CN110923341B - 养殖鱼类病原海藻希瓦氏菌lamp检测方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了养殖鱼类病原海藻希瓦氏菌LAMP检测方法及应用，包括设计用于特异性检测海藻希瓦氏菌的LAMP检测引物；设计用于检测海藻希瓦氏菌的荧光LAMP检测试剂盒；对外引物、内引物进行浓度比例调节，然后根据扩增效果确定最佳引物浓度比例；对待检样品的DNA进行提取，然后作为模板DNA进行LAMP扩增；通过肉眼观察荧光染料颜色变化情况；用琼脂糖凝胶电泳实验进行验证；本发明通过设计4条特异性引物，并通过优化反应体系和反应条件，设计了海藻希瓦氏菌的荧光LAMP检测试剂盒，利用LAMP检测技术可以在65℃的条件下完成扩增，不需要操作复杂和昂贵的仪器，使用成本低，且本发明提供的试剂盒反应快速，可以在1h内完成反应。

Description

养殖鱼类病原海藻希瓦氏菌LAMP检测方法及应用

技术领域

本发明涉及分子生物学检测技术领域，尤其涉及养殖鱼类病原海藻希瓦氏菌LAMP检测方法及应用。

背景技术

海藻希瓦氏菌是一类重要的人鱼共患病的条件性致病菌，会给养殖渔业带来严重的经济损失，其引起鱼类感染的报道也越来越多，因此，进行病害的快速检测技术研究是实现病害早期诊断和提出有效防控措施的关键。且鉴于该细菌对鱼体的严重危害，开展快速检测技术研制，对于防治该菌引起的鱼类疾病有着重要意义；

环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是一种恒温核酸扩增新技术，LAMP技术关键在于自动链置换反应，能在恒温条件下，一小时内完成反应，不需要热变性和热循环等过程，具备强特异性，高灵敏度，耗时短，操作简单等优点。引物设计是该技术的重要步骤，其中针对靶标基因的6个特定区域设计内引物和外引物，内引物包括正向内引物(FIP)和反向内引物(BIP)，外引物包括正向外引物(F3)和反向外引物(B3)；

目前对于海藻希瓦氏菌的检测，主要的研究和检测方法还是传统的病原菌分离与鉴定，但此方法不但耗费时间久、灵敏度低，而且特异性较差，建立一种快速、准确的检测方法是控制鱼类感染海藻希瓦氏菌的有效手段之一。因此，本发明提出养殖鱼类病原海藻希瓦氏菌LAMP检测方法及应用，以解决现有技术中的不足之处。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的在于提出养殖鱼类病原海藻希瓦氏菌LAMP检测方法及应用，该检测方法通过根据海藻希瓦氏菌的16s RNA基因设计了4条特异性引物，并通过优化反应体系和反应条件，设计了海藻希瓦氏菌的荧光LAMP检测试剂盒，利用LAMP检测技术可以在65℃的条件下完成扩增，不需要操作复杂和昂贵的仪器，使用成本低，且本发明提供的试剂盒反应快速，可以在1h内完成反应。

为实现本发明的目的，本发明通过以下技术方案实现：

一种养殖鱼类病原海藻希瓦氏菌LAMP检测方法，包括以下步骤：

步骤一：设计用于特异性检测海藻希瓦氏菌的LAMP检测引物，所述引物由正向外引物F3、反向外引物B3、正向内引物FIP和反向内引物BIP组成，其中：

正向外引物F3核苷酸序列为:5'-GAAAGCAGGGGACCTTCG-3'；

反向外引物B3核苷酸序列为:5'-GGTTTCCCCCATTGTGCA-3'；

正向内引物FIP核苷酸序列为:

5'-CGCCTAGGTGAGCCTTTACCTC-CTTGCGCTGATGGATAAGCC-3'；

反向内引物BIP核苷酸序列为:

5'-GAGGATGATCAGCCACACTGGG-TATTCCCCACTGCTGCCTC-3'；

步骤二：设计用于检测海藻希瓦氏菌的荧光LAMP检测试剂盒，所述荧光LAMP检测试剂盒包括

Colorimetric LAMP2X Master Mix试剂，所述荧光LAMP检测试剂盒内的反应体系为：Bst DNA聚合酶、dNTPs、缓冲液、可视化染料检测液、Mg²⁺、10μmol/L正向外引物F3、10μmol/L反向外引物B3、10μmol/L正向内引物FIP和10μmol/L反向内引物BIP；

步骤三：根据所述荧光LAMP检测试剂盒内的反应体系，对正向外引物F3和反向外引物B3组成的外引物以及正向内引物FIP和反向内引物BIP组成的内引物进行浓度比例调节，然后根据扩增效果确定最佳引物浓度比例；

步骤四：对待检样品的DNA进行提取，然后作为模板DNA添加到所述荧光LAMP检测试剂盒中，进行LAMP扩增；

步骤五：通过肉眼观察荧光染料颜色变化情况，对得到的LAMP扩增产物进行分析，得出分析结果；

步骤六：利用琼脂糖凝胶电泳实验对步骤五中得到的分析结果进行验证。

进一步改进在于：所述步骤三中需要设置内引物和外引物浓度为10μmol/L，内引物和外引物的浓度比为4：1，6：1，8：1，10：1。

进一步改进在于：所述步骤四中进行LAMP扩增时，将所述荧光LAMP检测试剂盒的反应体系置于65℃恒温水浴中进行反应1h。

进一步改进在于：所述步骤五中肉眼观察的判断方法为：观察到样品在荧光染料中呈橙黄色则为阳性；观察到样品在荧光染料中呈粉红色则为阴性。

一种养殖鱼类病原海藻希瓦氏菌LAMP检测方法在快速诊断、预防及治疗海藻希瓦氏菌引起的水产动物感染疾病中的应用。

本发明的有益效果为：本发明方法通过根据海藻希瓦氏菌的16s RNA基因设计了4条特异性引物，并通过优化反应体系和反应条件，设计了海藻希瓦氏菌的荧光LAMP检测试剂盒，利用LAMP检测技术可以在65℃的条件下完成扩增，不需要操作复杂和昂贵的仪器，使用成本低，且本发明提供的试剂盒反应快速，可以在1h内完成反应，并且本发明提供海藻希瓦氏菌的荧光LAMP检测试剂盒灵敏度高，特异性强，为水产动物感染海藻希瓦氏菌引起疾病的快速诊断提供方便，对相关疾病的预防、治疗具有重要意义。

附图说明

图1为本发明实施例一中海藻希瓦氏菌的LAMP体系内、外引物浓度比例优化结果示意图。

图2为本发明实施例二中海藻希瓦氏菌的LAMP特异性检测显色结果示意图。

图3为本发明实施例二中海藻希瓦氏菌LAMP特异性检验的琼脂糖凝胶电泳结果示意图。

图4为本发明实施例三中海藻希瓦氏菌LAMP灵敏性检测显色结果示意图。

图5为本发明实施例三中海藻希瓦氏菌LAMP灵敏性检验的琼脂糖凝胶电泳结果示意图。

图6为本发明实施例四中样品组织的LAMP检验显色结果示意图。

图7为本发明实施例四中样品组织的LAMP检验的琼脂糖凝胶电泳结果示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例一

根据图1所示，本实施例提出一种养殖鱼类病原海藻希瓦氏菌LAMP检测方法，

设计用于特异性检测海藻希瓦氏菌的LAMP检测引物，登录NCBI(美国国立生物技术信息中心)网站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/查找海藻希瓦氏菌16S rDNA序列，通过MEGA 6.0软件比对，选取该基因序列的保守区域，然后打开http://primerexplorer.jp/e/，进入Primer Explorer引物设计软件的界面，点击Primer Explorer V5，上传靶序列，设计特异性的LAMP引物，所述引物由正向外引物F3、反向外引物B3、正向内引物FIP和反向内引物BIP组成，其中：

正向外引物F3核苷酸序列为:5'-GAAAGCAGGGGACCTTCG-3'；

反向外引物B3核苷酸序列为:5'-GGTTTCCCCCATTGTGCA-3'；

正向内引物FIP核苷酸序列为:

5'-CGCCTAGGTGAGCCTTTACCTC-CTTGCGCTGATGGATAAGCC-3'；

反向内引物BIP核苷酸序列为:

5'-GAGGATGATCAGCCACACTGGG-TATTCCCCACTGCTGCCTC-3'；

海藻希瓦氏菌DNA提取：

选择试剂、耗材和仪器，包括：DNA提取试剂盒(halcyon海森通检测技术有限公司)，离心机，恒温水浴锅，旋涡振荡仪；

准备海藻希瓦氏菌DNA模板：

将海藻希瓦氏菌接种到2216E固体培养基中，28℃培养18h，然后挑选单个菌落接种至2216E液体培养基中进行培养，获得的菌液用于提取模板DNA，根据DNA提取试剂盒说明书操作步骤提取DNA，用超微量分光光度计(德国Implen)测定DNA浓度。说明书操作步骤为：

取菌液0.6-1.0ml到2ml灭菌离心管中，12000rpm离心1min，弃去上清液；

加入600μL的Lysis Buffer A，在旋涡振荡仪中进行旋涡震荡，然后加入20μl的蛋白酶K，60℃水浴55min，期间颠倒混匀数次(若加入细菌较多，可以适当延长水浴时间，适量增加蛋白酶K的量，并按比例增加Lysis Buffer A和Lysis Buffer B的用量)；

加入400μL的Lysis Buffer B，充分混匀；

利用离心机进行离心10min，将上清液倒入离心柱，12000rmp离心1min，弃去废液；

加入700μL的Wash buffer A(使用前先检查是否加入无水乙醇)，12000rpm离心1min，弃去废液；

加入700μL的Wash buffer B，12000rpm离心1min，弃去废液；

加入500μL的Wash buffer B，12000rpm离心1min，弃去废液；

再次用离心机进行离心，12000rpm离心2min，将离心柱置于新的离心管，并打开离心柱，于室温或37℃恒温放置5-10分钟直至无明显乙醇味；

在硅基质膜中央加入事先预热到60℃的TE Buffer 150μL，置于室温2min，然后在12000rpm离心2min，得到海藻希瓦氏菌的模板DNA；

将模板DNA添加到荧光LAMP检测试剂盒中，进行LAMP扩增，然后通过肉眼观察荧光染料颜色变化情况，对得到的LAMP扩增产物进行分析，得出分析结果；

具体为：以海藻希瓦氏菌DNA为模板DNA进行LAMP反应(如图1所示，其中，1：浓度比为4:1；2：浓度比为6:1；3：浓度比为8:1；4：浓度比为10:1)，琼脂糖凝胶电泳呈特征性梯状条带，内、外引物浓度比为4：1，6：1和10：1时出现较浅条带，8：1时条带最清晰，因此确立内、外引物最佳浓度比为8：1(如图1所示)；海藻希瓦氏菌最佳检测体系为25μL：

Colorimetric LAMP 2X Master Mix 10μL，10μmol/L的FIP 1.6μL，10μmol/L的BIP 1.6μL，10μmol/L的F3 0.2μL，10μmol/L的B3 0.2μL，模板DNA1μL，超纯水10.4μL，然后在65℃恒温水浴中反应1h；

判定结果为：阳性对照显示为橙黄色，空白对照显示为粉红色。当样品的反应液颜色为橙黄色则表示该样品的海藻希瓦氏菌检测的结果为阳性，当样品的反应液颜色为粉红色则表示该样品的海藻希瓦氏菌检测的结果为阴性，然后取5μL扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳验证，在凝胶成像仪中观察电泳条带。

实施例二

根据图2、3所示，本实施例分别以海藻希瓦氏菌(Shewanella alga)、假交替单胞菌(Pseudoalteromonas pisicida)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)和副溶血弧菌(Vibrio parahemolyticus)的基因组DNA为模板DNA，按照实施例一中的LAMP反应体系扩增程序进行扩增，反应结果显示：只有海藻希瓦氏菌呈橙黄色，为阳性反应；其他菌株均呈粉红色，为阴性反应(如图2所示，其中，1：海藻希瓦氏菌；2：无菌水；3：空白对照；4：假交替单胞菌(P.pisicida)；5：嗜水气单胞菌(A.hydrophila)；6：维氏气单胞菌(A.veronii)；7：副溶血弧菌(V.parahemolyticus)；

经琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示(如图3所示，其中，1：海藻希瓦氏菌；2：无菌水；3空白对照；4：假交替单胞菌；5：嗜水气单胞菌；6：维氏气单胞菌；7：副溶血弧菌)：1泳道海藻希瓦氏菌有典型梯型条带，2-7泳道均未出现典型梯型条带。琼脂糖凝胶电泳结果与染料显色结果相符，表明建立的LAMP检测方法具有较好的特异性。

实施例三

根据图4、5所示，本实施例提出灵敏性试验，用超微量分光光度计(德国Implen)测定DNA浓度，得到所提取的海藻希瓦氏菌DNA的浓度为81.5ng/μL。然后将海藻希瓦氏菌DNA模板按10倍倍比稀释，以不同浓度的稀释液作为模板，按照实施例一LAMP反应体系扩增程序进行扩增，结果显示(如图4所示，其中，海藻希瓦氏菌浓度分别为1：8.15×10^-2μg/μL；2：8.15×10^-3μg/μL；3：8.15×10^-4μg/μL；4：8.15×10^-5μg/μL；5：8.15×10^-6μg/μL；6：8.15×10^-7μg/μL，7：8.15×10^-8μg/μL；8：8.15×10^-9μg/μL)：海藻希瓦氏菌DNA稀释10和100倍时，反应显示橙黄色，当其稀释到1000倍(模板DNA浓度为8.15×10^-5μg/μL)时，反应显示较淡的橙黄色，稀释到10000倍及以上时，反应液呈现粉红色。经琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示(如图5所示，其中，海藻希瓦氏菌浓度分别为1：8.15×10^-2μg/μL；2：8.15×10^-3μg/μL；3：8.15×10^-4μg/μL；4：8.15×10^-5μg/μL；5：8.15×10^-6μg/μL)：海藻希瓦氏菌DNA经10倍倍比稀释到1000倍时，仍可见典型的梯型扩增条带，且条带亮度随着稀释倍数升高而变淡，稀释到10000倍时则没有出现扩增条带。表明建立的海藻希瓦氏菌LAMP检测方法最低检测量为8.15×10^-5μg/μL，且本发明方法具有很高的灵敏性。

实施例四

根据图6、7所示，本实施例为了评价海藻希瓦氏菌LAMP检测方法的有效性，对海藻希瓦氏菌感染的锦鲤进行检测，实验所用锦鲤由天津市隆锦水产养殖公司提供，运回实验室暂养14d，选取20尾健康锦鲤，平均重量为320g，进行人工感染实验，然后以海藻希瓦氏菌的半致死量剂量(LD50，1.0×10⁶CFU/g)，向每尾锦鲤腹腔注射菌悬液20μL，试验期间不喂食，观察鱼体发病情况，感染24h后，选取8尾出现临床症状的锦鲤，取其肝脏组织进行研磨，然后按照DNA提取步骤提取基因组DNA，同时将标准阳性模板和超纯水作为对照，用LAMP检测方法对海藻希瓦氏菌进行检测，同步取样品组织进行细菌分离、培养检查。

取8份锦鲤样品的肝脏组织按照实施例一种所建立的LAMP检测方法提取基因组DNA，各取1μL提取的DNA进行LAMP检测，结果显示(如图6所示，其中，1-8为8份检测样品序号)：8份样品和阳性对照都呈现橙黄色，显示阳性结果；

将LAMP扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示(如图7所示，其中，1-8为8份检测样品序号)：8份检测样品和阳性对照均出现典型的梯型扩增条带，与显色结果相符合。并且，同步取样品组织进行细菌分离、培养检查结果与LAMP检测结果一致，说明本发明的荧光LAMP检测试剂盒检测结果可信度高。

通过根据海藻希瓦氏菌的16s RNA基因设计了4条特异性引物，并通过优化反应体系和反应条件，设计了海藻希瓦氏菌的荧光LAMP检测试剂盒，利用LAMP检测技术可以在65℃的条件下完成扩增，不需要操作复杂和昂贵的仪器，使用成本低，且本发明提供的试剂盒反应快速，可以在1h内完成反应，并且本发明提供海藻希瓦氏菌的荧光LAMP检测试剂盒灵敏度高，特异性强，为水产动物感染海藻希瓦氏菌引起疾病的快速诊断提供方便，对相关疾病的预防、治疗具有重要意义。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (1)

1.一种用于检测养殖鱼类病原海藻希瓦氏菌的荧光LAMP检测试剂盒，其特征在于，包括

Colorimetric LAMP2X Master Mix试剂和反应体系；

所述反应体系包括Bst DNA聚合酶、dNTPs、缓冲液、可视化染料检测液、Mg²⁺、10μmol/L正向外引物F3、10μmol/L反向外引物B3、10μmol/L正向内引物FIP和10μmol/L反向内引物BIP；

所述正向外引物F3的核苷酸序列为:5'-GAAAGCAGGGGACCTTCG-3'；

所述反向外引物B3的核苷酸序列为:5'-GGTTTCCCCCATTGTGCA-3'；

所述正向内引物FIP的核苷酸序列为:

5'-CGCCTAGGTGAGCCTTTACCTC-CTTGCGCTGATGGATAAGCC-3'；

所述反向内引物BIP的核苷酸序列为:

5'-GAGGATGATCAGCCACACTGGG-TATTCCCCACTGCTGCCTC-3'。

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