CN103614465A - 用于检测革兰阴性杆菌常见碳青霉烯酶基因的lamp引物、试剂盒及其检测方法 - Google Patents
用于检测革兰阴性杆菌常见碳青霉烯酶基因的lamp引物、试剂盒及其检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了用于检测革兰阴性杆菌常见碳青霉烯酶基因的LAMP引物、试剂盒及其检测方法。本发明LAMP引物中，KPC和NDM引物组可检测到除NDM-10以外的所有亚型，IMP和VIM引物组可检测到国内外常见亚型。本发明建立的LAMP试剂盒用于联合检测KPC、NDM、IMP和VIM基因，可涵盖非发酵菌和肠杆菌科细菌常见的碳青霉烯酶基因，可准确快速的进行常见碳青霉烯酶基因的筛查，对于及时发现并进一步控制碳青霉烯酶基因在肠杆菌科细菌中传播导致的暴发流行具有重大的临床意义。本发明试剂盒检测灵敏度高，KPC、NDM、IMP和VIM基因的最低检测极限均可达到100CFU/反应。
Description
技术领域
本发明属于细菌耐药基因检测技术领域，特别涉及用于检测KPC、NDM、IMP和VIM基因的LAMP引物、试剂盒及其检测方法。
背景技术
碳青霉烯类抗生素是目前抗菌谱最广，抗菌活性最强的非典型b-内酰胺类抗菌药物。由于其对b-内酰胺酶稳定和毒性低的特点，该类药物已经成为目前治疗多种细菌感染的主要抗菌药物之一。然而，随着其临床应用日益广泛，碳青霉烯类抗生素不可避免地出现细菌耐药现象，这些菌株也大都表现为泛耐药。近年来，耐碳青霉烯的非发酵菌甚至肠杆菌科细菌的报道都越来越多，对于这种耐药菌株的快速检测并预防其流行在临床工作中极为重要。
近几年对于耐药性的调查研究显示，产碳青霉烯酶是细菌对碳青霉烯类抗生素耐药的主要原因。对于这类产酶菌株的监测最快速有效的方法是检测其耐药基因。针对临床常见且水解活性强的碳青霉烯酶进行分子生物学方法检测其相关基因成为急需的实验室技术。KPC（Klebsieila pneumoniae carbapenemase，KPC）是引起肠杆菌科细菌对碳青霉烯耐药的主要原因，而NDM（New Delhi metallo-b-lactamase）是引起世界关注的新发现的强水解活性的碳青霉烯酶，IMP和VIM（Verona integron-encoded MBL）是临床中常见的具有强水解碳青霉烯活性的金属b-内酰胺酶。上述四个基因可以涵盖非发酵菌和肠杆菌科细菌常见碳青霉烯酶基因，进行快速检测对于及时发现并进一步控制这类细菌的流行有很重要的临床意义。
目前用于检测碳青霉烯酶基因的主要技术是PCR，如多重PCR，荧光定量PCR。但这些方法或操作不够简化快捷，或检测成本高需要特殊仪器设备。而近几年新兴起的基因扩增方法，环介导等温扩增方法（Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP），主要是针对目的基因的6个区域设计4条特异性引物及2条辅助成环引物，在恒温条件下即可完成核酸扩增反应，且可以达到成本低，操作简便，检测时间短，灵敏特异的检测目的基因。这项技术自发现起已广泛用于检测细菌领域，并有相关专利获得授权。虽国内已有发明利用LAMP方法检测NDM-1（申请号20111029784.4），但由于NDM基因因存在位点的突变，有多个亚型，此发明不能满足NDM基因所有型别的检出。而且也没有IMP、VIM、KPC基因的检测。因此，对于碳青霉烯酶基因的检测是不够全面的。本发明更是针对上述四个基因国内临床常见亚型的基因保守区设计特异的LAMP引物，以便能更敏感特异的检出相应的基因片段。在引物设计的基础上，我们基于LAMP的方法建立了一种能对同一标本的KPC、NDM、IMP和VIM四种碳青霉烯酶基因进行检测的试剂盒。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一组用于检测细菌常见碳青霉烯酶基因（KPC、NDM、IMP和VIM）的LAMP引物，并建立一种常见碳青霉烯酶基因的LAMP检测试剂盒及其检测方法，以灵敏特异、简便快速的检测细菌常见碳青霉烯酶基因。
本发明所采取的技术方案是：
用于检测革兰阴性杆菌常见碳青霉烯酶基因的LAMP引物，包括KPC引物组、NDM引物组、IMP引物组和VIM引物组，其核苷酸序列分别如下所示：
1) KPC引物组：
外引物：
KF3：GTATCGCCGTCTAGTTCTG（SEQ ID NO.1），
KB3：TGAATGAGCTGCACAGTG（SEQ ID NO.2）；
内引物：
KFIP：AATGGTTCCGCGACGAGGCTGTCTTGTCTCTCATGGC（SEQ ID NO.3），
KBIP：GGACTTTGGCGGCTCCATGCGCGGTAACTTACAGTT（SEQ ID NO.4）；
环引物：
KLoopF：GGCAGAAAAGCCAGCCAG（SEQ ID NO.5），
KLoopB：CGATGGATACCGGCTCAG（SEQ ID NO.6）；
2) NDM引物组：
外引物：
NF3：AACACAGCCTGACTTTCG（SEQ ID NO.7），
NB3：GCTCATCACGATCATGCT（SEQ ID NO.8）；
内引物：
NFIP：ATGTCGGTGCCGTCGATCCCCGCTCAAGGTATTTTACC（SEQ ID NO.9），
NBIP：GCTTTTGGTGGCTGCCTGATCACCGAGATTGCCGAG（SEQ ID NO.10）；
环引物：
NLoopF：GATATTGTCACTGGTGTGGC（SEQ ID NO.11），
NLoopB：GGACAGCAAGGCCAAGTC（SEQ ID NO.12）；
3) IMP引物组：
外引物：
IF3：GGGCGTTGTTCCTAAACA（SEQ ID NO.13），
IB3：GCTTGAACCTTACCGTCTT（SEQ ID NO.14）；
内引物：
IFIP：ACGTTCCACAAACCAAGTGACTGGTTGTTCTTGTAGATGCTGA（SEQ ID NO.15），
IBIP：CAGCACGGGCGGAATAGAGGCTCATTAGTTAATTCAGACGC（SEQ ID NO.16）；
环引物：
ILoopF：TTAGCCGTAAATGGAGTGTCAA（SEQ ID NO.17），
ILoopB：TGGCTTAATTCTCAATCCATCC（SEQ ID NO.18）；
4) VIM引物组：
外引物：
VF3：CTTCGGTCCAGTAGAACTCT（SEQ ID NO.19），
VB3：GTGTGCTTGAGCAAGTCT（SEQ ID NO.20）；
内引物：
VFIP：TCGCACAACCACCATAGAGCGCATTCGACCGACAACTT（SEQ ID NO.21），
VBIP：GTTGTCACGCACGTCTGCGAATCCGCTCAATGGAGG（SEQ ID NO.22）；
环引物：
VLoopF：GACGGGACGTACACAACT（SEQ ID NO.23），
VLoopB：GATGCCGATCTGGCTGAA（SEQ ID NO.24）。
用于检测革兰阴性杆菌常见碳青霉烯酶基因的LAMP试剂盒，包括上述LAMP引物。
优选的，该试剂盒包括以下组份：（1）权利要求1所述的LAMP引物；（2）2×反应缓冲液；（3）DNA Bst聚合酶；（4）荧光指示剂或显色剂；（5）阳性对照；（6）阴性对照。
优选的，2×反应缓冲液包括：40mM Tris-HCl（pH 8.8），20mM KCl，16mM MgSO4，20mM (NH4)2SO4，0.2v/v% Tween-20，0.8M甜菜碱，2.8mM dNTPs。
优选的，阳性对照为分别为KPC、NDM、IMP和VIM基因阳性的四种DNA模板；阴性对照为灭菌双蒸水。
优选的，荧光指示剂为Syto-9，显色剂为SYBR-Green。
利用上述试剂盒检测革兰阴性杆菌常见碳青霉烯酶基因的方法，包括以下步骤：
1) 提取待检样本DNA；
2) 恒温扩增反应：配制反应体系：2×反应缓冲液12.5μl、DNA Bst聚合酶8U、KPC或NDM或IMP或VIM引物组、荧光指示剂0.5μl、待检样本DNA模板1μl、用灭菌双蒸水补齐至25μl，同时设置阳性对照和阴性对照；最后加入20μl无菌石蜡油，混匀，离心，将反应管置于荧光定量PCR仪，63℃扩增反应50分钟，于每分钟末进行荧光收集；
3) 结果判断：呈S型扩增曲线，且起峰时间小于40分钟，判定为阳性。
优选的，反应体系中，KPC引物组或NDM引物组或IMP引物组或VIM引物组的外引物各为5pmol、内引物各为40pmol、环引物各为20pmol。
利用上述试剂盒检测革兰阴性杆菌常见碳青霉烯酶基因的方法，包括以下步骤：
1) 提取待检样本DNA；
2) 恒温扩增反应：配制反应体系：2×反应缓冲液12.5μl、DNA Bst聚合酶8U、KPC引物组或NDM引物组或IMP引物组或VIM引物组、待检样本DNA模板1μl、用灭菌双蒸水补齐至25μl，同时设置阳性对照和阴性对照；加入20μl无菌石蜡油，混匀，离心，然后于反应管盖内侧加1μl显色剂；将反应管置于金属浴中，63℃扩增反应40分钟；
3) 结果判断：反应完成后，将反应液与显色剂混匀，呈现绿色为阳性，呈现橙色为阴性。
优选的，反应体系中，KPC引物组或NDM引物组或IMP引物组或VIM引物组的外引物各为5pmol、内引物各为40pmol、环引物各为20pmol。
本发明的有益效果是：
本发明建立的LAMP试剂盒用于联合检测KPC、NDM、IMP和VIM基因，可涵盖非发酵菌和肠杆菌科细菌常见的碳青霉烯酶基因，可准确快速的进行常见碳青霉烯酶基因的筛查，对于及时发现并进一步控制碳青霉烯酶基因在肠杆菌科细菌中传播导致的暴发流行具有重大的临床意义。
本发明操作简便，不需专门特殊仪器，只需荧光定量PCR仪或金属浴即可。
本发明LAMP引物中，KPC和NDM引物组可检测到除NDM-10以外的所有亚型，IMP和VIM引物组可检测到国内外常见亚型，满足流行病学监测的需求。
本发明LAMP引物具有高特异性，每种基因的检测需6个区域的引物均匹配，方可获得扩增，保证了检测结果的可靠性。
本发明试剂盒检测灵敏度高，KPC、NDM、IMP和VIM基因的最低检测极限均可达到100 CFU/反应。
附图说明
图1～4依次为本发明LAMP试剂盒荧光法检测KPC、NDM、IMP、VIM基因的扩增曲线；
图5为本发明LAMP试剂盒直接显色法检测KPC、NDM、IMP、VIM基因的检测结果图；
图6～9依次为本发明LAMP试剂盒检测KPC、NDM、IMP和VIM基因的敏感性评价结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明内容，但并不局限于此。
实施例1
常见碳青霉烯酶基因KPC、NDM、IMP、VIM的LAMP检测引物的设计与合成。
（1）引物设计方法：
在GeneBank上下载KPC、NDM、IMP和VIM基因所有亚型的序列。到目前为止KPC共14个亚型，分别为KPC-2，KPC-3，KPC-4，KPC-5，KPC-6，KPC-7，KPC-8，KPC-9，KPC-10，KPC-11，KPC-12，KPC-13， KPC-14， KPC-15，GeneBank序列号依次是AY034847，AF395881，FJ473382，EU400222，EU555534，EU729727，FJ234412，FJ624872，GQ140348，HM066995，HQ641421，HQ342889，JX524191，KC433553。NDM共10个亚型，分别为NDM-1，NDM-2，NDM-3，NDM-4，NDM-5，NDM-6，NDM-7，NDM-8，NDM-9，NDM-10，对应的GeneBank序列号分别是AB614355，JF703135，JQ734687，JQ348841，JN104597，JN967644；JX412225，AB744718，KC999080，KF361506。IMP有40多个亚型，其中我国有报道的型别以IMP-4为主，对应的GeneBank序列号为AF244145。VIM共有38个亚型，我国的临床常见亚型为型VIM-2，GeneBank序列号为AF291438。分别针对KPC、NDM、IMP和VIM基因各亚型间保守区域的6个节段设计4条特异引物和2条特异环引物，尽量使引物与模板的结合点避开突变区域。设计好的引物通过Oligo6.44、DNAstar、Primer Premier5.0等多种软件进行评估，将每个基因的6条引物在NCBI数据库上BLAST均未见除目的基因外的其他同源序列。
（2）引物序列
KPC引物组：
KPC的外引物：
KF3：GTATCGCCGTCTAGTTCTG（SEQ ID NO.1）；
KB3：TGAATGAGCTGCACAGTG（SEQ ID NO.2）；
KPC的内引物：
KFIP：AATGGTTCCGCGACGAGGCTGTCTTGTCTCTCATGGC（SEQ ID NO.3）；
KBIP：GGACTTTGGCGGCTCCATGCGCGGTAACTTACAGTT（SEQ ID NO.4）；
KPC的环引物：
KLoopF：GGCAGAAAAGCCAGCCAG（SEQ ID NO.5）；
KLoopB：CGATGGATACCGGCTCAG（SEQ ID NO.6）。
NDM引物组：
NDM的外引物：
NF3：AACACAGCCTGACTTTCG（SEQ ID NO.7）；
NB3：GCTCATCACGATCATGCT（SEQ ID NO.8）；
NDM的内引物：
NFIP：ATGTCGGTGCCGTCGATCCCCGCTCAAGGTATTTTACC（SEQ ID NO.9）；
NBIP：GCTTTTGGTGGCTGCCTGATCACCGAGATTGCCGAG（SEQ ID NO.10）；
NDM的环引物：
NLoopF：GATATTGTCACTGGTGTGGC（SEQ ID NO.11）；
NLoopB：GGACAGCAAGGCCAAGTC（SEQ ID NO.12）。
IMP引物组：
IMP的外引物：
IF3：GGGCGTTGTTCCTAAACA（SEQ ID NO.13）；
IB3：GCTTGAACCTTACCGTCTT（SEQ ID NO.14）；
IMP的内引物：
IFIP：ACGTTCCACAAACCAAGTGACTGGTTGTTCTTGTAGATGCTGA（SEQ ID NO.15）；
IBIP：CAGCACGGGCGGAATAGAGGCTCATTAGTTAATTCAGACGC（SEQ ID NO.16）；
IMP的环引物：
ILoopF：TTAGCCGTAAATGGAGTGTCAA（SEQ ID NO.17）；
ILoopB：TGGCTTAATTCTCAATCCATCC（SEQ ID NO.18）。
VIM引物组：
VIM的外引物：
VF3：CTTCGGTCCAGTAGAACTCT（SEQ ID NO.19）；
VB3：GTGTGCTTGAGCAAGTCT（SEQ ID NO.20）；
VIM的内引物：
VFIP：TCGCACAACCACCATAGAGCGCATTCGACCGACAACTT（SEQ ID NO.21）；
VBIP：GTTGTCACGCACGTCTGCGAATCCGCTCAATGGAGG（SEQ ID NO.22）；
VIM的环引物：
VLoopF：GACGGGACGTACACAACT（SEQ ID NO.23）；
VLoopB：GATGCCGATCTGGCTGAA（SEQ ID NO.24）。
（3）引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。
实施例2
建立用于检测KPC、NDM、IMP和VIM基因的LAMP试剂盒。
1、LAMP试剂盒内包含反应试剂、无菌石蜡油、阳性对照和阳性对照。其中，反应试剂包含2×反应缓冲液（40mM Tris-HCl pH 8.8，20mM KCl，16mM MgSO4，20mM (NH4)2SO4，0.2v/v% Tween-20，0.8M甜菜碱，2.8mM dNTPs）、DNA Bst聚合酶、引物组（内引物、外引物、环引物）、指示剂荧光指示剂Syto-9或显色剂SYBR-Green、灭菌双蒸水；阳性对照为KPC、NDM、IMP和VIM基因的阳性对照株，即经常规PCR法检测并测序验证KPC、NDM、IMP和VIM基因的阳性标本的DNA，本实施例所用阳性标本为GeneBank序列号分别为JF431928、JN711113、KF184385和KF255586的DNA；阴性对照为灭菌双蒸水。
每个基因所对应的引物组如实施例1中所述。
结果的检测根据所加入的指示剂不同而不同。加入荧光指示剂的反应体系用荧光定量PCR仪（如美国ABI7500FAST）进行反应的实时监测。阳性标本的荧光信号会随着反应时间推进而出现类似的S型扩增曲线。有“S”型扩增曲线且扩增值超过设定的阈值为阳性，无“S”型扩增曲线为阴性。加入显色剂的反应体系，通过将反应后的LAMP扩增产物与其混合出现颜色的不同而判断为阴性或阳性，混合液为绿色判为阳性，橙色判为阴性。
2、建立用于检测KPC、NDM、IMP和VIM基因的LAMP检测方法。
（1）利用TaKaRa MiniBEST DNA Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0试剂盒提取细菌基因组DNA。通过Thermo公司核酸分析仪NanoDrop测定OD260值以确定DNA浓度，并保存于-20℃备用。
（2）使用步骤1中制备的试剂盒，分别用荧光法和直接显色法两种反应体系进行LAMP扩增。
荧光法：每个反应管中加入2×反应缓冲液12.5 μl、DNA Bst聚合酶（8U/μl）1.0μl、内引物（FIP、BIP）各40 pmol、外引物（F3、B3）各5 pmol、环引物（LoopF、LoopB）各20 pmol、荧光指示剂0.5 μl、待检测DNA模板或阳性对照或阴性对照1μl、用灭菌双蒸水补齐至25 μl，最后加入20μl无菌石蜡油，混匀并瞬时离心。将反应管置于美国ABI7500FAST荧光定量PCR仪进行实时检测，扩增条件为：63℃ 50分钟，于每分钟末进行荧光收集，荧光通道选择FAM。扩增曲线横坐标为扩增时间。
直接显色法：每个反应管包括2×反应缓冲液12.5 μl、DNA Bst聚合酶（8U/μl）1.0 μl、内引物（FIP、BIP）各40 pmol、外引物（F3、B3）各5 pmol、环引物（LoopF、LoopB）各20 pmol、待检测DNA模板或阳性对照或阴性对照1μl，用灭菌双蒸水补齐至25 μl，最后加入20μl无菌石蜡油混匀并瞬时离心，然后于反应管盖内侧加1 μl显色剂。将反应管置于金属浴中进行扩增，通过反应后颜色的变化判断结果。扩增条件为：63℃ 40分钟。
（3）荧光法结果判定：有明显的S型扩增曲线，起峰时间小于40分钟，为阳性。无S型扩增曲线，则为阴性。
显色法结果判定：反应完成后，将反应缓冲液与管盖内侧的显色液混匀，呈现绿色为阳性，呈现橙色为阴性。
实施例3
对本发明LAMP检测试剂盒的评价。
（1）LAMP试剂盒检测KPC、NDM、IMP和VIM基因的特异性评价。
对本发明试剂盒特异性的评价，通过用本发明检测不含KPC、NDM、IMP和VIM基因的菌株DNA模板来实现。所用到的菌株为标准株大肠埃希菌ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC27853 、肺炎克雷伯菌ATCC70060和金黄色葡萄球菌ATCC25923，以试剂盒中提供的相应阳性对照模板作阳性对照，以灭菌双蒸水为阴性对照，按照实施例2中涉及的两种检测方法分别进行LAMP试验。
结果显示，荧光法检测，在荧光定量PCR仪上，这四个基因的阳性对照扩增后可见S型曲线，指数期明显，起峰时间均小于30分钟，而标准株大肠埃希菌ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC27853、肺炎克雷伯菌ATCC70060和金黄色葡萄球菌ATCC25923的反应管与阴性对照一样均无扩增，结果如图1～4所示。其中，图1为本发明LAMP试剂盒荧光法检测KPC基因的扩增曲线，图2为本发明LAMP试剂盒荧光法检测NDM基因的扩增曲线，图3为本发明LAMP试剂盒荧光法检测IMP基因的扩增曲线，图4为本发明LAMP试剂盒荧光法检测VIM基因的扩增曲线，图1～4中，曲线1为各基因的阳性对照，曲线2为大肠埃希菌ATCC25922，曲线3为铜绿假单胞菌ATCC27853，曲线4为肺炎克雷伯菌ATCC70060，曲线5为金黄色葡萄球菌ATCC25923，曲线6为阴性对照。
直接显色法检测，结果与荧光法的结果一致：四个基因的阳性对照均在反应结束后呈绿色，而标准菌株和阴性对照均为橙色。结果如图5所示，从上至下A、B、C、D依次为KPC、NDM、IMP和VIM基因的检测结果，其中，反应管1为阳性对照，反应管2为大肠埃希菌ATCC25922，反应管3为铜绿假单胞菌ATCC27853，反应管4为肺炎克雷伯菌ATCC70060，反应管5为金黄色葡萄球菌ATCC25923，反应管6为阴性对照。
结果表明，采用本发明建立的LAMP试剂盒及其反应体系和检测方法，检测常见碳青霉烯酶基因方法有良好的特异性。
（2）LAMP试剂盒检测KPC、NDM、IMP和VIM基因的敏感性评价。
用KPC、NDM、IMP和VIM基因的阳性对照株（分别是JF431928、JN711113、KF184385和NF112173）作为敏感性的参考菌株，进行本发明LAMP试剂盒的敏感性检测。以这四株菌提取的DNA模板为初始浓度，初始浓度均调至105 CFU/μl，然后分别进行10倍的系列梯度稀释，最终使在各反应管中DNA的量分别为105，104，103，102，10，1 CFU。按照实施例2中所述的两种检测方法分别进行LAMP试验，检测这四个基因的敏感性，同时将灵敏度与常规PCR方法比较。
常规PCR扩增体系和反应条件：
检测KPC、NDM、IMP和VIM基因所用引物序列如下：
KPC-F ATGTCACTGTATCGCCGTCT（SEQ ID NO.25）；
KPC-R TTTTCAGAGCCTTACTGCCC（SEQ ID NO.26）；
NDM-F CACCTCATGTTTGAATTCGCC（SEQ ID NO.27）；
NDM-R CTCTGTCACATCGAAATCGC（SEQ ID NO.28）；
IMP-F TTTGTTTTGTAGCATTGC（SEQ ID NO.29）；
IMP-R CTTTCGTTTAACCCTTTA（SEQ ID NO.30）；
VIM-F GCGTCTATCATGGCTATTG（SEQ ID NO.31）；
VIM-R TCAACGACTGAGCGATTT（SEQ ID NO.32）。
扩增反应体系为20μl：含Mg2+的10×buffer 2μl，dNTP 终浓度为200μmol/L，上下游引物终浓度分别为0.4μmol/L，DNA模板1μl，TaqDNA聚合酶1 U，加入灭菌去离子水至20μl。
反应条件：95℃预变性5min；95℃变性15s，60℃退火并延伸1min，40个循环。
取5μl扩增产物与1μl 6×Loading buffer上样缓冲液混匀，在含EB的1%琼脂糖凝胶中电泳，Bio-Rad GeldocXR凝胶成像仪读取电泳结果。
结果如图6～9所示，其中，图6为KPC基因的三种检测方法敏感性的比较，图7为NDM基因的三种检测方法敏感性的比较，图8为IMP基因的三种检测方法敏感性的比较，图9为VIM基因的三种检测方法敏感性的比较。可见，荧光法检测可达到104稀释倍数即10 CFU/ 反应，直接显色法能达到103稀释倍数即100 CFU/反应。虽然常规PCR方法检测灵敏度亦可达到100 CFU/反应，但其检测步骤较直接显色法更为繁琐。
（3）LAMP试剂盒检测KPC、NDM、IMP和VIM基因的临床菌株评价。
以临床分离的180株耐碳青霉烯革兰阴性杆菌基因组DNA为模板，利用实施例2建立的LAMP试剂盒进行KPC、NDM、IMP和VIM基因的检测。结果显示：KPC基因阳性的有8株肺炎克雷伯菌；NDM阳性的有1株产酸克雷伯菌、3株肺炎克雷伯菌、2株阴性沟肠杆菌、2株不动杆菌；IMP阳性的为1株产气肠杆菌、1株肺炎克雷伯菌；VIM阳性的为13株铜绿假单胞菌；其余菌株均为阴性，未见同时携带有两个或以上基因的菌株。结果与常规PCR扩增后的测序结果一致。
本发明建立的LAMP试剂盒检测肠杆菌科细菌中常见碳青霉烯霉基因KPC、NDM、IMP和VIM。对于KPC和NDM基因，其引物均针对所有亚型保守区设计，可检测到除NDM-10以外的所有亚型。IMP和VIM由于亚型种类多，保守区较短，针对国内外较常见的亚型的保守区进行引物设计，可满足流行病学监测需求。从实验结果来看，本试剂盒敏感特异，可准确快速的进行常见碳青霉烯酶基因的筛查，以有效防止KPC、NDM、IMP和VIM基因在肠杆菌科细菌传播导致的暴发流行。
<110> 南方医科大学
<120> 用于检测革兰阴性杆菌常见碳青霉烯酶基因的LAMP引物、试剂盒及其检测方
法
<130>
<160> 32
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gtatcgccgt ctagttctg 19
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<213> 人工序列
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tgaatgagct gcacagtg 18
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<212> DNA
<213> 人工序列
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aatggttccg cgacgaggct gtcttgtctc tcatggc 37
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<213> 人工序列
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ggactttggc ggctccatgc gcggtaactt acagtt 36
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<211> 18
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<213> 人工序列
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ggcagaaaag ccagccag 18
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<211> 18
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<213> 人工序列
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cgatggatac cggctcag 18
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<213> 人工序列
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aacacagcct gactttcg 18
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
gctcatcacg atcatgct 18
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<212> DNA
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<400> 9
atgtcggtgc cgtcgatccc cgctcaaggt attttacc 38
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<213> 人工序列
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gcttttggtg gctgcctgat caccgagatt gccgag 36
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gatattgtca ctggtgtggc 20
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ggacagcaag gccaagtc 18
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<211> 18
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gggcgttgtt cctaaaca 18
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<213> 人工序列
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gcttgaacct taccgtctt 19
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<213> 人工序列
<400> 15
acgttccaca aaccaagtga ctggttgttc ttgtagatgc tga 43
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
cagcacgggc ggaatagagg ctcattagtt aattcagacg c 41
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<213> 人工序列
<400> 17
ttagccgtaa atggagtgtc aa 22
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tggcttaatt ctcaatccat cc 22
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cttcggtcca gtagaactct 20
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tcgcacaacc accatagagc gcattcgacc gacaactt 38
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gttgtcacgc acgtctgcga atccgctcaa tggagg 36
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gacgggacgt acacaact 18
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gatgccgatc tggctgaa 18
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atgtcactgt atcgccgtct 20
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ttttcagagc cttactgccc 20
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cacctcatgt ttgaattcgc c 21
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ctctgtcaca tcgaaatcgc 20
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tttgttttgt agcattgc 18
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gcgtctatca tggctattg 19
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<213> 人工序列
<400> 32
tcaacgactg agcgattt 18
Claims (10)
1. 用于检测革兰阴性杆菌常见碳青霉烯酶基因的LAMP引物，包括KPC引物组、NDM引物组、IMP引物组和VIM引物组，其核苷酸序列分别如下所示：
1) KPC引物组：
外引物：
KF3：GTATCGCCGTCTAGTTCTG（SEQ ID NO.1），
KB3：TGAATGAGCTGCACAGTG（SEQ ID NO.2）；
内引物：
KFIP：AATGGTTCCGCGACGAGGCTGTCTTGTCTCTCATGGC（SEQ ID NO.3），
KBIP：GGACTTTGGCGGCTCCATGCGCGGTAACTTACAGTT（SEQ ID NO.4）；
环引物：
KLoopF：GGCAGAAAAGCCAGCCAG（SEQ ID NO.5），
KLoopB：CGATGGATACCGGCTCAG（SEQ ID NO.6）；
2) NDM引物组：
外引物：
NF3：AACACAGCCTGACTTTCG（SEQ ID NO.7），
NB3：GCTCATCACGATCATGCT（SEQ ID NO.8）；
内引物：
NFIP：ATGTCGGTGCCGTCGATCCCCGCTCAAGGTATTTTACC（SEQ ID NO.9），
NBIP：GCTTTTGGTGGCTGCCTGATCACCGAGATTGCCGAG（SEQ ID NO.10）；
环引物：
NLoopF：GATATTGTCACTGGTGTGGC（SEQ ID NO.11），
NLoopB：GGACAGCAAGGCCAAGTC（SEQ ID NO.12）；
3) IMP引物组：
外引物：
IF3：GGGCGTTGTTCCTAAACA（SEQ ID NO.13），
IB3：GCTTGAACCTTACCGTCTT（SEQ ID NO.14）；
内引物：
IFIP：ACGTTCCACAAACCAAGTGACTGGTTGTTCTTGTAGATGCTGA（SEQ ID NO.15），
IBIP：CAGCACGGGCGGAATAGAGGCTCATTAGTTAATTCAGACGC（SEQ ID NO.16）；
环引物：
ILoopF：TTAGCCGTAAATGGAGTGTCAA（SEQ ID NO.17），
ILoopB：TGGCTTAATTCTCAATCCATCC（SEQ ID NO.18）；
4) VIM引物组：
外引物：
VF3：CTTCGGTCCAGTAGAACTCT（SEQ ID NO.19），
VB3：GTGTGCTTGAGCAAGTCT（SEQ ID NO.20）；
内引物：
VFIP：TCGCACAACCACCATAGAGCGCATTCGACCGACAACTT（SEQ ID NO.21），
VBIP：GTTGTCACGCACGTCTGCGAATCCGCTCAATGGAGG（SEQ ID NO.22）；
环引物：
VLoopF：GACGGGACGTACACAACT（SEQ ID NO.23），
VLoopB：GATGCCGATCTGGCTGAA（SEQ ID NO.24）。
2. 用于检测革兰阴性杆菌常见碳青霉烯酶基因的LAMP试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括权利要求1所述的LAMP引物。
3. 根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括以下组份：（1）权利要求1所述的LAMP引物；（2）2×反应缓冲液；（3）DNA Bst聚合酶；（4）荧光指示剂或显色剂；（5）阳性对照；（6）阴性对照。
4. 根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：2×反应缓冲液包括：40mM Tris-HCl（pH 8.8），20mM KCl，16mM MgSO4，20mM (NH4)2SO4，0.2v/v% Tween-20，0.8M甜菜碱，2.8mM dNTPs。
5. 根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：阳性对照为分别为KPC、NDM、IMP和VIM基因阳性的四种DNA模板；阴性对照为灭菌双蒸水。
6. 根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：荧光指示剂为Syto-9，显色剂为SYBR-Green。
7. 利用权利要求2～6任意一项所述的试剂盒检测革兰阴性杆菌常见碳青霉烯酶基因的方法，包括以下步骤：
1) 提取待检样本DNA；
2) 恒温扩增反应：配制反应体系：2×反应缓冲液12.5μl、DNA Bst聚合酶8U、KPC或NDM或IMP或VIM引物组、荧光指示剂0.5μl、待检样本DNA模板1μl、用灭菌双蒸水补齐至25μl，同时设置阳性对照和阴性对照；最后加入20μl无菌石蜡油，混匀，离心，将反应管置于荧光定量PCR仪，63℃扩增反应50分钟，于每分钟末进行荧光收集；
3) 结果判断：呈S型扩增曲线，且起峰时间小于40分钟，判定为阳性。
8. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于：反应体系中，KPC引物组或NDM引物组或IMP引物组或VIM引物组的外引物各为5pmol、内引物各为40pmol、环引物各为20pmol。
9. 利用权利要求2～6任意一项所述的试剂盒检测革兰阴性杆菌常见碳青霉烯酶基因的方法，包括以下步骤：
1) 提取待检样本DNA；
2) 恒温扩增反应：配制反应体系：2×反应缓冲液12.5μl、DNA Bst聚合酶8U、KPC引物组或NDM引物组或IMP引物组或VIM引物组、待检样本DNA模板1μl、用灭菌双蒸水补齐至25μl，同时设置阳性对照和阴性对照；加入20μl无菌石蜡油，混匀，离心，然后于反应管盖内侧加1μl显色剂；将反应管置于金属浴中，63℃扩增反应40分钟；
3) 结果判断：反应完成后，将反应液与显色剂混匀，呈现绿色为阳性，呈现橙色为阴性。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：反应体系中，KPC引物组或NDM引物组或IMP引物组或VIM引物组的外引物各为5pmol、内引物各为40pmol、环引物各为20pmol。
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