CN113444777A - 一种用于碳青霉烯酶检测的CrRNA、CRISPR-Cas12a系统及应用 - Google Patents

一种用于碳青霉烯酶检测的CrRNA、CRISPR-Cas12a系统及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及医疗技术领域，提供了一种用于碳青霉烯酶检测的CrRNA，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示。所述CrRNA用于引导Cas12a蛋白识别并结合到经LAMP扩增的序列上以切割靶序列，同时，Cas12a蛋白反式切割反应体系内的任一单链DNA。本发明还提供了一种CRISPR‑Cas12a系统以及基于CRISPR‑Cas12a快速检测碳青霉烯酶的方法。同时，本发明还提供了一种CRISPR‑Cas12a系统在制备碳青霉烯酶检测试剂盒中的应用。本发明可作为临床大规模检测人群的方法，且相对传统诊断检测方式，本发明检测方式既大大地缩短了检测时间，也不需要反复训练的操作人员，同时秏价低。

Description

一种用于碳青霉烯酶检测的CrRNA、CRISPR-Cas12a系统及 应用
技术领域
本发明涉及医疗技术领域，尤其涉及一种用于碳青霉烯酶检测的CrRNA、CRISPR-Cas12a系统及应用。
背景技术
肺炎克雷伯菌是肠杆菌科克雷伯氏菌属中最为重要的一类菌(俗称肺炎杆菌)，其所致疾病占克雷伯氏菌属感染的95％以上。肺炎克雷伯菌感染人体后会出现咳嗽、咳痰、发热、寒战、呼吸困难等症状，其携带的“碳青霉烯酶类耐药基因”对抗生素的耐药性是目前全球关注的热点问题。这类耐药菌在医院内传播力强，引起的感染临床治疗手段有限，且效果不佳。因此，如何快速、有效、方便的进行分子检测至关重要，也是目前急需解决的问题。
目前，这类菌株在临床上的药敏检测方法包括纸片扩散法、E-test、肉汤微量稀释法以及微生物自动化药敏检测法；表型检测方法包括CarbaNP试验、mCIM试验(改良碳青霉烯灭活试验)和eCIM试验(EDTA碳青霉烯灭活试验)试验、酶抑制剂增强试验等；基因型检测方法包括PCR、多重PCR、巢式PCR、RT-PCR和微流控技术相结合来检测基因型或者通过测序来鉴定；由于需要昂贵的实验室仪器，而且这些方法所需时间均较长、操作复杂，普通实验室也很难开展。
为了满足快速和廉价诊断的需求，我们开发了一种基于CRISPR–Cas12a技术设计出的CrRNA与CRISPR-Cas12a系统，同时与免疫层析条耦联开发了一种快速(30-40分钟)检测临床样本中碳青霉烯酶的方法，对于临床快速诊断至关重要。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种用于碳青霉烯酶检测的用于碳青霉烯酶检测的CrRNA、CRISPR-Cas12a系统及应用。
本发明采用以下技术方案解决上述技术问题：
一种用于碳青霉烯酶检测的CrRNA，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示。
作为本发明的优选方式之一，所述CrRNA用于引导Cas12a蛋白识别并结合到经LAMP扩增的序列上以切割靶序列，同时，Cas12a蛋白反式切割反应体系内的任一单链DNA。
一种CrRNA在制备碳青霉烯酶检测产品中的应用。
一种检测碳青霉烯酶的CRISPR-Cas12a系统，包括上述crRNA。
作为本发明的优选方式之一，具体包括Cas12a蛋白、crRNA、异硫氰酸荧光素-猝灭剂双标记探针、LAMP扩增产物，或者，包括Cas12a蛋白、crRNA、荧光素-生物素双标记探针、LAMP扩增产物。
作为本发明的优选方式之一，所述LAMP扩增产物的扩增引物包括引物F3、引物B3、引物BIP、引物FIP、引物LB、引物LF，其序列分别如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7所示。
作为本发明的优选方式之一，所述系统还包括LAMP扩增体系和Cas12a裂解反应体系所需试剂。
作为本发明的优选方式之一，所述LAMP扩增体系如下：引物F3(0.2μM)、引物B3(0.2μM)、引物BIP(1.6μM)、引物FIP(1.6μM)、引物LB(0.4μM)、引物LF(0.4μM)、1.4mM dNTP、6mM MgSO4、1×等温扩增缓冲液、320U/mL Bst 2.0温启动DNA聚合酶、异硫氰酸荧光素、2μL靶DNA模板，并添加ddH2O至最终体积25μL。LAMP扩增条件为：阶段一：65℃扩增，1min；40个循环；阶段二：4℃保温。
作为本发明的优选方式之一，所述Cas12a裂解反应体系(25μL)如下：5μL NEB 3.1缓冲液、3μL crRNA(10μM)、1μL LbCas12a(40nM)、1μL异硫氰酸荧光素-猝灭剂双标记探针(60nM)、3ul LAMP扩增产物、ddH2O 12μL。
或者，所述Cas12a裂解反应体系(25μL)如下：5μL NEB 3.1缓冲液、3μLcrRNA(10μM)、1μL LbCas12a(40nM)、1μL荧光素-生物素双标记探针(60nM)、3ul LAMP扩增产物、12μLddH2O。
一种基于CRISPR-Cas12a快速检测碳青霉烯酶的方法，利用上述检测碳青霉烯酶的CRISPR-Cas12a系统对待测样品进行检测。
作为本发明的优选方式之一，当所述CRISPR-Cas12a系统采用Cas12a蛋白、crRNA、异硫氰酸荧光素-猝灭剂双标记探针和LAMP扩增产物时，通过观察Cas12a裂解反应后切割产物的荧光值来读取检测结果；
当所述CRISPR-Cas12a系统采用Cas12a蛋白、crRNA、荧光素-生物素双标记探针和LAMP扩增产物时，通过Cas12a裂解反应后的切割产物与胶体金免疫层析条的耦联反应，来读取检测结果。
一种CRISPR-Cas12a系统在制备碳青霉烯酶检测试剂盒中的应用，当所述CRISPR-Cas12a系统采用Cas12a蛋白、crRNA、异硫氰酸荧光素-猝灭剂双标记探针和LAMP扩增产物时，该试剂盒用于室内荧光检测；当所述CRISPR-Cas12a系统采用Cas12a蛋白、crRNA、荧光素-生物素双标记探针和LAMP扩增产物时，该试剂盒用于室外低资源条件下的免疫层析条快速检测。
本发明相比现有技术的优点在于：
(1)本发明的CrRNA可引导Cas12a蛋白结合到靶序列上识别并切割靶序列，同时，切割在反应体系的单链DNA报告分子；当单链DNA报告分子为异硫氰酸荧光素-猝灭剂双标记探针时，可配合荧光检测仪器直接读取检测结果；当单链DNA报告分子为荧光素-生物素双标记探针时，可配合免疫层析条读取检测结果；据此，本发明可作为临床大规模检测人群的方法，且相对传统诊断检测方式，本发明检测方式既大大地缩短了检测时间，也不需要反复训练的操作人员，同时秏价低。
(2)本发明建立在等温扩增的基础上，结合CRISPR-Cas12a的快速检测平台，为临床分子水平快速诊断的研究奠定坚实的理论基础。
(3)本发明以CRISPR为基础的技术提供了一种解决方案致力于目前临床快速诊断市场空缺的研究，更具有市场价值的创新性；将基础研究转向临床研究，具有转化的创新性。
(4)通过该技术可建立快速检测平台，该平台可应用于其他引起重大公共卫生问题的病原体，如新冠病毒、人乳头瘤病毒、新布尼亚病毒，且只需要改动其中的LAMP扩增引物和crRNA即可完成，即使在低资源环境条件下，也可提供了更多的诊断结果。
(5)由于不同耐药基因的基因型可出现部分改变，针对这些改变的基因型设计不同的gRNA识别不同的靶序列，可精确地对不同耐药基因进行精确分型，起到预防含碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌院内传播的作用；此外，该CrRNA-Cas12a蛋白复合物可用于其他扩增方法如：RPA、LAMP早期检测的检测试剂盒。
附图说明
图1是实施例1中CrRNA的设计思路图；
图2是实施例6基于CRISPR-Cas12a快速检测碳青霉烯酶的方法过程图；
图3是实施例6中LAMP扩增荧光定量图；
图4是实施例6中LAMP产物琼脂糖凝胶电泳结果图；
图5是实施例6中Cas12a反式切割过程原理图；
图6是实施例6中加入探针后的Cas12a蛋白反式切割荧光值图；
图7是实施例6中免疫胶体金平板设计原理图；
图8是实施例6中表示阳性结果时的层析条状态展示图；
图9是实施例6中表示阴性结果时的层析条状态展示图；
图10是实施例6中最终层析条状态图。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
本实施例的一种用于碳青霉烯酶检测的CrRNA。
CRISPR-Cas12a检测方法的核心在于CrRNA，故CrRNA的选择与最终检测方法的有效性直接相关。
本实施例CrRNA的碱基序列如SEQ ID NO.1所示，设计思路见图1(crRNA的设计根据Cas12a识别的PAM TTTN位点后面20个碱基得到)。该CrRNA用于引导Cas12a蛋白识别并结合到经LAMP扩增的序列上以切割靶序列，同时，Cas12a蛋白反式切割反应体系内的任一单链DNA。
具体地，所述反应体系内的任一单链DNA主要是CRISPR-Cas12a系统中的LAMP扩增引物，包括引物F3、引物B3、引物BIP、引物FIP、引物LB、引物LF，其序列分别如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7所示。
实施例2
本实施例的一种检测碳青霉烯酶的CRISPR-Cas12a系统，包括Cas12a蛋白、crRNA、异硫氰酸荧光素-猝灭剂双标记探针、LAMP扩增产物。其中，LAMP扩增产物的扩增引物包括：引物F3、引物B3、引物BIP、引物FIP、引物LB、引物LF，序列分别如SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7所示。
同时，CRISPR-Cas12a系统还包括LAMP扩增体系和Cas12a裂解反应体系所需的各试剂。
具体地，LAMP扩增体系如下：引物F3(0.2μM)、引物B3(0.2μM)、引物BIP(1.6μM)、引物FIP(1.6μM)、引物LB(0.4μM)、引物LF(0.4μM)、1.4mM dNTP、6mM MgSO4、1×等温扩增缓冲液、320U/mL Bst 2.0温启动DNA聚合酶、异硫氰酸荧光素、2μL靶DNA模板，并添加ddH2O至最终体积25μL。LAMP扩增条件为：阶段一：65℃扩增，1min；40个循环；阶段二：4℃保温。
Cas12a裂解反应体系(25μL)如下：5μL NEB 3.1缓冲液、3μL crRNA(10μM)、1μLLbCas12a(40nM)、1μL异硫氰酸荧光素-猝灭剂双标记探针(60nM)、3ul LAMP扩增产物、ddH2O 12μL。
实施例3
本实施例的一种基于CRISPR-Cas12a快速检测碳青霉烯酶的方法，利用实施例2的CRISPR-Cas12a系统对待测样品进行检测，方法如下：
一、待测样品DNA的提取：
采用煮沸法粗提样品DNA，并将其作为后续LAMP反应的DNA模板。
二、引物设计及LAMP扩增：
(1)使用primer explorerV5设计目的基因片段NDM的核苷酸序列LAMP引物与CrRNA并送往公司合成。其中，目的基因片段NDM为碳青霉烯酶NDM基因对应的从5‘端563号位开始的核苷酸序列，所述核苷酸序列的外引物F3、B3序列(5’-3’)如SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.3所示，内引物FIP、BIP序列(5’-3’)如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示。
(2)LAMP反应体系见表1，合成的引物根据说明书要求稀释至0.01mol/L。并且，LAMP的全部加样过程均在冰上操作完成。
表1LAMP反应体系
试剂 用量
WarmStart LAMP 2X Master Mix 12.5μL
DNA模板 3.0μL
外引物F3(0.2μM) 0.5μL
外引物B3(0.2μM) 0.5μL
内引物BIP(1.6μM) 1.0μL
内引物FIP(1.6μM) 1.0μL
环引物LB(0.4μM) 1.0μL
环引物LF(0.4μM) 1.0μL
FITC异硫氰酸荧光素 0.5μL
ddH<sub>2</sub>0 4.0μL
总计 25μL
(3)LAMP扩增条件见表2。
表2LAMP扩增条件
65℃ 扩增 40min
4℃ 保温
(4)配1％的琼脂糖凝胶，将LAMP产物(含loading buffer)和DNA Marker加入加样孔中，设置电压为118V，电泳30min后取出凝胶。
三、LAMP扩增产物的鉴定：
将扩增完毕的LAMP扩增产物置于凝胶成像系统中成像并拍取照片，观察琼脂糖存在梯状条带，即LAMP扩增完毕。
四、扩增片段被Cas12a蛋白切割、同时切割异硫氰酸荧光素-猝灭剂双标记探针：
(1)将设计完成的CrRNA与Cas12a蛋白、靶序列、异硫氰酸荧光素-猝灭剂双标记探针等按照表3反应体系进行加样，构建Cas12a裂解反应体系；
表3添加异硫氰酸荧光素-猝灭剂双标记探针的Cas12a裂解反应体系
试剂 用量
Cas12a蛋白 1.0μL
CrRNA 3.0μL
NEB Buffer 5.0μL
靶基因 3.0μL
异硫氰酸荧光素-猝灭剂双标记探针 1.0μL
ddH<sub>2</sub>0 12μL
总量 25μL
上述所有加样过程均在冰上操作完成。
(2)将加样完毕的反应体系在37℃下孵育1h，并利用7500荧光定量PCR仪观察切割后探针的荧光值；荧光值显著增加是阳性，表示含目的基因；荧光值无增加结果为阴性，表示不含目的基因。
实施例4
本实施例的一种检测碳青霉烯酶的CRISPR-Cas12a系统，包括Cas12a蛋白、crRNA、荧光素-生物素双标记探针、LAMP扩增产物。其中，LAMP扩增产物的扩增引物包括：引物F3、引物B3、引物BIP、引物FIP、引物LB、引物LF，序列分别如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7所示。
同时，CRISPR-Cas12a系统还包括LAMP扩增体系和Cas12a裂解反应体系所需的各试剂。
具体地，LAMP扩增体系如下：引物F3(0.2μM)、引物B3(0.2μM)、引物BIP(1.6μM)、引物FIP(1.6μM)、引物LB(0.4μM)、引物LF(0.4μM)、1.4mM dNTP、6mM MgSO4、1×等温扩增缓冲液、320U/mL Bst 2.0温启动DNA聚合酶、异硫氰酸荧光素、2μL靶DNA模板，并添加ddH2O至最终体积25μL。LAMP扩增条件为：阶段一：65℃扩增，1min；40个循环；阶段二：4℃保温。
Cas12a裂解反应体系(25μL)如下：5μL NEB 3.1缓冲液、3μL crRNA(10μM)、1μLLbCas12a(40nM)、1μL荧光素-生物素双标记探针(60nM)、3ul LAMP扩增产物、ddH2O 12μL。
实施例5
本实施例的一种基于CRISPR-Cas12a快速检测碳青霉烯酶的方法，利用实施例4的CRISPR-Cas12a系统对待测样品进行检测，完整方法如下：
一、待测样品DNA的提取：
采用煮沸法粗提样品DNA，并将其作为后续LAMP反应的DNA模板。
二、引物设计及LAMP扩增：
同实施例3。
三、LAMP扩增产物的鉴定：
同实施例3。
四、扩增片段被Cas12a蛋白切割、同时切割荧光素-生物素双标记探针：
(1)将设计完成的CrRNA、Cas12a蛋白、靶序列、荧光素-生物素双标记探针等按照表4反应体系进行加样，以构建Cas12a裂解反应体系；
表4添加荧光素-生物素双标记探针的Cas12a裂解反应体系
试剂 用量
Cas12a蛋白 1.0μL
CrRNA 3.0μL
NEB Buffer 5.0μL
靶基因 3.0μL
荧光素-生物素双标记探针 1.0μL
ddH<sub>2</sub>0 12μL
总量 25μL
上述所有加样步骤均在冰上完成。
(2)将水浴锅调至37℃，将加样好的切割体系放进水浴锅孵育20min，得切割产物备用；
五、胶体金纳米粒子和耦联物的制备：
(1)煮沸350mL(1mM)氯化金溶液(HAuCl4)。
(2)在煮沸完毕后搅拌并添加3.5mL 1％柠檬酸钠溶液。
(3)加入柠檬酸钠溶液后，这种混合物形成无颜色的溶液在煮沸10min后溶液变成酒红色，可在室温下冷却后使用。
(4)接着制备AuNP-抗生物素结合物，首先离心(12000×g，25min)收集1mL制备的胶体金纳米粒子溶液，浓缩4次。
(5)随后与100μL悬浮缓冲液(10％蔗糖，0.1％NaN3，5％BSA，0.25％吐温-20，20mMNa3PO4)混合；最后，添加0.5mg/mL的抗生物素抗体。
(6)在4℃下轻轻摇晃3h，离心(12000×g，25min)，然后用悬浮缓冲液冲洗三次，去除游离抗生物素抗体。将红色颗粒重新悬浮在100μL悬浮缓冲液中，然后分配到结合垫上。
六、胶体金免疫层析条的制备：
(1)样品垫、结合垫、硝化纤维膜构成了免疫层析条主要的三个部分。分别将抗FAM抗体和抗鼠IgG抗体分别涂在硝化纤维膜条(25mm宽)上形成对照区和试验区，并且保持测试线与对照线之间的距离大于5mm。
(2)试纸条的部分材料在22℃干燥12小时，并储存在干燥剂容器中直至使用，同时也是为了防止硝化纤维膜受潮影响实验结果。
(3)为了组装完整的检测条，将样品垫(16mm宽)浸入样品垫缓冲液(1％Triton，1％BSA，2％葡萄糖，50mm硼酸，pH 8.0)中，干燥并储存。所有的垫子沿着硝化纤维素膜的粘合部分依次组装，重叠2mm，然后切成0.4cm宽的条带。
(4)将自制的样品垫和吸收垫浸泡在由1％Triton，1％BSA，2％葡萄糖，50mM硼酸组成的pH 8.0缓冲液中，干燥并储存在干燥的容器。结合垫和吸收垫在没有缓冲处理的情况下使用，然后沿着硝酸纤维膜依次装配。
七、切割产物被胶体金免疫层析条捕获：
(1)在步骤四的切割产物中加入稀释液，稀释倍数根据目标物浓度确定，然后取上清80ul缓慢滴加在步骤六装配好的试纸条加样孔上，7-10分钟判读结果。
(2)当观察到检测线出现条带，或者，控制线和检测线同时出现条带，那么说明检测结果是阳性；当只有控制线出现条带，则表示结果为阴性。
实施例6
参照图2，本实施例的一种上述实施例中基于CRISPR-Cas12a快速检测碳青霉烯酶的方法的验证。
一、碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌的筛选及DNA的提取：
(1)碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌的筛选：
mCIM实验：取1ul接种环满环生长于血平板的过夜培养菌落，于2ml TSB肉汤中振荡混匀10-15s，每管放入一张美罗培南无菌纸片，确认纸片沉没于菌悬液中，37℃过夜培养，孵育结束后，立即用营养肉汤制备0.5麦氏单位的ATCC 25922菌悬液，菌悬液制备和平板涂布必须10-15min完成，干燥3-10min，用10ul的接种环从TSB肉汤中取出，轻贴于内壁，压干水分。
eCIM实验：同时，取第二支TSB的肉汤管，加入20ul 0.5M EDTA溶液2ml，使其最终浓度为5mM，取1ul接种环满环生长于血平板的过夜培养菌落，于2ml TSB肉汤中振荡混匀10-15s，每管放入一张美罗培南无菌纸片，确认纸片沉没于菌悬液中，37℃过夜培养，孵育结束后，立即用营养肉汤制备0.5麦氏单位的ATCC 25922菌悬液，菌悬液制备和平板涂布必须10-15分钟完成，干燥3-10分钟，用10ul的接种环从TSB肉汤中取出，轻贴于内壁，压干水分。
将mCIM和eCIM两张美罗培南纸片同贴于一块涂有大肠杆菌ATCC25922的MHA平板，观察抑菌圈情况。当mCIM阳性(抑菌圈直径为6mm)，eCIM阴性(抑菌圈直径＝6mm)，则报告产生含NDM的金属酶。
(2)肺炎克雷伯菌DNA提取：
选取经eCIM和mCIM筛选过确定的含碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌，调菌液浓度为2.0麦氏单位，100℃金属浴8min，然后12000rpm离心10min，取上清液，即目的基因(作为后续LAMP反应的DNA模板)。
二、引物设计及LAMP扩增：
(1)-(3)步骤同实施例3。
(4)观察荧光荧光值的情况；
结果图3所示。根据图3，可观察到荧光值出现峰值，表示扩增成功。
(5)配1％的琼脂糖凝胶，将LAMP产物(含loading buffer)和DNA Marker加入加样孔中，设置电压为118V，电泳30min后取出凝胶。
三、LAMP扩增产物的鉴定：
将扩增完毕的LAMP扩增产物置于凝胶成像系统中成像并拍取照片，观察琼脂糖存在梯状条带，如图4所示，即LAMP扩增完毕。
四、扩增片段被Cas12a蛋白切割、同时切割异硫氰酸荧光素-猝灭剂双标记探针(参见图5，图5中，BHQ表示猝灭剂，FITC表示异硫氰酸荧光素，在CrRNA的引导下，Cas12a蛋白结合到靶序列上识别并切割靶序列，同时反式切割反应体系内的单链报告分子，报告分子经切割后会发出荧光)：
(1)将设计完成的CrRNA与Cas12a蛋白、靶序列、异硫氰酸荧光素-猝灭剂双标记探针等按照表3反应体系进行加样，构建Cas12a裂解反应体系；
(2)将加样完毕的反应体系在37℃下孵育1h，并利用7500荧光定量PCR仪观察切割后探针的荧光值，结果如图6所示。由于随着探针被切割开，荧光素不受猝灭剂的影响发出荧光，荧光信号强度会显著增加，所以图6结果显示阳性结果，即表示样品中含目的基因。
据此，本发明的含异硫氰酸荧光素-猝灭剂双标记探针的CRISPR-Cas12a系统以及相应的检测方法可精准、快速的检测碳青霉烯酶，可行性高。
五、扩增片段被Cas12a蛋白切割、同时切割荧光素-生物素双标记探针：
(1)将设计完成的CrRNA、Cas12a蛋白、靶序列、荧光素-生物素双标记探针等按照表4反应体系进行加样，以构建Cas12a裂解反应体系；
(2)将水浴锅调至37℃，将加样好的切割体系放进水浴锅孵育20min，得切割产物备用；
六、胶体金纳米粒子和耦联物的制备：
同实施例5。
七、胶体金免疫层析条的制备：
同实施例5。
八、切割产物被胶体金免疫层析条捕获：
(1)在步骤五的切割产物中加入稀释液，稀释倍数根据目标物浓度确定，然后取上清80ul缓慢滴加在步骤七装配好的试纸条加样孔上，7-10分钟判读结果。
(2)免疫胶体金平板设计原理图如图7所示。当观察到检测线出现条带，或者，控制线和检测线同时出现条带，那么说明检测结果是阳性，提示样品含有NDM酶基因，如图8所示；当只有控制线出现条带，则表示结果为阴性，提示样品不含NDM酶基因，如图9所示。
(3)本实施例检测结果如图10所示，
据此，本发明的含荧光素-生物素双标记探针的CRISPR-Cas12a系统以及相应的检测方法也可精准、快速的检测碳青霉烯酶，可行性高。
但需注意的是，由于检测条件要求的差异性，“含异硫氰酸荧光素-猝灭剂双标记探针的CRISPR-Cas12a系统以及相应的检测方法”适用于室内环境检测，而“含荧光素-生物素双标记探针的CRISPR-Cas12a系统以及相应的检测方法”更适用于室外低资源条件下的快速检测。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 安徽医科大学第四附属医院
<120> 一种用于碳青霉烯酶检测的CrRNA、CRISPR-Cas12a系统及应用
<130> 2021
<160> 7
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 41
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 1
uaauuucuac uaaguguaga ucgccagcuc gcaccgaaug u 41
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cattagccgc tgcattgatg 20
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ccgccatccc tgacgatc 18
<210> 4
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tggttttccg ccagctcgca gcgactgccc cgaaac 36
<210> 5
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
atcgccaaac cgttggtcgc ccggtgaaat ccgcccg 37
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
accgaatgtc tggcagcaca 20
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
tccatttgct ggccaatcg 19

Claims (10)

1.一种用于碳青霉烯酶检测的CrRNA，其特征在于，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的用于碳青霉烯酶检测的CrRNA，其特征在于，所述CrRNA用于引导Cas12a蛋白识别并结合到经LAMP扩增的序列上以切割靶序列，同时，Cas12a蛋白反式切割反应体系内的任一单链DNA。
3.一种如权利要求1-2任一所述的CrRNA在制备碳青霉烯酶检测产品中的应用。
4.一种检测碳青霉烯酶的CRISPR-Cas12a系统，其特征在于，包括如权利要求1-2任一所述crRNA。
5.根据权利要求4所述的检测碳青霉烯酶的CRISPR-Cas12a系统，其特征在于，具体包括Cas12a蛋白、crRNA、异硫氰酸荧光素-猝灭剂双标记探针、LAMP扩增产物，或者，包括Cas12a蛋白、crRNA、荧光素-生物素双标记探针、LAMP扩增产物。
6.根据权利要求5所述的检测碳青霉烯酶的CRISPR-Cas12a系统，其特征在于，所述LAMP扩增产物的扩增引物包括引物F3、引物B3、引物BIP、引物FIP、引物LB、引物LF，其序列分别如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7所示。
7.根据权利要求5所述的检测碳青霉烯酶的CRISPR-Cas12a系统，其特征在于，其特征在于，所述系统还包括LAMP扩增体系和Cas12a裂解反应体系所需试剂。
8.一种基于CRISPR-Cas12a快速检测碳青霉烯酶的方法，其特征在于，利用如权利要求5-7任一所述的检测碳青霉烯酶的CRISPR-Cas12a系统对待测样品进行检测。
9.根据权利要求8所述的基于CRISPR-Cas12a快速检测碳青霉烯酶的方法，其特征在于，当所述CRISPR-Cas12a系统采用Cas12a蛋白、crRNA、异硫氰酸荧光素-猝灭剂双标记探针和LAMP扩增产物时，通过观察Cas12a裂解反应后切割产物的荧光值来读取检测结果；
当所述CRISPR-Cas12a系统采用Cas12a蛋白、crRNA、荧光素-生物素双标记探针和LAMP扩增产物时，通过Cas12a裂解反应后的切割产物与胶体金免疫层析条的耦联反应，来读取检测结果。
10.一种如权利要求5-7任一所述的检测碳青霉烯酶的CRISPR-Cas12a系统在制备碳青霉烯酶检测试剂盒中的应用，其特征在于，当所述CRISPR-Cas12a系统采用Cas12a蛋白、crRNA、异硫氰酸荧光素-猝灭剂双标记探针和LAMP扩增产物时，该试剂盒用于室内荧光检测；当所述CRISPR-Cas12a系统采用Cas12a蛋白、crRNA、荧光素-生物素双标记探针和LAMP扩增产物时，该试剂盒用于室外低资源条件下的免疫层析条快速检测。
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