CN112725539A

CN112725539A - 一种呼吸合胞病毒的PRA/Cas12a/IF试剂盒及其检测方法

Info

Publication number: CN112725539A
Application number: CN202110203839.5A
Authority: CN
Inventors: 刘代顺; 龚玲
Original assignee: Zhuhai Campus Of Zunyi Medical University; Zunyi First Peoples Hospital
Current assignee: Zhuhai Campus Of Zunyi Medical University; Zunyi First Peoples Hospital
Priority date: 2021-02-24
Filing date: 2021-02-24
Publication date: 2021-04-30
Anticipated expiration: 2041-02-24
Also published as: CN112725539B

Abstract

本发明属于生物医学技术领域，公开了一种呼吸合胞病毒的PRA/Cas12a/IF试剂盒及其检测方法。所述试剂盒包括以下试剂：RPA引物、crRNA和Cas12a酶和ssDNA报告子；所述RPA引物包括用于扩增RSV A、RSV B特异性片段的RSV A引物和RSV B引物；所述crRNA包括如SEQ ID NO.8所示的RSV A‑TS2和如SEQ ID NO.12所示的RSV B‑TS4；所述ssDNA报告子修饰有荧光基团和淬灭基团。本发明能够快速检测和区分RSV A或RSV B病毒，具有高灵敏度、高扩增效率、特异性强、操作简便和节约时间的特点，对于检测RSV A或RSV B具备很好的临床和科研应用价值。

Description

一种呼吸合胞病毒的PRA/Cas12a/IF试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种呼吸合胞病毒的PRA/Cas12a/IF试剂盒及其检测方法。

背景技术

呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus，RSV)是一种具有丝状包膜的负义单链RNA病毒。RSV属于正肺病毒属，包含两个抗原亚群A和B，即RSV A和RSV B。呼吸道合胞病毒是婴幼儿下呼吸道感染的主要原因，如引发毛细支气管炎和肺炎，疾病发生率约占全球学龄前儿童的60％，每年有数万名5岁及以下儿童因呼吸道合胞病毒感染而死亡。RSV也是造成老年人(≥65岁)和免疫力低下人群感染的重要病原体。根据世卫组织的数据，全球每年约有3300万新感染者，340多万严重感染者需要住院治疗。RSV感染是一种普遍存在的传染病，给全球带来巨大的临床和经济负担。

在当前，帕利珠单抗是唯一批准的呼吸道合胞病毒的预防药物，但适用性有限，且价格昂贵。因此，早期对于呼吸道合胞病毒的检测对于呼吸道感染疾病的防控和治疗具有重要意义。

目前已存在有多种呼吸道合胞病毒的检测方式，如病毒培养、快速抗原检测、直接荧光抗体检测、快速分子检测、多重分子检测。目前，RSV最常用的检测方法是快速分子检测。它包括RT-PCR分析、GeneXpert Xpress Flu/RSV检测、BioFire FilmArrayrespiratory panel检测、Diasorin Simplexa Flu A/B&RSV检测[11]、Aries Flu A/B&RSV检测、Cobas influenza A/B&RSV检测、Panther Fusion Flu A/B/RSV检测。其中，RT-PCR分析耗时且操作繁琐，GeneXpert Xpress Flu/RSV检测需要重复操作，BioFire FilmArrayrespiratory panel检测和Diasorin Simplexa Flu A/B&RSV检测耗时且灵敏度低，AriesFlu A/B&RSV检测、Cobas Flu A/B&RSV检测、Panther Fusion Flu A/B/RSV检测耗时且需要重复的操作。在快速分子检测中，虽然GeneXpert Xpress Flu/RSV试剂盒能在30分钟内快速检测RSV，且阳性率高，但却无法区分RSV A或RSV B感染。

此外，虽然有几种方法可以区分RSV A或RSV B病毒，如eSensor呼吸病毒面板测试、ePlex呼吸病原体面板测试、Verigene呼吸病毒+核酸测试、Verigene RP Flex呼吸病毒面板测试、Nx-TAG呼吸病毒面板测试，但它们都存在耗时长的缺陷。eSensor呼吸病毒面板测试需要8小时，ePlex呼吸病原体面板测试需要2小时，Verigene呼吸病毒+核酸测试需要3.5小时，Verigene RP Flex病毒面板测试需要3.5小时，Nx TAG呼吸病毒面板测试需要4-8小时。

因此，本发明希望提出一种操作简单、可区分RSV A或RSV B、且耗时短的呼吸合胞病毒检测方法。

发明内容

本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种呼吸合胞病毒的PRA/Cas12a/IF试剂盒及其检测方法，能够快速检测和区分RSV A或RSVB病毒(约30min)，具有高灵敏度、高扩增效率、特异性强、操作简便和节约时间的特点，对于检测RSV A或RSV B具备很好的临床和科研应用价值。

本发明提出一种呼吸合胞病毒的PRA/Cas12a/IF试剂盒，包括以下试剂：RPA引物、crRNA和Cas12a酶和ssDNA报告子；

所述RPA引物包括用于扩增RSV A特异性片段的RSV A引物，以及用于扩增RSV B特异性片段的RSV B引物；

所述crRNA包括如SEQ ID NO.8所示的RSV A-TS2和如SEQ ID NO.12所示的RSV B-TS4；

RSV A-TS2：5’-UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUUGAUUAGUUACCAAUCUUCA-3’(SEQ IDNO.8)，

RSV B-TS4：5’-UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUAUGAUUUUUGAUCAGUGAUC-3’(SEQ IDNO.12)；

所述ssDNA报告子的一端采用荧光基团进行修饰，另一端采用淬灭基团进行修饰。

本发明通过分别在RSV A特异性片段和RSV B特异性片段处进行RPA引物的设计，采用RPA引物对待测样品进行扩增，然后在crRNA激活Cas12a酶后对扩增片段进行切割，如果待测样品中存在目标片段RSV A或RSV B，则将被Cas12a酶切割，同时荧光ssDNA报告子也会被其催化酶切，继而发出可被检测的荧光信号，最后被荧光酶标仪或实时荧光定量PCR仪所检测到，以此获知待测样品中是否含有RSV A或RSV B。

RPA(Recombinase Polymerase Amplification)，即重组酶聚合酶扩增技术，是在多种酶和蛋白的参与下，在恒温条件下实现核酸指数扩增技术。该技术主要依赖于三种酶，即能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶。RPA技术具无需昂贵的精密仪器、无需专业技术人员、高放大效率、高特异性和敏感性、常温操作、操作简单、成本低廉的优点。

CRISPR(Clustered Regularly interspaced short palindromic repeats)，称为“聚集有规律的间隔短回文重复”。CRISPR是基因编辑工具中最快、最简单、最便宜的方法。目前为止，已发现6种类型和超过20种的CRISPR-Cas系统亚型。其中，CRISPR-Cas12a是第二类(V型)用于编辑哺乳动物基因组的CRISPR-Cas系统。Cas12a具有独特的功能，可以与CRISPR-Cas9系统进行互补，而且Cas12a(Cpf1)蛋白具有类似于Cas9的RuvC内切核酸酶结构域。Cas12a执行剪切后的DNA双链断裂会引入4或5个核苷酸突出的粘性末端。与Cas9不同的是，Cas12a酶识别富含T的酶原型间隔子相邻基序(PAM)，催化自身引导的RNA(crRNA)成熟，并使具有交错的5’和3’末端的PAM远端的dsDNA断裂。此外，Cas12a(Cpf1)蛋白不具有HNH内切酶结构域，并且Cas12a的N-末端不具有Cas9的α-螺旋识别叶。研究表明LbCas12a-crRNA复合物与互补单链DNA或者双链DNA的结合释放出强大的非特异性ssDNA反式切割活性，这促使Cas12a可以作为一种新型的基因检测和成像的工具。

免疫荧光(Immunofluorescence，IF)分析的主要原理是在ssDNA报告子的5’端和3’端分别标记荧光基团和荧光猝灭基团。采用荧光酶标仪、实时荧光定量PCR仪器等进行检测和数据读取，该设备较为常见，适用性较广。该分析方法具有操作简单、快速、灵敏度和特异性高等优点。

进一步的，所述RSV A引物的上、下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3-4所示；

RSV A上游引物：5’-GAGAAATTGAACAACCTATTGGAAGGGAATG-3’(SEQ ID NO.3)，

RSV A下游引物：5’-GTCTTCTGTTGGTATTGTGTGTTGATGTGA-3’(SEQ ID NO.4)。

进一步的，所述RSV B引物的上、下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.5-6所示；

RSV B上游引物：5’-TAATCCAACTTCCAAAAAATTGAGTGACTTG-3’(SEQ ID NO.5)，

RSV B下游引物：5’-TGTTTTATTGATGTTGTTGATTGCTGAGTG-3’(SEQ ID NO.6)。

进一步的，所述荧光基团包括FAM、VIC、HEX、TRT、Cy3、Cy5、ROX、JOE或Texas Red中的一种，所述猝灭基团包括TAMRA、DABCYL、MGB、BHQ-1、BHQ-2或BHQ-3中的一种。

进一步的，所述试剂盒还包括RNA酶抑制剂、反应缓冲液、dNTP或Basic E-mix中的至少一种。

进一步的，所述试剂盒还包括阳性标准品，所述阳性标准品为包含有RSV A和/或RSV B特异性片段的克隆质粒。

更进一步的，所述RSV A特异性片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述RSV B特异性片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

RSV A特异性片段：5’-GAGAAATTGAACAACCTATTGGAAGGGAATGATAGTGAC AATGATCTATCACTTGAAGATTTCTGATTAGTTACCAATCTTCACATCAACACACAATA CCAACAGAAGAC-3’(SEQ IDNO.1)；

RSV B特异性片段：5’-TAATCCAACTTCCAAAAAATTGAGTGACTTGTTGGAAGAC AACGATAGTGACAATGATCTGTCACTTGATGATTTTTGATCAGTGATCAACTCACTCAG CAATCAACAACATCAATAAAACA-3’(SEQ ID NO.2)。

本发明还提出一种呼吸合胞病毒的PRA/Cas12a/IF检测方法，用于非诊断目的，包括以下步骤：

提取待测样品的RNA后，利用上述试剂盒同时进行RPA扩增、Cas12a切割和荧光分析一体化检测，得到检测结果。

本发明为了节约检测时间和简化操作步骤，将RPA扩增、CRISPR/Cas12a切割与荧光分析检测所需要的试剂在一个反应系统中进行混合，进行一体化检测，同样能达到分步实验的检测效果。与分步实验相比(RPA实验25分钟，Cas12a切割实验30分钟，荧光分析实验3-5分钟)，本发明所采用的PRA/Cas12a/IF一体化检测方法操作更为简单，检测RSV A和RSVB的时间可缩短至30分钟。

进一步的，所述RPA扩增的反应条件为：39℃水浴进行扩增。

进一步的，所述荧光分析的激发光波长为495nm，检测光波长为521nm。

相对于现有技术，本发明的有益效果如下：

(1)本发明所使用的两种crRNA(RSV A-TS2和RSV B-TS4)中，RSV A-TS2可特异性激活Cas12a切割RSV A，RSV B-TS4可特异性激活Cas12a切割RSV B，因此通过选用不同类型的crRNA，便可有效检测和区别RSV A或RSV B病毒，具备良好的特异性；

(2)采用本发明所述的PRA引物，可高放大效率扩增RSV A或RSV B片段。当待测样品最低浓度为1.38×10¹copies/μL时，也能实现良好的扩增效果；

(3)本发明所采用的呼吸合胞病毒的PRA/Cas12a/IF检测方法为一体化检测方法，相同样能达到分步实验的检测效果。与分步实验相比(RPA实验25分钟，Cas12a切割实验30分钟，荧光分析实验3-5分钟)，本发明所采用的PRA/Cas12a/IF检测方法操作更为简单，检测RSV A和RSV B的时间可缩短至30分钟，且具有高放大效率、高特异性和高灵敏度的效果。

附图说明

图1表示实施例3中RPA扩增测试结果；

图2表示实施例5中可激活Cas12a酶的有效crRNA的筛选结果；

图3表示实施例5中可激活Cas12a酶的有效crRNA的验证结果；

图4表示实施例6中IF检测的荧光信号；

图5表示PRA、Cas12a、IF分步检测RSV A或RSV B的工作原理；

图6表示PRA/Cas12a/IF一体化检测RSV A或RSV B的工作原理；

图7表示实施例7中采用PRA/Cas12a/IF一体化检测RSV A和RSV B的结果。

具体实施方式

为了让本领域技术人员更加清楚明白本发明所述技术方案，现列举以下实施例进行说明。需要指出的是，以下实施例仅为本发明的优选实施例，对本发明要求的保护范围不构成限制作用，任何未违背本发明的精神实质和原理下所做出的修改、替代、组合，均包含在本发明的保护范围内。

以下实施例中所用的原料、试剂或装置如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有已知方法得到。

实施例1

RPA引物设计

通过分析和对比，本发明找到两条RSV A和RSV B的特异性片段，具体序列信息如下：

RSV B特异性片段：5’-TAATCCAACTTCCAAAAAATTGAGTGACTTGTTGGAAGAC AACGATAGTGACAATGATCTGTCACTTGATGATTTTTGATCAGTGATCAACTCACTCAG CAATCAACAACATCAATAAAACA-3’(SEQ ID NO.2)

根据上述RSV A和RSV B的特异性片段，遵从TwistAmp分析设计指南进行引物设计，所得引物的核苷酸序列如下：

RSV A引物：

RSV A上游引物：5’-GAGAAATTGAACAACCTATTGGAAGGGAATG-3’(SEQ ID NO.3)，

RSV A下游引物：5’-GTCTTCTGTTGGTATTGTGTGTTGATGTGA-3’(SEQ ID NO.4)。

RSV B引物：

RSV B上游引物：5’-TAATCCAACTTCCAAAAAATTGAGTGACTTG-3’(SEQ ID NO.5)，

RSV B下游引物：5’-TGTTTTATTGATGTTGTTGATTGCTGAGTG-3’(SEQ ID NO.6)。

实施例2

阳性标准品的构建

分别将实施例1中RSV A的特异性片段(SEQ ID NO.1)和RSV B的特异性片段(SEQID NO.2)加载到PUC57克隆质粒上，克隆位点为HindIII/EcoRI，抗性Ampicillin，宿主TOP10，即为阳性标准品。

将4μg质粒以10000r/min离心2min于管底，加入100μL ddH₂O混匀，分装5管，每管20μL，换算浓度为1.38×10¹⁰copies/μL。对该质粒进行10倍梯度稀释，从而得到1.38×10⁹cop ies/μL、1.38×10⁸copies/μL、1.38×10⁷copies/μL、1.38×10⁶copies/μL、1.38×10⁵copies/μL、1.38×10⁴copies/μL、1.38×10³copies/μL、1.38×10²copies/μL和1.38×10¹copies/μL等多种浓度的质粒样品。

实施例3

RPA扩增测试

采用实施例1中所示引物和实施例2中所示样品标准品，加载不同浓度质粒的RSVA和RSV B特异性片段，按照表1所示反应体系添加各组分，进行RPA扩增测试。

表1RPA反应体系(50μL)：

试剂	剂量
		上游引物(10μM)	2.4μL
下游引物(10μM)	2.4μL
		2×Reaction Buffer	25μL
dNTPs(9μL)+ddH<sub>2</sub>O(0.2μL)	9.2μL
		10×Basic E-mix	5.0μL
20×Core Reaction E-mix	2.5μL
		280mM MgOAc	2.5μL
阳性标准品	1.0μL

RPA反应程序为：39℃温水浴25min。

得到扩增产物后，采用琼脂糖凝胶电泳对RPA扩增产物进行验证，包括以下步骤：

(1)称取0.25g琼脂粉放入烧杯中，量筒取25ml 1×TAE加入烧杯中，充分摇匀；

(2)洗净制胶板并安插好梳子；

(3)将烧杯放入微波炉中，中火3min，取出；

(4)琼脂胶冷却到60℃左右，加入2.5μL II型Glod view后充分混匀；

(5)将琼脂胶快速倒入制胶板中，赶走气泡，冷却30min；

(6)上样：样本：2μL RPA扩增产物+3μL纯水+1μL Loading Buffer，Marker：1μLMarker+5μL纯水+1μL Loading Buffer；

(7)跑胶：电压90V、电流180mA、25min电泳，待溴酚蓝距离边沿还有1cm时即可停止电泳；

(8)通过凝胶成像仪拍照。

将加载质粒浓度为1.38×10⁹copies/μL的RSV A片段(110bp)和RSV B片段(122bp)的特异性片段进行RPA扩增，然后利用TBU-PAGE凝胶电泳得到扩增片段，测试结果如图1中A所示；将所得扩增片段外送基因公司测序发现，其序列以及大小与RSV A和RSV B特异性片段想一致，表明扩增成功。

将加载质粒的RSV A和RSV B特异性片段进行10倍稀释后(1.38×10⁹copies/μL-1.38×10¹copies/μL)，进行RPA扩增，采用琼脂糖凝胶电泳进行验证，测试结果如图1中B和C所示：无论是RSV A还是RSV B特异性片段在质粒浓度为1.38×10¹copies/μL时能进行RPA扩增，说明本发明的RPA扩增具有高放大效率。

实施例4

crRNA的设计

根据RSV A和RSV B的扩增片段序列，依据Cas12a酶的激活原则，设计针对RSV A的RSV A-TS1和RSV A-TS2两个crRNA，针对RSV B的RSV B-TS1、RSV B-TS2、RSV B-TS3和RSVB-TS4的四个crRNA，具体序列如下所示：

RSV A-TS1：5’-UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUGAAGUUCACUAUCUAGUAAC-3’(SEQ IDNO.7)，

RSV A-TS2：5’-UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUUGAUUAGUUACCAAUCUUCA-3’(SEQ IDNO.8)，

RSV B-TS1：5’-UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUGUAGUUCACUGUCUAGUAAC-3’(SEQ IDNO.9)，

RSV B-TS2：5’-UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUAUCAGUGAUCAACUCACUCA-3’(SEQ IDNO.10)，

RSV B-TS3：5’-UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUAUCAGUGAUCAACUCACUCAGC-3’(SEQ IDNO.11)，

RSV B-TS4：5’-UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUAUGAUUUUUGAUCAGUGAUC-3’(SEQ IDNO.12)。

实施例5

Cas12a酶切反应(筛选有效crRNA)

按以下反应体系(如表2所示)添加各组分，将实施例3中RSV A和RSV B的RPA扩增产物进行Cas12a切割，从而对实施例4中的crRNA进行筛选，得到可激活Cas12a酶的有效crRNA。

表2Cas12a反应体系(20μL)：

根据靶点序列位置，合成激活子(activator)序列。单链通过95℃5min后逐步降温退火，形成双链；RSV A/B激活子和RSV A/B RPA扩增产物在本实施例中的功能类似，crRNA通过激活Cas12a酶来切割RSV A/B激活子和RSV A/B RPA扩增产物。

RSV A activator：5’-TCACTGTTACTAGATAGTGAACTTCTAAAGACTAATCAATGC ATTGATTAGTCTTTAGAAGTTCACTATCTAGTAACAGTGA-3’(SEQ ID NO.13)，

RSV B activator：5’-CACTTGATGATTTTTGATCAGTGATCAACTCACTCAGCAATC GATTGCTGAGTGAGTTGATCACTGATAAAAATCATCAAGTG-3’(SEQ ID NO.14)。

Cas12a酶切反应的程序为：37℃，避光反应25min，置于65℃干燥5min。

TBU-PAGE凝胶电泳检测验证Cas12a酶切产物，包括以下步骤：

(1)TBU-PAGE胶的配置：配置6mL 10％凝胶配方，3mL 20％丙烯酰胺/甲叉丙烯酰胺、2.4mL 8mol/L尿素、0.6mL 10×TBE缓冲液(含0.89mol Tris-base，2mol硼酸，20mmolEDTA))、48μL 10％APS、6μL TEMED)。

(2)利用垂直电泳仪，调节电压150V，在1×TBE缓冲液中电泳60min。

(3)取出凝胶置于凝胶成像仪中对荧光信号进行成像检测。

测试结果如图2所示：通过对RSV A的两个靶点(RSV A-TS1及RSV A-TS2)和RSV B的2个靶点(RSV B-TS1、RSV B-TS2)进行检测，发现RSV A-TS2 crRNA对RSV A激活子在激活Cas12a酶中有很好的活性(图2A#2)，表明RSV A-TS2 crRNA可激活Cas12a酶对RSV A进行切割；但RSV A-TS2 crRNA不能激活Cas12a酶对RSV B进行切割(图2A#6，图2B右#2)。RSV B-TS2可激活Cas12a酶切割RSV B，但效果欠佳(图2A#8)。因此，我们重新设计RSV B的2个靶点(RSV B-TS3、RSV B-TS4)，发现RSV B-TS4 crRNA可激活Cas12a酶对RSV B进行切割(图2B右#7)；但RSV B-TS4 crRNA不能激活Cas12a酶对RSV A进行切割(图2B左#7)。RSV B-TS1crRNA可激活Cas12a酶对RSV A进行切割(图2左#4)，说明筛选的crRNA具有交互作用，RSVB-TS1不能作为区分RSV A和RSV B感染的有效靶点。以上结果说明RSV A-TS2 crRNA和RSVB-TS4 crRNA可作为区分RSV A或RSV B的有效靶点，且具有明显的特异性。

再利用加载不同浓度质粒(1.38×10⁹copies/μL-1.38×10¹copies/μL)的RSV A和RSV B特异性片段进行RPA，然后用筛选出的crRNA验证是否可激活Cas12a酶对RSV A和RSVB具有切割作用。结果如图3所示，RSV A-TS2 crRNA能有效激活Cas12a酶并切割RSVA(图3A)，RSV B-TS4 crRNA能有效激活Cas12a酶并切割RSV B(图3B)。因此，RSV A-TS2crRNA和RSV B-TS4 crRNA为筛选出的可激活Cas12a酶进行切割并区分RSV A或RSV B有效靶点，且具有特异性。

实施例6

IF荧光检测

按以下反应体系(如表3所示)添加各组分，选用实施例5中所筛选的有效crRNA(RSV A-TS2/RSV B-TS4)和实施例3中的RPA产物，对Cas12a酶切后的RPA产物和F-Q ssDNA进行IF荧光检测。

其中F-Q ssDNA的核苷酸序列为：5’-FAM-TTTTTTTTATT-TAMRA-3’(SEQ ID NO.15)表3IF荧光检测反应体系(20μL)：

荧光定量PCR反应，以循环为横轴，荧光为纵轴，39℃2min，39℃每20S读数一次，20℃10S终止，共计70个循环。荧光酶标仪检测：激发光波长495nm，检测光波长521nm。

检测结果如图4所示，不同浓度质粒(1.38×10⁹copies/μL-1.38×10¹copies/μL)的RSV A(依次表示为RSV A1-RSV A8)和RSV B(依次表示为RSV B1-RSV B8)的RPA产物在Cas12a切割后均具有荧光信号(图4A和4B)。同时，利用实时荧光定量PCR发现RSV A和RSV B的RPA产物在Cas12a切割后的荧光信号随着循环周期的推移逐渐出现(图4C和4D)。以上结果表明，当存在RSV A或RSV B时，RSV A-TS2 crRNA能激活Cas12a酶切割RSV A，RSV B-TS4crRNA能激活Cas12a酶切割RSV B，荧光猝灭终止，出现荧光。空白对照组(blank组，其组成为FAM和水)无RSV A或RSV B目标序列存在，处于荧光猝灭状态，无荧光出现。该检测方式具有足够的灵敏度。

实施例7

本实施例提供一种呼吸合胞病毒的PRA/Cas12a/IF试剂盒，包括以下试剂：实施例1中的RPA引物、实施例2中的阳性标准品、crRNA(RSV A-TS2 crRNA和RSV B-TS4 crRNA)、RNA酶抑制剂、反应缓冲液、dNTP或Basic E-mix和Lba Cas12a酶、ssDNA报告子(5’-FAM和3’-TAMRA)。

实施例8

RPA/Cas12a/IF一体化检测呼吸合胞病毒(RSV A或RSV B)

采用实施例7中试剂盒，按以下反应体系(如表4所示)添加各组分，采用RPA/Cas12a/IF一体化方法进行呼吸合胞病毒检测。

表4RPA/Cas12a/IF反应体系(25μL)：

荧光定量PCR反应，以循环为横轴，荧光为纵轴，39℃10min，39℃每20S读数一次，20℃10S终止，共计100个循环。荧光酶标仪检测：激发光波长495nm，检测光波长521nm。

图5所示为PRA扩增、Cas12a、IF分步检测RSV A或RSV B的工作原理，根据实施例3-6的记载，分步实验可以有效地检测到RSV A或RSV B。如图6所示，本发明为了节约检测时间和简化操作步骤，将RPA扩增、CRISPR/Cas12a、IF检测所需要的试剂在一个反应系统中进行混合，这样就无需单独进行RPA和Cas12a切割试验，并使用荧光酶标仪和实时荧光定量PCR同时进行检测。

测试结果如图7所示：采用本实施例的PRA/Cas12a/IF一体化检测方法，空白对照组(CON组，其组成为FAM和水)没有荧光信号检测，而RSV A和RSV B都有荧光信号出现(图7A)。同时，利用实时荧光定量PCR发现PRA/Cas12a/IF一体化实验后的RSV A和RSV B的荧光信号随着循环周期的推移逐渐出现(图7B)。以上结果说明PRA/Cas12a/IF一体化实验同样能达到分步实验的效果。与分步实验相比(RPA实验25分钟，Cas12a切割实验30分钟，IF实验3-5分钟)，其操作更简单，而且节省了检测RSV A和RSV B的时间(30分钟)。

SEQUENCE LISTING

<110> 遵义医科大学珠海校区、遵义市第一人民医院

<120> 一种呼吸合胞病毒的PRA/Cas12a/IF试剂盒及其检测方法

<130> 1

<160> 15

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 110

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gagaaattga acaacctatt ggaagggaat gatagtgaca atgatctatc acttgaagat 60

ttctgattag ttaccaatct tcacatcaac acacaatacc aacagaagac 110

<210> 2

<211> 122

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

taatccaact tccaaaaaat tgagtgactt gttggaagac aacgatagtg acaatgatct 60

gtcacttgat gatttttgat cagtgatcaa ctcactcagc aatcaacaac atcaataaaa 120

ca 122

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gagaaattga acaacctatt ggaagggaat g 31

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gtcttctgtt ggtattgtgt gttgatgtga 30

<210> 5

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

taatccaact tccaaaaaat tgagtgactt g 31

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tgttttattg atgttgttga ttgctgagtg 30

<210> 7

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

uaauuucuac uaaguguaga ugaaguucac uaucuaguaa c 41

<210> 8

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

uaauuucuac uaaguguaga uugauuaguu accaaucuuc a 41

<210> 9

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

uaauuucuac uaaguguaga uguaguucac ugucuaguaa c 41

<210> 10

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

uaauuucuac uaaguguaga uaucagugau caacucacuc a 41

<210> 11

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

uaauuucuac uaaguguaga uaucagugau caacucacuc agc 43

<210> 12

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

uaauuucuac uaaguguaga uaugauuuuu gaucagugau c 41

<210> 13

<211> 82

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

tcactgttac tagatagtga acttctaaag actaatcaat gcattgatta gtctttagaa 60

gttcactatc tagtaacagt ga 82

<210> 14

<211> 83

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

cacttgatga tttttgatca gtgatcaact cactcagcaa tcgattgctg agtgagttga 60

tcactgataa aaatcatcaa gtg 83

<210> 15

<211> 11

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

ttttttttat t 11

Claims

1.一种呼吸合胞病毒的PRA/Cas12a/IF试剂盒，其特征在于，包括以下试剂：RPA引物、crRNA和Cas12a酶和ssDNA报告子；

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述RSV A引物的上、下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3-4所示。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述RSV B引物的上、下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.5-6所示。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光基团包括FAM、VIC、HEX、TRT、Cy3、Cy5、ROX、JOE或Texas Red中的一种，所述猝灭基团包括TAMRA、DABCYL、MGB、BHQ-1、BHQ-2或BHQ-3中的一种。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括RNA酶抑制剂、反应缓冲液、dNTP或Basic E-mix中的至少一种。

6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性标准品，所述阳性标准品为包含有RSV A和/或RSV B特异性片段的克隆质粒。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述RSV A特异性片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述RSV B特异性片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

8.一种呼吸合胞病毒的PRA/Cas12a/IF检测方法，用于非诊断目的，其特征在于，包括以下步骤：

提取待测样品的RNA后，利用权利要求1-7中任一项所述的试剂盒同时进行RPA扩增、Cas12a切割和荧光分析一体化检测，得到检测结果。

9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述RPA扩增的反应条件为：39℃水浴进行扩增。

10.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述荧光分析的激发光波长为495nm，检测光波长为521nm。