CN102154476B - 一种香蕉穿孔线虫特异性lamp检测方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明为“一种香蕉穿孔线虫特异性LAMP检测方法及其应用”，属生物技术领域。一种香蕉穿孔线虫特异性的循环恒温扩增(LAMP)检测方法，其反应体系中香蕉穿孔线虫特异性LAMP检测引物RSF3、RSB3、RSFIP、RSBIP和RSLF，通过对罹病植物组织中香蕉穿孔线虫或单头香蕉穿孔线虫DNA提取，LAMP等温扩增，从而快速和特异性检测香蕉穿孔线虫。本发明的检测方法特异性强、灵敏度高、成本低廉、操作简便，在香蕉穿孔线虫现场快速检测和香蕉穿孔线虫病的早期诊断方面具有很高的应用价值。

Description

一种香蕉穿孔线虫特异性LAMP检测方法及其应用

技术领域

本发明涉及植物病害的分子生物学检测技术，特别涉及一种香蕉穿孔线虫特异性LAMP检测引物及LAMP快速分子检测方法

背景技术

香蕉穿孔线虫(Radopholus similis),，又名相似穿孔线虫，它是一种具有毁灭性的外来入侵植物检疫性有害线虫，是我国对外植物检疫对象之一。香蕉穿孔线虫（Radopholus similis）寄主范围也非常广泛，目前已报道的寄主多达360多种，主要分布在热带及亚热带地区。

近年来，随着国际贸易和出国旅游日趋频繁，从香蕉穿孔线虫疫区国家或地区引进各种花卉苗木及种质材料的种类和数量迅速增加，因此由寄主植物携带而将该线虫传入中国的可能性和传入风险日益剧增。近年来在我国各口岸多批次截获香蕉穿孔线虫。由于该线虫的寄主植物在中国广泛分布，一旦入侵后将给我国农业生产带来毁灭性的打击和造成严重的损失。一旦香蕉穿孔线虫扩散到田野，则极易定殖和流行。这将给中国的农业生产造成严重危害。

在香蕉穿孔线虫的鉴定与检测方面，往往以形态鉴定为主,但因为形态特征细微复杂，变化幅度较大及表型特征不稳定问题，传统形态鉴定往往比较困难，导致误诊，传统形态鉴定过程耗时、费力，需要专业人士操作，且需要大量线虫样本，在单头线虫水平上不能达到要求。在PCR技术上建立起来的分子鉴定方法，一定程度上克服了传统形态鉴定上的缺陷。目前已有一些利用分子和生化方法鉴定香蕉穿孔线虫的方法，如RFLP、一步双重PCR和荧光定量PCR。在植物检疫领域中，DNA分子标记是目前线虫学研究中发展较快的一种鉴定手段。线虫种特异性引物PCR扩增检测或双重PCR扩增检测是近年重要植物线虫分子诊断的重要进展之一。通过一次PCR测验就可以在混合样品中特异性地检测出一个或多个线虫种。如Mulholland et al.(1996)分别构建了马铃薯金线虫和马铃薯白线虫的特异性引物，描述了一种基于rDNA-ITS区域特异性等位多重PCR技术检测这两种线虫的方法，能快速鉴定马铃薯白线虫和马铃薯金线虫及其复合种群。与标准的PCR途径不同，这一技术在每个PCR反应中应用了3个引物，通用引物5.8SrRNA、马铃薯金线虫的特异性引物ITS1-Gr和马铃薯白线虫的特异性引物ITS1-Gp。Bulman&Marshall（1997）成功应用多重PCR技术快速诊断马铃薯孢囊线虫。在研究了秘鲁和澳大利亚的马铃薯金线虫和马铃薯白线虫的rDNA-ITS的序列结构基础上，构建了马铃薯金线虫的特异性引物PITSr3和白线虫的特异性引物PITSp4，通用引物ITS5与PITSr3可以扩增343bp马铃薯金线虫的特异性片段，与PITSp4可以扩增出265bp特异性识别马铃薯白线虫的DNA片段。在一个PCR反应中，使用PITSr3，PITSp4和ITS5这3个引物，即使复合种群中金线虫DNA的含量仅为白线虫的百分之一，也能从复合种群检测出金线虫。

欧师琪、彭德良（Ou SQ，Peng DL，2008）设计构建了大豆孢囊线虫特异性SCAR标记引物SCNFI和SCNRI，发明了大豆孢囊线虫的一步双重PCR检测方法，检测的特异性片段长度为494bp，建立快速准确检测和早期诊断大豆孢囊线虫的分子生物学方法和技术规程，可以检测大豆孢囊线虫单个孢囊、单头二龄幼虫和雄虫，该项检测技术获得国家发明专利（ZL200510012246.1）.

宛飞、彭德良等（2008）根据马铃薯腐烂茎线虫rDNA-ITS区的序列特征，对我国甘薯茎线虫两个不同型群体各设计了一对特异性引物。A型甘薯茎线虫特异引物为DDS1/DDS2，特异扩增片段为252bp；B型甘薯茎线虫特异引物为DDL1/DDL2，特异扩增片段为485bp；引入线虫通用引物D3A/D3B作内标，研究出一步双重PCR特异性检测甘薯茎线虫不同类型群体的分子技术和方法，该分子检测技术具有特异性强、方法可靠、灵敏性高、操作简便，检测的精确度达到单条线虫的水平。

目前在香蕉穿孔线虫的分子检测方面也进行了基于PCR技术的相关研究。1996年KaplanD.T.等筛选380个随机引物，从基因组DNA中找到6条差异片段，克隆、测序后设计了一对24bp的特异性引物，可特异扩增Radopholus similis，。Falls et al.(1996)利用PCR方法扩增rDNA片段来比较两个ITS区及5.8S基因。基于rDNA片段的RFLPs可用于比较全世界不同的香蕉种植区域的10个香蕉穿孔种群。Elbadri et al.(2002)也对香蕉穿孔线虫的rDNA-ITS做了相关研究，通过研究穿孔线虫(R..similis)种内rDNA-ITS的变异，测定ITS序列并进行RFLP分析发现，香蕉穿孔线虫种内ITS序列稳定，变异很小。但穿孔线虫（Radopholus）属的不同种间ITS存在差异。国外的研究表明，曾经认为是香蕉穿孔线虫的一个来自澳大利亚种群，经过对rDNA-ITS序列特征和RFLP分析研究，发现该群体实际上是香蕉穿孔线虫的近缘种，最近重新命名和描述为澳洲穿孔线虫新种(Radopholus musicola)、来自越南榴莲和咖啡根系的两个穿孔线虫群体虽然与香蕉穿孔线虫及其近似，但rDNA-ITS序列和RFLP酶谱都存在差异，分别描述为“榴莲穿孔线虫新种(Radopholus duriophilus)和阿拉伯咖啡穿孔线虫新种(Radopholus arabocoffeae)。近年的分子和细胞遗传学证据表明，香蕉穿孔线虫与柑桔穿孔线虫为同一个种。

近年来，我国口岸多年多次截获香蕉穿孔线虫，国内相关单位加大了对香蕉穿孔线虫的检疫检验力度，相继开展了香蕉穿孔线虫的分子特征等相关研究。葛建军等根据NCBI已登录的香蕉穿孔线虫序列聚类比对后根据保守区域设计出穿孔线虫属（Radopholus）水平上的特异性引物Rl、R2(R1／2)和香蕉穿孔线虫种水平上的特异性引物RS1、RS2(RS1／2)进行双重PCR扩增香蕉穿孔线虫,检测精度可达单条水平和实时荧光定量PCR检测单头香蕉穿孔线虫技术;但是没有从罹病植物组织中检测香蕉穿孔线虫。周春娜谢辉等（2006）等利用国外的通用引物研究了香蕉穿孔线虫rDNA-ITS,没有涉及特异性引物。彭德良等根据我国多个口岸截获的香蕉穿孔线ITS克隆测序结果设计出香蕉穿孔线虫特异性引物对（RsF1和RsR1），以此开发出能够从罹病植物组织中检测香蕉穿孔线虫技术，检测精度可达单条水平，同时也开发出实时荧光定量PCR检测单头香蕉穿孔线虫技术。

目前PCR特异性检测技术仍然需要PCR仪、凝胶电泳和成像系统(紫外仪)等昂贵的专业仪器和分子生物学试剂，且需要分子生物学专业实验人员操作，以上检测只能在实验室条件下才可以检测，限制了PCR检测方法在生产中的推广应用。

循环恒温扩增技术（Ioop-mediated isothermal amplification,简称LAMP）是2000年由日本荣研株式会社Notomi等人开发的一种新型循环恒温核酸扩增技术。LAMP反应针对靶基因的6个位点设计出4条引物，利用一种链式置换活性的DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)，在恒温条件下(65℃左右)保温10-90分钟，即可完成扩增反应。由于LAMP反应的高效性和等温快速扩增的特点，在90分钟内可将靶基因扩增10⁹-10¹⁰。LAMP扩增产物的检测一般采用荧光染料目测观察、琼脂糖凝胶电泳、浊度观察等方法。由于LAMP反应简单、快速、高效、经济等特征。因而具有极为广泛的应用前景。目前LAMP检测主要应用于人畜病原物、食品安全和环境卫生的检测，在植物病原线虫检测中报道极少，目前仅2009年日本Kikuchi开发出松材线虫LAMP快速检测体系，能在1小时内检测到松材线虫，其它植物线虫以及香蕉穿孔线虫的LAMP国内外均未见报道。

发明内容

本发明提供了针对上述领域中的缺陷，提供一种应用恒温扩增技术检测罹病植物中检测香蕉穿孔线虫的方法，以建立了一种不需要PCR仪的香蕉穿孔线虫的早期快速准确检测和诊断的分子生物学方法，可以检测罹病植物组织中的香蕉穿孔线虫，达到早检测、早治理和早控制的效果，克服已有PCR检测香蕉穿孔线虫不能在生产一线应用的问题。

一种香蕉穿孔线虫特异性LAMP检测方法，其特征在于：其中的LAMP反应体系中所使用的引物分别是：

RSF3：5’-AGCTGGCGTATCTAGCCTG-3’，

RSB3：5’-AACGCCAGAACGCACAAC-3’，

RSFIP：5’-GCACCCAACGGACAAAACAACA-CATTCAGCCTCTGGGCATC-3’，

RSBIP：5’-GCAGCGCTGTGAGCCTGTTT-GTTCGCCCATTCTGGGTAC-3’，

RSLF：5’-AGGCGTCGTCCCAAGGTCA-3’。

所述LAMP反应体系包括：引物混合液、反应混合液和1μL DNA模板，用灭菌双蒸馏水补全到25μL，所述引物混合液为外侧引物RSF3和RSB3各0.2μM，内侧引物RSFIP和RSBIP各1.6μM，环引物RSLF为0.4μM；所述反应混合液为20mM Tris-HCl，10mM(NH₄)₂SO₄，10mM KCl，8mM MgSO₄，0.1%Triton X-100，0.8M Betaine，1.4mM dNTPs，8U Bst DNA聚合酶大片段。

所述LAMP反应的条件为在61-65℃保温30-90min，82℃保温5-10min。

所述LAMP反应的最终扩增产物中加入有显色剂，所述显色剂为SYBR green I与PCR级DMSO混合液，其体积比为1：9。

所述DNA模板为从罹病香蕉穿孔线虫病的植物组织中提取。

所述提取的方法为：截取0.2-0.5cm长的罹病植物组织放入装有48μL的LA提取液的离心管中，加入2μL的LB提取液，混合均匀后离心，放入液氮中速冻，用研磨棒将其捣碎，点动离心后将离心管放入65℃条件下温育45min，95℃下反应10min，冷却至室温，点动离心后的上清液即可作为线虫DNA模板，所述LA提取液为100mM NaCl，100mM Tris-HCl(pH8.5)，50mM EDTA(pH7.4),1%SDS混合液和单独分装的占总体积比为1%巯基乙醇组成，LB提取液为20mg/mL蛋白酶K。

一种香蕉穿孔线虫特异性LAMP检测试剂盒，包括：

1）引物混合液：外侧引物RSF3和RSB3各0.2μM，内侧引物RSFIP和RSBIP各1.6μM，环引物RSLF为0.4μM

2）反应混合液：

20mM Tris-HCl，10mM(NH₄)₂SO₄，10mM KCl，8mM MgSO₄，0.1%Triton X-100，0.8MBetaine，1.4mM dNTPs，8U Bst DNA聚合酶大片段(New England Biolabs)

试剂盒中还包括显色剂，所述显色剂为SYBR green I与PCR级DMSO混合液，体积比为1：9。

试剂盒中还包括从罹病植物组织中香蕉穿孔线虫DNA提取试剂，由LA提取液和LB提取液组成，所述LA提取液由100mM NaCl，100mM Tris-HCl(pH8.5)，50mM EDTA(pH7.4),1%SDS混合液和单独分装的占总体积比为1%巯基乙醇组成，LB提取液为20mg/mL蛋白酶K。

上述香蕉穿孔线虫特异性LAMP分子检测方法或上述试剂盒在诊断植物、土壤的香蕉穿孔线虫感染情况或鉴别香蕉穿孔线虫中的应用。

本发明解决上述技术问题主要采取的技术方案包括以下三个部分：1、提供了从罹病植物中提取香蕉穿孔线虫的试剂和方法，其中试剂主要为LA提取液和LB提取液两种，采用65℃温浴45min，95℃温浴10min即可；2、提供了5条用于检测香蕉穿孔线虫的LAMP引物序列，分别命名为RSBIP、RSFIP、RSF3、RSB3、RSLF,长度分别为39bp、41bp、19bp、18bp、19bp；配制并优化了LAMP反应体系和反应条件，有利于LAMP以最高效率对样品进行扩增。3、提供了多种LAMP结果检测方法，主要有荧光染料直接目测法、琼脂糖凝胶电泳法和浊度目测法。具体包括以下步骤：

1、罹病植物组织中香蕉穿孔线虫DNA提取试剂组分如下:

LA提取液：100mM NaCl，100mM Tris-HCl(pH8.5)，50mM EDTA(pH7.4),1%SDS,混合均匀后高温高压灭菌，使用时加入1%巯基乙醇。

LB提取液：20mg/mL蛋白酶K

罹病植物组织中香蕉穿孔线虫DNA提取方法步骤是：

截取0.2-0.5cm长的罹病植物组织放入装有48μL的LA缓冲液的0.2mL离心管中，加入2μL的LB提取液，混合均匀后简单离心，放入液氮中速冻，用研磨棒或将其捣碎，反复2-3次后，点动离心后将离心管放入65℃条件下温育45min，95℃反应10min处理后上清液作为线虫DNA模板直接用于LAMP和PCR反应。

如果直接用于香蕉穿孔线虫的检测，可采用常规的方法从香蕉穿孔线虫体中提取DNA。2、LAMP引物设计：采用通用引物D2A/D3B扩增出香蕉穿孔线虫AM种群的rDNA的D2D3区，将目的片段克隆到PGEM-T载体中测序获得香蕉穿孔线虫D2D3序列如SEQ ID NO1。通过对序列分析比对，选取香蕉穿孔线虫特异的一段区域设计5条LAMP引物：

RSF3：5’-AGCTGGCGTATCTAGCCTG-3’

RSB3：5’-AACGCCAGAACGCACAAC-3’

RSFIP：5’-GCACCCAACGGACAAAACAACA-CATTCAGCCTCTGGGCATC-3’

RSBIP：5’-GCAGCGCTGTGAGCCTGTTT-GTTCGCCCATTCTGGGTAC-3’

RSLF:5’-AGGCGTCGTCCCAAGGTCA-3’

引物序列分别和香蕉穿孔线虫D2D3序列的相应位置的核苷酸序列相同或者互补。

3、LAMP反应体系配置：反应体系的总浓度分别为:外侧引物RSF3和RSB3各0.2μM，内侧引物RSFIP和RSBIP各1.6μM,环引物RSLF为0.4μM，20mM Tris-HCl，10mM(NH₄)₂SO₄，10mM KCl，8mM MgSO₄，0.1%Triton X-100，0.8M Betaine，1.4mM dNTPs，8U Bst DNA聚合酶大片段(New England Biolabs)，1μL DNA模板，用灭菌双蒸馏水补全到25μL

4、LAMP反应扩增条件：将上述配制好的反应体系放入65℃中保温60min，82℃保温5分钟灭活Bst DNA聚合酶

5、LAMP结果检测：结果可以采用以下三种检测方法：1）将上述反应完的体系中加入1μL的显色剂。轻晃混匀，即可观察；2）取1μL扩增产物在2%琼脂糖凝胶电泳中电泳可观察到梯形带；3）将反应后的离心管3000rpm离心30min，阳性的底部可观察到白色沉淀。本发明优选显色剂方式。

本发明所提供的香蕉穿孔线虫LAMP快速检测技术具有其他检测方法所无法比拟的优点：

1、特异性强，所采用的引物根据香蕉穿孔线虫地理种群的D2D3序列7个位点设计出5条特异性引物，同时这些引物的顺序也是有固定规则。特异性比常规PCR要强很多倍。

2、灵敏度高，对香蕉穿孔线虫的检测极限可低至1/20000条。比常规PCR检测香蕉穿孔线虫高100以上

3、检测快速，整个反应不要在温度变化上浪费时间，扩增过程只需要1h即可完成，比常规PCR要节省2-4h

4、经济性强，不需要PCR仪、凝胶电泳和成像系统和昂贵的分子试剂，只需要一个水浴锅即可完成扩增检测，结果肉眼直接可见，有利于生产实践和基层机构中应用。

5、操作简便，结果明显，整个过程不需要复杂的仪器和设备，稍具有分子生物学基础的人员即可完成。结果清晰明显，肉眼即可观察结果，不需要繁琐的电泳和紫外观察。

6、对人和环境友好，检测过程不需要使用EB等有毒试剂，对人和环境非常安全。

综上所述，本发明具有比现有PCR技术检测香蕉穿孔线虫的方法具有更高的特异性、灵敏度和便携性，可以在实际生产中现场应用检测。该技术可应用于对香蕉穿孔线虫田间土壤样品及植物上香蕉穿孔线虫病发生的早期快速分子检测，具有实际的应用价值。

附图说明

图1为香蕉穿孔线虫rDNA-D2D3序列的LAMP引物设计示意图，

图2为LAMP检测结果。

其中A为加荧光染料检测结果，1：阳性结果，具有绿色荧光，2：阴性对照，为深褐色。其中B为电泳检测结果，M:DL2000DNA标准分子量（Takara）1：阳性结果，为LAMP扩增梯形条带，2为阴性对照，无扩增产物。

图3为不同地理种群香蕉穿孔线虫LAMP及普通PCR检测结果。

A：荧光染色结果，B:电泳检测结果，C:普通PCR检测结果。1-7：分别为香蕉穿孔线虫种群RSXH2、RSHN5、RSHZ、RSSH、RSAM、RSRZ5、RSHK扩增结果；8：阴性对照。M:DL2000DNA标准分子量（Takara）

图4为香蕉穿孔线虫LAMP(A)和普通PCR(B)灵敏度电泳检测结果。

1-7泳道为10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7倍稀释香蕉穿孔线虫DNA，8泳道为无模板对照。M:DL2000DNA标准分子量（Takara）

图5为香蕉穿孔线虫LAMP特异性检测结果。

A：荧光染色结果，B:电泳检测结果。第1管或第1泳道为香蕉穿孔线虫AM种群扩增结果；2-12分别为植物寄生线虫PXM、PGMpra、J01、USA.pra、Maco pra、DdCL、SCNGS、CCNGS、BX、BM、BD种群DNA扩增结果，M:DL2000DNA标准分子量（Takara）

图6为罹病植物中香蕉穿孔线虫LAMP检测结果，

A：荧光染色结果，B:电泳检测结果。1：无菌水为阴性对；2-4：分别为从罹病红掌根和培养香蕉穿孔线虫中直接提取的的香蕉穿孔线虫DNA及以香蕉穿孔线虫AM种群单头DNA扩增结果，M:DL2000DNA标准分子量（Takara）

图7为罹病植物中香蕉穿孔线虫LAMP特异性检测结果。

A：荧光染色结果，B:电泳检测结果。1-2管或泳道分别为从接种香蕉穿孔线虫胡萝卜和感染了香蕉穿孔线虫的红掌根中直接提取的香蕉穿孔线虫DNA扩增结果，3-5分别为培养短体线虫PLD种群的的胡萝卜，甘薯茎线虫病组织，接种了南方根结线虫番茄根的的根结中直接提取的DNA扩增结果，6：无模板对照，M:DL2000DNA标准分子量（Takara）

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明进行进一步详细描述。

所用的线虫材料在申请人的实验室中均有保存，均可以对公众免费发放。

所用试剂均为市售产品。

实验材料

共收集7个香蕉穿孔线虫种群(RSXH2、RSSH、RSHZ、RSAM、RSHK、RSHN5、RSRZ5)(表1)。1个香蕉穿孔线虫种群样品（RSSH）为中国检疫科学院葛建军老师惠赠，2个样品RSSZ和RSHZ为深圳动植物检疫局李一农老师惠赠，一个样品RSXH2为华南农业大学谢晖老师惠赠，其它种群为本实验室自行采集。供试香蕉穿孔线虫均为纯培养试验种群。了

表1供试香蕉穿孔线虫种群及其来源

主要试剂：Taq DNA聚合酶、DNA marker购自TaKaRa公司；引物由上海生工生物技术有限公司合成；pGEM-T Easy Vector购于美国promega，Pro K（蛋白酶K）购自Roche公司，Bst DNA聚合酶购于英国NEB公司

实施例1香蕉穿孔线虫DNA的提取、rDNA-ITS扩增及序列分析与注册

1.1香蕉穿孔线虫DNA的提取

所有样本的DNA提取均参照彭德良等（2003）的方法并在此基础上略加改动。挑取单头线虫放入装有10μl ddH2O的Eppendorf管中，-20℃冷冻过夜，取出后，用75％酒精消毒的玻璃棒研磨至冰块融化，加入7μl WLB（worm lysis buffer）和3μl蛋白酶K（2mg/ml）溶液，混匀于5000rmp点动离心，-20℃冷冻30min以上，然后转入PCR仪，65℃温浴60min，95℃反应10min，取出后点动离心，取上清液进行PCR扩增或于－20℃保存备用。

1.2香蕉穿孔线虫rDNA-ITS扩增及序列分析

利用D2D3区的通用引物D2A(5’-ACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTG-3’)，

D3B(5’-TCGGAAGGAACCAGCTACTA-3’)扩增各香蕉穿孔线虫AM种群28S-rDNA-D2D3区片段。PCR扩增反应体系为50μl，PCR反应体系为10×Buffer(含Mg2+)5μl，10mM dNTP4μl，ddH2O32.6μl，引物D2A和D3B(10μmol/L）各1.5μl，Taq酶（5U/μl,Takara）0.4μl，模板DNA5μl。PCR扩增条件为：95℃预变性5min，50℃退火30s，72℃延伸2min；94℃变性45s，50℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃再次延伸10min，4℃保存。PCR扩增后，取5μl扩增产物加1μl加样缓冲液在1.0%琼脂糖凝胶上电泳，EB染色，在紫外灯下观测并照相回收、克隆和测序，序列测定由上海生工生物工程有限公司完成。测定的香蕉穿孔线虫28S-rDNA-D2D3序列在GenBank上的登录号为HM469450。NCBI blast比对发现和其他香蕉穿孔线虫的28S-rDNA-D2D3相似性为100%。

2、LAMP技术检测香蕉穿孔线虫的方法的建立

2.1LAMP引物设计

根据香蕉穿孔线虫D2D3序列测序分析结果，设计并筛选下述LAMP引物(见图1)，引物交上海生物工程技术服务有限公司合成。引物序列如下：

RSF3：5’-AGCTGGCGTATCTAGCCTG-3’

RSB3：5’-AACGCCAGAACGCACAAC-3’

RSFIP：5’-GCACCCAACGGACAAAACAACA-CATTCAGCCTCTGGGCATC-3’

RSBIP：5’-GCAGCGCTGTGAGCCTGTTT-GTTCGCCCATTCTGGGTAC-3’

RSLF:5’-AGGCGTCGTCCCAAGGTCA-3’

2.2LAMP扩增条件优化

采用本发明所提供的DNA提取方法提取香蕉穿孔线虫的DNA，本发明的LAMP检测反应体系如下：0.2μM RSF3,0.2μM RSB3，1.6μM RSFIP，1.6μM RSBIP，0.4μM RSLF，20mMTris-HCl，10mM(NH₄)₂SO₄，10mM KCl，8mM MgSO₄，0.1%Triton X-100，0.8M Betaine，1.4mM dNTPs，8U Bst DNA聚合酶大片段，1μL基因组DNA模板，用灭菌双蒸馏水补全到25μL。将上述反应液分别装入无菌的0.2ml eppendorf管中。

在反应过程中，扩增温度影响着LAMP的扩增效率。本发明提供引物和反应体系在扩增温度为61-65摄氏度时，扩增效率没有太大变化。本发明选择64℃。扩增时间为60min，82度保温5min灭活酶。检测结果显示，阳性肉眼能够观察到绿色荧光，而阴性对照仍为褐色（如图2中A）。琼脂糖电泳扩增产物将阳性可观察到梯形带，阴性则无扩增产物（如图2中B）。上述反应条件能够快速准确的检测单条香蕉穿孔线虫。

2.3LAMP检测技术检测不同地里种群香蕉穿孔线虫

采用1.1所述的方法提取本实验室保存的七个香蕉穿孔线虫种群DNA,以无菌水作为对照，采用下述已经优化的检测体系和条件0.2μM RSF3,0.2μM RSB3，1.6μM RSFIP，1.6μMRSBIP，0.4μM RSLF，20mM Tris-HCl，10mM(NH₄)₂SO₄，10mM KCl，8mM MgSO₄，0.1%Triton X-100，0.8M Betaine，1.4mM dNTPs，8U Bst DNA聚合酶大片段，1μL基因组DNA模板，用灭菌双蒸馏水补全到25μL。64℃保温60min，82℃保温5min，完成对不同地理种群的香蕉穿孔线虫LAMP扩增。反应完成后向上述离心管中分别加入1μL染色剂，轻轻甩动离心管，即可观察。结果显示（如图3中A）：七个不同地理种群的香蕉穿孔线虫DNA为模板的结果中均观察到强烈的绿色荧光，而对照ck没有观察到，仍为深褐色。取取上述反应液2μL在2%琼脂糖凝胶电泳，紫外观察发现（如图3中B），第一到第七泳道的香均出现LAMP特征性的梯形带。阴性对照没有发现有扩增产物。同时以上述DNA为模板，以RSF3和RSB3为引物，进行常规PCR检测：体系如下：10×PCR Buffer(含Mg2+)，2μl10mM dNTP（2.5mM），1.5μl引物对RSB3/RSF3(20uM)，0.2μl Taq DNA聚合酶（5U/ul），1μl模板DNA，灭菌ddH2O补足至25μl。采用无线虫DNA模板为阴性对照。凝胶电泳观察结果（图3中C）。结果表明在7个地理种群的香蕉穿孔线虫的PCR均能够扩增出相同大小的条带，常规PCR检测验证的LAMP的检测结果。

综上所述本发明提供的LAMP引物和反应体系能够准确的检测不同地理种群的香蕉穿孔线虫。

2.4香蕉穿孔线虫LAMP灵敏度检测

提取单头香蕉穿孔线虫澳门种群DNA，以10的倍数稀释，依次稀释10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7倍。分别取上述稀释的DNA1μL为模板，以2.3的反应体系和条件进行LAMP扩增，以此来检测香蕉穿孔线虫LAMP检测的灵敏度。反应液凝胶电泳结果显示（图4中A）：第1-3泳道有很清楚的梯形带，第四个泳道有弱的条带。同时以上述稀释DNA为模板，以RSF3和RSB3为引物，进行常规PCR检测：体系如下：10×PCR Buffer(含Mg²⁺)，2μl10mM dNTP（2.5mM），1.5μl引物对RSB3/RSF3(20uM)，0.2μl Taq DNA聚合酶（5U/ul），1μl模板DNA，灭菌ddH₂O补足至25μl。采用无线虫DNA模板为阴性对照。凝胶电泳观察结果（图4中B）。结果表明在DNA稀释到10^-2倍，能够观察到扩增条带，再稀释常规PCR则不能检测。

以上结果说明：上述LAMP检测体系能够检测到2x10^-4条香蕉穿孔线虫。具有极高的灵敏度，比常规PCR检测灵敏100倍。

2.5香蕉穿孔线虫LAMP特异性检测

收集5个短体线虫群体（分别采集于北京PXM、北京PGMpra、天津J01、美国USA.pra和澳门Maco pra）、1个甘薯茎线虫群体（采集于河北昌黎DdCL）、1个大豆孢囊线虫群体（采集于甘肃SCNGS）、1个禾谷孢囊线虫（采集于甘肃CCNGS）、3个松材线虫及其近缘种线虫群体（见表2），分别提取其DNA，采用上述LAMP引物和体系来检测香蕉穿孔线虫LAMP检测方法的特异性。

表2供试的其它植物线虫群体样品代码及来源

LAMP引物、反应体系和反应条件如2.3所述。在LAMP特异性检测结果显示（如图5）：第一个离心管以香蕉穿孔线虫DNA为模板的LAMP扩增体系观察到绿色荧光，短体线虫、甘薯茎线虫、大豆孢囊线虫、禾谷孢囊线虫、松材线虫及其近缘种和阴性对照等13个离心管均为深褐色（如图5中A）。取上述反应液2μL在2%琼脂糖凝胶电泳，紫外观察发现（如图5中B），只有第一泳道的香蕉穿孔线虫出现LAMP特征性的梯形带。其他均没有发现有扩增产物。

以上结果说明：LAMP引物和反应体系的检测香蕉穿孔线虫具有很高的特异性。

3罹病植物组织中香蕉穿孔线虫的LAMP检测

3.1罹病植物组织中香蕉穿孔线虫DNA的直接提取

以培养香蕉穿孔线虫的胡萝卜和人工接种香蕉穿孔线虫的红掌根为对象分别截取0.2cm长的罹病组织，采用改进的SDS法，提取液成分：100mM NaCl，100mM Tris-HCl(pH8.5)，50mM EDTA(pH7.4),1%SDS,混合均匀后高温高压灭菌，使用时1%巯基乙醇，5μL20mg/mL蛋白酶K。提取步骤：在50ul提取液中加入0.2-0.5cm长的感病红掌根，液氮速冻后用研磨棒将其捣碎，重复2-3次。65℃温浴45min，95℃保温10min，冷却到室温后，上清液即为模板DNA。

3.2罹病植物组织中香蕉穿孔线虫的LAMP检测

以3.1所述方法提取罹病红掌根和胡萝卜中的香蕉穿孔线虫DNA，同时以香蕉穿孔线虫AM种群的DNA为阳性对照，无菌水为阴性对照，以2.3所述的LAMP检测体系和条件进行扩增。加入荧光染料和琼脂糖电泳检测结果表明（图6中A、B）从罹病植物和胡萝卜中提取的的香蕉穿孔线虫DNA均能够采用上述LAMP体系对香蕉穿孔线虫进行有效扩增。具有很高的扩增效率。

3.3罹病植物组织中香蕉穿孔线虫的LAMP特异性检测

分别收集培养短体线虫PLD种群的的胡萝卜，甘薯茎线虫病组织，接种了南方根结线虫番茄根的的根结，采用本发明3.1所述的方法提取各种植物组织中的寄生线虫DNA，加上罹病红掌和接种香蕉穿孔线虫的胡萝卜中的香蕉穿孔线虫DNA,以此为模板采用以2.3所述的检测体系和条件进行香蕉穿孔线虫LAMP扩增特异性验证。扩增完成后加入荧光染料染色结果表明（图7中A）：在第一和第二个离心管中均出现了绿色荧光成阳性，而其他植物线虫DNA和无菌水为阴性对照的均没有绿色荧光为深褐色，扩增产物琼脂糖电泳检测发现（图7中B）：在第1和第2泳道均有LAMP特征性的梯形条带，而其他均没有产物的出现。以上结果说明：本发明所提供的香蕉穿孔线虫LAMP检测技术从植物罹病组织中检测香蕉穿孔线虫具有很高的特异性，在生产中具有极高的应用价值。

根据以上实验结果表明：LAMP技术能够为香蕉穿孔线虫提供快速、灵敏、简便的现场检测。

Claims (10)

1.一种香蕉穿孔线虫特异性LAMP检测方法，其特征在于：其中的LAMP反应体系中所使用的引物分别是：

RSF3：5’-AGCTGGCGTATCTAGCCTG-3’，

RSB3：5’-AACGCCAGAACGCACAAC-3’，

RSFIP：5’-GCACCCAACGGACAAAACAACA-CATTCAGCCTCTGGGCATC-3’，

RSBIP：5’-GCAGCGCTGTGAGCCTGTTT-GTTCGCCCATTCTGGGTAC-3’，

RSLF：5’-AGGCGTCGTCCCAAGGTCA-3’。

2.根据权利要求1所述的检测方法，所述LAMP反应体系包括：引物混合液、反应混合液和1μL DNA模板，用灭菌双蒸馏水补全到25μL，所述引物混合液为外侧引物RSF3和RSB3各0.2μM，内侧引物RSFIP和RSBIP各1.6μM，环引物RSLF为0.4μM；所述反应混合液为20mM Tris-HCl，10mM(NH₄)₂SO₄，10mM KCl，8mM MgSO₄，0.1%Triton X-100，0.8MBetaine，1.4mM dNTPs，8U Bst DNA聚合酶大片段。

3.根据权利要求2所述的检测方法，所述LAMP反应的条件为在61-65℃温育30-90min，82℃保温5-10min。

4.根据权利要求3所述的检测方法，所述LAMP反应的最终扩增产物中加入有显色剂，所述显色剂为SYBR green I与PCR级DMSO混合液，其体积比为1：9。

5.根据权利要求1所述的检测方法，所述DNA模板为从罹病香蕉穿孔线虫病的植物组织中提取。

6.根据权利要求5所述的检测方法，所述提取的方法为：截取0.2-0.5cm长的罹病植物组织放入装有48μL的LA提取液的离心管中，加入2μL的LB提取液，混合均匀后离心，放入液氮中速冻，用研磨棒将其捣碎，点动离心后将离心管放入65℃条件下温育45min，95℃下反应10min，冷却至室温，点动离心后的上清液即可作为线虫DNA模板，所述LA提取液为100mM NaCl，pH8.5的100mM Tris-HCl，pH7.4的50mM EDTA,1%SDS和单独分装的占总体积比为1%巯基乙醇组成，LB提取液为20mg/mL蛋白酶K。

7.一种香蕉穿孔线虫特异性LAMP检测试剂盒，包括：

1）引物混合液：外侧引物RSF3和RSB3各0.2μM，内侧引物RSFIP和RSBIP各1.6μM，环引物RSLF为0.4μM，

2）反应混合液：20mM Tris-HCl，10mM(NH₄)₂SO₄，10mM KCl，8mM MgSO₄，0.1%Triton X-100，0.8M Betaine，1.4mM dNTPs，8U Bst DNA聚合酶大片段；所述引物混合物中，

RSF3：5’-AGCTGGCGTATCTAGCCTG-3’，

RSB3：5’-AACGCCAGAACGCACAAC-3’，

RSFIP：5’-GCACCCAACGGACAAAACAACA-CATTCAGCCTCTGGGCATC-3’，

RSBIP：5’-GCAGCGCTGTGAGCCTGTTT-GTTCGCCCATTCTGGGTAC-3’，

RSLF：5’-AGGCGTCGTCCCAAGGTCA-3’。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，还包括显色剂，所述显色剂为SYBR green I与PCR级DMSO混合液，体积比为1：9。

9.根据权利要求7所述的试剂盒，还包括从罹病植物组织中提取香蕉穿孔线虫DNA提取试剂，由LA提取液和LB提取液组成，所述LA提取液由100mM NaCl，pH8.5的100mM Tris-HCl，pH7.4的50mM EDTA,1%SDS和单独分装的占总体积比为1%巯基乙醇组成，LB提取液为20mg/mL蛋白酶K。

10.权利要求1-6任一香蕉穿孔线虫特异性LAMP检测方法或权利要求7-9任一试剂盒在诊断植物、土壤中的香蕉穿孔线虫感染情况或鉴别香蕉穿孔线虫中的应用。

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