CN106520952B - 一种基于lamp技术的检测剪股颖粒线虫的方法 - Google Patents

一种基于lamp技术的检测剪股颖粒线虫的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种基于LAMP技术的检测剪股颖粒线虫的方法。本发明首次揭示了对于剪股颖粒线虫特异性良好的LAMP扩增引物，所述引物针对含有剪股颖粒线虫的DNA可发生特异性扩增，而对没有剪股颖粒线虫的非剪股颖粒线虫或非线虫的DNA不发生特异性扩增。本发明的方法可良好地应用于检测剪股颖粒线虫、将之与其非常接近的其它种类的线虫相区分，并且具有良好的再现性、灵敏度、检测稳定性。

Description

一种基于LAMP技术的检测剪股颖粒线虫的方法
技术领域
本发明属于核酸检测技术领域，更具体地，本发明涉及一种基于LAMP技术的检测剪股颖粒线虫的方法。
背景技术
粒属线虫是一类高度专化的植物种子和地上部寄生线虫，可危害多种禾本科植物，导致产量和质量严重下降。中国口岸曾多次在进境牧草种子中截获粒属线虫，该类线虫在植物穗部形成虫瘿，在收获植物种子时虫瘿脱落混入植物种子，随植物种子的调运作远距离传播。
粒属线虫中，剪股颖粒线虫(Anguina agrostis)是非常重要的种类，是危害牧草及草坪草的一种十分危险的线虫。此外，剪股颖粒线虫还是棒状杆菌的介体，它们协同作用在寄主植物的颖果上形成的黄色虫瘿对动物有高度毒性，牛、马、羊等牲畜误食后中毒、甚至晕倒，最后抽搐死亡，对畜牧业威胁极大。因此，许多国家或地区将其列为检疫性有害生物。
线虫进行分类鉴定多数是依据成熟雌虫的形态学特征，幼虫和雄虫形态一般不作为定种的主要依据。据剪股颖粒线虫的生活史可知，要得到该线虫的雌、雄虫，关键是取得虫瘿。口岸检验检疫部门在进境牧草种子检疫中遇到的难题是只分离到粒属线虫的幼虫，却没有找到虫瘿，难以根据幼虫特征进行种类鉴定。还有，粒属线虫的形态学鉴定要求鉴定人员具有良好的分类学基础。
因此，开展剪股颖粒线虫的分子生物学检测方法研究，建立能够准确、快速鉴定幼虫的分子生物学技术是十分迫切和必要的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测剪股颖粒线虫的方法，所述方法包括：以待测样品的DNA为模板，以特异性扩增引物进行环介导等温扩增；若发生特异性扩增，则表明待测样品中包含剪股颖粒线虫；所述的特异性扩增引物包括：正向外引物SEQ ID NO:1，反向外引物SEQ ID NO:2，正向内引物SEQ ID NO:3，反向内引物SEQ ID NO:4，正向环引物SEQ IDNO:5，反向环引物SEQ ID NO:6。
在本发明的另一方面，一种将剪股颖粒线虫与其它线虫进行区分的方法，所述方法包括：以待测线虫的DNA为模板，以特异性扩增引物进行环介导等温扩增；若发生特异性扩增，则表明待测线虫为剪股颖粒线虫；若不发生特异性扩增，则表明待测线虫为非剪股颖粒线虫；所述的特异性扩增引物包括：正向外引物SEQ ID NO:1，反向外引物SEQ ID NO:2，正向内引物SEQ ID NO:3，反向内引物SEQ ID NO:4，正向环引物SEQ ID NO:5，反向环引物SEQ ID NO:6。
在一个优选例中，所述的环介导等温扩增的体系中包括所述的特异性扩增引物、Tris-HCl、K+、Mg2+、(NH4)2SO4、Tween20、甜菜碱、dNTP、DNA聚合酶。
在另一优选例中，所述的环介导等温扩增的体系中还包括钙黄绿素。
在另一优选例中，Mg2+浓度8±1mM、甜菜碱浓度0.8±0.2M、dNTP浓度1.4±0.2mM、Tris-HCl浓度20±3mM、K+浓度10±2mM、(NH4)2SO4浓度10±2mM、Tween20浓度0.1±0.02％。
在另一优选例中，所述的环介导等温扩增在63±1℃恒温反应。
在另一优选例中，所述的待测样品包括但不限于：植物、动物(包含家畜)、饲料、土壤、淡水、海水、地下水。
在另一优选例中，所述的待测样品或待测线虫包括：剪股颖粒线虫，维氏粒线虫，小麦粒线虫，粒科线虫，鳞球茎茎线虫，茎属线虫，穿刺短体线虫，伤残短体线虫，北方根结线虫，无花果胞囊线虫，仙人掌胞囊线虫，松材线虫，菊花滑刃线虫，柑橘半穿刺线虫，强壮盘旋线虫，厚皮拟毛刺线虫，肾形拟毛刺线虫，剑属线虫。
在本发明的另一方面，提供用于鉴定剪股颖粒线虫的引物，所述引物是LAMP扩增引物，包括：正向外引物SEQ ID NO:1，反向外引物SEQ ID NO:2，正向内引物SEQ ID NO:3，反向内引物SEQ ID NO:4，正向环引物SEQ ID NO:5，反向环引物SEQ ID NO:6。
在本发明的另一方面，提供所述的引物的用途，用于从待测样品中检测剪股颖粒线虫；或用于将剪股颖粒线虫与其它线虫进行区分。
在本发明的另一方面，提供一种检测剪股颖粒线虫的试剂盒，其中包括所述的引物。
在一个优选例中，所述试剂盒中还包括但不限于：
含有剪股颖粒线虫的检测标准品；
Tris-HCl；
DNA提取试剂；
pH缓冲试剂；
钾离子溶液；
镁离子溶液；
铵离子溶液；
Tween20；
甜菜碱；
dNTP；
DNA聚合酶；
荧光染料；和/或
说明检测剪股颖粒线虫的方法的使用说明书。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、LAMP特异性检测(LA-320C柱状图)。
其中，左上图DNA模板顺序依次为：剪股颖粒线虫，剪股颖粒线虫，维氏粒线虫，小麦粒线虫，粒科线虫，鳞球茎茎线虫，茎属线虫6(即表1中编号6)，茎属线虫7(即表1中编号7)；右上图DNA模板顺序依次为：茎属线虫8(即表1中编号8)，茎属线虫9(即表1中编号9)，穿刺短体线虫，伤残短体线虫，北方根结线虫，无花果胞囊线虫，仙人掌胞囊线虫，松材线虫；左下图DNA模板顺序依次为：菊花滑刃线虫，柑橘半穿刺线虫，强壮盘旋线虫，厚皮拟毛刺线虫，肾形拟毛刺线虫，剑属线虫，剪股颖植物种子，及ddH2O。
图2、LAMP特异性检测(LA-320C速率曲线)。
其中，左上图DNA模板顺序依次为：剪股颖粒线虫，剪股颖粒线虫，维氏粒线虫，小麦粒线虫，粒科线虫，鳞球茎茎线虫，茎属线虫6，茎属线虫7；右上图DNA模板顺序依次为：茎属线虫8，茎属线虫9，穿刺短体线虫，伤残短体线虫，北方根结线虫，无花果胞囊线虫，仙人掌胞囊线虫，松材线虫；左下图DNA模板顺序依次为：菊花滑刃线虫，柑橘半穿刺线虫，强壮盘旋线虫，厚皮拟毛刺线虫，肾形拟毛刺线虫，剑属线虫，剪股颖植物种子，及ddH2O。
图3、LAMP特异性检测(LA-320C扩增曲线)。
其中，左上图DNA模板顺序依次为：剪股颖粒线虫，剪股颖粒线虫，维氏粒线虫，小麦粒线虫，粒科线虫，鳞球茎茎线虫，茎属线虫6，茎属线虫7；右上图DNA模板顺序依次为：茎属线虫8，茎属线虫9，穿刺短体线虫，伤残短体线虫，北方根结线虫，无花果胞囊线虫，仙人掌胞囊线虫，松材线虫；左下图DNA模板顺序依次为：菊花滑刃线虫，柑橘半穿刺线虫，强壮盘旋线虫，厚皮拟毛刺线虫，肾形拟毛刺线虫，剑属线虫，剪股颖植物种子，及ddH2O。
图4、LAMP特异性检测(显色法)。
其中，1～24反应管的DNA模板顺序依次为：剪股颖粒线虫，剪股颖粒线虫，维氏粒线虫，小麦粒线虫，粒科线虫，鳞球茎茎线虫，茎属线虫6，茎属线虫7，茎属线虫8，茎属线虫9，穿刺短体线虫，伤残短体线虫，北方根结线虫，无花果胞囊线虫，仙人掌胞囊线虫，松材线虫，菊花滑刃线虫，柑橘半穿刺线虫，强壮盘旋线虫，厚皮拟毛刺线虫，肾形拟毛刺线虫，剑属线虫，剪股颖植物种子，及ddH2O。
图5、LAMP灵敏度检测(LA-320C柱状图)。
其中，1～7号样本为剪股颖粒线虫DNA梯度稀释的模板，依次为：100，10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，8号的模板为ddH2O。
图6、LAMP灵敏度检测(LA-320C速率曲线)。
其中，CH1～CH7样本为剪股颖粒线虫DNA梯度稀释的模板，依次为：100，10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，CH8的模板为ddH2O。
图7、LAMP灵敏度检测(LA-320C扩增曲线)。
其中，CH1～CH7样本为剪股颖粒线虫DNA梯度稀释的模板，依次为：100，10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，CH8的模板为ddH2O。
具体实施方式
本发明人致力于物种的区分和鉴定研究，经过广泛地比较筛选，揭示了一组对于剪股颖粒线虫特异性良好的LAMP扩增引物，所述引物针对含有剪股颖粒线虫的DNA可发生特异性扩增(获得阳性结果)，而对没有剪股颖粒线虫的非剪股颖粒线虫或非线虫的DNA不发生特异性扩增(获得阴性结果)。本发明的方法可良好地应用于检测剪股颖粒线虫、将之与其非常接近的其它种类的线虫相区分，并且具有良好的再现性、灵敏度、检测稳定性。
线虫的种类非常多，存在超过28,000个已被记录的物种，粒属线虫是一类高度专化的植物种子和地上部寄生线虫，而剪股颖粒线虫是其中之一。
鉴于线虫种类繁多，从如此多的种类中找到对于剪股颖粒线虫特异性的鉴定试剂非常困难。需要考虑的不仅仅是剪股颖粒线虫这类物种本身的基因序列，而是需要考虑不要与其它与之具有亲缘关系的诸多物种产生交叉反应，这是非常困难的。对于这种区分，本领域中目前而言尚缺乏检测手段。
为此，本发明人经过了长期的研究和筛选，深入比对剪股颖粒线虫种内的保守性和非剪股颖粒线虫种间的差异性，以及比对粒线虫的属内的保守性和非粒线虫属间的差异性，经过针对各种样本的反复试验验证，最终确定了适用于鉴定剪股颖粒线虫的特异性引物和探针序列，即以下特异性扩增引物：正向外引物SEQ ID NO:1，反向外引物SEQ ID NO:2，正向内引物SEQ ID NO:3，反向内引物SEQ ID NO:4，正向环引物SEQ ID NO:5，反向环引物SEQ ID NO:6。
如本文所用，所述的“待测样品”可以是(但不限于)：植物、动物(包含家畜)、饲料、土壤、淡水、海水、地下水等。
基于本发明人的新发现，本发明提供一种引物，所述的引物是LAMP扩增引物，包括：正向外引物SEQ ID NO:1，反向外引物SEQ ID NO:2，正向内引物SEQ ID NO:3，反向内引物SEQ ID NO:4，正向环引物SEQ ID NO:5，反向环引物SEQ ID NO:6。
本发明的这些引物还可以用放射性同位素、生物素、酶、荧光素或其他化学发光物质进行标记。
利用本发明的引物，进行LAMP反应，并通过浊度仪检测或显色观察，就可以准确、快速地判断待测样品是否含有剪股颖粒线虫，而且所需的样品量很少。
LAMP是近年来发展的一种新颖和较成熟的等温核酸扩增技术。LAMP是针对靶基因的多个区域设计特异引物，利用链置换DNA聚合酶在等温条件下，即可完成的核酸扩增反应。与PCR方法相比，LAMP不需要热循环仪(PCR仪)，且由于LAMP反应中产生大量的副产物-白色焦磷酸镁沉淀，扩增产物通过肉眼观察或浊度计即可判定结果；因此LAMP适合于现场或条件较差的实验室进行快速检测。LAMP技术具有快速、准确和操作简便等优点。
本发明建立的剪股颖粒线虫的LAMP检测方法，用于解决我国检验检疫一线实验室快速、准确鉴定剪股颖粒线虫的检测需求。
获取待测样品的DNA的方法是本领域技术人员所熟知的技术，例如可采取传统的酚/氯仿/异戊醇法，或者可采用一些商购的DNA提取试剂盒，这类试剂盒是本领域技术人员熟知的。
本发明还涉及一种用于检测剪股颖粒线虫的试剂盒，所述试剂盒中含有针对剪股颖粒线虫的LAMP扩增引物。
此外，所述的试剂盒还可含有其它检测剪股颖粒线虫的试剂，如(但不限于)：含有剪股颖粒线虫的检测标准品；DNA提取试剂；pH缓冲试剂(如Tris-HCl(PH8.8))；钾离子溶液；镁离子溶液；铵离子溶液；Tween20；甜菜碱；dNTP；Bst大片段DNA聚合酶；荧光染料(如SYBR Green I荧光染料)。
此外，所述的试剂盒中还可含有检测剪股颖粒线虫的使用说明书和/或标准操作程序。
本发明所述的试剂盒可实现快速检测、批量检测剪股颖粒线虫的目的。
LAMP技术以其快速、准确、成本低和操作简便等优点在核酸的科学研究、病原微生物鉴定等领域得到了日益广泛的应用，但目前在剪股颖粒线虫中尚无相关报道。本发明将建立剪股颖粒线虫的LAMP检测方法，用于解决中国检验检疫一线实验室快速、准确鉴定剪股颖粒线虫的检测需求。
本发明的主要优点在于：
(1)快速、便捷。本领域人员只需要60min即可完成LAMP反应，而且对仪器设备要求低，不需要PCR仪、凝胶成像系统等昂贵仪器，使用水浴锅即可完成检测。
(2)特异性强。本发明的方法只能够特异地扩增剪股颖粒线虫，供试其它粒科线虫和非粒科线虫以及剪股颖植物种子均未发生非特异性扩增，具有非常理想的物种特异性。
(3)灵敏度高。本发明的检测方法的检测灵敏度可达0.41ng。
(4)步骤简单。所有试剂在反应前添加，实现一步核酸扩增。
(5)结果判定简便。其产物的检测方法比较多，用肉眼观察浊度或荧光显色就能够判断扩增与否，实现了结果可视化，还可采用实时浊度仪等方法判定。
(6)本发明的检测方法对人和环境安全，检测过程不需要使用EB等有毒试剂。
本发明建立的剪股颖粒线虫LAMP快速检测方法具有物种特异性和稳定性，且费用成本低廉，操作简便，快速准确，适用于各种实验条件的实验室(尤其是基层实验室)对剪股颖粒线虫的检测，对口岸快速检测具有重要意义。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
1、材料与方法
1.1 材料
剪股颖粒线虫DNA由天津出入境检验检疫局提供，小麦粒线虫DNA来自美国北卡罗来那州农业部农业服务处线虫实验室。其它供试线虫DNA均为上海出入境检验检疫局近年检疫工作中收集的线虫DNA。
线虫及其来源见表1。
表1、供试线虫DNA及其寄主植物材料和来源
1.2 主要试剂与仪器
试剂：
Bst DNA polymerase large fragment购自New England Biolabs公司。
Tris，KCl，(NH4)2SO4，Tween20，MgSO4，甜菜碱(Betaine)购自Sigma公司。
荧光试剂钙黄绿素，购自荣研生物科技(中国)有限公司。
dNTPs和MgCl2购自宝生物工程(大连)有限公司。
LAMP引物由上海生工生物技术有限公司合成。
其它常规试剂购自国药集团化学试剂有限公司。
仪器：
实施例中，所应用的主要仪器包括：LAMP实时浊度仪LA-320C；旋涡混合器；微量移液器；微量分光光度计；冰箱；离心机。
1.3 DNA提取
线虫DNA提取使用DNeasyBlood&Tissue Kit(QIAGEN)试剂盒。
剪股颖植物种子DNA提取使用DNAsecure Plant Kit(TIANGEN)试剂盒。
DNA提取方法按照试剂盒使用说明书进行。
1.4 LAMP引物设计
本发明人进行了大量的研究、分析，包括线虫属内比较(将剪股颖粒线虫与粒属的其它近似种进行比较)、属间比较(将剪股颖粒线虫与粒属线虫以外其它线虫进行比较)，以及将剪股颖粒线虫与大量其它物种进行比较。在此基础上，本发明人设计了适用于鉴定剪股颖粒线虫的LAMP特异性检测引物。引物序列如下：
正向外引物F3：GACGAATTCATTCTTACAGCCA(SEQ ID NO:1)；
反向外引物B3：GCACCATATCTGGTACTCATTG(SEQ ID NO:2)；
正向内引物FIP：CTGCTAAGCGGTGGGGACGAGTCTGAGAAGGTGCCCT(SEQ ID NO:3)；
反向内引物BIP：TCTCTGAGCAGTTGTATGCCTACGCTCGCGATCACGAAGACC(SEQ ID NO:4)；
正向环引物LF：CACCAGTAAGCAGCGTGC(SEQ ID NO:5)；
反向环引物LB：CTGCGTTGAAGAGAGACGG(SEQ ID NO:6)。
1.5 LAMP扩增和检测
25μL反应体系中各组分终浓度为：
当需要进行显色反应时，还在反应体系中加荧光试剂钙黄绿素1μL。用灭菌双蒸水补足体系。
LAMP反应条件：
63℃恒温反应60min，80℃灭活5min结束反应。
采用以下方法鉴别是否发生了LAMP反应：
(A)直接通过LAMP实时浊度仪观察。
(B)在反应前向体系中加入1μL钙黄绿素，反应后观察溶液颜色是否变为绿色。
1.6 LAMP特异性试验
将供试21种植物寄生线虫(包括粒科线虫9种和非粒科线虫12种)DNA和剪股颖植物种子DNA作为LAMP反应的模板，采用显色法的反应体系，进行LAMP扩增。
使用LAMP实时浊度仪实时监测LAMP反应，63℃运行60min，验证LAMP反应的特异性。
分别以实时浊度仪和显色法观察检测结果。
1.7 LAMP灵敏度试验
测定供试剪股颖粒线虫DNA浓度，并以10倍梯度进行系列稀释，DNA模板依次稀释至：10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，进行灵敏度试验。
使用LAMP实时浊度仪实时监测LAMP反应，63℃运行60min，以确定LAMP检测灵敏度。以实时浊度仪观察检测结果。
实施例1、LAMP特异性试验
使用本发明的引物和检测体系对供试DNA进行LAMP特异性检测。供试线虫包括：隶属于粒科的剪股颖粒线虫、维氏粒线虫、小麦粒线虫、粒科线虫1种、鳞球茎茎线虫、茎属线虫4种；以及穿刺短体线虫等12种非粒科线虫(见表1中编号10～21)。
图1～3为实时浊度仪LA-320C呈现LAMP特异性检测的结果。可见，所有样本中，仅剪股颖粒线虫样本呈阳性扩增，其它线虫及剪股颖植物种子样本均未发生扩增。
图4为显色法呈现LAMP特异性检测的结果，上中下三排小管中，上排第1和第2小管中的溶液呈现绿色(阳性)，其它小管均呈现橙黄色(阴性)，也即，所有样本中，仅剪股颖粒线虫样本呈阳性扩增，其它线虫及剪股颖植物种子样本均未发生扩增。
上述结果显示，只有剪股颖粒线虫样本呈阳性扩增，其它线虫及剪股颖植物种子样本均未发生扩增。因此，本发明的LAMP引物及方法具有物种特异性。
实施例2、LAMP灵敏度试验
使用本发明的引物和检测体系对供试DNA进行LAMP灵敏度检测。测定供试剪股颖粒线虫DNA浓度，DNA模板依次为：100，10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，进行灵敏度试验。
结果如图5～7。经测定，供试剪股颖粒线虫DNA浓度为16.5ng/μL。可以看出，线虫DNA在10-2稀释度时，60min内就可以准确检测到扩增产物，10-3稀释度未发生扩增反应。
经计算，本发明建立的剪股颖粒线虫LAMP检测方法的检测灵敏度为0.41ng。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 上海出入境检验检疫局动植物与食品检验检疫技术中心
<120> 一种基于LAMP技术的检测剪股颖线虫的方法
<130> 168437
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 1
gacgaattca ttcttacagc ca 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 2
gcaccatatc tggtactcat tg 22
<210> 3
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 3
ctgctaagcg gtggggacga gtctgagaag gtgccct 37
<210> 4
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 4
tctctgagca gttgtatgcc tacgctcgcg atcacgaaga cc 42
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 5
caccagtaag cagcgtgc 18
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 6
ctgcgttgaa gagagacgg 19

Claims (11)

1.一种检测剪股颖粒线虫的方法，其特征在于，所述方法为不以疾病诊断为目的的方法，包括：
以待测样品的DNA为模板，以特异性扩增引物进行环介导等温扩增；若发生特异性扩增，则表明待测样品中包含剪股颖粒线虫；
所述的特异性扩增引物包括：正向外引物SEQ ID NO: 1，反向外引物SEQ ID NO: 2，正向内引物SEQ ID NO: 3，反向内引物SEQ ID NO: 4，正向环引物SEQ ID NO: 5，反向环引物SEQ ID NO: 6。
2.一种将剪股颖粒线虫与其它线虫进行区分的方法，其特征在于，所述方法为不以疾病诊断为目的的方法，包括：
以待测线虫的DNA为模板，以特异性扩增引物进行环介导等温扩增；若发生特异性扩增，则表明待测线虫为剪股颖粒线虫；若不发生特异性扩增，则表明待测线虫为非剪股颖粒线虫；所述的其它线虫包括维氏粒线虫，小麦粒线虫，粒科线虫，鳞球茎茎线虫，茎属线虫，穿刺短体线虫，伤残短体线虫，北方根结线虫，无花果胞囊线虫，仙人掌胞囊线虫，松材线虫，菊花滑刃线虫，柑橘半穿刺线虫，强壮盘旋线虫，厚皮拟毛刺线虫，肾形拟毛刺线虫，剑属线虫；
所述的特异性扩增引物包括：正向外引物SEQ ID NO: 1，反向外引物SEQ ID NO: 2，正向内引物SEQ ID NO: 3，反向内引物SEQ ID NO: 4，正向环引物SEQ ID NO: 5，反向环引物SEQ ID NO: 6。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的环介导等温扩增的体系中包括所述的特异性扩增引物、Tris-HCl、K+、Mg2+、(NH4)2SO4、Tween20、甜菜碱、dNTP、DNA聚合酶。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的环介导等温扩增的体系中还包括钙黄绿素。
5. 如权利要求3所述的方法，其特征在于，Mg2+浓度8±1 mM、甜菜碱浓度0.8±0.2 M、dNTP浓度1.4±0.2 mM、Tris-HCl浓度20±3 mM、K+浓度10±2 mM、(NH4)2SO4浓度10±2 mM、Tween20浓度0.1±0.02 %。
6.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的环介导等温扩增在63±1℃恒温反应。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的待测样品包括：植物、动物、饲料、土壤、淡水、海水、地下水。
8. 用于检测剪股颖粒线虫的引物，其特征在于，所述引物是LAMP扩增引物，包括：正向外引物SEQ ID NO: 1，反向外引物SEQ ID NO: 2，正向内引物SEQ ID NO: 3，反向内引物SEQ ID NO: 4，正向环引物SEQ ID NO: 5，反向环引物SEQ ID NO: 6。
9.权利要求8所述的引物的用途，用于从待测样品中检测剪股颖粒线虫；或用于将剪股颖粒线虫与其它线虫进行区分；所述的其它线虫包括维氏粒线虫，小麦粒线虫，粒科线虫，鳞球茎茎线虫，茎属线虫，穿刺短体线虫，伤残短体线虫，北方根结线虫，无花果胞囊线虫，仙人掌胞囊线虫，松材线虫，菊花滑刃线虫，柑橘半穿刺线虫，强壮盘旋线虫，厚皮拟毛刺线虫，肾形拟毛刺线虫，剑属线虫；所述用途为不以疾病诊断为目的的用途。
10.一种检测剪股颖粒线虫的试剂盒，其特征在于，其中包括权利要求8所述的引物。
11.如权利要求10所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括：
含有剪股颖粒线虫的检测标准品；
Tris-HCl；
DNA提取试剂；
pH缓冲试剂；
钾离子溶液；
镁离子溶液；
铵离子溶液；
Tween20；
甜菜碱；
dNTP；
DNA聚合酶；
荧光染料；和/或
说明检测剪股颖粒线虫的方法的使用说明书。
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