CN115287375A - 一种检测筛查新冠病毒y453f突变的方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
一种检测筛查新冠病毒Y453F突变的方法及试剂盒，包括核酸提取得到待检核酸；以设计的引物进行扩增反应，得到核酸扩增产物；配置CRISPR反应混合液，2μL核酸扩增产物加入到第一CRISPR反应混合液或第二CRISPR反应混合液，37℃孵育30分钟，通过荧光读取检测结果。本发明具有检测速度快、准确度高、成本低以及多场景实时检测的优点。
Description
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，涉及一种检测筛查新冠病毒Y453F突变的方法及试剂盒。
背景技术
冠状病毒是有包膜的正链RNA病毒，在人类、其他哺乳动物和鸟类中广泛传播，可引起呼吸道、肠道和肝脏疾病。严重急性呼吸系统综合症(SARS)、中东呼吸系统综合症(MERS)和新型冠状病毒病COVID-19。由严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2(SARS-CoV-2)引起的COVID-19是一个主要的全球健康威胁。相比于其它冠状病毒造成的急性症状，新型冠状病毒感染症状从轻微、咳嗽、发烧到危重均有出现，感染症状和常见呼吸系统疾病相似，隐蔽性强，传染性极强。
随着新冠病毒的传播，全球已监测到数千种新冠病毒突变。绝大部分突变并不会导致病毒特性的改变，但是部分位于新冠病毒S蛋白上的特殊突变可能使病毒更具危害性。新冠病毒S蛋白(刺突蛋白)是病毒最外层结构的组成部分，新冠病毒通过表面蛋白识别宿主细胞表面的hACE2受体从而入侵细胞。人体也是通过识别病毒表面抗原从而产生相应抗体来实现病毒免疫。目前大多数的新冠疫苗也是针对新冠病毒S蛋白设计的。因此发生在新冠病毒 S蛋白上的突变可能导致相应氨基酸的改变，从而使病毒入侵方式更具传染性。氨基酸的改变可能导致病毒抗原表位的变化从而使疫苗诱导的保护性抗体失效。
研究表明，Y453F是一种在刺突蛋白的受体结合结构域(RBD)中发生从酪氨酸到苯丙氨酸的取代(第453位A22920T突变)。这种突变不会降低先前感染个体的体液免疫，也不会影响以原株RBD为抗原的疫苗小鼠模型的中和性抗体应答。然而，它与hACE2受体的亲和力比原始菌株高4倍，结合得更稳定、速度更快，表明其传播能力增强，对控制病毒的传播构成挑战。此外，由于这种突变可能会逃避抗体中和，这种变体的出现可能会增加对单克隆抗体治疗或恢复期血清治疗的耐药性。Y453F于2020年夏天在养殖水貂中首次被发现，该变体在被报道已传播给人类时引起了国际社会的极大关注。数以百万计的水貂被扑杀，它们的毛皮被丢弃，导致一个全国性的行业被关闭。水貂中已发现了三种传染类型，早期的人传水貂、水貂之间传染，和之后出现的貂传人。这些病毒却在水貂内出现了共有的变异。在目前划分出的5个水貂新冠变异株类别中，均包含有Y453F突变。而新冠病毒很可能通过在动物间大量传播，发生新的变异或出现新的变异组合，导致其传染能力增强以及对疫苗敏感性降低等不利情况。因此，该变体的检测对于人类健康和社会经济发展均具有重要意义。
单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)指由于单个核苷酸碱基的改变而导致的核酸序列的多态性。单核苷酸多态性检测(SNP检测)是一种用来检测基因组水平上由单个核苷酸变异引起的DNA序列多态性的检测技术。SNP检测方法大致分为3类：①以凝胶为基础的已知多态性检测，包括聚合酶链反应、限制性片段长度多态性标记、寡核苷酸连接分析和小测序等；②非凝胶高通量的检测技术，包括荧光能量共振转移的检测法、质谱技术和DNA芯片等；③构象为基础的未知突变检测，包括单链构象多态性、化学或酶错配修饰分析、变性梯度凝胶电泳、变性高效液相色谱等。目前，新冠病毒突变的监控主要依赖高通量测序鉴别SNP，虽然准确度较高，但是检测周期长达7天且成本昂贵，无法适用于新冠病毒突变的快速筛查。因此，研发一种速度快、准确度高、成本较低的快速SNP检测筛查新冠病毒突变方法，意义重大。
CRISPR是“Clμstered regμlarly interspaced short palindromic repeats”缩写，指规律成簇的间隔短回文重复。Cas是“CRISPR-associated”缩写，为CRISPR相关。CRISPR/Cas系统是一个细菌及古细菌进化出来用以抵御噬菌体入侵的适应性机制，后被发现并发展成为一种由引导RNA指引Cas核酸酶对靶向基因进行特定核酸编辑的技术。CRISPR/Cas系统的工作原理是crRNA(CRISPR-derived RNA)通过碱基配对与tracrRNA(trans-activating RNA)结合形成tracrRNA/crRNA复合物，此复合物引导核酸酶如Cas9蛋白至与crRNA配对的序列靶位点处剪切双链DNA，从而实现对基因组DNA序列进行编辑；而通过人工设计这两种RNA，可以改造形成具有引导作用的gRNA(gμide RNA)，足以引导Cas9对DNA的定点切割。目前，基于CRISPR的核酸快速检测技术主要分为两大类，即2020年诺贝尔化学奖得主Jennifer Doμdna开发的依赖于Cas12a的称为DETECTR的核酸恒温检测技术，以及CRISPR专利所有者张锋开发的依赖于Cas13a的称为SHERLOCK的核酸恒温检测技术。其原理都是通过恒温扩增方法如RPA对目的片段进行扩增富集，扩增后的目的片段会被Cas蛋白通过一段 crRNA的引导靶向识别，激活Cas蛋白成为一个DNA切割机(Cas12a)或者RNA切割机 (Cas13a)，将附近所有的单链DNA(Cas12a)或者单链RNA(cas13a)进行切割。这一特性作用于单链核酸荧光探针则可用于报告检测结果。
CRISPR/Cas系统的切割检测需要CRISPR靶向RNA(crRNA)结合识别靶向序列并激活Cas蛋白后才能进行，单碱基突变(SNP)检测则利用crRNA的碱基识别特异性，通过将突变碱基置于crRNA的不同位置或者人为引入碱基错配，使得crRNA仅能识别突变序列而不能识别不含SNP的原始序列，从而实现突变分型检测。
如图1所示，分别展示了LwaCas13a以及LbaCas12a区分SNP的模式原理。Cas12a的SNP区分：PAM(Protospacer adjacent motif)是crRNA靶向结合区域(spacer)附近的一段固定短序列(TTTN)。PAM及靠近PAM的1-6个碱基的种子区(seed region)对LbaCas12a 的识别与激活至关重要，PAM及seed region处的碱基错配可使LbaCas12a蛋白的切割活性下降约1000倍。通过将突变碱基放置在PAM或seed region区域可极大地影响LbaCas12a的激活从而进行SNP鉴定。Cas13a的SNP区分：不同于LbaCas12a对单碱基的高度灵敏性，LwaCas13a没有类似于PAM的区域且可以在一个碱基错配的情况下激活并进行切割检测，但是在两个碱基错配的情况下LwaCas13a则无法激活。所以通过在LwaCas13a的crRNA上人为引入一个额外的碱基错配即可达到检测SNP的临界点：在检测SNP序列时仅有一个人为错配，crRNA激活Cas蛋白进行切割检测；当检测不含SNP的原始序列时，因为有两个碱基错配，crRNA无法激活Cas蛋白使其发生相应的空间结构变化，显示检测阴性。据已有文献报道的利用LwaCas13a对ZIKV病毒进行SNP分型，倾向于将突变碱基放置在spacer的第三个碱基处，将人为合成的碱基错配放置在crRNA对应spacer的第5个碱基处进行SNP的区分检测。但是由于不同检测位点的碱基组成序列不同，其与crRNA结合后对LwaCas13a 蛋白的空间变化影响亦不同，他人的SNP鉴定设计工作只能作为参考，无法套用。所以在进行LwaCas13a的Y453F突变检测时，需要尝试将突变碱基放置在spacer的不同位置，尝试将人为错配放置在crRNA的不同位置，从而设计出多组crRNA用于筛选，最终筛选出一种 crRNA序列可以最特异灵敏地检出Y453F突变。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测筛查新冠病毒Y453F突变的方法及试剂盒。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一种检测筛查新冠病毒 Y453F突变的试剂盒，所述试剂盒包括：
一组RT-RAA扩增引物：
RT-RAA上游引物：
5’-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGtatagcttggaattctaacaatcttgattc-3’；
RT-RAA下游引物：5’-accggcctgatagatttcagttgaaatatc-3’；
两种CRISPR特异性检测的crRNA：
Cas13-Y453F crRNA：
5’-ggauuuagacuaccccaaaaacgaaggggacuaaaacatcaaaacagguaauuauaauuaccacc-3’；
Cas12-Y453F crRNA：
5’-guaauuucuacuaaguguagaugauguuuaggaagucuaau-3’；
RNA荧光探针：
5’-FAM-mArArUrGrGrCmAmArArUrGrGrCmA-BHQ1-3’；
其中，m代表2位氧甲基修饰，r代表核糖核苷酸；
DNA荧光探针：
5’-FAM-TTATTATT-BHQ1-3’。
优选的技术方案为：还包括HEPES缓冲液、MgCl2溶液、10×NEB bμffer2.1缓冲液、RNase inhibitor、T7 RNA polymerase、无RNA酶水。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一种非诊断目的的检测筛查新冠病毒Y453F突变的方法，包括下列步骤：
步骤1：将待检测样本浸入病毒保存液中，然后用RNA提取试剂盒进行核酸提取，得到待检核酸；
步骤2：向一容纳有蛋白酶冻干粉的反应管中，加入41.5μL的Bμffer A溶液，2μL的RT-RAA上游引物，2μL的RT-RAA下游引物以及2μL待检核酸，然后加2.5μL的Bμffer B 溶液，盖上反应管的管盖后进行扩增反应，得到核酸扩增产物；
RT-RAA上游引物：
5’-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGtatagcttggaattctaacaatcttgattc-3’；
RT-RAA下游引物：5’-accggcctgatagatttcagttgaaatatc-3’；
步骤3：配置第一CRISPR反应混合液：将0.4μL的浓度为1M的HEPES缓冲液、0.18μL的浓度为1M的MgCl2溶液、0.8μL的浓度为10μM的rNTP mix、2μL的浓度为的63.2ng/μL 的LwaCas13a、1μL的浓度为40Μ/μL的RNase inhibitor、0.1μL的浓度为50Μ/μL的T7 RNApolymerase、0.5μL的浓度为10ng/μL的K1 crRNA或P1 crRNA、0.2μL的浓度为100μM的 RNA荧光探针和12.82μL的无RNA酶水混合；配置第二CRISPR反应混合液：将1μL的浓度为1μM的LbaCas12a、1μL的浓度为15ng/μL的B2 crRNA、2μL的10×NEB bμffer2.1、 0.1μL的浓度为100μM的DNA荧光探针和12.9μL的无RNA酶水混合；
Cas13-Y453F crRNA:
5’-ggauuuagacuaccccaaaaacgaaggggacuaaaacatcaaaacagguaauuauaauuaccacc-3’；
Cas12-Y453F crRNA：
5’-guaauuucuacuaaguguagaugauguuuaggaagucuaau-3’；
RNA荧光探针：
5’-FAM-mArArUrGrGrCmAmArArUrGrGrCmA-BHQ1-3’；其中，m为2位氧甲基修饰， r为RNA
DNA荧光探针：
5’-FAM-TTATTATT-BHQ1-3’；
步骤4：取2μL步骤2得到的核酸扩增产物加入到步骤3配置得到的第一CRISPR反应混合液或第二CRISPR反应混合液，37℃孵育30分钟；通过下列方法进行判断：
1、通过荧光定量PCR仪孵育并同时检测荧光，或直接水浴最后肉眼观察荧光变化；
2、在CRISPR反应孵育开始时使用qPCR仪器读取FAM通道下的荧光值，37℃孵育20个循环，每个循环间隔1.5分钟，每次循环结束记录一次荧光信号，通过最终荧光信号强度判断Y453F检测结果，即荧光值大于3000代表Y453F检测阳性，荧光值小于2000代表Y453F检测阴性，若荧光值处于2000-3000之间则重新检测一次，若荧光值依然为2000-3000则判定Y453F检测阳性；若现场无qPCR等荧光读取仪器，亦可等反应完成后将反应管置于激发波长为485nm的透射光源下观察颜色变化确定检测结果；Y453F检测阳性的反应管会发出黄绿色荧光，Y453F检测阴性反应管则无荧光。
优选的技术方案为：bμffer A溶液配置方法为：向1L水中加入50mmol的Tris缓冲液， 100nmol的醋酸钾，20g的聚乙二醇粉末和2mmol二硫苏糖醇；BμfferB溶液为浓度为280mM 的醋酸镁溶液。
由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有的优点是：
本发明具有检测速度快、准确度高、成本较低且不依赖特定检测设备的优点。
附图说明
图1为LwaCas13a及LbaCas12a区分SNP的模式原理模式图。
图2Y453F位点的RT-RAA最佳引物筛选图。
图3Y453FCas13a的crRNA设计与筛选图。
图4Y453FCas12a的crRNA设计与筛选图。
图5Y453FCas13a的crRNA验证图。
图6Y453FCas12a的crRNA验证图。
图7不依赖检测设备的结果读取。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。
请参阅图1-7。须知，本说明书所附图式所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整。提供以下实施例以便更好地理解本发明，而非限制本发明。以下实施例中的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料如无特殊说明，均为常规生化试剂商店购买所得。
实施例1：一种检测筛查新冠病毒Y453F突变的方法及试剂盒
一种检测筛查新冠病毒Y453F突变的方法，其特征在于，包括以下技术步骤。
(1)提取新冠病毒核酸
将待测标本浸入含2-3ml病毒保存液中(也可使用等渗盐溶液)，尾部弃去，旋紧管盖。标本应尽快进行核酸提取并检测，可在24小时内检测的标本可置于4℃保存；24小时内无法检测的标本则应置于-70℃或以下保存。使用RNA提取试剂盒进行核酸提取，以试剂盒
Mini Kit(QIAGEN，Cat No.74106)为例：取200μL病毒保存液加入350μL BufferRLT 吹打混匀，再加入550μL 70％浓度的无水乙醇沉淀病毒RNA。获得的浑浊悬液过滤柱离心， 12000rpm，2min，4℃。先后使用Buffer RW1与Buffer RPE洗脱杂质，最后用80μL不含RNA 酶的水加至吸附柱中，通过离心溶解洗脱病毒核酸。
(2)RT-RAA引物设计
RT-RAA(Reverse-Transcription-Recombinase-aid Amplification)即逆转录-重组酶介导的扩增反应。即逆转录酶将RNA逆转录成cDNA，然后在多个重组酶与特异性的RT-RAA引物的介导下对目的片段进行37℃恒温扩增。RT-RAA反应是CRISPR检测方法中的第一步，起到放大信号从而提高检测灵敏度的作用。
RT-RAA引物的设计遵循以下原则：1.引物长30-35个碱基；2.引物GC含量为30％＜GC ＜70％；3.扩增产物长度范围在100bp-200bp之间；4.扩增区域需要GC含量为40％＜GC＜ 60％，避免单一重复序列以及回文序列。建议围绕检测位点设计上下游各3组RT-RAA引物，并使用完整的CRISPR检测切割反应筛选出扩增效果最佳的RT-RAA引物。
本发明针对新型冠状病毒Y453F突变设计了3组引物，经过最终筛选得到最佳扩增引物， Cas12a体系与Cas13a体系的扩增引物序列相同，区别仅在于Cas13a体系在上游引物的5’端增加了一段T7启动子识别位点(大写字母表示)用于CRISPR检测时进行RNA转录。
Cas13-453-for2：
5’-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGtatagcttggaattctaacaatcttgattc-3’
Cas12-453-rev3：5’-accggcctgatagatttcagttgaaatatc-3’
(3)RT-RAA核酸扩增
使用杭州众测RT-RAA核酸扩增基础试剂盒以及对应的RT-RAA引物对提取的样本核酸进行扩增，37℃孵育20分钟。具体操作步骤如下：
50μL RT-RAA扩增体系，取装有蛋白酶冻干粉的反应管，向其中依次加入41.5μLbuffer A 溶液(50mM Tris pH 7.9,100nM醋酸钾(PotassiμM acetate),5％聚乙二醇(PEG)，2mM 二硫苏糖醇(DTT))，2μL RT-RAA上游引物(10μM)，2μL RT-RAA下游引物(10μM)以及2μL 待检核酸。加2.5μL Buffer B溶液(280mM醋酸镁溶液(MagnesiμM Acetate))至管盖上，盖上管盖后将反应管瞬离即可启动扩增反应。将反应管39℃水浴孵育20分钟或直接握在手心利用体温孵育20分钟。
(4)配置CRISPR反应体系用于快速SNP检测筛查新冠病毒Y453F突变
本发明共设计了18种crRNA用于新型冠状病毒Y453F突变的区分鉴定，7种利用LbaCas12a检测Y453F突变的crRNA，通过将突变置于PAM区域并在种子区域(seed region)添加人为碱基错配的方式进行设计；11种利用LwaCas13a检测突变的crRNA则通过将突变碱基置于spacer第3，4，6个碱基处，将人为错配碱基置于crRNA对应spacer的第2，3，4， 5，6个碱基处组合设计而来。通过比较这些crRNA位点分别检测突变毒株以及原始毒株时的荧光信号强度，对以上设计的crRNA位点经过完整的荧光切割检测筛选。
本发明最终筛选出2种特异灵敏的crRNA序列可用于Y453F突变的鉴别区分，现公布如下：
Cas13-Y453F crRNA(编号A4):
5’-ggauuuagacuaccccaaaaacgaaggggacuaaaacatcaaaacagguaauuauaauuaccacc-3’；
Cas12-Y453F crRNA(编号B4)：
5’-guaauuucuacuaaguguagaugauguuuaggaagucuaau-3’；
按如下表格所述成分，体积以及浓度配置CRISPR反应体系：
CRISPR Cas13a反应混合液配置体系如下：
| 组分 | 浓度 | 体积 | 来源 |
| HEPES | 1M | 0.4μL | 赛默飞 |
| MgCl2 | 1M | 0.18μL | 赛默飞 |
| rNTP mix | 10μM of each | 0.8μL | NEB |
| LwaCas13a | 63.2ng/μL | 2μL | 南京金斯瑞 |
| RNase inhibitor | 40U/μL | 1μL | NEB |
| T7 RNA polymerase | 50U/μL | 0.1μL | Lucigen |
| crRNA | 10ng/μL | 0.5μL | 体外转录 |
| RNA荧光探针 | 100μM | 0.2μL | 南京擎科 |
| 无RNA酶水 | 无 | 12.82μL | 赛默飞 |
| 总计 | - | 18μL |
CRISPR Cas12a反应混合液配置体系如下：
| 组分 | 浓度 | 体积 | 来源 |
| LbaCas12a | 1μM | 1μL | NEB |
| crRNA | 15ng/μL | 1μL | 体外转录 |
| NEB buffer2.1 | 10× | 2μL | NEB |
| 无RNA酶水 | 无 | 13.9μL | 赛默飞 |
| DNA荧光探针 | 100μM | 0.1μL | 南京擎科 |
| 总计 | 18μL |
RNA荧光探针：m为2位氧甲基修饰，r为RNA。
5’-FAM-mArArUrGrGrCmAmArArUrGrGrCmA-BHQ1-3’；
DNA荧光探针：
5’-FAM-TTATTATT-BHQ1-3’。
CRISPR反应体系对SNP检测的作用主要体现在特异性上，即CRISPR体系的特异性碱基识别特性赋予了其进行SNP检测的能力。本发明提供的crRNA能够有效识别Y453F突变序列并激活对应的Cas蛋白，切割周围的荧光报告探针显示Y453F突变检测阳性。而该crRNA在检测不含突变的原始序列时，因为碱基错配无法激活对应的Cas蛋白从而显示Y453F突变检测阴性。
(5)Y453F突变的荧光检测及结果读取
取2μL核酸扩增产物加入到配制好的18μL CRISPR反应混合液，37℃孵育30分钟。可通过荧光定量PCR仪孵育并同时检测荧光，或直接水浴最后肉眼观察荧光变化。根据使用的 Cas蛋白酶不同，CRISPR反应混合液分为两种，分别是使用LwaCas13a效应蛋白进行突变检测的CRISPR Cas13a反应混合液以及使用LbaCas12a效应蛋白进行突变检测的CRISPRCas12a反应混合液，分别使用不同的crRNA。
可在CRISPR反应孵育开始时使用qPCR仪器(伯乐CFX96)读取FAM通道下的荧光值，37℃孵育20个循环，每个循环间隔1.5分钟，每次循环结束记录一次荧光信号。通过最终荧光信号强度判断Y453F检测结果，即荧光值大于3000代表Y453F检测阳性，荧光值小于2000代表Y453F检测阴性，若荧光值处于2000-3000之间则重新检测一次，若荧光值依然为2000-3000则判定Y453F检测阳性。若现场无qPCR等荧光读取仪器，亦可等反应完成后将反应管置于激发波长为485nm的透射光源下观察颜色变化确定检测结果。Y453F检测阳性的反应管会发出黄绿色荧光，Y453F检测阴性反应管则无荧光。
所述的FAM通道，是qPCR仪器读取荧光时的一种荧光检测通道，读取波长为450nm-490nm的荧光信号。
Y453F突变检测方法的建立
1.材料与方法
1.1材料
RT-RAA扩增引物，crRNA及单链探针由南京擎科生物公司以及南京金斯瑞生物公司合成。RT-RAA核酸基础扩增试剂盒购自杭州众测生物公司。LbaCas12a蛋白购自于NEB。LwaCas13a蛋白购自于南京金斯瑞生物公司。含有突变序列的假病毒为实验室内包装所得，也可委托公司代为包装含有对应突变序列的假病毒。
1.2方法
1.2.1：RT-RAA引物的设计
根据GenBank中已经公布的新冠病毒原始毒株(NC_045512.2)序列，设计Y453F突变位点的RT-RAA扩增引物。按照RT-RAA的设计要求设计上游引物与下游引物各3条，具体序列如下表：
1.2.2RT-RAA最佳扩增引物的筛选：
通过完整的RT-RAA-CRISPR Cas13a实验筛选出扩增效率最高的一种引物组合，首先设计一条Cas13a检测Y453F原始位点的crRNA，序列如下：
5’-gttggtggtaattataattacctgtataGTTTTAGTCCCCTTCGTTTTTGGGGTAGTCTAAATCCCCT ATAGTGAGTCGTATTAATTTC-3’；Y453F-crRNA0
使用该条crRNA验证RT-RAA三对上下游引物，两两配对共9种组合
使用不同浓度梯度的新冠病毒S片段RNA模板对每组引物进行扩增效率验证，根据RNA 模板长度计算分子量，50ng/μL RNA模板换算成分子拷贝数约为1.4×1011cp/μL。将其按10 倍梯度稀释至1400cp/μL，140cp/μL，14cp/μL，1.4cp/μL，0.7cp/μL和0cp/μL。然后使用 RT-RAA-CRISPR Cas13切割检测，按上述6种浓度梯度对共9种引物组合进行扩增效率验证，通过荧光强度判断引物的扩增效率高低，并最终选出一组最佳扩增引物。
1.2.3设计LwaCas13a crRNA用于检测Y453F突变
Y453F是一种在刺突蛋白的受体结合结构域(RBD)中发生从酪氨酸到苯丙氨酸的取代 (第453位A22920T突变)，本实施例使用LwaCas13a检测Y453F作为举例方案。
crRNA是一段引导RNA，由固定的骨架(scaffold)以及一段与靶向序列互补的区域(spacer)构成，根据已有的报道Cas13a可以容忍spacer上一个碱基的错配并成功激活，所以在检测Y453F突变时，在已有一个突变错配的情况下，我们通过在spacer上额外引入一个人为错配，即有可能使得crRNA仅识别突变序列而不识别原始序列，从而达到突变分型的目的。综合分析Cas13a蛋白与crRNA作用时的空间结构后，针对Y453F突变，本发明在spacer的不同区域人为引入碱基错配，共设计了12种crRNA用于后续筛选。具体序列见下表，序列展示见图3
表5
1.2.4设计LbaCas12a crRNA用于检测Y453F突变
Y453的突变为该区域带来了一段可供Cas12a特异性识别的PAM，PAM是Cas12a识别并激活的关键序列，根据这一特点本发明设计了7种Cas12a crRNA用于Y453F突变的识别。序列如下表，序列展示见图4：
1.2.5利用完整的RT-RAA CRISPR Cas13a反应筛选出有效区分Y453F的crRNA
使用含有Y453F突变序列的假病毒模拟病毒突变阳性样本，使用含有原始序列的假病毒作为阴性对照。用100cp/μL的两种假病毒样本对上述设计的11种crRNA进行筛选。通过 RT-RAA-CRISPR Cas13a切割检测的荧光强度筛选出能检出Y453F突变却不能检出原始序列的Cas13a crRNA。
1.2.6利用完整的RT-RAA CRISPR Cas12a反应筛选出有效区分Y453F的crRNA。
使用含有Y453F突变序列的假病毒模拟病毒突变阳性样本，使用含有原始序列的假病毒作为阴性对照。用100cp/μL的两种假病毒样本对上述设计的7种crRNA进行筛选。通过 RT-RAA-CRISPR Cas12a切割检测的荧光强度筛选出能检出Y453F突变却不能检出原始序列的Cas12a crRNA。
1.2.7已筛选出crRNA的进一步验证
使用1400cp/μL，140cp/μL，14cp/μL，1.4cp/μL和0.7cp/μL共5种不同浓度的假病毒样本，对已筛选出的crRNA做进一步的效果验证。
2.结果
2.1Y453F位点RT-RAA最佳扩增引物的选择
将九种RT-RAA引物引物组合，通过完整的RT-RAA-CRISPR Cas13a切割检测反应比较不同引物组的荧光强度，荧光信号由伯乐CFX96采集。如图2所示，引物F2+R3 (Cas13-453-for2+Cas13-453-rev3)组合检测灵敏度最高，可稳定检出浓度为0.7cp//μL的病毒核酸，引物扩增效率最高，因此选择该组合作为最佳RT-RAA扩增引物。
2.2CRISPR Cas13a有效区分Y453F的crRNA筛选结果
使用含有突变的阳性样本与不含突变的阴性样本，通过RT-RAA-CRISPR Cas13a切割检测反应筛选有效的crRNA。假病毒样本浓度为100cp/μL，设置两个重复，使用核酸提取试剂盒提取核酸。并使用众测RT-RAA核酸基础扩增试剂盒进行恒温扩增。每个crRNA都配制单独的CRISPR反应体系，取18μL CRISPR反应体系加入2μL RT-RAA扩增产物，37℃孵育20个循环，孵育全程通过伯乐CFX96采集荧光。通过对比每种crRNA检测突变样本及原始样本时的荧光强度判断其突变区分能力。如图3所示crRNA Cas13-Y453F-6+4(编号A4)能够有效检出Y453F(G)突变，而不检出原始模板。
2.3CRISPR Cas12a有效区分Y453F的crRNA筛选结果
使用含有突变的阳性样本与不含突变的阴性样本，通过RT-RAA-CRISPR Cas12a切割检测反应筛选能够有效的crRNA。假病毒样本浓度为100cp/μL，设置两个重复，使用核酸提取试剂盒提取核酸。并使用众测RT-RAA核酸基础扩增试剂盒进行恒温扩增。每个crRNA都配制单独的CRISPR反应体系，取18μL CRISPR反应体系加入2μL RT-RAA扩增产物，37℃孵育20个循环，孵育全程通过伯乐CFX96采集荧光。通过对比每种crRNA检测突变样本及原始样本时的荧光强度判断其突变区分能力。如图4所示，crRNA Cas12-Y453F(编号B4)能够有效检出Y453F突变，而不检出原始模板。
2.4Cas13a crRNA A4区分效果的进一步验证
对筛选出的Cas13a crRNA A4进行进一步的SNP区分验证。将突变阳性与突变阴性两种假病毒，分别梯度稀释至1400cp/μL，140cp/μL，14cp/μL，1.4cp/μL和0.7cp/μL。通过完整的RT-RAA-CRISPR Cas13a切割检测两组样本的多个浓度梯度，再次验证crRNA A4的SNP区分能力。图5显示crRNA A4可以在1400cp/μL，140cp/μL，14cp/μL，1.4cp/μL和0.7cp/μL有效检出Y453F突变，相应浓度的原始模板则显示检测阴性。待反应完成后，将反应管置于485nm的透射光源下，可以观察到突变模板的反应管发出明显的黄绿色荧光，而原始模板的反应孔则无荧光。
2.5Cas12a crRNA B4区分效果的进一步验证
对筛选出的Cas12a crRNA B4进行进一步的SNP区分验证。将突变阳性与突变阴性两种假病毒，分别梯度稀释至14000cp/μL，1400cp/μL，140cp/μL，14cp/μL和7cp/μL。通过完整的RT-RAA-CRISPR Cas12a切割检测两组样本的多个浓度梯度，再次验证Cas12a crRNAB4 的SNP区分能力。图6显示crRNA P1可以在14000cp/μL，1400cp/μL，140cp/μL，14cp/μL和7cp/μL有效检出Y453F突变，相应浓度的原始模板则显示检测阴性。待反应完成后，将反应管置于485nm的透射光源下，可以观察到突变模板的反应管发出明显的黄绿色荧光，而原始模板的反应孔则无荧光。
图1：分别展示了利用CRISPR/Cas13a以及CRISPR/Cas12a进行突变检测的原理。即突变毒株与引导RNA(crRNA)更加匹配，从而激活Cas蛋白进行切割检测。
图2：展示了Y453F位点RT-RAA引物的筛选结果。上下游三组引物两两配对共有9种组合，图中展示了每种引物组合检测不同浓度梯度病毒模板时的荧光强度。筛选结果显示引物F2+R3扩增效果最好。
图3：第一部分碱基序列图展示了设计的11种LwaCas13a用于区分Y453F突变的crRNA。通过在crRNA上人为引入碱基错配，使得Cas效应蛋白能够在检测突变毒株时识别并激活，在检测原始毒株时无法识别。第二部分展示了多种crRNA检测突变的筛选效果图，分别用设计的每种crRNA去检测Y453F突变样本以及原始毒株样本，比较其突变的检测效果。筛选结果表明A4 crRNA区分突变能力最强。
图4：第一部分碱基序列图展示了设计的7种LbaCas12a用于区分Y453F突变的crRNA。将突变位点置于Cas12a的PAM识别区，并在种子区域(seed region)添加人为突变提高突变区分能力，使得Cas效应蛋白能够在检测突变毒株时识别并激活，在检测原始毒株时无法识别。第二部分展示了多种crRNA检测突变的筛选效果图，分别用设计的每种crRNA去检测 Y453F突变样本以及原始毒株样本，比较其突变的检测效果。筛选结果表明B4 crRNA区分突变能力最强。
图5：对于筛选出的A4 crRNA的进一步验证结果。使用A4 crRNA及CRISPR/Cas13a系统对不同浓度梯度的突变毒株样本以及原始毒株样本进行检测，显示A4 crRNA均能达到很好的突变检测效果。第二张图展示了反应结束后，将反应管置于485nm激发光下，肉眼可以观察到突变组的黄绿色荧光。
图6：对于筛选出的B4 crRNA的进一步验证结果。使用B4 crRNA及CRISPR/Cas12a系统对不同浓度梯度的突变毒株样本以及原始毒株样本进行检测，显示B4 crRNA均能达到很好的突变检测效果。第二张图展示了反应结束后，将反应管置于485nm激发光下，肉眼可以观察到突变组的黄绿色荧光。
实施例2：一种检测筛查新冠病毒Y453F突变的方法及试剂盒
一种检测筛查新冠病毒Y453F突变的试剂盒，所述试剂盒包括：
一组RT-RAA扩增引物：
Y453F-For：
5’-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGtatagcttggaattctaacaatcttgattc-3’；
Y453F-Rev：5’-accggcctgatagatttcagttgaaatatc-3’；
两种CRISPR特异性检测的crRNA：
Cas13-Y453F crRNA(编号A4):
5’-ggauuuagacuaccccaaaaacgaaggggacuaaaacatcaaaacagguaauuauaauuaccacc-3’；
Cas12-Y453F crRNA(编号B4)：
5’-guaauuucuacuaaguguagaugauguuuaggaagucuaau-3’；
RNA荧光探针：
5’-FAM-mArArUrGrGrCmAmArArUrGrGrCmA-BHQ1-3’；
其中，m代表2位氧甲基修饰，r代表核糖核苷酸；
DNA荧光探针：
5’-FAM-TTATTATT-BHQ1-3’。
还包括buffer A溶液和BufferB溶液；buffer A溶液配置方法为：向1L水中加入50mmol 的Tris缓冲液，100nmol的醋酸钾，20g的聚乙二醇粉末和2mmol二硫苏糖醇；BufferB溶液为浓度为280mM的醋酸镁溶液；HEPES缓冲液、MgCl2溶液、10×NEB buffer2.1缓冲液、 RNase inhibitor、T7 RNA polymerase、无RNA酶水。
一种检测筛查新冠病毒Y453F突变的方法，包括下列步骤：
步骤1：将待检测样本浸入病毒保存液中，然后用RNA提取试剂盒进行核酸提取，得到待检核酸；待检测样本提取于门把手。
步骤2：向一容纳有蛋白酶冻干粉的反应管中，加入41.5μL的buffer A溶液，2μL的RT-RAA上游引物，2μL的RT-RAA下游引物以及2μL待检核酸，然后加2.5μL的BufferB溶液，盖上反应管的管盖后进行扩增反应，得到核酸扩增产物；
Y453F-For：
5’-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGtatagcttggaattctaacaatcttgattc-3’；
Y453F-Rev：5’-accggcctgatagatttcagttgaaatatc-3’；
步骤3：配置第一CRISPR反应混合液：将0.4μL的浓度为1M的HEPES缓冲液、0.18μL的浓度为1M的MgCl2溶液、0.8μL的浓度为10μM的rNTP mix、2μL的浓度为的63.2ng/μL 的LwaCas13a、1μL的浓度为40U/μL的RNase inhibitor、0.1μL的浓度为50U/μL的T7 RNApolymerase、0.5μL的浓度为10ng/μL的A4 crRNA、0.2μL的浓度为100μM的RNA荧光探针和12.82μL的无RNA酶水混合；配置第二CRISPR反应混合液：将1μL的浓度为1μM的 LbaCas12a、1μL的浓度为15ng/μL的B4 crRNA、2μL的10×NEB buffer2.1、0.1μL的浓度为 100μM的DNA荧光探针和12.9μL的无RNA酶水混合；
Cas13-Y453F crRNA(编号A4):
5’-ggauuuagacuaccccaaaaacgaaggggacuaaaacatcaaaacagguaauuauaauuaccacc-3’；
Cas12-Y453F crRNA(编号B4)：
5’-guaauuucuacuaaguguagaugauguuuaggaagucuaau-3’；
RNA荧光探针：
5’-FAM-mArArUrGrGrCmAmArArUrGrGrCmA-BHQ1-3’；其中，m为2位氧甲基修饰，r为RNA
DNA荧光探针：
5’-FAM-TTATTATT-BHQ1-3’；
步骤4：取2μL步骤2得到的核酸扩增产物加入到步骤3配置得到的第一CRISPR反应混合液或第二CRISPR反应混合液，37℃孵育30分钟；通过下列方法进行判断：
1、通过荧光定量PCR仪孵育并同时检测荧光，或直接水浴最后肉眼观察荧光变化；
2、在CRISPR反应孵育开始时使用qPCR仪器读取FAM通道下的荧光值，37℃孵育20个循环，每个循环间隔2分钟，每次循环结束记录一次荧光信号，通过最终荧光信号强度判断Y453F检测结果，即荧光值大于3000代表Y453F检测阳性，荧光值小于2000代表Y453F 检测阴性，若荧光值处于2000-3000之间则重新检测一次，若荧光值依然为2000-3000则判定Y453F检测阳性；若现场无qPCR等荧光读取仪器，亦可等反应完成后将反应管置于激发波长为485nm的透射光源下观察颜色变化确定检测结果；Y453F检测阳性的反应管会发出黄绿色荧光，Y453F检测阴性反应管则无荧光。
以上所述者仅为用以解释本发明之较佳实施例，并非企图具以对本发明做任何形式上之限制，是以，凡有在相同之发明精神下所作有关本发明之任何修饰或变更，皆仍应包括在本发明意图保护之范畴。
Claims (4)
1.一种检测筛查新冠病毒Y453F突变的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括：
一组RT-RAA扩增引物：
RT-RAA上游引物：
5’-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGtatagcttggaattctaacaatcttgattc-3’；
RT-RAA下游引物：5’-accggcctgatagatttcagttgaaatatc-3’；
两种CRISPR特异性检测的crRNA：
Cas13-Y453F crRNA：
5’-ggauuuagacuaccccaaaaacgaaggggacuaaaacatcaaaacagguaauuauaauuaccacc-3’；
Cas12-Y453F crRNA：
5’-guaauuucuacuaaguguagaugauguuuaggaagucuaau-3’；
RNA荧光探针：
5’-FAM-mArArΜrGrGrCmAmArArΜrGrGrCmA-BHQ1-3’；
其中，m代表2位氧甲基修饰，r代表核糖核苷酸；
DNA荧光探针：
5’-FAM-TTATTATT-BHQ1-3’。
2.根据权利要求1所述的检测筛查新冠病毒Y453F突变的试剂盒，其特征在于：还包括HEPES缓冲液、MgCl2溶液、10×NEB bμffer2.1缓冲液、RNase inhibitor、T7 RNApolymerase、无RNA酶水。
3.一种非诊断目的的检测筛查新冠病毒Y453F突变的方法，其特征在于：包括下列步骤：
步骤1：将待检测样本浸入病毒保存液中，然后用RNA提取试剂盒进行核酸提取，得到待检核酸；
步骤2：向一容纳有蛋白酶冻干粉的反应管中，加入41.5μL的Bμffer A溶液，2μL的RT-RAA上游引物，2μL的RT-RAA下游引物以及2μL待检核酸，然后加2.5μL的Bμffer B溶液，盖上反应管的管盖后进行扩增反应，得到核酸扩增产物；
RT-RAA上游引物：
5’-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGtatagcttggaattctaacaatcttgattc-3’；
RT-RAA下游引物：5’-accggcctgatagatttcagttgaaatatc-3’；
步骤3：配置第一CRISPR反应混合液：将0.4μL的浓度为1M的HEPES缓冲液、0.18μL的浓度为1M的MgCl2溶液、0.8μL的浓度为10μM的rNTP mix、2μL的浓度为的63.2ng/μL的LwaCas13a、1μL的浓度为40Μ/μL的RNase inhibitor、0.1μL的浓度为50Μ/μL的T7 RNApolymerase、0.5μL的浓度为10ng/μL的K1 crRNA或P1 crRNA、0.2μL的浓度为100μM的RNA荧光探针和12.82μL的无RNA酶水混合；配置第二CRISPR反应混合液：将1μL的浓度为1μM的LbaCas12a、1μL的浓度为15ng/μL的B2 crRNA、2μL的10×NEB bμffer2.1、0.1μL的浓度为100μM的DNA荧光探针和12.9μL的无RNA酶水混合；
Cas13-Y453F crRNA:
5’-ggauuuagacuaccccaaaaacgaaggggacuaaaacatcaaaacagguaauuauaauuaccacc-3’；
Cas12-Y453F crRNA：
5’-guaauuucuacuaaguguagaugauguuuaggaagucuaau-3’；
RNA荧光探针：
5’-FAM-mArArUrGrGrCmAmArArUrGrGrCmA-BHQ1-3’；其中，m为2位氧甲基修饰，r为RNA
DNA荧光探针：
5’-FAM-TTATTATT-BHQ1-3’；
步骤4：取2μL步骤2得到的核酸扩增产物加入到步骤3配置得到的第一CRISPR反应混合液或第二CRISPR反应混合液，37℃孵育30分钟；通过下列方法进行判断：
1、通过荧光定量PCR仪孵育并同时检测荧光，或直接水浴最后肉眼观察荧光变化；
2、在CRISPR反应孵育开始时使用qPCR仪器读取FAM通道下的荧光值，37℃孵育20个循环，每个循环间隔1.5分钟，每次循环结束记录一次荧光信号，通过最终荧光信号强度判断Y453F检测结果，即荧光值大于3000代表Y453F检测阳性，荧光值小于2000代表Y453F检测阴性，若荧光值处于2000-3000之间则重新检测一次，若荧光值依然为2000-3000则判定Y453F检测阳性；若现场无qPCR等荧光读取仪器，亦可等反应完成后将反应管置于激发波长为485nm的透射光源下观察颜色变化确定检测结果；Y453F检测阳性的反应管会发出黄绿色荧光，Y453F检测阴性反应管则无荧光。
4.根据权利要求3所述的非诊断目的的检测筛查新冠病毒Y453F突变的方法，其特征在于：bμffer A溶液配置方法为：向1L水中加入50mmol的Tris缓冲液，100nmol的醋酸钾，20g的聚乙二醇粉末和2mmol二硫苏糖醇；BμfferB溶液为浓度为280mM的醋酸镁溶液。
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