CN108411019B - 环介导等温扩增技术检测猫胞裂虫的方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于分子检测领域，提供了环介导等温扩增技术检测猫胞裂虫的方法及其应用，设计合成专用引物，包括2条内引物FIP和BIP，2条外引物F3和B3，以待测的猫基因组DNA为模板，在专用引物的引导下进行LAMP扩增；取LAMP产物小心垂直加到加样孔中，对照Marker是DL2000DNA，用100V电泳电压，约30min，停止电泳，取出凝胶，于紫外凝胶成像系统中观察凝胶，观察有目的条带为阳性，没有目的条带为阴性；还可以将SYBR Green I加入到扩增产物中，在紫外光照射下，发出淡黄绿色荧光的为阳性，红橙色为阴性。本发明可以快速、准确的检测猫胞裂虫，CR高，并且耗时短、成本低、操作简单，便于临床上应用。

Description

环介导等温扩增技术检测猫胞裂虫的方法及其应用

技术领域

本发明属于分子检测领域，具体涉及环介导等温扩增技术检测猫胞裂虫的方法及其应用。

背景技术

猫胞裂虫(Cytauxzoon felis)属于梨形虫亚目泰勒科胞裂属的血液原虫，由于感染的蜱虫叮咬猫科动物而使其感染胞裂虫病。1976年在密苏里州首次报道了四例感染胞裂虫病例，通常感染了胞裂虫的家猫会致命，不过也有个别能存活下来，野生猫科动物是天然宿主，大部分会携带胞裂虫且活着。猫感染胞裂虫病后会出现如乏力，嗜睡，沮丧、发热、厌食、脱水、黄疸和肝脾肿大等临床症状，但是目前还没有有效的治疗方式。

胞裂虫病是一种新发、致命的疾病，这种传染性寄生虫病可以感染各种野生猫科动物和家猫，造成世界上重大的公共卫生问题，目前在北美洲、南美洲、欧洲以及亚洲少部分国家均有报道。研究表明山猫是胞裂虫的天然宿主，但是也有一些山猫感染严重急性的胞裂虫病后会死亡，临床上的家猫长期携带这种寄生虫表现正常的，通常感染胞裂虫病严重的恢复期很长。由于猫科动物感染胞裂虫病严重的程度和不断扩大的地理范围的影响，要加强兽医、宠物主人和群众对这种疾病的认识及重视程度。

目前的检测方法有显微镜诊断其中姬姆萨染料或苏木精-伊红染色法是最常用的方法，此方法简单易行，但是其疾病的早期症状不明显，不容易观察，即使是血液的病原量多时也不一定能确诊是这个疾病，况且载玻片上的水影等会干扰试验，准确度不高；临床诊断，能结合症状确定进一步检查的项目，但临床诊断只是一个诊断方向，不能马上确诊；免疫诊断准确度高，病程短，抗体可能还没有产生或者产生的量少，可行性不高；分子诊断，其中PCR是常用、有效且检测的准确率非常高的一种方法，但是PCR仪器价格昂贵，基层推广性不强，且试验时间长，还需凝胶电泳。

猫胞裂虫病的诊断方法有很多包括：临床诊断、实验室诊断(形态学诊断、抗体检测、PCR诊断)等传统的检测方法，其中形态学诊断、临床诊断很常用且直观，抗体检测、PCR诊断辅助治疗，帮助确诊。

(1)临床诊断由于猫科动物感染胞裂虫病出现特异性临床症状：黄疸、厌食和嗜睡这些最常见的表现，在夏季及其前后的时间发生黄疸、急性发作厌食、嗜睡的猫，兽医应该考虑可能胞裂虫病感染。全血计数和血清生化分析，虽然非特异性，但是对于胞裂虫病感染诊断也有用，异常的血液学参数是诊断胞裂虫病感染的支撑，包括出现弥散性血管内凝血(DIC)和全血细胞减少如白细胞低计数、血小板减少、淋巴细胞减少。胞裂虫病感染情况存在一些生化异常包括凝血酶原时间延长、低蛋白、高血糖、高胆红素血、低蛋白血、低钙血、稍微升高的丙氨酸转氨酶和天冬氨酸转氨酶、溶血性贫血等症状，这些异常的血液学参数并不是所有病例中都有，只能参考，临床诊断只是提供了一个诊断方向，大多数不能马上确诊，还需借助其他诊断方式。

(2)形态学诊断在临床实践中，诊断通常是通过涂片或细针抽吸肝脾快速淋巴结的血液中的寄生虫进行显微镜检测鉴定，姬姆萨染料或苏木精-伊红染色法是最常用的方法。红细胞内的胞裂虫正广泛用于胞裂虫病的诊断，猫胞裂虫存在几个不同的形状，有图章戒指形、安全别针、线形、逗号形和四分体形等，含有核区域，这种方法在生物上和技术上有一定的局限性。虫的循环标准通常较低，而其它的早期感染症状可能不存在，因为显微镜检测临床症状引起的裂殖体和红细胞内的变化，红细胞内的虫的量会决定疾病的程度，目前自然或实验感染猫科动物的胞裂虫病感染严重的病例只有一半。使用血涂片不一定排除其它疾病，在疑似病例中，推荐每日血涂片的制备，这些虫与泰勒虫属和巴贝虫属的形态上没有什么区别，但猫巴贝虫不在美国国家流行，猫很少会感染巴贝虫属和泰勒虫属发热和黄疸。小而多形性的胞裂虫可能会被误认为染色质小体、色斑沉淀、水影、支原体属，不过他们没有胞裂虫的环状典型特征，也没有细胞质，通常观察到在血细胞和覆盖的血细胞之间的染色沉淀物。支原体属、细菌通常在受感染的红细胞的外围观察，通常形成点、链和小环，但它不含核区域，很少在环状的红细胞内。精心制作的薄层血涂片应该有足够的血细胞扩散，以避免覆盖血细胞，在开始染色前，应彻底清洗干净载玻片，避免形成染色沉淀物或水伪影。在临床表现健康家养的猫红细胞内可能会有其他的发现，这当中的一些就是感染胞裂虫病并存活下来的猫，后者通常持续多年的胞裂虫低水平。观察这些存活下来的猫的红细胞内的虫并不一定确认临床症状是由胞裂虫病感染的，因为他们可能会感染其他疾病的病原体被误认为是胞裂虫病的感染，检测方法有显微镜诊断，但是不容易观察，准确度也不高。

(3)抗体检测在野生和家养猫科动物和其他动物中的胞裂虫的流行病学研究中，血清学检测具有研究价值，Uilenberg等人用胞裂虫抗体在感染猫胞裂虫的家猫或山猫中检测抗原，在使用噻唑烷二酮类药物以及脾切除术后表现出胞裂虫量增多，其血液适合于间接荧光抗体试验的抗原涂片的制备，这只猫恢复后抗体含量较高，当用包含胞裂虫裂殖体的器官材料感染猫时，猫死于胞裂虫病。采用胞裂虫、南非巴贝斯虫的阳性血清显示胞裂虫和非洲寄生虫之间没有显着的血清学关系，胞裂虫未显示对脾切除的绵羊具有感染性。Shindel等人(1978)用猫的血清作为抗体通过间接荧光抗体进行检测在实验感染的猫的冷冻脾切片中发现胞裂虫，初步结果表明感染的猫在死亡前没有形成可检测的抗体，疾病晚期只有低滴度的抗体，这种方法在急性病例中使用很有限，因为家猫在死亡之前还没有产生抗体或抗体效价很低。胞裂虫的抗体存在于实验感染家养的猫的血清中，由于产生纯化抗原的技术困难，还没有市售的猫胞裂虫病抗体检测试剂盒，可从血清中分离出抗体对感染胞裂虫又康复的家猫进行间接荧光抗体试验(IFA)检测抗原的试验，它的特异性尚未确定，且寄生虫抗原滴度通常很低，这种IFA测试对诊断感染胞裂虫但临床上正常的猫和宿主山猫并不是很有用。

(4)ISH检测原位杂交技术(ISH)分析研究并检查七个存档的猫胞裂虫病病例的各种组织，靶向地高辛标记的探针巴贝斯虫微型16S rRNA样基因，它与胞裂虫91％相同，比H&E染色敏感2至10倍，原位杂交重点在大多数组织中存在生物体显著的肺和脾脏，并且通常在原位观察到比HE多2到10倍的感染细胞杂交。通常在血管内发现携带寄生虫的细胞，这些细胞经常是紧密结合经常形成寄生血栓，在抗溶酶的作用下使用特异性抗体钙卫蛋白(Mac387)进行免疫组化抗体，验证了感染细胞的巨噬细胞来源，寄生细胞明显缺乏这种蛋白质，这表明缺乏寄生细胞的寄生虫的互相排斥和血管拥挤，为蜱提供更多传播寄生虫机会。免疫组化标记2个增殖标志物，增殖细胞核抗原(PCNA)和p53，表明寄生细胞具有增强的复制能力，这可能是一个另外的寄生虫驱动修改，以促进生存和传播。不同组织上ISH表现出具有实际应用的潜能，但是ISH特异性较低，不同组织/细胞之间存在差异,，这种情况下的低特异性可能是由于使用了非特异性的探测。

(5)PCR检测PCR是常用、有效且检测的准确率高的一种方法，PCR具有很高的灵敏度和特异性，美国佛罗里达州南部超过三分之一的野生的美洲狮染上了一项不能确定的疾病类型，其血液学参数中的皮质类固醇异常。最近一项采用巢式18s rRNA聚合酶链式反应(PCR)检测的研究发现，自由活动在南佛罗里达州只有9％的美洲狮感染胞裂虫，但发现这些动物中有83％感染了巴贝斯虫。利用PCR测定18S rRNA基因序列的研究来自这三只动物的血液显示感染胞裂虫病但不感染巴贝斯虫属。在这份报告中，发现轻度溶血性贫血和可能的肝损伤伴随最初发现胞裂虫病而发生染色血膜中的皮质蛋白，伊利诺斯州的一项研究基于PCR扩增胞裂虫ITS-1和ITS-2的遗传片段，全部检测并设有阴性对照分别对每对引物对应反应，在检测的2003-2012年600个猫科动物样品中阳性为12(0.02％)。一项使用实时PCR分析阿肯色州，佐治亚州的胞裂虫18S rRNA基因研究显示，阳性率27/89(30.3％)和34/133(25.6％)，对所有阳性样品进行常规PCR分析，用利用ITS序列ITS1、ITS2作为标记来评估寄生虫群体的基因型变异性。Carli等在同一城市(n＝63)和(n＝52)的猫进行一个流行病学研究调查胞裂虫，通过对意大利的里雅斯特的三只猫临床上检测到胞裂虫病后，感染并观察临床疾病的结果和与这种感染相关的变量。胞裂虫感染是通过PCR检测18S rRNA基因23％(27/118)和血涂片检查15％(18/118)家猫，说明了PCR比血涂片准确度要高，同时获得的18S rRNA基因序列与西班牙、法、蒙古在GenBank中上传的野生和家猫胞裂虫的序列相似度达99％，通过PCR检测统计统计学相关性，结果发现阳性之间没有性别、年龄、蜱和跳蚤的统计关联。

PCR扩增靶基因包括猫胞裂虫病18SrRNA基因序列、ITS-1、ITS-2和一个多拷贝基因(线粒体cox3)，其中PCR对cox3基因由于较高的拷贝数要比18S rRNA基因的扩增敏感，PCR检测通常比血涂片的显微镜检查敏感1000倍。PCR的缺点是不能区分急、慢性感染性疾病，猫胞裂虫病需要几个小时的时间内能现场性或样品远距离邮寄到诊断实验室，PCR仪器价格昂贵，基层推广性不强，试验时间长。

环介导等温扩增检测技术研究进展：环介导等温扩增(loop-mediatedisothermal amplification,LAMP)检测技术已经应用到了很多病原体的检测如利什曼虫、弓形虫、沙眼衣原体、结核分枝杆菌、猫冠状病毒、锥虫、禽流感H5、丙型肝炎病毒、黄曲霉、沙门氏菌等，但是针对猫胞裂虫的检测尚未开展。

Parida等研究发现，核酸扩增的检测方法比如PCR、3SR等对于传染病的诊断具有极高的应用价值。他们也存在不足之处：需要用于扩增和检测的复杂仪器以及试验方法的设计要科学合理，直到在2000年Notomi等人成功地设计了一种新的等温扩增方法LAMP检测法，能够在一小时内将少量的DNA大量扩增。

LAMP检测种类：不同的LAMP检测技术包括传统的LAMP，反转录LAMP，多重LAMP和其他用于检测微生物的LAMP形式。

反转录环介导等温扩增(RT-LAMP)是通过反向添加LAMP转录酶进行RNA检测。RT-LAMP使用逆转录酶从RNA中获得互补的DNA，并通过RNA使用DNA聚合酶进一步扩增可以完成检测，这种方法不仅有效更有研究和应用价值。这种检测方法检测病毒非常有效，比如埃博拉病毒、HIV等。有研究将数字设备与RT-LAMP结合在一起，提供全血检测的智能HIV-1阳性图像，用于设备简单的临床或者实验室中从个体中手指刺出血液进行简单检测艾滋阳性病毒，该检测技术可用于医院控制感染和实验室观察，检测结果简单并随时用肉眼观察颜色变化，该检测的灵敏度比qRT-PCR高出约100倍，RT-LAMP显示有希望特别是在农场内用于BATV检测的诊断工具。

电动LAMP(eLAMP)提供了一个快速和经济的LAMP模板推定测试靶序列的兼容性，这种方法有助于提高效率和使用现有引物来检测最近发现的艾滋病序列变体进行诊断。Santiago-Felipe等开发了盘内LAMP(iD-LAMP)检测致病性沙门氏菌的检测方法。并采用iD-LAMP原理和定量方法鉴定肉类样品中的牛肉由光盘驱动器进行光学读出，iD-LAMP是由微反应器组成的集成设备嵌入到光盘上用于实时靶向DNA检测。在孵化过程中，光盘是循环的，当光学响应大于截止值时，扫描样品被认为是正的值，iD-LAMP与传统的LAMP具有使用较少量模板的优点。

LAMP可以制成一个便携式设备，以方便运输到现场诊断，例如埃博拉病毒和食源性病原体的诊断。目前已经有试剂盒出现，LAMP作为即时检测方法的应用，包括冻干形式的LAMP试剂的开发，用于微生物特异性检测的市售LAMP试剂盒，其在用于任何分子检测之前经受住环境温度和长时间的储存，因此可以进行现场诊断。市场上有几种LAMP试剂盒可以买到，例如：布氏锥虫试剂盒、疟原虫病药盒、SARS冠状病毒检测试剂盒、弯曲杆菌检测试剂盒、肺炎支原体检测试剂盒、隐孢子虫检测试剂盒等均可从Eiken Chemical美国生物科技有限公司买到。

LAMP检测方法：LAMP常用的检测方法多种多样，通过借助仪器或者试剂实现对LAMP产物的判断，方法主要包括浊度法，琼脂糖凝胶电泳法，颜色观察法，用UV光检测、横向流动检测法。

LAMP应用病原：目前将LAMP技术用于诊断包括传统的LAMP检测人类呼吸道病原体结核分枝杆菌，肺炎链球菌，百日咳博德特氏菌，且LAMP也是设计来诊断与食源性疾病相关的病原体，例如伤寒沙门氏菌，空肠弯曲杆菌。Lee等成功的将LAMP应用到包括肠道沙门氏菌、艾滋病和疟原虫病在内的传染病以及其他病原体感染性疾病，LAMP的检测法使用，证明了它准确的分子检测和区分病原体的优点，具有广阔的应用前景，其在常见的病原(病毒、寄生虫、真菌、细菌等)均有应用。

寄生虫，原生动物寄生虫对人类同样有害，是世界上导致死亡的主要原因之一，短时快速准确的检测对于生产和生活有着极大的意义。最近，用于检测某些寄生虫的LAMP试剂已被使用商业化。LAMP检测已在多种寄生虫上进行了应用比如检测溶组织内阿米巴、弓形虫、利什曼原虫、罗阿丝虫，还有一些其他LAMP技术应用报道，显示LAMP比常规PCR更敏感，并在现场检测和早期寄生虫感染检测中进行了应用。

常规的检测双芽巴贝斯虫病的方法包括血液涂片镜检、血清学检查、常规PCR检测等，但是这些方法存在假阳性率高的缺点，由于经济等原因大部分方法并不适合于流行病学的实验室诊断，尤其是实时定量PCR技术，必须使用较昂贵的试验条件及需要较高的专业技术。杨秋林等用LAMP法检测恶性疟原虫,实验结果显示其检测恶性疟原虫的阈值达1.5个疟原虫/107RBC，并将这4条引物与间日疟原虫环子孢子蛋白基因进行同源性分析，显示没有配对碱基,具有很好的特异性。

目前检测胞裂虫病所采用的ELISA方法敏感性强但特异性不高，PCR目前检测胞裂虫病常用且有效的检测方法，PCR所依赖的仪器价格较贵，因胞裂虫病病程短，很多检测方法不能满足临床需要，因此迫切需要建立快速便捷的检测方法。LAMP是一种创新的基因扩增技术，并为实验室PCR方法和临床寄生虫检测提供基础性检测。由于其显著的灵敏度高，特异性强，速度快等优点，LAMP已经适用于微生物病原体的检测和鉴定，LAMP的高灵敏度可以检测到样品材料中的病原体，可不进一步制备样品，LAMP能够应用于临床诊断以及感染性疾病的监测。因此，进行胞裂虫的LAMP检测方法研究将为胞裂虫病的诊断提供更好的方法，建立特异检测猫胞裂虫病的LAMP反应体系，丰富胞裂虫病分子检测手段，为该病的田间快速检测和控制提供技术支持。

环介导等温扩增技术(1oop-mediated isothermal amplification，LAMP)应用于检测胞裂虫病，是一种新的核酸等温扩增方法，其特点是利用一种链置换BstDNA聚合酶在等温条件保温30～60min，即可高效、快速、高特异、高灵敏地扩增靶序列。技术主要包括针对靶基因ITS1在线设计4条(2条内引物：FIP和BIP；2条外引物：F3和B3)特异引物；LAMP扩增反应体系优化；同时，对LAMP特异性、敏感性进行了评估，扩增结果可通过肉眼或显色反应直接判断结果。LAMP技术是一种灵敏度高、特异性强、操作简单快速的检测胞裂虫病的方法。不需要模板的热变性、长时间温度循环、繁琐的电泳、紫外观察等过程，便于临床推广运用。

发明内容

针对以上技术问题，本发明公开了环介导等温扩增技术检测猫胞裂虫的方法及其应用，目的是建立是一种灵敏度高、特异性强、操作简单快速的检测猫胞裂虫病的方法，弥补传统检测方法的不足，不需要模板的热变性、长时间温度循环、繁琐的电泳、紫外观察等过程，对仪器的依赖性较低，便于临床推广运用。

本发明的技术方案为：一种环介导等温扩增技术检测猫胞裂虫的特异性引物，所述特异性引物包括：2条内引物FIP和BIP，2条外引物F3和B3，所述特异性引物的序列如下：

FIP:5'-CATGGAGGGGTGGTAATGTAACGTTGTTTATTCATAGAGTAAACGCT-3'

BIP:5'-TCACTTGGGTTATGTTGCAGTGCAGCAACTAATAGAGAATTAGCA-3'

F3:5'-CCTTCATCCTGTAATTTCGTAAC-3'

B3:5'-GTAGTTGTATGAAAGAAAGAAGGA-3'

本发明还提供了一种环介导等温扩增技术检测猫胞裂虫的方法，包括

A提取待测的样品基因组DNA为模板；

B在前面所述的特异性引物及其体系下进行LAMP扩增；

C扩增反应结束后，肉眼直接观察是否有白色沉淀物，出现白色沉淀物的为阳性，没有白色沉淀物的为阴性。

本发明还提供了另一种环介导等温扩增技术检测猫胞裂虫的方法，包括：

a提取待测的猫基因组DNA为模板；

b在前面所述的特异性引物及其体系下进行LAMP扩增；

c扩增反应结束后，将SYBR Green I加入到扩增产物，在紫外光照射下，发出黄绿色荧光的为阳性，红橙色为阴性。

进一步的，所述LAMP的反应体系为25μL，包括：FIP、BIP各1.6mM；B3、F3各0.2mM，dNTPs 1.4mM，MgSO₄ 6mM，待测的基因组DNA 1μL，8U Bst DNA聚合酶。

进一步的，所述待测的猫基因组DNA的最大稀释度为10²。

进一步的，LAMP扩增条件为：61℃-65℃恒温反应60min。

进一步的，所述恒温反应温度为63℃。

本发明还提供了一种猫胞裂虫的LAMP检测试剂盒，所述试剂盒包含有前面所述的特异性引物。

本发明还提供了前面所述的环介导等温扩增技术检测猫胞裂虫的特异性引物在猫胞裂虫病的诊断和鉴定中的应用。

本发明还提供了前面所述的环介导等温扩增技术检测猫胞裂虫的方法在猫胞裂虫病的诊断和鉴定中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

比常规PCR检测相比，LAMP技术是一种灵敏度高、特异性强、操作简单快速的检测猫胞裂虫病的方法。不需要模板的热变性、长时间温度循环、繁琐的电泳、紫外观察等过程，便于临床推广运用。

附图说明

图1为不同温度扩增电泳图，图中M:DNA标准DL2000，2:阴性对照，1、3、4、5、6分别为：61℃、62℃、63℃、64℃、65℃；

图2为不同dNTPs浓度扩增电泳图，图中M:DNA标准DL2000，1:阴性对照，2-6分别为:0.8mM、1.0mM、1.4mM、1.8mM、2.2mM；

图3为不同Mg²⁺浓度扩增电泳图，图中M:DNA标准DL2000，1-5分别为:1.2mM、3.6mM、6mM、8.4mM、10.8mM；

图4为本发明LAMP检测方法灵敏度电泳图，图中M:DNA标准DL2000，1:阴性对照，2-10分别为:DNA稀释梯度10⁰，10¹，10²，10³，10⁴，10⁵；

图5为本发明LAMP检测方法特异性电泳图，图中M:DNA标准DL2000，1:胞裂虫，2:阴性对照，3-7:分别为:弓形虫、巴尔通体、隐孢子虫、间日疟原虫、巴贝斯虫，8：空白对照；

图6为LAMP检测方法的研究技术路线图。

具体实施方式

以下将结合附图和实施例对本发明技术方案作进一步地详述。

胞裂虫病的传播是与多方面因素有关，如环境卫生的管理、疾病的防控措施等，胞裂虫的传播是通过蜱虫进行的，一旦蜱虫带有病原叮咬猫之后，猫就会感染，因此猫感染胞裂虫，尤其是流浪猫感染率居高，跟其接触到带有病原的蜱虫有关。我们采集的流浪猫的血样是集中在云南的边境地带，边境跟国外的贸易频繁，也出现检疫不到的贸易物品，如此滋生寄生虫的发展和繁殖，流浪猫的生存环境大都是湿润潮湿等适合蜱虫生存的地方，被带病原的蜱虫叮咬后感染，而不带病原的蜱虫叮咬了带病的猫之后，也会再次传染给其他健康的猫，家猫感染可能是其在生活环境附近活动，会接触到蜱虫，增加感染机率。另外猫胞裂虫病感染的主要原因还有饲养管理水平较弱，环境卫生较差，消毒不彻底等，大多数猫散养户都是原生态的，不同动物间接触频繁，也是导致猫胞裂虫病感染率高的重要原因之一。

LAMP是一种核酸扩增方法，其反应过程是一组四个或六个不同的引物与靶基因上的六个或者八不同区域结合使其高度地结合，该引物组由两个外引物(F3和B3)，两个内引物(FIP、BIP)组成。LAMP反应通过使用具有高置换活性的Bst DNA聚合酶可以在等温下简单完成。

用于LAMP反应的一组引物包括正向内部引物FIP，后向内部引物BIP，两个外部引物被描述为向前外部引物F3和向后外部引物B3，对应于6个不同的靶基因序列区域：3'侧的F3c，F2c，F1c和5'侧的B1，B2，B3。设计两个循环引物：正向引物(FLP)和反向环状引物(BLP)来加速扩增反应。

LAMP扩增可以分成两个阶段，在初始阶段，FIP的F2与模板DNA链的F2c杂交，指导互补DNA链的合成，F3引物在FIP之外退火到模板的F3c区域。在Bst DNA聚合酶的作用下，开始链式取代反应释放FIP连接的互补链，双链从F3引物和模板DNA合成DNA链，互补端发生的反应类似，看起来像一个哑铃结构形成，这个结构在随后的反应期间用于循环扩增的模板。第二阶段是循环扩增，哑铃结构作为模板，合成DNA，这样反复扩增最终产生很多的哑铃结构DNA，形成的产物是茎环DNA与几个重复的目标和菜花状结构多重循环。

由于新的和现有的疾病或病原体的发生，使疾病的检测正在逐渐变得困难，检测技术中LAMP是一个有效的检测方式，可以作为首选的工具，尽管原理和反应机制稍微复杂但是相比方便的特性和优点是微不足道。

LAMP最显着的优势就是LAMP的快速性，能保证方便检测，任何其他核酸扩增技术，例如PCR不能做到短时间检测；LAMP不需要DNA模板的最初热变性，扩增迅速进行；简单，只需要一个水浴锅或加热块者能提供等温条件，这消除了需要其他扩增技术所需的高级仪器。LAMP有希望提高分子生物学技术与检测的简单性，由此用于LAMP反应的染料能够肉眼观察，在自然光或紫外光下使用荧光观察颜色变化。

LAMP也有一些局限性，比如这种技术不适用于克隆或其他分子生物学的研究，因为其最终的产物是一个大的DNA链，与PCR相比功能更少，选择一个特异性的扩增目标，高度保守的区域或微生物菌株特定的靶位点有些困难，为了提高灵敏度和特异性，LAMP使用4～6个靶向6的引物或在目标序列的相当小的片段内的8个区域。引物设计是受许多限制，即使在线免费软件是可以帮助引物设计，但在一些目标区域不适合选择的时候需要手动设计引物。使用多个引物将增加引物-引物杂交的机会导致无模板扩增产生假阳性结果，需要进一步筛查判断假阳性的可能性，在发生上述现象的情况下，需重新设计引物。

LAMP的一个主要缺点是其经常受到污染的高风险导致阴性对照的假阳性结果，这是由于LAMP反应的效率非常高，LAMP产物稳定，不易于降解，因此可能发生意外的携带污染。如果出现上述污染，建议LAMP在层流罩内进行，使用移液器进行添加试剂。涉及程序反应管例如凝胶电泳的开启，单独进行LAMP反应，因为LAMP对微小的产物污染非常敏感。LAMP能够直接从环境样本中检测病原体，特别是在由环境病原体引起的疾病如钩端螺旋体病，LAMP是对日常现场有利检测工具。

LAMP使用4到6个靶向6的引物或在目标序列的相当小的片段内的8个区域。引物设计受多项限制，在线免费软件可以帮助引物设计，但在一些不适合选择目标区域的时候设计一个LAMP引物会出现问题，需要手动设计引物。使用多个引物将增加引物-引物杂交的机会，无模板扩增产生假阳性结果，需要进一步筛查判断假阳性，在发生上述现象的情况下，建议重新设计引物。LAMP的一个主要缺点是其经常受到污染导致阴性对照的假阳性结果，这是由于LAMP反应的效率高，LAMP产物非常稳定不易于降解，因此可能发生意外的携带污染，如果出现上述污染，建议LAMP在层流罩内进行，使用移液器进行添加试剂。涉及程序例如凝胶电泳反应管的开启，由于LAMP对微小的产物污染非常敏感，需要单独进行LAMP反应。

本实施例的研究步骤如下：

一、材料准备

1、采集云南版纳州、临沧市、红河州流浪猫，昆明和玉溪宠物医院家待检测胞裂虫的血液样品，并提取DNA，实验室保存，测定含量后，-20℃保存备用。

2、主要试剂

2×Taq PCR MasterMix、Red Cell Lysis Buffer、DNA回收试剂盒、高纯质粒小量制备试剂盒，TIANamp Genomic DNA Kit血液、细胞、组织基因组DNA提取试剂盒，2000bpDNAmarker为天根生物技术(北京)有限公司产品；

SYBR Green I、pMD18-T载体等为宝生物工程(大连)有限公司产品；dNTPs、BstDNA聚合酶、MgSO₄、10×ThermoPol Buffer为New England Biolabs公司产品；Goldview核酸染料、琼脂糖为北京全式金生物技术有限公司产品；

EDTA为昆明贝尔吉生物科技有限公司产品。

电泳50×TAE缓冲液配制：电泳使用的缓冲液，先配制成50×TAE，配制方法为：Tris-base242g、Na₂EDTA·2H₂O37.2g、冰醋酸28.5ml，使用时加入ddH₂O配置溶液容积为1000ml，加ddH₂O稀释成使用溶液是1×TAE，室温存放备用。

3、主要仪器设备

QL-861的涡旋混合器为北京安捷来勒科技有限公司产品；

CF-10的微型离心机为北京朋利驰科技有限公司产品；

702的-80℃冰箱为Thermo Scientific公司产品；

BSA124S的电子天平为赛多利斯公司产品；

UPW-50S型超纯水器为北京历元电子仪器技贸公司产品；

SW–CJ–IFD的超净工作台为苏净集团安泰空气技术有限公司产品；

HVE-50是高压蒸汽灭菌锅为日本Hirayama公司产品；

BG-subMINI是迷你水平电泳仪为BAYGENE公司产品；

YXQ-SG46-280是高压锅为上海博迅实业有限公司医疗设备厂产品；

PTC-1148的PCR仪器为Bibby Scientific公司产品；

全封闭式紫外分析仪为BAYGENE公司产品；

W-CJ-1F的垂直流净化工作台为苏净集团安泰空气技术有限公司产品；

微波炉；WD-9405B的水平摇床，2.5μL、10μL、100μL、200μL、1000μL的移液器为eppendorf公司产品；

制冰机、JY300的电泳仪、DYCP-40C的转膜仪等为北京六一生物科技有限公司产品；

枪头、冻存管、塑胶手套等为天根生物技术(北京)有限公司产品等。

二、LAMP检测方法的研究

LAMP检测方法的研究技术路线见附图6。

1、血液DNA提取

胞裂虫虫体基因组提取DNA是从EDTA抗凝和新鲜冰冻血按TIANamp Genomic DNAKit血液、细胞、组织基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)使用说明进行，其具体方法和步骤如下：

311只猫全血中加入红细胞裂解液，留下沉淀，将上清吸出；

然后混合20μL蛋白酶K消化，和200μLGB在70℃恒温水浴，从水浴锅里取出消化完全的血液裂解液，若有块状物，可适当延长消化时间并上下点到混匀；

12000rpm离心10sec，加入200μl无水乙醇，震荡15sec，12000rpm离心10sec，将所有的混合溶液转移到收集管中的CB3吸附柱中12000rpm离心30sec，倒掉收集管内液体，吸附柱CB3放回收集管；

加入500μl缓冲液GD到吸附柱CB3中12000rpm离心30sec，将收集到的液体倒掉，放回吸附柱CB3；

CB3吸附柱内加入600μl漂洗液PW，12000rpm离心30sec，倒掉收集管内废液，放回吸附柱CB3；

重复操作上一步，12000rpm空离2min，倒掉废液；

取出CB3吸附柱，放置室温几分钟，直到吸附柱里的漂洗液完全晾干；

取出CB3吸附柱，放到一个灭菌且干净的1.5mL Eppendorf管中，取25μl的TE洗脱缓冲液加入到吸附膜中央，滴入后室温静置4min，12000rpm离心1min，重复上述步骤，最终收集到离心管的溶液即为所需液体。放置在-20℃冰箱保存提取DNA备用。

2、PCR反应

(1)引物合成

通过查找文献和设计引物，并由上海生工合成，使用前加入灭菌超纯水到引物中进行稀释，按规定稀释浓度稀释，分装后于-20℃保存备用。

最终筛选使用根据文献中发表的胞裂虫ITS2基因特异性的PCR引物基因(GenBank登录号：EU450801)，核苷酸序列如下：

上游引物ITS2F：5'-TGAACGTATTAGACACACCACCT-3'；

下游引物ITS2R：5'-TCCTCCCGCTTCACTCGCCG-3'。

引物保存的稀释浓度为:Forward primer 50pmol/μL、Reverse primer 50pmol/μL于-20℃保存备用，使用浓度为Forward primer 10pmol/μL、Reverse primer 10pmol/μL，使用时进行稀释，并放4℃保存，以免反复冻融。

(2)扩增及条件优化

在0.2mL的离心管中依次加入灭菌去离子双蒸水、2×Taq PCR MasterMix、上游引物、下游引物、模板DNA，瞬时离心混匀后，于PCR扩增仪中扩增，PCR扩增反应体系为25μL，体系如表1。

表1 PCR扩增反应体系

(3)PCR反应及优化结果

优化后的单PCR反应条件：引物0.2mmol/L，2×Taq PCR MasterMix 0.5mol/L；扩增条件为：95℃5min；94℃30sec；58℃30sec；72℃1min共35个循环，72℃延伸10min，4℃保存。电泳后分析显示扩增出大小为233bp和234bp(去除两端无效碱基)的目的条带，与目的片段264bp相符。

(4)琼脂糖电泳分析

取适量1×TAE将其倒进电泳槽中，使槽内的液面刚好没过凝胶，称量琼脂糖1.5g，然后量取100mL 1xTAE溶液混匀，在微波炉内用中火加热至琼脂糖完全溶解，溶液变清亮，配成1.5％的琼脂糖凝胶。取Goldview核酸染料10μL加入到溶解好的溶液中充分摇匀，取出制胶板安放好插梳，然后将溶液倒入制胶板内，根据需要调整凝胶的厚度，室温冷却25-30min后，胶块完全凝固拔掉插梳，将凝胶放进提前准备的电泳槽内，电泳时，取5μLPCR产物小心垂直加到加样孔中，对照Marker是DL2000DNA。用100V电泳电压，约30min，停止电泳，取出凝胶，于紫外凝胶成像系统中观察凝胶，拍照并保存记录结果。阳性PCR产物测序鉴定及序列的分析比对，送上海生工鉴定为胞裂虫阳性的PCR产物进行测序，验证是否为胞裂虫的序列片段，确定之后按上海生物工程公司UNIQ-5柱式PCR产物纯化试剂盒说明进行。

(5)连接与转化

配置10μL的体系：将胶回收产物取4.2μL，solution1取5μL，pMD18-T取0.8mL混匀，PCR16℃连接10h，100μL DH5α放在冰盒中10min融化，无菌条件下将10μL连接产物完全转移到100μL DH5α感受态细胞中混匀。

冰浴30min，42℃水浴热应激90sec，立即冰浴冷却3-4min。加入LB培养基900μL混匀，于水浴恒温摇床37℃，95rpm培养1h。

制备LB固体选择培养基：在含Amp的LB固体培养基中加入45μL IPTG/X-gal(40μLX-gal、5μLIPTG)混合液，全部加到培养皿上，转动摇匀。

取培养后的菌液100μL加到Amp培养基上，转动摇匀，放入恒温箱中37℃平放5h，待其吸收完全后，倒置平皿，继续培养13～19h后，取出观察结果。

用接种环小心挑取平板中的单个白色菌落，于含有5ml Amp(浓度为1g/ml)的液体培养基的试管中轻轻搅动几次；将试管于水浴恒温摇床中37℃，150rpm培养15h及以上。

取10μL的菌液稀释100倍(加90μL的去离子水)，100℃高温煮菌10min，取1μL的煮好的菌液做扩增模板进行PCR鉴定，反应体系及反应条件与之前的PCR鉴定条件一致。

扩增完毕后，取3～4μL PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，经鉴定为阳性转化的菌液(可扩增出ITS2基因的265bp左右的目的片段)作好标记，4℃保存备用。

(6)测序与比对

将扩增产物送上海生工测序以及拼接，将测序公司反馈结果在NCBI上进行Blast验证是否为胞裂虫的序列片段，通过DNAstar Version 7.0软件对序列进行比对以及系统发育分析。

三、LAMP引物设计、体系建立与优化

(1)LAMP引物设计

根据猫胞裂虫的ITS1片段设计引物登录号为:KT783520.1，并已经测序的胞裂虫ITS1基因序列，通过在线设计软件primerexplorerV5设计LAMP引物网址为http://primerexplorer.jp/e/，每个反应所需的引物共4条包括有2条内引物：FIP和BIP、2条外引物：F3和B3，本实验选取了分值较高的前4套引物进行筛选，分数最高的第一是套进行的LAMP反应最敏感的，经试验确定最佳引物为：

本发明选取的引物为：

FIP:5'-CATGGAGGGGTGGTAATGTAACGTTGTTTATTCATAGAGTAAACGCT-3'

BIP:5'-TCACTTGGGTTATGTTGCAGTGCAGCAACTAATAGAGAATTAGCA-3'

F3:5'-CCTTCATCCTGTAATTTCGTAAC-3'

B3:5'-GTAGTTGTATGAAAGAAAGAAGGA-3'

引物选取之后进行在线BLAST分析，分析结果显示为胞裂虫特异性引物，并由上海生物工程公司合成。实验反应对引物进行稀释，四套引物的F3、B3的浓度为10pmol，FIP、BIP的浓度为10pmol，-20℃保存备用。

(2)LAMP体系建立与优化

反应体系25μL，体系终浓度：FIP、BIP各1.6mM；B3、F3各0.2mM，400μM dNTPs，5mMMgSO₄，以胞裂虫DNA样品为模板1μL，8U Bst DNA聚合酶。

1)LAMP检测体系的建立

反应体系25μL，体系的最终浓度：FIP、BIP各1.6mM，B3、F3各0.2mM，dNTPs 400μM，MgSO₄ 5mM，以胞裂虫DNA样品为模板1μL，Bst DNA 8U聚合酶。反应体系如表2：

表2 LAMP扩增反应体系

上述反应物混匀后于63℃，恒温反应60min。取5μL扩增产物，加到1.5％的琼脂糖凝胶上调整电压120V、时间30min电泳，在紫外灯下进行观察结果，试验结果显示该引物能满足LAMP的敏感性，特异性，显色反应试验的要求。

2)LAMP检测体系的优化

对LAMP的扩增温度及Mg²⁺、dNTPs浓度进行优化，确定最佳的反应条件，分别置于63℃恒温反应60分钟，电泳观察条带特征，选择最优结果。温度设置了61℃、62℃、63℃、64℃、65℃，Mg²⁺的浓度分别为1.2mM、3.6mM、6mM、8.4mM、10.8mM，Mg²⁺(100mM)体积为0.3μL、0.9μL、1.5μL、2.1μL、2.7μL。dNTPs的最终浓度是0.8mM、1.0mM、1.4mM、1.8mM、2.2mM，dNTPs(10mM)的最终体积是3.2μL、0.4μL、3.5μL、7.2μL、8.8μL，结果见附图1、2、3。

由附图1可知，在61-65℃温度范围内LAMP扩增同一模板，反应条件相同，结果显示，每个温度都对应相应的电泳梯形条带，各温度之间存在一定的差异，但不是很明显，61℃和62℃的条带较弱，在61-65℃温度范围内条带两度呈现递增趋势，但是考虑到条带的清晰度和均匀程度选择63℃为最适LAMP的反应温度。

由附图2可知，LAMP反应dNTPs的浓度是其中一个重要影响因素。随dNTPs浓度的变化量增加，反应的条带也由模糊到清晰，然后再到模糊。dNTPs的最终浓度为1.4mM时的效果要好于其他终浓度，选择1.4mMd dNTPs终浓度作为LAMP的dNTPs最佳反应浓度。

由附图3可知，Mg²⁺对LAMP试验有一定的影响，条带变化是随着Mg²⁺终浓度升高逐渐变亮，Mg²⁺终浓度为1.2mM未出现条带，但是Mg²⁺终浓度过高时，条带特异性下降出现模糊。LAMP实验的最佳反应浓度选择6mM作为Mg²⁺终浓度。

将胞裂虫阳性的DNA进行5倍倍比稀释,稀释度从10⁰到10⁵倍,取每个稀释度的1μL作为模板，加入到建立的LAMP反应体系中，进行LAMP扩增,结果如附图4所示，本发明的AMP方法检测DNA的最大稀释度为10²，浓度为100fg。

3)LAMP的灵敏性以及显色反应

LAMP能检测到胞裂虫DNA样品浓度为100fg。样品经LAMP扩增后，加SYBR Green I荧光染料，在紫外灯的照射下，阳性扩增产物呈黄绿色，荧光下发出黄绿色的荧光，阴性为红橙色。

4)LAMP的特异性

利用本发明的方法检测胞裂虫、弓形虫、巴尔通体、隐孢子虫、间日疟原虫、巴贝斯虫、空白对照，结果见附图5，表明LAMP只对胞裂虫的基因扩增，而对弓形虫、巴尔通体、隐孢子虫、间日疟原虫、巴贝斯虫、空白对照没有交叉反应，证明LAMP反应的特异性强。

实验调查云南省胞裂虫病流行情况，调查结果显示的与国外研究情况相符，流浪猫或者散养的猫感染的比较多，尤其是散养在温暖湿润的环境中，同时研究结果显示胞裂虫病在云南省的流行范围较广，感染的机率较大。

我国云南省胞裂虫病的平均感染率与国外以往对胞裂虫病调查结果比较整体相对偏低，但也有局部地区处于相对偏高水平，平均感染率数据没有稳定的变化呈波动特点，但流浪胞裂虫病感染率总体呈上升趋势，宠物猫的部分地区也是感染率居高于国外研究的平均水平，说明胞裂虫病感染率严重。云南省素有动物王国、植物王国之称，寄生虫种类丰富，地理环境复杂多样，温度和湿度适宜，根据其他寄生虫的调查，中国云南省的寄生虫的感染程度往往比其他地区要严重，也是寄生虫的高发区、重灾区，证明了云南省存在胞裂虫的感染。

研究采用LAMP方法，是其比常规PCR检测方法灵敏、特异、检出率也比常规PCR高。在进行胞裂虫检测或实验室检测时，感染的不同时间段胞裂虫的含量不同，然而在猫血液中的胞裂虫DNA含量低时很难确诊，它的临床症状与猫的很多病症相似，因此将LAMP检测方法辅助其他检测方法进行确诊，结果更加准确。

LAMP检测胞裂虫病，是一种新的检测胞裂虫病的技术，与传统的检测胞裂虫病的方法相比，LAMP比PCR更灵敏10-100倍，LAMP分析可以用于感染早期的疾病检测或临床症状不明显时，需要时间少，反应的温度条件程序简单，DNA可在15-60min完成扩增10⁹-10¹⁰倍，比PCR节约1h来完成反应，通过实施例可知，LAMP比PCR有更大的优势：耗时短、成本低、操作简单，解决了胞裂虫病病程短，对快速检测的方法的需求问题。

当LAMP检测胞裂虫病时，条件保温30～60min，即可高效、快速、高特异、高灵敏地扩增靶序列，扩增结果可通过肉眼或显色反应直接判断结果，不需要模板的热变性、长时间温度循环、繁琐的电泳、紫外观察等过程，便于临床推广运用。

LAMP是快速检测和诊断猫感染胞裂虫的检测工具，除了操作简单，易于适应任何现场环境和环境，LAMP拥有实时检测所需的基本功能，比如高灵敏度，仪器设备容易操作，是实用价值高的检测工具，检测猫胞裂虫准确度高，且不与其他病原以及空白对照发生交叉反应。

实验得出云南省胞裂虫的流行情况，通过对云南省猫胞裂虫的检测情况显示总体阳性率为21.54％，流浪猫感染率是51.35％，家猫的感染率为12.24％，说明我国云南省的胞裂虫感染率居高，本研究为胞裂虫的流行病学调查和防控提供参考。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种环介导等温扩增技术检测猫胞裂虫的特异性引物，所述特异性引物包括：2条内引物FIP和BIP，2条外引物F3和B3，引物序列为：

FIP:5'-CATGGAGGGGTGGTAATGTAACGTTGTTTATTCATAGAGTAAACGCT-3'，

BIP:5'-TCACTTGGGTTATGTTGCAGTGCAGCAACTAATAGAGAATTAGCA-3'，

F3:5'-CCTTCATCCTGTAATTTCGTAAC-3'，

B3:5'-GTAGTTGTATGAAAGAAAGAAGGA-3'。

2.一种猫胞裂虫的LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含有权利要求1所述的特异性引物。

3.权利要求1所述的特异性引物，在制备猫胞裂虫的LAMP检测试剂盒中的应用。

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