对nCoV-Orf1ab靶点和nCoV-N靶点进行灵敏度分析，实验设阴性对照。

反应条件：42℃反应40-60min，每1min读取FAM荧光值。

参照上述实施例2中结果判读方法进行结果判读。

2、结果。

使用ABI7500荧光检测仪，对扩增产物进行荧光检测。结果如图5-6所示，图中纵坐标为Fold-change值(即Fold-change值＝临床样本的荧光信号值/阴性对照的荧光信号值，nCoV-Orf1ab靶点和nCoV-N靶点体系的检测限均可达到单个拷贝每反应体系。

实施例4

本实施例基于RPA扩增、T7体外转录联合Cas13a，检测2019-nCoV的特异性验证。

以2019-nCoV、嗜肺军团菌、肺炎克雷伯菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、腺病毒3型、肺炎支原体、肺炎衣原体、副流感1型、呼吸道合胞病毒A型、百日咳杆菌、冠状病毒OC43、冠状病毒NL63、冠状病毒HKU-1、冠状病毒229E、禽流感病毒H7N9、禽流感病毒H5N1、乙型流感病毒(Victoria系)、甲型H1N1(2009)流感病毒、甲型H3N2流感病毒、EB病毒、 MERS假病毒、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞杆菌、缓症性链球菌、化脓性链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、粪肠球菌，为检测模板基因组各样本稀释至10⁴copies/μL，以人的基因组RNA作为阴性质控，分别测试Orf1ab基因靶点和N基因靶点体系的特异性。

1、方法。

反应体系：逆转录酶(20U-100U)，上游引物(0.1-0.6μM)0.5-2.5μL，下游引物(0.1-0.6μM) 0.5-2.5μL，RPA酶预混液21μL，醋酸镁(10-20mM)0.5-2μL，信号报告探针(50-400nM)1μl， NTP混合液(0.2-6mM)1-10μL，T7 RNA聚合酶预混液(NEB公司)1μl，LwCas13a蛋白 (1-5μM)1μL，crRNA(浓度20～200nmol/L)1μL，RNA酶抑制剂(NEB公司)0.5μl，待测样本基因组2-5μL,用灭菌的去离子水补齐至30μl。

总体积为30μL,其中使用引物1，反应程序为42℃，30min。

参照上述实施例2中结果判读方法进行结果判读。

2、结果分析。

使用ABI 7500荧光检测仪，对扩增产物进行荧光检测。实验结果如图7和图8所示，纵坐标为Fold-change值(即Fold-change值＝临床样本的荧光信号值/阴性对照的荧光信号值)，其中NC表示阴性样本，PC表示阳性样本(即2019-nCoV)，结果显示只有2019-nCoV能够被特异性检出，其它样本没有明显信号。

表明本实施例基于RPA扩增、T7体外转录联合Cas13a检测2019-nCoV具有较好的特异性。

实施例5

一、一种用于快速检测2019-nCoV的试剂盒，包括：

(1)Orf1ab基因靶点引物及crRNA、N基因靶点引物及crRNA，具体如下：

nCoV-Orf1ab-crRNA(SEQ ID NO.10)：

5’-GGGGAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACAAACUCUGAGGCUAUAGCUUGUAAGGUU-3’，浓度为1μM；

nCoV-ORF1ab正向引物(SEQ ID NO.3)：

5’-TAATACGACTCACTATAGGGACATAAACAAGCTTTGTGAAGAAATGCTGGAC-3’，浓度为10μM；

nCoV-ORF1ab反向引物(SEQ ID NO.4)：

5’-TTGAGCAGTAGCAAAAGCTGCATATGATGGAAGG-3’，浓度为10μM；

nCoV-N-crRNA(SEQ ID NO.21)：

5’-GGGGAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACACGUGGUUGACCUACACAGCUGCCAUCA-3’，浓度为1μM；

nCoV-N正向引物(SEQ ID NO.16)：

5’-TAATACGACTCACTATAGGGCGTCAATATGCTTATTCAGCAAAATGACTTGA-3’，浓度为10μM；

nCoV-N反向引物(SEQ ID NO.17)：

5’-TGCCCCCAGCGCTTCAGCGTTCTTCGGAATGTCG-3’，浓度为10μM；

(2)RPA酶预混液：磷酸肌酸(浓度20-80mM)、肌酸激酶(浓度50-150mM)、dNTPs(浓度100-300μM)、ATP(浓度20-80mM)、DTT(浓度1-10mM)、醋酸钾(浓度50-200mM)、重组酶uxsX(50-300ng/μL)、uxsY(10-100ng/μL)、单链结合蛋白(200-1000ng/μL)、Bsu聚合酶 (10-100ng/μL)；

(3)醋酸镁：浓度280mM。

(4)LwCas13a蛋白：浓度为1-5μM；

(5)T7 RNAPolymerase mix：市售；

(6)NTP混合液1-10μL：浓度为每种NTP 20mM；

(7)信号报告探针：5’6-FAM-UUUUUUUUUUUUUU-BHQ1-3’，浓度为10μM；

(8)逆转录酶：市售，浓度为200U/μL。

(9)RNA酶抑制剂：市售，浓度为40U/μL。

可以理解的，上述试剂及浓度也可根据运输、储存等需要进行调整，使用时根据检测要求调整。

二、采用上述试剂盒进行2019-nCoV的检测方法

(1)检测样本的基因组提取。

检测样本可以是培养的病毒株，也可以是临床样本(主要包括血液样本、上呼吸道样本、下呼吸道样本、肺泡灌洗液、痰液、咽拭子、鼻咽拭子等)或是其它科研实验样本。

(2)RPA扩增和CRISPR反应检测。

参照上述实施例4中的方法。

(3)结果分析。

使用荧光检测仪进行检测，将得到的累积荧光值作为信号强度，按照以下标准进行分析判定：

阴性判断标准：荧光量小于或等于阴性对照荧光量的3倍。

阳性判断标准：荧光量大于阴性对照荧光量的3倍。

当样本两靶点Orf1ab基因和N基因均为阳性，则该样品判定为2019-nCoV阳性。

实施例6

以上述实施例5的试剂盒进行临床样品的检测。

以上述实施例5中的试剂盒检测112例临床样本，上述样本中，包括痰液咽拭子，鼻咽拭子，肺泡灌洗液，血液等多种样本类型，按照不同样本类型的核酸提取方式，提取核酸后分别进行本检测方法和RT-PCR方法(外购试剂盒：说明书显示其最低检测限为1000copies/mL)检测。

结果如下表所示。

表3不同方法对临床样品检测结果

注：上标a表示检测到两靶点Orf1ab基因和N基因均为阳性。

上述样本检测中，两例样本初检仅检测出一个靶点是阳性的，随后通过复核确认两个靶点均为阳性，结果统计为阳性。

上述结果显示，有4例样本按照本发明方法检测结果为阳性，而RT-PCR结果为阴性，经mNGS复核，此4例样本检测结果为阳性，与本案方法检测结果一致。

上述结果说明本发明检测方法通过RPA与CRISPR-Cas的偶联，能够实现“序列扩增”加上“酶促级联”的两级放大，从而超越qPCR这种单级扩增的灵敏度。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 广州微远基因科技有限公司

广州微远医疗器械有限公司

广州微远医学检验实验室有限公司

深圳微远医疗科技有限公司

<120> 基于CRISPR技术的2019-nCoV快速检测引物组及其用途

<160> 32

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 420

<212> DNA/RNA

<213> 2019-nCoV(2019-nCoV)

<400> 1

atgccttcaa actcaacatt aaattgttgg gtgttggtgg caaaccttgt atcaaagtag 60

ccactgtaca gtctaaaatg tcagatgtaa agtgcacatc agtagtctta ctctcagttt 120

tgcaacaact cagagtagaa tcatcatcta aattgtgggc tcaatgtgtc cagttacaca 180

atgacattct cttagctaaa gatactactg aagcctttga aaaaatggtt tcactacttt 240

ctgttttgct ttccatgcag ggtgctgtag acataaacaa gctttgtgaa gaaatgctgg 300

acaacagggc aaccttacaa gctatagcct cagagtttag ttcccttcca tcatatgcag 360

cttttgctac tgctcaagaa gcttatgagc aggctgttgc taatggtgat tctgaagttg 420

<210> 2

<211> 400

<212> DNA/RNA

<213> 2019-nCoV(2019-nCoV)

<400> 2

gaagagtcac agtttgctgt ttcttctgtc tctgcggtaa ggcttgagtt tcatcagcct 60

tcttcttttt gtccttttta ggctctgttg gtgggaatgt tttgtatgcg tcaatatgct 120

tattcagcaa aatgacttga tctttgaaat ttggatcttt gtcatccaat ttgatggcac 180

ctgtgtaggt caaccacgtt cccgaaggtg tgacttccat gccaatgcgc gacattccga 240

agaacgctga agcgctgggg gcaaattgtg caatttgcgg ccaatgtttg taatcagttc 300

cttgtctgat tagttcctgg tccccaaaat ttccttgggt ttgttctgga ccacgtctgc 360

cgaaagcttg tgttacattg tatgctttag tggcagtacg 400

<210> 3

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

taatacgact cactataggg acataaacaa gctttgtgaa gaaatgctgg ac 52

<210> 4

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ttgagcagta gcaaaagctg catatgatgg aagg 34

<210> 5

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tgctcataag cttcttgagc agtagcaaaa gct 33

<210> 6

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

agcctgctca taagcttctt gagcagtagc aa 32

<210> 7

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

aacagcctgc tcataagctt cttgagcagt agcaa 35

<210> 8

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

aacagcctgc tcataagctt cttgagcagt a 31

<210> 9

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

taatacgact cactataggg aaacaagctt tgtgaagaaa tgctggacaa ca 52

<210> 10

<211> 67

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaaca aacucugagg cuauagcuug 60

uaagguu 67

<210> 11

<211> 67

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacg aacuaaacuc ugaggcuaua 60

gcuugua 67

<210> 12

<211> 66

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacc uauagcuugu aagguugccc 60

uguugu 66

<210> 13

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

taatacgact cactataggg gcttattcag caaaatgact tgatctttga aatt 54

<210> 14

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

caaattgcac aatttgcccc cagcgcttca gcg 33

<210> 15

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

cactaaagca tacaatgtaa cacaagcttt cggc 34

<210> 16

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

taatacgact cactataggg cgtcaatatg cttattcagc aaaatgactt ga 52

<210> 17

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

tgcccccagc gcttcagcgt tcttcggaat gtcg 34

<210> 18

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

gcaaattgca caatttgccc ccagcgcttc agcg 34

<210> 19

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

taatacgact cactataggg ctctgcggta aggcttgagt ttcatcagcc ttc 53

<210> 20

<211> 67

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaaca ggugccauca aauuggauga 60

caaagau 67

<210> 21

<211> 67

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaaca cgugguugac cuacacagcu 60

gccauca 67

<210> 22

<211> 67

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacg aagucacacc uucgggaacg 60

ugguuga 67

<210> 23

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

taatacgact cactataggg gcagggtgct gtagacataa acaagctttg t 51

<210> 24

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

taatacgact cactataggg atgcagggtg ctgtagacat aaacaagctt tgt 53

<210> 25

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

taatacgact cactataggg cattctctta gctaaagata ctactgaagc c 51

<210> 26

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

taatacgact cactataggg tgtgtccagt tacacaatga cattctctta gct 53

<210> 27

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

accattagca acagcctgct cataagcttc ttga 34

<210> 28

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

taatacgact cactataggg atgcttattc agcaaaatga cttgatcttt gaaa 54

<210> 29

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

taatacgact cactataggg tatgcgtcaa tatgcttatt cagcaaaatg ac 52

<210> 30

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

taatacgact cactataggg ttgctgtttc ttctgtctct gcggtaaggc tt 52

<210> 31

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

cagcgcttca gcgttcttcg gaatgtcgcg cat 33

<210> 32

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

gcacaatttg cccccagcgc ttcagcgttc ttc 33

Claims

1.一种基于CRISPR技术的2019-nCoV快速检测引物组，其特征在于，包括：Orf1ab基因扩增引物对和Orf1ab基因crRNA，N基因扩增引物对和N基因crRNA；所述Orf1ab基因扩增引物对和N基因扩增引物对分别用于扩增2019-nCoV如SEQ ID NO.1所示Orf1ab基因序列和SEQ ID NO.2所示N基因序列；所述Orf1ab基因crRNA和N基因crRNA均包括锚定序列和向导序列，锚定序列与Cas蛋白特异性识别，Orf1ab基因crRNA的向导序列与所述SEQ ID NO.1序列中的靶向序列片段相匹配，N基因crRNA的向导序列与所述SEQ ID NO.2序列中的靶向序列片段相匹配。

2.根据权利要求1所述的基于CRISPR技术的2019-nCoV快速检测引物组，其特征在于，所述Orf1ab基因扩增引物对选自：SEQ ID NO.3-4所示序列的引物对1，SEQ ID NO.3和SEQID NO.5所示序列的引物对2，SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6所示序列的引物对3，SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.7所示序列的引物对4，SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.8所示序列的引物对5，SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.4所示序列的引物对6；

所述Orf1ab基因crRNA选自：SEQ ID NO.10-12所示序列；

所述N基因扩增引物对选自：SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示序列的引物对7，SEQID NO.13和SEQ ID NO.15所示序列的引物对8，SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17所示序列的引物对9，SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.14所示序列的引物对10，SEQ ID NO.16和SEQ IDNO.18所示序列的引物对11，SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.14所示序列的引物对12；

所述N基因crRNA选自：SEQ ID NO.20-22所示序列。

3.根据权利要求2所述的基于CRISPR技术的2019-nCoV快速检测引物组，其特征在于，所述Orf1ab基因扩增引物对选自：SEQ ID NO.3-4所示序列的引物对1；

所述Orf1ab基因crRNA选自：SEQ ID NO.10所示序列；

所述N基因crRNA选自：SEQ ID NO.21所示序列。

4.根据权利要求3所述的基于CRISPR技术的2019-nCoV快速检测引物组，其特征在于，所述Orf1ab基因扩增引物对和N基因扩增引物对的工作浓度为0.1～0.6μmol/L，所述Orf1ab基因crRNA和N基因crRNA的工作浓度为20～200nmol/L。

5.权利要求1-4任一项所述的基于CRISPR技术的2019-nCoV快速检测引物组在开发和/或制备具有2019-nCoV感染诊断和/或预后评估用途的产品中的应用。

6.一种用于快速检测2019-nCoV的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-4任一项所述的基于CRISPR技术的2019-nCoV快速检测引物组。

7.根据权利要求6所述的用于快速检测2019-nCoV的试剂盒，其特征在于，还包括逆转录酶，LwCas13a蛋白，信号报告探针和RNA聚合酶。

8.根据权利要求7所述的用于快速检测2019-nCoV的试剂盒，其特征在于，还包括RPA酶预混液、Tris-HCl、醋酸镁、NTP缓冲液和RNA酶抑制剂。

9.一种非诊断治疗目的2019-nCoV快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

样本提取：取待测样本，提取其中基因组；

一步检测：向上述提取得到的待测样本基因组中加入权利要求1-4任一项所述的Orf1ab基因扩增引物对和N基因扩增引物对，逆转录酶、权利要求1-4任一项所述的Orf1ab基因crRNA和N基因crRNA、LwCas13a蛋白、信号报告探针、RNA聚合酶和信号报告探针，同时进行RT-RPA扩增和CRISPR反应检测，读取检测信号，即得。

10.根据权利要求8所述的2019-nCoV检测方法，其特征在于，所述一步检测的条件为：恒温42±1℃反应40-60min。