CN101899521B - 一组用于广州管圆线虫环介导等温扩增检测方法中的特异性引物组 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别是用于寄生虫病快速检测技术中的一种利用环介导等温扩增技术快速检测广州管圆线虫的方法。该方法包括两对用于检测广州管圆线虫的环介导等温扩增引物FIP、BIP、F3与B3，和一种利用上述两对引物检测广州管圆线虫的LAMP方法，其中包括反应模板的制备、LAMP反应体系、LAMP反应程序和检测结果判断。其操作简便、成本低廉，结果易于观察，非常适用于广州管圆线虫的现场快速检测。

Description

一组用于广州管圆线虫环介导等温扩增检测方法中的特异性引物组

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是用于寄生虫病快速检测技术中的一种广州管圆线虫环介导等温扩增检测方法。 

背景技术

广州管圆线虫(Angiostrongylus cantonensis)最早是由我国著名的陈心陶教授首次在广州家鼠肺血管内发现并命名的。螺、蛞蝓是主要的中间宿主，人因进食了含有广州管圆线虫幼虫的生或半生的螺肉而感染广州管圆线虫病，又称嗜酸性粒细胞增多性脑脊髓膜炎。广州管圆线虫幼虫主要侵犯人体中枢神经系统，表现为脑膜和脑炎、脊髓膜炎和脊髓炎，可使人致死或致残。临床主要症状为急剧的头痛，甚至不能受到任何震动，走路、坐下、翻身时头痛都会加剧，伴有恶心呕吐、颈项强直、活动受限、抽搐等症状，重者可导致瘫痪、死亡。诊断治疗及时的情况下，绝大多数病人预后良好。极个别感染虫体数量多者，病情严重可致死亡，或留有后遗症。广州管圆线虫病广泛流行于我国台湾、广东、浙江、黑龙江等地，近年来在北京、浙江温州、福建等地均有爆发流行，严重危害人体健康，应引起广泛的重视。 

广州管圆线虫感染常用的检测方法包括病原学检查和免疫学诊断，病原学检查主要是脑脊液中查广州管圆线虫虫体，但概率很小。从我国目前的病例统计看，病原检出率仅为4.8％；免疫学诊断方法中的抗体检测特异性不高，不能区分现症和既往感染，与其他寄生虫存在着交叉反应，而抗原的检测虽然特异性较强，但敏感性不高。为有效控制广州管圆线虫病，需要建立高度敏感、特异和简便的检测技术。聚合酶链反应(PCR)具有极高的灵敏度和特异性，并已应用于多种寄生虫病的诊断，但PCR需要精密仪器的配套使用，无法满足基层和现场检测的需求。 

Notomi T等在2000年开发了一种新颖的恒温核酸扩增方法，即环媒恒温扩增法(Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP)，其原理是利用Bst(Bacillus stearothermophilus)大片段DNA聚合酶和根据不同靶序列设计的 两对特殊的内引物(FIP由F1C和F2组成；BIP由B1C和B2组成)、外引物(F3和B3)，特异地识别靶序列上的6个独立区域，在等温条件下进行靶序列高效快速扩增。 

LAMP技术从2003年开始逐步用于医学检测，目前主要是应用于病原微生物的检测和传染性疾病的诊断，应用环介导等温DNA扩增技术(LAMP)快速检测广州管圆线虫18s rRNA基因目前国内外文献尚无报道。 

发明内容

本发明的目的是提供一种基于环介导等温DNA扩增技术(LAMP)检测广州管圆线虫高灵敏度、高特异性的检测方法，使其操作简便、成本低廉，结果易于观察，适用于广州管圆线虫的现场快速检测。 

本发明是根据环介导等温扩增(LAMP)技术原理，针对广州管圆线虫的特异性片段设计4条引物，识别靶序列的6个区域，利用BstDNA酶的链置换特性，在等温条件下生成大量重复的茎环状结构；设计扩增广州管圆线虫18s rRNA基因的4条特异性引物： 

FIP：5’-CCTGGTGGTGCCATTCCGTCTCTTTCGGTTCCTGGGGTAG-3’ 

BIP：5’-GCCCGGACACCGTAAGGATTGCACCACCAACCACCAAAT-3’ 

F3：5’-TTGTCGAGGAGCTTCCCG-3’ 

B3：5’-CACCAACTAAGAACGGCCAT-3’ 

提取样品DNA后，环介导等温扩增(LAMP)反应体系扩增靶DNA，LAMP检测体系由一套设计的引物、10×LAMP反应液、DNA聚合酶、阳性对照、阴性对照和显色剂组成，并对LAMP反应条件进行优化，特异性和重复性检验证实该方法可靠性强。 

本发明的广州管圆线虫LAMP检测试剂包括LAMP反应液，与4条LAMP引物共同构成LAMP检测体系，25μl LAMP检测体系的具体配置为： 

25ul LAMP反应体系的具体配置： 

F3、B3                                      0.1～0.2μM 

FIP、BIP                                    1.2～1.6μM 

dNTP                                        1.4～2.8mM 

Mg2+                                        6～16mM 

反应缓冲液10×ThermoPol Reaction Buffer 

链置换DNA聚合酶BstDNA polymerase            8U 

甜菜碱betaine                                        1.0～1.6M 

本发明所述广州管圆线虫环介导等温扩增检测方法，反应条件为：63℃恒温60分钟，80℃5分钟终止反应。 

由于LAMP的扩增效率非常高，产生大量的焦磷酸镁，可直接通过肉眼观察是否有白色的焦磷酸镁沉淀来判断是否生成焦磷酸离子，出现白色沉淀为阳性结果，未出现白色沉淀为阴性结果。或者通过SYBR Green I染色剂颜色变化来判断靶基因是否存在，反应后的混合液中加入染色剂SYBR Green-I，出现绿色的为阳性结果，橙色的是阴性结果。 

另一种检测结果的方法是取反应后的混合液2μl，加入0.5μl溴酚蓝上样缓冲液，在2％的琼脂糖凝胶中电泳，电压为100v，时间为30min，溴化乙锭(EB)染色后在紫外灯下观察，出现梯度条带为阳性结果，如未出现则为阴性结果。 

本发明在定性检测时可不需任何特殊设备。该方法与常规检测方法相比，具有操作简便快速、敏感特异、无需特殊仪器、检测时间比普通PCR短等特点，适合于广州管圆线虫病现场快速检测。 

附图说明

1、图1是LAMP检测广州管圆线虫的敏感性试验，采用SYBR Green I染色方法检测。1)是阴性对照，2)阳性对照，3)是100pg模板DNA，4)是10pg模板DNA，5)是1pg模板DNA，6)是100fg模板DNA，7)是10fg模板DNA，8)是1fg模板DNA，9)是0.1fg模板DNA，10)是0.01fg模板DNA。从结果可看出，LAMP检测广州管圆线虫的最低检测量是1fg。 

2、图2是LAMP检测广州管圆线虫的敏感性试验，采用电泳方法检测。1)是DNA标志物DL2000，2)是阴性对照，3)是阳性对照，4)是100pg模板DNA，5)是10pg模板DNA，6)是1pg模板DNA，7)是100fg模板DNA，8)是10fg模板DNA，9)是1fg模板DNA，10)是0.1fg模板DNA，11)是0.01fg模板DNA。从结果可看出，LAMP检测广州管圆线虫的最低检测量是1fg。 

3、图3是LAMP检测广州管圆线虫的特异性试验，采用SYBR Green I染色方法检测。1)是阴性对照，2)是广州管圆线虫DNA样本，3)是疟原虫DNA样本，4)是弓形虫DNA样本，5)是血吸虫DNA样本，6)是异尖线虫DNA样本。从结果可看出，广州管圆线虫样本显示为阳性，其他样本均为阴性，表明与其他寄生虫无交叉反应。 

4、图4是LAMP检测广州管圆线虫的特异性试验，采用电泳方法检测。1)是DNA标志物DL2000，2)是阴性对照，3)是广州管圆线虫DNA样本，4)是疟原虫DNA样本，5)是弓形虫DNA样本，6)是血吸虫DNA样本，7)是异尖线虫DNA样本。从结果可看出，广州管圆线虫样本显示为阳性，其他样本均为阴性，表明与其他寄生虫无交叉反应。 

具体实施方式

以下实施例用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。 

如无特别指明，实验所用的引物由上海生工生物技术有限公司合成；BstDNA聚合酶(大片段购自New England公司；甜菜碱(Betaine)、Mg²⁺购自SIGMA公司。 

实施例： 

一、特异性DNA序列查找： 

从美国基因数据库-GENBANK检索获得广州管圆线虫18s rRNA基因序列，登录号为AY295804.1，针对该保守靶序列进行LAMP引物设计，该特异性靶序列为： 

  1 attaagccat gcatgaggag ttcagcttta agtgaaactg cgaacggctc attagagcag 

 61 atgtgattta ttcggaaaat cctattggat aactgcggta attctggagc taatacatgc 

121 gtataaaccc tgactttcga aagggtgcaa ttattagagc aaatcaatca ttttcggatg 

181 tagtttgctg actctgaata acgcagcata tcggcggctt gttcgccgat aatccgaaaa 

241 agtgtctgcc ctatcaacct gatggtagtc tattagtcta ccatggttat tacgggtaac 

301 ggagaataag ggttcgactc cggagaggga gccttagaaa cggctaccac atccaaggaa 

361 ggcagcaggc gcgaaactta tccaatcttg aatagatgag atagtgacta aaaataaaaa 

421 gaccattcct atggaacggt tatttcaatg agttgatcat aaaccttttt tcgagtatcc 

481 agtggagggc aagtctggtg ccagcagccg cggtaattcc agctccacta gtgtaaatcg 

541 tcattgctgc ggttaaaaag ctcgtagttg gatctgagtt gcatgcaatg attcgccttt 

601 ggcgttaatc attgttgtga ctatttgctg gttttctatt gaaatttcga tttctttagt 

661 ggctagcgag tttactttga ataaattaaa gtgctcagaa caagcgtttg cttgaatggt 

721 cgatcatgga ataataaaag aggacttcgg ttctatttat tggttcagga actgaagtaa 

781 tgattaagag ggacaattcg ggggcattcg tatccctgcg cgagaggtga aattcgtgga 

 841 ccgcaggggg acgccctaaa gcgaaagcat ttgccaagaa tgtcttcatt aatcaagaac 

 901 gaaagtcaga ggttcgaagg cgattagata ccgccctagt tctgaccgta aactatgcca 

 961 tctagcgatc cgatggggta ttgttgcctt gtcgaggagc ttcccggaaa cgaaagtctt 

1021 tcggttcctg gggtagtatg gttgcaaagc tgaaacttaa agaaattgac ggaatggcac 

1081 caccaggagt ggagcctgcg gcttaatttg actcaacacg ggaaaactca cccggcccgg 

1141 acaccgtaag gattgacaga ttgaaagctc tttctcgatt tggtggttgg tggtgcatgg 

1201 ccgttcttag ttggtggagc gatttgtctg gtttattccg ataacgagcg agactctagc 

1261 ctgctaaata gtgactagat tattgagtct agtctacttc ttagagggat aagcggtgtt 

1321 tagccgcacg agattgagcg ataacaggtc tgtgatgccc ttagatgtcc ggggctgcac 

1381 gcgcgctaca atggaagaat cagctggcct atccattgcc gaaaggtatt ggtaaaccgt 

1441 tgaaactctt ccgtgaccgg gatagggaat tgtaattatt tcccttgaac gaggaattcc 

1501 tagtaagtgt gagtcatcag ctcacgctga ttacgtccct gccatttgta cacaccgccc 

1561 gtcgctgtcc gggactgagc tgtctcgaga ggactgcgga ctactgtatt gaggccttcg 

1621 ggtcgcgata tggcgggaaa cagttcaatc gcaatggctt gaaccgggta aaagtcgtaa 

1681 caaggtatct g 

二、引物的设计 

LAMP方法中的引物设计是LAMP法实现扩增的关键所在，应用PrimerExplorerV3软件设计引物。LAMP扩增的靶序列长度控制在300bp以下，LAMP最少需要4条引物，分别是正向内引物FIP，由F2区段(与靶基因F2c区段完全互补)和F1c区段(同靶基因3’末端的F1c序列相同)组成；正向外引物F3(与靶基因F3c区段完全互补)；反向内引物BIP，由B2区段(与靶基因3’末端的B2c区段完全互补)和B1c区段(同靶基因3’末端B1c序列完全相同)组成；反向外引物B3(与靶基因B3c区段完全互补)。各区段的设计规则与PCR相同。内引物长度通常超过40个碱基，外引物为20个碱基左右。除了引物的长度、碱基组成外，需要考虑引物与靶序列的环状结构等。 

三、LAMP 

1、广州管圆线虫基因组DNA提取：实验室建立广州管圆线虫的动物感染模型。使用Takara公司的基因组提取试剂盒提取广州管圆线虫的基因组DNA，分光光度分析A260/A280＞1.8，为检测体系提供模板，-80℃冰箱中储存备用。 

2、LAMP反应的条件： 

反应体系包括引物FTP、BIP、F3、B3；dNTP、Mg²⁺、链置换型DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)、Betaine、核酸模板，终体积25μl。LAMP反应在60～65℃恒温条件下进行。最佳反应条件因引物的效率和模板DNA质量变化而不同，因此通过比较试验确定最佳反应时间、反应温度和试剂浓度。每个反应设立阴性与阳性对照。 

3、反应的敏感性、特异性分析 

将广州管圆线虫基因组DNA梯度稀释后进行LAMP检测，由最低DNA检出量分析反应的敏感性，由图1，图2可知，LAMP方法的最低检测量为1fg； 

以广州管圆线虫、疟原虫、弓形虫、血吸虫、异尖线虫等五种寄生虫核酸为模板检测体系的特异性。LAMP检测体系的特异性良好，与疟原虫、弓形虫、血吸虫、异尖线虫DNA没有交叉反应，可以特异性地检测广州管圆线虫，参见图3，图4。 

4、LAMP反应的鉴定分析： 

(1)直接观察：LAMP反应中核酸大量合成时，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg²⁺结合，产生副产物-焦磷酸镁白色沉淀。它有极高的特异性，可以用肉眼观察或浊度仪检测反应管中的沉淀浊度判断扩增与否。 

(2)显色反应：直接向扩增管中加入嵌入剂SYBR Green-I，无扩增反应的管子呈橙色，有扩增反应的管子将变为绿色。 

(3)琼脂糖凝胶电泳：取反应后的混合液2μl，加入0.5μl溴酚蓝上样缓冲液，在2％的琼脂糖凝胶中电泳，电压为100v，时间为30min。EB染色剂染色后在紫外灯下观察。LAMP反应会产生各种片断长度的茎环结构的扩增产物，因此在电泳图谱中显示为从点样孔处开始的拖尾条带现象。 

5、根据优化结果，确定了最佳的LAMP检测体系，在实际操作中可以存在一定的浮动范围，具体如下： 

F3、B3                                          0.1～0.2μM 

FIP、BIP                                        1.2～1.6μM 

dNTP                                            1.4～2.8mM 

Mg2+                                            6～16mM 

反应缓冲液10×ThermoPol Reaction Buffer 

链置换DNA聚合酶BstDNA polymerase                8U 

甜菜碱betaine                                   1.0～1.6M 

Claims (1)

1.一组由4条引物组成的用于广州管圆线虫环介导等温扩增检测方法中的特异性引物组，其特征在于，其用于扩增广州管圆线虫18s rRNA基因，4条特异性引物为：

FIP：5’-CCTGGTGGTGCCATTCCGTCTCTTTCGGTTCCTGGGGTAG-3’

BIP：5’-GCCCGGACACCGTAAGGATTGCACCACCAACCACCAAAT-3’

F3：5’-TTGTCGAGGAGCTTCCCG-3’

B3：5’-CACCAACTAAGAACGGCCAT-3’。

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