CN105624290A - 烟曲霉膜联蛋白anxC4基因(anxC4基因)的应用 - Google Patents

烟曲霉膜联蛋白anxC4基因(anxC4基因)的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了烟曲霉膜联蛋白anxC4基因(anxC4基因)的应用，该anxC4基因可以作为烟曲霉检测的靶标。本发明还提供了根据该anxC4基因的特异性保守序列设计的烟曲霉的LAMP试剂盒及其专用引物，烟曲霉实时荧光定量PCR检测试剂盒及其引物和TaqMan探针。本发明技术可用于定性检测痰、血液、支气管肺泡灌洗液等待测样品中的烟曲霉成分，可在等温条件下快速、方便、高效、高特异性、高灵敏度地检测出烟曲霉。

Description

烟曲霉膜联蛋白anxC4基因(anxC4基因)的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及利用烟曲霉膜联蛋白anxC4及其基因(anxC4基因)作为对烟曲霉检测的靶标，涉及anxC4基因作为核酸检测、免疫检测、生化检测的检测靶标的应用，以及应用中得到的烟曲霉的LAMP试剂盒及其引物、荧光定量PCR检测试剂盒及其引物和TaqMan探针。
背景技术
烟曲霉临床感染及检测现状
烟曲霉(Aspergillusfumigatus)是一种常见的机会致病菌，在环境中分布广泛，其孢子被免疫缺陷或免疫低下病人吸入后极易引发侵袭性曲霉病，由于其致病机理尚不清楚，缺乏有效的治疗方法，病死率高达90％。引起侵袭性曲霉病的主要真菌是烟曲霉，一般病人只有到了患病晚期或死亡后才能检测出烟曲霉感染，因此，对烟曲霉进行早期诊断和预防至关重要。在过去的几十年里，随着免疫抑制治疗、广谱抗生素的广泛使用，导致患者体内正常菌群失调以及屏障功能被破坏，从而引起真菌移位、定植以及感染等，烟曲霉感染患者的数量也不断上升[陈云茹,陈天艳,赵英仁.烟曲霉菌感染的研究进展.临床内科杂.2011,28(8):54-57.]。国内外学者及临床专家普遍认为，对烟曲霉进行早期诊断并加以及时治疗是预防侵袭性曲霉病相对有效的方法。因此，建立一种特异性高、准确、灵敏、快速、方便、成本低廉的烟曲霉检测方法是降低侵袭性曲霉病发生和危害的重要途径。
现有的烟曲霉检测方法主要为镜检和培养法，镜检法检出率很低；而传统培养鉴定方法需要对患者样本先进行48小时以上培养，然后对菌落和微观形态进行直接观察[NouerSA,NucciM,KumarNS,GrazziuttiM,BarlogieB,AnaissieE.EarlierresponseassessmentininvasiveaspergillosisbasedonthekineticsofserumAspergillusgalactomannan:proposalforanewdefinition.ClinInfectDis.2011,53:671-676.]。传统的培养鉴定方法虽然简单、成本低，但耗时太长，灵敏度低，远不能满足临床上对烟曲霉进行快速准确检测的需要。目前，烟曲霉的检测方法除了传统的培养鉴定方法外，还有免疫学检测方法和分子生物学检测方法。免疫学检测方法主要是检测半乳甘露聚糖和1,3-β-D-葡聚糖，这两种物质都是烟曲霉细胞壁的组成成分，当烟曲霉菌丝在肺组织中生长时这两种物质就会释放到血液中。但是，由于病人自身的免疫低下以及进行过抗真菌治疗，用免疫学检测方法可能会产生假阴性或假阳性的结果[SulahianA,TouratierS,RibaudP.Falsepositivetestforaspergillusantigenemiarelatedtoconcomitantadministrationofpiperacillinandtazobactam.NEnglJMed.2003,349:2366-2367.]。分子生物学检测方法主要是通过PCR技术(包括荧光定量PCR)对烟曲霉的特异性基因进行检测，PCR技术具有特异性高、准确、灵敏、快速等优点，但是PCR技术对实验人员及环境的要求很高，仪器设备昂贵，同时需要进行严格的温度控制，很难应用于烟曲霉的临床快速检测[Ostrosky-ZeichnerL.Invasivemycoses:diagnosticchallenges.AmJMed.2012,125:S14-24.]。
LAMP技术介绍
环介导恒温核酸扩增技术(1oop-mediatedisothermalamplification，LAMP)是由Notomi[NotomiT，etal.Loop-mediatedisothermalamplificationofDNA，NucleicAcidsRes.2000；28(12)：63.]发明的一种新型核酸扩增技术。具体方法是针对靶基因(DNA或者cDNA)的6个区域，设计4-6种特异引物，利用链置换DNA聚合酶，在60-65℃的恒温条件下进行核酸扩增反应，40-50min即可完成核酸扩增反应，在LAMP反应过程中可以形成明显的副产物－白色的焦磷酸镁沉淀，可通过浊度观察、荧光染料染色，或者对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳来对反应结果进行判定。LAMP技术具有特异性高、准确度高、灵敏度高、快速高效、操作简单、检测直观和对仪器设备要求低等特点。自2000年发明以来，LAMP技术已被迅速用于病原微生物检测、遗传病诊断、食品安全等领域的分子生物学检测。近年来，国外已将LAMP技术广泛应用于病原体检测，符合疾病检测的快速、准确诊断需要，适合临床推广应用。
实时荧光定量PCR技术介绍
实时荧光定量PCR技术(QuantitativeReal-timePCR，qPCR)是1996年由美国AppliedBiosystems公司推出的，该技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析[HeidCA,StevensJ,LivakKJ,WilliamsPM.RealtimequantitativePCR.GenomeRes.1996Oct；6(10):986-94.]。与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点。实时荧光定量PCR作为一个极有效的实验方法，已被广泛地应用于分子生物学研究的各个领域。通过该技术可快速、灵敏的检测病毒RNA和DNA以及细菌DNA，该方法已被应用于人类传染病的诊断和病原定量，以及动物病原体基因的检测，畜禽产品的检验检疫，生物制品的鉴定等领域[JozefczukJ,AdjayeJ.Quantitativereal-timePCR-basedanalysisofgeneexpression.MethodsEnzymol.2011；500:99-109.]。
烟曲霉anxC4基因介绍
烟曲霉膜联蛋白anxC4为真菌膜联蛋白家族的新成员，具体功能尚不清楚[KhalajV,SmithL,BrookmanJ,TuckwellD.Identificationofanovelclassofannexingenes.FEBSLett.2004Mar26；562(1-3):79-86.KhalajV,AzarianB,EnayatiS,VaziriB.AnnexinC4inA.fumigatus:aproteomicsapproachtounderstandthefunction.JProteomics.2011Sep6；74(10):1950-8.]。
发明内容
发明人分析得知烟曲霉的anxC4基因序列与其它真菌及人类的基因序列有显著差异，因此其能作为烟曲霉的理想特异性检测靶标。
本发明的一个目的在于提供烟曲霉膜联蛋白anxC4基因(anxC4基因)作为烟曲霉检测靶标的应用，所述检测包括分子生物学、免疫学和生物化学等检测方法。
所述anxC4基因序列如序列表中SEQIDNO：1所示。
所述应用是以anxC4基因作为核酸检测靶标，是指将anxC4基因序列或其互补序列、anxC4蛋白或多肽及其抗体应用于烟曲霉检测，包括以anxC4基因作为对烟曲霉进行核酸扩增检测的引物和探针的设计模板而扩增得到扩增子为anxC4基因部分或全部序列的过程；所述的核酸扩增检测包括普通PCR、荧光定量PCR、等温扩增及其他通过扩增anxC4基因序列对烟曲霉的核酸检测。
所述的应用是以anxC4蛋白作为检测靶标，是指将anxC4蛋白或其多肽，或其抗体应用于烟曲霉检测。
本发明另一目的在于以烟曲霉anxC4基因序列作为设计模板，提供了用于对烟曲霉进行LAMP检测的引物，以实现烟曲霉的批量检测，提高检测的特异性和灵敏度。
本发明所提供的用于检测烟曲霉的LAMP引物，是根据烟曲霉膜联蛋白anxC4基因(anxC4，序列表中SEQIDNO：1所示)设计的，用以定性检测痰、血液、支气管肺泡灌洗液等待测样品中的烟曲霉基因组DNA，所述LAMP引物是由四条引物组成的引物组合，包括外引物F3、B3和内引物FIP、BIP按摩尔比5:40的组合。
具体来讲，所述用于对烟曲霉进行LAMP检测的四条引物的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：2(F3)、SEQIDNO：3(B3)、SEQIDNO：4(FIP)和SEQIDNO：5(BIP)所示。
对烟曲霉进行LAMP检测的试剂盒也属于本发明。该试剂盒中包括上述用于对烟曲霉进行LAMP检测的引物。具体来讲，所述试剂盒包括以下用于25μLLAMP反应体系的试剂：2×反应缓冲液12.5μL，BstDNA(8000U/ml)聚合酶1μL，去离子水5.5μL，引物加入量为：5pmol引物F31μL，5pmol引物B31μL，40pmol引物FIP1μL，40pmol引物BIP1μL。为方便检测，所述试剂盒中还可包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为烟曲霉标准株基因组DNA，所述阴性对照为不含DNA的LAMP扩增体系，如双蒸水、无菌去离子水。
上述LAMP引物或试剂盒在烟曲霉LAMP检测中的应用也属于本发明。使用所述试剂盒对烟曲霉的LAMP检测可包括以下步骤：
1)以待测样品基因组DNA为模板，在上述LAMP引物的引导下进行LAMP扩增，25μLLAMP反应液包括：待测样品基因组DNA2μL，2×反应缓冲液12.5μL，BstDNA聚合酶(8000U/ml)1μL，去离子水5.5μL，引物加入量为：5pmol引物F31μL，5pmol引物B31μL，40pmol引物FIP1μL，40pmol引物BIP1μL；LAMP扩增条件为：置60-65℃恒温60min左右；
2)LAMP扩增结束后进行结果判定，结果判定可采用以下三种方法：
2.1用浊度仪检测LAMP扩增前后反应液的浊度变化，根据浊度变化判断结果：浊度上升表示待测样品中存在烟曲霉(阳性)，浊度无变化表示待测样品中不存在烟曲霉(阴性)；
2.2在LAMP反应液中添加SYBRGreenI染液，根据LAMP扩增前后反应液的颜色变化判断结果：绿色表示待测样品中存在烟曲霉(阳性)，橙色表示待测样品中不存在烟曲霉(阴性)；
2.3对LAMP扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像系统观察电泳条带并判断结果：在凝胶上显示一系列大小不同的区带，形成连续阶梯式的图谱表示待测样品中存在烟曲霉(阳性)，在凝胶上未出现连续阶梯式图谱表示待测样品中不存在烟曲霉(阴性)。
在上述检测方法中，所述步骤1)中的LAMP反应体系中还设有阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为烟曲霉标准株基因组DNA，所述阴性对照为不含DNA的LAMP反应体系，如双蒸水、无菌去离子水(优选)。
所述步骤1)中的LAMP扩增条件优选为：置63℃恒温60min，反应结束后还需对BstDNA聚合酶进行高温失活，优选为80℃保持5min。
所述步骤2)方法2.2中SYBRGreenI染液的添加量可为1μL(终反应体系为26μL)，所述SYBRGreenI染液优选为经10倍稀释的SYBRGreenI染料。
所述步骤2)方法2.3中在电泳前需要将5μLLAMP扩增产物与1μL6×Buffer混合，所述琼脂糖凝胶的浓度优选为1.5％。
采用LAMP技术对烟曲霉膜联蛋白anxC4基因(anxC4)进行检测有以下优点：
1、操作简单，设备要求低：不需要复杂仪器，不需要特殊试剂，不需要预先进行双链DNA变性等繁琐步骤，只需要一部恒温仪就能进行反应。只需将待测样品和检测反应液放入60-65℃恒温仪中孵育60分钟即可完成反应。
2、检测时间短、扩增效率高：整个LAMP扩增反应可在1小时内完成，目的基因扩增产量可达109-1010拷贝(copies)。
3、特异性高：用本发明的引物和方法对黄曲霉、黑曲霉、土曲霉、构巢曲霉、杂色曲霉、白色念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌、浅白隐球菌、指甲隐球菌、新生隐球菌、桔青霉、马内菲青霉、棘状外瓶霉、皮炎外瓶霉、荚膜组织胞浆菌、尖孢镰刀菌、红色毛癣菌、金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌和人(Human)的DNA进行检测，结果均呈阴性，仅对烟曲霉的检测结果呈阳性。
4、灵敏度高：本发明设计的四条LAMP引物对烟曲霉靶序列特异区域的识别保证了LAMP扩增的高度特异性，即能从相差仅1个核苷酸的基因标本中找出相应的靶序列进行扩增，最低检出限达101copies，其灵敏度是普通PCR(103copies)的100倍。
5、结果判断方法简单：可通过浊度仪、肉眼观察(SYBRGreenI染色)或琼脂糖凝胶电泳判断结果，无需复杂仪器。
综上所述，本发明LAMP技术对烟曲霉膜联蛋白anxC4基因(anxC4)进行检测可实现在等温条件下快速、方便、高效、高特异性、高灵敏度地检测出烟曲霉，为烟曲霉的检测提供了新的技术平台，可用于畜牧业生产单位、基层医疗卫生单位和各疾病预防控制中心筛查和检测烟曲霉。
本发明还有一个目的是以烟曲霉anxC4基因序列作为设计模板，提供用于对烟曲霉进行实时荧光定量PCR检测的引物与TaqMan探针，以实现烟曲霉的批量检测，提高检测的特异性和灵敏度。
本发明所提供的一对用于对烟曲霉进行实时荧光定量PCR检测的引物，其上游引物(Af-A)的核苷酸序列如序列表中SEDIDNO：7所示，下游引物(Af-B)的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：8所示。由上述引物衍生的引物序列也属于本发明的保护范围。所述衍生序列是指在SEQIDNO：7和/或SEQIDNO：8的基础上经过一至十个碱基的取代、缺失或添加得到的引物序列。
本发明所提供的用于对烟曲霉进行实时荧光定量PCR检测的TaqMan探针(TaqManProbe(Af))，其核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：9所示；所述探针为经过荧光标记的，其5’端标记有报告荧光基团，3’端标记有淬灭荧光基团。由上述TaqMan探针序列的衍生序列也属于本发明。所述衍生序列是指在SEQIDNO：9的基础上，在序列的5’端和/或3’端再添加、减少一个或多个碱基得到的序列。所述报告荧光基团可为HEX、FAM等，优选为FAM；所述荧光淬灭基团可为ECLIPSE、TAMRA等，优选为TAMRA。为防止PCR扩增时被延伸，所述探针的3’端还需经磷酸化处理。
用于对烟曲霉进行实时荧光定量PCR检测试剂盒也属于本发明。本发明所提供的实时荧光定量PCR检测试剂盒，包括上述用于对烟曲霉进行实时荧光定量PCR检测的引物和TaqMan探针。
具体来讲，所述试剂盒包括以下用于25μL实时荧光定量PCR反应体系的试剂：实时荧光定量PCR反应液(TaKaRa公司产品，2×PremixEXTaq，内含ExTaqHS，dNTPMixture，Mg2+,TliRNaseH等)12.5μL，无菌水9μL，引物加入量为：0.5μL(5pmol)引物Af-A，0.5μL(5pmol)引物Af-B，TaqMan探针加入量为：0.5μL(5pmol)TaqManProbe(Af)。
为方便检测，所述试剂盒中还可包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为烟曲霉标准株基因组DNA或携带烟曲霉anxC4基因的克隆质粒(优选为pMD19-T-anxC4)，所述阴性对照为不含烟曲霉anxC4基因的反应体系，如H2O(双蒸水、无菌去离子水等)。
本发明还提供上述引物、探针和试剂盒的应用，即在对烟曲霉进行定性、定量检测中的应用。对烟曲霉进行实时荧光定量PCR检测，可包括以下步骤：
1)建立标准曲线：将携带烟曲霉anxC4基因的克隆质粒作为标准品，梯度稀释成101、102、103、104、105、106、107拷贝/2μL，以不同浓度的标准品作为模板，在试剂盒中引物和TaqMan探针的引导下进行实时荧光定量PCR检测，检测结束后，以各标准品的浓度Log值(X轴)对其相应Ct值(Y轴)作图，绘制标准曲线；
2)提取待测样品的DNA，以提取的DNA为模板，在试剂盒中引物和TaqMan探针的引导下进行烟曲霉anxC4基因的实时荧光定量PCR检测；
3)根据荧光信号的变化及强度，对待测样品中的烟曲霉anxC4基因进行定性、定量检测，出现荧光扩增曲线表明样品中含有烟曲霉anxC4基因，未出现荧光扩增曲线表明样品中不含有烟曲霉anxC4基因，再根据样品的荧光信号强度和步骤1)中的标准曲线，得出待测样品中所含的烟曲霉DNA的拷贝数。
在上述检测方法中，所述步骤1)中携带烟曲霉anxC4基因的克隆质粒优选为pMD19-T-anxC4。
所述步骤2)中的待测临床样本主要包括分离的菌株和痰、肺泡灌洗液、血液、咽拭子等标本。
所述步骤1)和步骤2)中的25μL实时荧光定量PCR反应体系可包括：模板2μL，实时荧光定量PCR反应液(TaKaRa公司产品，2×PremixEXTaq，内含ExTaqHS，dNTPMixture，Mg2+,TliRNaseH等)12.5μL，无菌水9μL，引物加入量为：0.5μL(5pmol)引物Af-A，0.5μL(5pmol)引物Af-B，TaqMan探针加入量为：0.5μL(5pmol)TaqManProbe(Af)。
所述步骤1)和步骤2)中的实时荧光定量PCR反应条件可为：先95℃30s；然后95℃5s，58℃30s，共40个循环。在每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。
本发明烟曲霉的实时荧光定量PCR检测，首先设计针对烟曲霉anxC4基因的引物与TaqMan探针，再以待测样品的DNA为模板，结合实时荧光定量PCR检测技术，实现对烟曲霉进行定性、定量检测的目的。具有以下优点：
1、简便、快速：整个检测(包括加样)可在1.5小时内完成，整个检测过程比普通PCR完成一次反应节省了大概一个小时，计算机自动报告结果，无需后续实验工作(电泳等)，减少了工作量。
2、特异性高：用本发明对黄曲霉、黑曲霉、土曲霉、构巢曲霉、杂色曲霉、白色念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌、浅白隐球菌、指甲隐球菌、新生隐球菌、桔青霉、马内菲青霉、棘状外瓶霉、皮炎外瓶霉、荚膜组织胞浆菌、尖孢镰刀菌、红色毛癣菌、金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌和人A549细胞的DNA进行检测，结果均呈阴性，仅对烟曲霉的检测结果呈阳性。本发明设计的引物和TaqMan探针对烟曲霉anxC4基因的特异性识别保证了实时荧光定量PCR的高度特异性，即能从相差仅1个核苷酸的基因标本中找出相应的靶序列进行扩增。
3、灵敏度高：最低检出限达5×10-2pg(即50fg)，其灵敏度是普通PCR(5×10-1pg)的10倍。
综上所述，本发明中烟曲霉的实时荧光定量PCR检测方法明显优于现有的烟曲霉检测方法，具有特异性高、灵敏度高、准确度高、检测速度快、低污染、对仪器设备要求低和成本低廉等优点，可用于临床、科研以及生产中对烟曲霉进行定性和定量分析。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
附图说明
图1-1为携带烟曲霉anxC4基因的重组载体PMD19-T-anxC4的物理图谱；
图1-2为烟曲霉LAMP检测方法特异性的琼脂糖凝胶电泳检测结果；
图1-3为烟曲霉LAMP检测方法灵敏度的琼脂糖凝胶电泳检测结果。
图2-1为PCR扩增的烟曲霉anxC4基因特异性保守区的1％琼脂糖凝胶电泳检测结果；
图2-2为携带烟曲霉anxC4基因的重组载体PMD19-T-anxC4标准品质粒的物理图谱；
图2-3为以标准品质粒为模板进行实时荧光定量PCR的扩增曲线；
图2-4为以标准品质粒为模板进行实时荧光定量PCR的标准曲线；
图2-5为烟曲霉实时荧光定量PCR检测方法特异性的检测结果；
图2-6为烟曲霉实时荧光定量PCR检测方法灵敏度的检测结果；
图2-7为烟曲霉普通PCR检测方法灵敏度的检测结果。
具体实施方式
已知烟曲霉anxC4基因是真菌膜联蛋白家族的成员，但其具体功能尚不清楚。发明人前期研究中分析出烟曲霉的anxC4基因序列与其它真菌及人类的同源基因序列有显著差异。利用该差异，发明人提出可将烟曲霉膜联蛋白anxC4及其基因(anxC4基因)作为理想特异性检测靶标,用于烟曲霉检测方法的研究。该分析得到了实例验证，以下详述。
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《MolecularCloning:ALaboratoryManual》(《分子克隆实验指南》)[Sambrook，J.，Russell，DavidW.，MolecularCloning:ALaboratoryManual，3rdedition，2001，NY，ColdSpringHarbor.]。
所述百分比浓度如无特别说明均为质量/质量(W/W，单位g/100g)百分比浓度、质量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度或体积/体积(V/V，单位mL/100mL)百分比浓度。
实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。
所用引物均由华大基因公司合成。
实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述实施例。
一、anxC4基因在烟曲霉的LAMP检测中检测模板的应用
实施例1-1、设计烟曲霉的LAMP检测引物
从NCBI的核酸数据库GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)检索获得烟曲霉(A.fumigatus)膜联蛋白anxC4基因(anxC4)序列(GenBank：AY598940.1)，通过BLAST软件进行同源性分析，获得烟曲霉膜联蛋白anxC4基因为烟曲霉的特异性保守序列(序列表中SEQIDNO：1，为anxC4基因全长，它相对其他真菌和人是特异性的，因此作为检测模板)，再根据该特异性保守序列(SEQIDNO：1)，用软件PrimerExplorerversion4(http://primerexplorer.jp/e)设计用于对烟曲霉进行LAMP检测的引物组合，共设计出30多套引物组合(其中部分如表2所示)，通过敏感性和特异性检测筛选出性能最佳的一套引物，该引物组合的序列如表1所示。
表1用于对烟曲霉进行LAMP检测的引物组合
表2：用于对烟曲霉进行LAMP检测的部分引物组合
实施例1-2、建立烟曲霉的LAMP检测方法
一)、构建携带烟曲霉(A.fumigatus)膜联蛋白ANXC4基因(anxC4)的克隆质粒(标准品)
根据烟曲霉(A.fumigatus)膜联蛋白anxC4基因(anxC4)的核苷酸序列(GenBank：AY598940.1)设计PCR扩增烟曲霉anxC4基因的引物(上游引物F序列：5’-TCGCCAAATCTTCGACCAGT-3’，下游引物B序列：5’-GGTCTGGCATAGCTGGGATG-3’)，用改进后的十六烷基三甲基溴化铵法(CTAB)(AttitallaIH.ModifiedCTABmethodforhighqualitygenomicDNAextractionfrommedicinalplants.PakJBiolSci.2011Nov1；14(21):998-9.)提取烟曲霉(ATCC13073)的基因组DNA，再以烟曲霉的基因组DNA为模板，在引物F和B的引导下进行PCR扩增，PCR反应体系为50μL(10×PCR反应缓冲液5μL，200μMdNTPs4μL，10μM引物均加10μL，TaqDNApolymerase2.5U，模板DNA为20-200ng，用ddH2O补齐至50μL)，PCR反应条件为95℃预变性5min、30个循环扩增(95℃变性30s、56℃退火30s、72℃延伸30s)、72℃加热10min，反应结束后回收PCR扩增产物，将其连接到载体PMD19-T(购自TaKaRa)中，将连接产物转化到JM109感受态细胞中(转化方法为氯化钙法)，用蓝白斑筛选的方法筛选出阳性克隆，对阳性克隆进行测序，测序结果表明经PCR扩增获得了长度为275bp的烟曲霉anxC4基因，其核苷酸序列如序列表中SEQIDNO:6所示(SEQIDNO:6为插入到标准品质粒中的目的序列)，而且烟曲霉anxC4基因成功连接入载体PMD19-T中的EcoRv克隆位点，与预期结果相符，将携带烟曲霉anxC4基因的重组载体命名为PMD19-T-anxC4，其物理图谱如图1-1所示。将携带PMD19-T-anxC4的阳性克隆接入液体沙氏培养基中，在室温、300rpm条件下振荡培养12-16小时，培养结束后提取质粒，得到携带烟曲霉膜联蛋白anxC4基因(anxC4)的克隆质粒(标准品，其物理图谱如图2-2所示)。
二)、确定用于烟曲霉LAMP检测的最佳反应体系
用实施例1-1优选的引物组合对烟曲霉(ATCC13073)进行LAMP检测，以获得最佳反应体系，具体方法如下：
1)在实施例1-1优选的引物组合的引导下进行LAMP扩增，25μLLAMP反应液包括：待测样品基因组DNA2μL，2×反应缓冲液12.5μL，BstDNA聚合酶(8000U/ml)1μL，去离子水5.5μL，引物加入量为：5pmol引物F31μL，5pmol引物B31μL，40pmol引物FIP1μL，40pmol引物BIP1μL；LAMP扩增条件为：置63℃恒温60min，为了使BstDNA聚合酶失活，扩增结束后还需80℃保持5min；所述LAMP检测方法中还设有阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为烟曲霉标准株基因组DNA，所述阴性对照为不含DNA的LAMP反应体系，如双蒸水、无菌去离子水(优选)。
2)反应结束后结果可用以下三种方法进行判定：
2.1用浊度仪检测LAMP扩增前后反应液的浊度变化，根据浊度变化判断结果：浊度上升表示待测样品中存在烟曲霉(阳性)，浊度无变化表示待测样品中不存在烟曲霉(阴性)；
2.2在LAMP反应液中添加SYBRGreenI染液，根据LAMP扩增前后反应液的颜色变化判断结果：绿色表示待测样品中存在烟曲霉(阳性)，橙色表示待测样品中不存在烟曲霉(阴性)；
2.3对LAMP扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像系统观察电泳条带并判断结果：出现连续阶梯式的图谱表示待测样品中存在烟曲霉(阳性)，未出现连续阶梯式的图谱表示待测样品中不存在烟曲霉(阴性)。
根据上述实验确定了最佳的烟曲霉的LAMP反应液(25μL)包括：待测样品基因组DNA2μL，2×反应缓冲液12.5μL，BstDNA(8000U/ml)聚合酶1μL，去离子水5.5μL，引物加入量为：5pmol引物F31μL，5pmol引物B31μL，40pmol引物FIP1μL，40pmol引物BIP1μL。
三)、确定用于烟曲霉LAMP检测的最佳扩增条件
用实例1优选的引物组合对烟曲霉进行LAMP检测，以获得最佳扩增条件，具体方法如下：
1)在实施例1-1优选的引物组合的引导下进行LAMP扩增，25μLLAMP反应液包括：与步骤二相同；LAMP扩增条件为：置60-65℃恒温60min，为了使BstDNA酶失活，反应结束后还需80℃保持5min；
2)反应结束后进行结果判定：与步骤二相同。
结果在60-65℃恒温60min的LAMP扩增条件下，优选的引物组合均取得了较好的反应效果，特别是在63℃恒温60min的LAMP扩增条件下，扩增效果最好；扩增结束后还需80℃保持5min。
上述实验确定最佳的检测烟曲霉的LAMP扩增条件为：置60-65℃恒温60min，优选为置63℃恒温60min，反应结束后80℃保持5min。
实施例1-3、烟曲霉的LAMP检测方法的特异性检测
分别以烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉、土曲霉、构巢曲霉、杂色曲霉、白色念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌、浅白隐球菌、指甲隐球菌、新生隐球菌、桔青霉、马内菲青霉、棘状外瓶霉、皮炎外瓶霉、荚膜组织胞浆菌、尖孢镰刀菌、红色毛癣菌、金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌(以上菌株均来自中国人民解放军疾病预防控制所传染病控制中心)、人肺腺癌细胞A549(Human)的基因组DNA为模板，以携带烟曲霉膜联蛋白ANXC4基因(anxC4)的克隆质粒为标准品，以无菌去离子水为阴性对照，在实例1优选的引物组合和实例2最佳反应体系和反应条件下检测烟曲霉LAMP检测方法的特异性。
琼脂糖凝胶电泳检测结果如图1-2(3、4、25：烟曲霉(阳性对照)，1、2、26阴性对照，5：黄曲霉，6：黑曲霉，7：土曲霉，8：构巢曲霉，9:杂色曲霉，10：白色念珠菌，11：热带念珠菌，12：近平滑念珠菌，13：克柔念珠菌，14：光滑念珠菌，15：浅白隐球菌，16：指甲隐球菌，17：新生隐球菌，18：桔青霉，19：马内菲青霉，20：棘状外瓶霉，21：皮炎外瓶霉，22：荚膜组织胞浆菌，23：尖孢镰刀菌，24：红色毛癣菌，27：金黄色葡萄球菌，28：鲍曼不动杆菌，29：人肺腺癌细胞A549(Human)，其中3、4、25是阳性对照)所示，从图中可以看出，琼脂糖凝胶电泳检测结果显示：只有3、4、25(烟曲霉)出现连续阶梯式的图谱(阳性)，其余均未出现连续阶梯式的图谱(阴性)，且未出现假阳性。
浊度仪检测结果和SYBRGreenI检测结果与琼脂糖凝胶电泳检测结果一致。
上述检测结果说明，本发明的LAMP引物组合能特异地扩增出烟曲霉膜联蛋白anxC4基因(anxC4)的靶序列，而不与其它细菌或人(Human)的基因组DNA发生交叉反应，说明本发明的烟曲霉LAMP引物及检测方法具有较高的特异性，可以特异地检测出烟曲霉。
实施例1-4、烟曲霉的LAMP检测方法的灵敏度检测
检测烟曲霉的LAMP检测方法与普通PCR检测方法的灵敏度，方法为：将标准品质粒稀释至0.5×108拷贝(copies)/μL，然后再以10倍梯度(101倍、102倍、103倍、104倍、105倍、106倍、107倍)进行稀释，再以经梯度稀释的标准品质粒为模板，使3-9号模板中标准品质粒的浓度分别为0.5×101拷贝(copies)/μL、0.5×102拷贝(copies)/μL、0.5×103拷贝(copies)/μL、0.5×104拷贝(copies)/μL、0.5×105拷贝(copies)/μL、0.5×106拷贝(copies)/μL、0.5×107拷贝(copies)/μL，1号模板中烟曲霉标准品质粒稀释到1拷贝(copies)/μL，分别对本发明LAMP检测方法和普通PCR(引物为实施例2中的F和B)检测方法的灵敏度进行检测。
烟曲霉LAMP检测方法灵敏度的琼脂糖凝胶电泳检测结果如图1-3中A幅(泳道M：Marker，泳道1-9分别表示：：阴性对照(水)、1拷贝(copies)/μL、0.5×101拷贝(copies)/μL、0.5×102拷贝(copies)/μL、0.5×103拷贝(copies)/μL、0.5×104拷贝(copies)/μL、0.5×105拷贝(copies)/μL、0.5×106拷贝(copies)/μL、0.5×107拷贝(copies)/μL，，从图中可以看出，本发明烟曲霉LAMP检测方法中琼脂糖凝胶电泳检测的灵敏度可达101copies。
烟曲霉普通PCR检测方法灵敏度的检测结果如图1-3中B幅(泳道M：Marker，泳道1-9分别表示：阴性对照(水)、1拷贝(copies)/μL、0.5×101拷贝(copies)/μL、0.5×102拷贝(copies)/μL、0.5×103拷贝(copies)/μL、0.5×104拷贝(copies)/μL、0.5×105拷贝(copies)/μL、0.5×106拷贝(copies)/μL、0.5×107拷贝(copies)/μL，从图中可以看出，烟曲霉普通PCR检测方法的灵敏度为103copies，表明本发明烟曲霉LAMP检测方法具有较高的灵敏度，其灵敏度是普通PCR检测方法的100倍。
实施例5、制备用于烟曲霉LAMP检测的试剂盒
本发明提供的试剂盒包括：用于定性检测痰、血液、支气管肺泡灌洗液等待测样品中烟曲霉的LAMP引物，包括外引物F3(SEQIDNO：2)、B3(SEQIDNO：3)和内引物FIP(SEQIDNO：4)、BIP(SEQIDNO：5)。
具体的，所述试剂盒包括以下用于25μL反应体系(不含模板)的试剂：将2×反应缓冲液12.5μL，BstDNA(8000U/ml)聚合酶1μL，去离子水5.5μL，5pmol引物F3(SEQIDNO：2所示引物)1μL，5pmol引物B3(SEQIDNO：2所示引物)1μL，40pmol引物FIP(SEQIDNO：3所示引物)1μL，40pmol引物BIP(SEQIDNO：5所示引物)1μL，作为阳性对照的烟曲霉标准株基因组DNA，以及作为阴性对照的双蒸水或无菌去离子水(优选)共同包装，得到用于25μL反应体系烟曲霉的LAMP检测试剂盒。
该烟曲霉LAMP检测试剂盒可参考实施例1-2的方法使用。
二、anxC4基因在烟曲霉的实时荧光定量PCR检测中的应用
实施例2-1、设计对烟曲霉进行定性、定量检测的实时荧光定量PCR引物及TaqMan探针
从NCBI的核酸数据库GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)检索获得烟曲霉膜联蛋白anxC4基因(anxC4或ANXC4)的序列(GenBank：AY598940.1)，用DNAMan软件进行比对后，获得烟曲霉膜联蛋白anxC4基因为烟曲霉的特异性保守序列(序列表中SEQIDNO：1，为anxC4基因全长，它相对其他真菌和人是特异性的，因此作为检测模板)；选取烟曲霉anxC4基因全序列为模板，用PrimerPremier5.0软件设计对烟曲霉进行实时荧光定量PCR检测的引物及TaqMan探针，共设计出30多套引物、探针组合(部分组合参见表3)。通过敏感性和特异性检测筛选出性能最佳的一套引物，序列如下：
上游引物Af-A：5’-CAGTGACGTATGAGAGTC-3’(序列表中SEQIDNO：7)；
下游引物Af-B：5’-GGACATAACTGGACCATC-3’(序列表中SEQIDNO：8)；
TaqManProbe(AF)：5’FAM-CTACTCAGATACGGACGACGAG-TAMRA3’(序列表中SEQIDNO：9)。
上述引物特异性扩增序列表SEQIDNO：1中自5’端第914-1071位碱基序列；TaqMan探针的5’端标记报告荧光基团FAM，3’端标记淬灭荧光基团TAMRA，并将探针的3’端进行磷酸化处理。
表3:烟曲霉实时荧光定量PCR检测的引物及TaqMan探针组合(部分)
实施例2-2、用本发明的引物及TaqMan探针进行烟曲霉的实时荧光定量PCR检测
1、提取烟曲霉的基因组DNA
用CTAB法提取烟曲霉(ATCC13073)的基因组DNA，具体方法包括以下步骤：
1)配制CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)抽提缓冲液(pH8.0)：称取十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)30g，Tris12.12g，乙二胺四乙酸(EDTA)5.84g，氯化钠(NaCl)82g，用800mL去离子水充分搅拌溶解，再加入100mL二硫苏糖醇(DTT)溶液，用NaOH调pH至8.0，最后定容到1L，室温保存；
2)配制CIA溶液：CIA饱和酚/氯仿/异戊醇25：24：1(V/V/V)，4℃保存；
3)向烟曲霉样本中加入600μLCTAB抽提缓冲液，振荡混匀后在65℃下裂解(裂解菌体释放基因组DNA)，裂解时间优选为30min，每隔10min充分混匀一次；
4)将裂解液放在冰水(约0℃)中冷却，冷却时间优选为10min；
5)再向裂解液中加入CIA溶液(除去蛋白质并获得DNA)400μL，充分混匀，4℃、10000rpm离心5min，将水相转移到新的离心管中；
6)加入等体积预冷的异丙醇(沉淀DNA)，颠倒混匀数次后静置5min，4℃、10000rpm离心10min；
6)轻轻倒出上清,将离心管倒置在滤纸上排干水分，用40μL去离子水重悬DNA，放置-20℃备用。
2、构建携带烟曲霉(Af)膜联蛋白anxC4基因(anxC4)的克隆质粒(实时荧光定量PCR标准品)
根据烟曲霉(Af)膜联蛋白anxC4基因(anxC4)的核苷酸序列(GenBank：AY598940.1，序列表SEQIDNO：1)设计PCR扩增烟曲霉anxC4基因的引物(上游引物Af-1序列：5’-TCGCCAAATCTTCGACCAGT-3’，下游引物Af-2序列：5’-GGTCTGGCATAGCTGGGATG-3’)，用CTAB法提取烟曲霉(ATCC13073)的基因组DNA，再以烟曲霉的基因组DNA为模板，在引物Af-1和Af-2的引导下进行PCR扩增。25μLPCR反应体系为：DNA模板2μL，2×Taqmix(配方：TaqDNAPolymerase(recombinant)：0.05units/μl；MgCl2：4mM；dNTPs(dATP，dCTP，dGTP，dTTP)：0.4mM)12.5μL，引物Af-10.5μL(5pmol)，引物Af-20.5μL(5pmol)，无菌水9.5μL。PCR反应条件为：先95℃3min，然后95℃30s，58℃30s，72℃40s，共35个循环，最后72℃7min。反应结束后，取50μLPCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳(100V30min)，结果如图2-1所示，经扩增获得了长度为275bp的DNA片段，用琼脂糖DNA胶回收试剂盒(OMEGA公司)回收、纯化PCR扩增产物，将其连接到载体PMD19-T(购自Takara公司)中，将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，用蓝白斑法筛选阳性克隆，对阳性克隆进行测序，测序结果表明经PCR扩增获得了序列正确的烟曲霉anxC4基因(检测基因)，其核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：6所示(SEQIDNO:6为插入到标准品质粒中的检测序列)，而且烟曲霉anxC4基因成功连接入载体PMD19-T中的431bp位点和432bp位点之间，与预期结果相符，将携带烟曲霉anxC4基因的重组载体命名为pMD19-T-anxC4，其标准品质粒物理图谱如图2-2所示。
将携带pMD19-T-anxC4的阳性克隆接入LB培养基中，在37℃条件下培养15小时，培养结束后用质粒小提试剂盒(OMEGA公司)提取质粒，得到携带烟曲霉膜联蛋白anxC4基因(anxC4)的克隆质粒。
用紫外分光光度计对克隆质粒准确定量后，根据以下公式计算出其拷贝数，进行10倍梯度稀释，浓度依次为101、102、103、104、105、106、107拷贝/2μL，作为标准品保存于-20℃备用。
分子量＝片段大小×660g/(molbp)
3、建立实时荧光定量PCR的标准曲线
每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可做出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
以步骤2获得的拷贝数分别为101、102、103、104、105、106、107拷贝/2μL的pMD19-T-anxC4标准品质粒为模板，在实施例1中引物Af-A、Af-B及探针TaqManProbe(AF)的引导下用伯乐IQ5荧光定量PCR仪进行实时荧光定量PCR扩增。25μL实时荧光定量PCR反应体系为：模板2μL，实时荧光定量PCR反应液(TaKaRa公司产品，2×PremixEXTaq，内含ExTaqHS，dNTPMixture，Mg2+,TliRNaseH等)12.5μL，无菌水9μL，引物加入量为：0.5μL(5pmol)引物Af-A，0.5μL(5pmol)引物Af-B，TaqMan探针加入量为：0.5μL(5pmol)TaqManProbe(Af)。实时荧光定量PCR反应条件为：先95℃30s；然后95℃5s，58℃30s，共40个循环。在每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。
结果各稀释度的pMD19-T-anxC4均能产生荧光信号，Ct值如表1所示，扩增曲线如图2-3所示(从左至右依次为以101、102、103、104、105、106、107拷贝/2μL标准品质粒为模板的扩增曲线)，从不同浓度起始模板的扩增曲线可以看出，S型曲线基线平整，指数区明显，斜率较大，平台区基本汇于一起，这些均说明在该条件下模板的扩增是较为理想的。以起始模板拷贝数的对数为X轴，以107-101拷贝/2μL烟曲霉标准品质粒Ct值为Y轴绘制标准曲线(样品线性回归与预期浓度相关系数R值为0.92以上)，标准曲线如图2-4所示(横坐标为标准品拷贝数q的对数值(Log10)，纵坐标为Ct值)，标准曲线相关系数为0.999，误差小，由标准曲线得到的线性方程为：Y＝-3.507Log10(q)+41。
4、样品检测
用CTAB法提取待测样品的基因组DNA(模板)，每个样品设3个复孔，同时设阴性对照(不加模板，NTC)，用步骤3中的反应体系及反应条件进行烟曲霉的实时荧光定量PCR检测。将样品的Ct值代入标准曲线的直线回归方程式，计算出样品拷贝数，再乘以稀释倍数再除以10，即为样品中烟曲霉DNA的拷贝数。
实施例2-3、检测烟曲霉实时荧光定量PCR检测方法的特异性
分别以烟曲霉(ATCC13073)、黄曲霉、黑曲霉、土曲霉、构巢曲霉、杂色曲霉、白色念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌、浅白隐球菌、指甲隐球菌、新生隐球菌、桔青霉、马内菲青霉、棘状外瓶霉、皮炎外瓶霉、荚膜组织胞浆菌、尖孢镰刀菌、红色毛癣菌、金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌(以上菌株均来自中国人民解放军疾病预防控制所医院感染监督中心)、人A549细胞基因DNA为模板，以104拷贝/2μL烟曲霉克隆质粒pMD19-T-anxC4标准品为阳性对照，以无菌去离子水为阴性对照，检测本发明烟曲霉实时荧光定量PCR检测方法的特异性。实时荧光定量PCR检测的反应体系及反应条件与实施例3相同。
特异性检测结果如图2-5所示，可以看出，只有以烟曲霉和阳性对照为模板会出现明显的S型扩增曲线(阳性)，以其它菌和人(Human)的基因组DNA为模板均为直线(无扩增曲线，阴性)，空白对照也为直线(无扩增曲线，阴性)，与预期结果相符，表明本发明的检测方法具有较高的特异性。
实施例2-4、检测烟曲霉实时荧光定量PCR检测方法的灵敏度
在实时荧光定量PCR检测中，检测灵敏度即所谓的检测低限通常有3种表示方法；绝对检测低限(能被检测和定量到的模板起始拷贝最低数)、相对检测低限(能被检测和定量到的外源基因的最低百分含量)、实际检测低限(实际被检测的DNA数量)。本实施例中采用绝对检测低限测定本发明烟曲霉实时荧光定量PCR检测方法的灵敏度。检测烟曲霉的实时荧光定量PCR检测方法与普通PCR检测方法的灵敏度，方法为：用CTAB法提取烟曲霉的基因组DNA(浓度为2.5ng/μL)，然后以10倍梯度进行稀释，再以经梯度稀释的烟曲霉基因组DNA为模板，模板浓度分别为2.5×103pg/μL、2.5×102pg/μL、2.5×101pg/μL、2.5pg/μL、2.5×10-1pg/μL、2.5×10-2pg/μL、2.5×10-3pg/μL，以去离子水作为阴性对照，每个浓度的模板取2μL，分别对本发明烟曲霉的实时荧光定量PCR检测方法和普通PCR(引物为实施例2-2中的Af-1和Af-2)检测方法的灵敏度进行检测。实时荧光定量PCR检测的反应体系及反应条件与实施例2-2中的步骤3相同。普通PCR检测的反应体系及反应条件与实施例2-2中的步骤2相同。
实时荧光定量PCR检测结果如图2-6所示，从图中可以看出，烟曲霉DNA浓度为2.5×103pg/μL、2.5×102pg/μL、2.5×101pg/μL、2.5pg/μL、2.5×10-1pg/μL、2.5×10-2pg/μL时均有明显的扩增曲线，最低检测浓度为2.5×10-2pg/μL，因为每个反应体系中模板的加入量为2μL，故最低可检出5×10-2pg(即50fg)的烟曲霉基因组DNA。
普通PCR的琼脂糖凝胶电泳检测结果如图2-7(泳道M位DNAMarker，泳道1-7为不同浓度模板的PCR扩增产物电泳条带，泳道1-7的模板浓度分别为2.5×103pg/μL、2.5×102pg/μL、2.5×101pg/μL、2.5pg/μL、2.5×10-1pg/μL、2.5×10-2pg/μL，8泳道为阴性对照(去离子水))所示，从图中可以看出，当烟曲霉基因组DNA浓度低于2.5×10-1pg/μL时无明显条带，普通PCR检测方法的最低检测浓度为2.5×10-1pg/μL。
上述实验结果表明，本发明烟曲霉的实时荧光定量PCR检测方法具有较高的的灵敏度，其灵敏度是普通PCR检测方法的10倍。
实施例2-5、制备用于烟曲霉实时荧光定量PCR检测的试剂盒
本发明提供的试剂盒包括：用于对烟曲霉进行实时荧光定量PCR检测的引物和TaqMan探针，上游引物(Af-A，SEDIDNO：7)，下游引物(Af-B，SEQIDNO：8)，TaqMan探针(TaqManProbe(AF)，SEQIDNO：9)。
具体的，将12.5μL实时荧光定量PCR反应液(2×PremixEXTaq,内含ExTaqHS，dNTPMixture，Mg2+,TliRNaseH等)，9μL无菌水，0.5μL(5pmol)引物Af-A(SEQIDNO：7)，0.5μL(5pmol)引物Af-B(SEQIDNO：8)，0.5μL(5pmol)TaqMan探针TaqManProbe(Af)(SEQIDNO：9)，作为阳性对照的携带烟曲霉anxC4基因的克隆质粒(pMD19-T-anxC4)，以及作为阴性对照的双蒸水或无菌去离子水(优选)共同包装，得到用于25μL反应体系的烟曲霉的实时荧光定量PCR检测试剂盒。
该烟曲霉实时荧光定量PCR检测试剂盒可参考实施例2-2的方法使用。

Claims (10)

1.烟曲霉膜联蛋白anxC4基因(anxC4基因)作为烟曲霉检测靶标的应用，所述检测包括分子生物学、免疫学和生物化学等检测方法。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述anxC4基因序列如序列表中SEQIDNO：1所示。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：anxC4基因作为烟曲霉检测靶标是指将anxC4基因序列或其互补序列、anxC4蛋白或多肽及其抗体应用于烟曲霉检测，包括以anxC4基因作为对烟曲霉进行核酸扩增检测的引物和探针的设计模板而扩增得到扩增子为anxC4基因部分或全部序列的过程；所述的核酸扩增检测包括普通PCR、荧光定量PCR、等温扩增及其他通过扩增anxC4基因序列对烟曲霉的核酸检测。
4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：anxC4基因作为烟曲霉检测靶标是指将anxC4蛋白或其多肽，或其抗体应用于烟曲霉检测。
5.用于检测烟曲霉的LAMP引物，是根据权利要1或2提及的烟曲霉膜联蛋白anxC4基因(anxC4)设计的，用以定性检测痰、血液、支气管肺泡灌洗液等待测样品中的烟曲霉，所述LAMP引物是由四条引物组成的引物组合，包括外引物F3、B3和内引物FIP、BIP按摩尔比5:40的组合。
6.根据权利要求5所述的LAMP引物，其特征在于：用于对烟曲霉进行LAMP检测的四条引物的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：2(F3)、SEQIDNO：3(B3)、SEQIDNO：4(FIP)和SEQIDNO：5(BIP)所示。
7.一种用于对烟曲霉进行LAMP检测的试剂盒，包括权利要求5或6所述用于对烟曲霉进行LAMP检测的引物。
8.用于对烟曲霉进行实时荧光定量PCR检测的引物和TaqMan探针，上游引物(Af-A)的核苷酸序列如序列表中SEDIDNO：7所示，下游引物(Af-B)的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：8所示，TaqMan探针(TaqManProbe(AF))的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：9所示。
9.根据权利要求8所述的引物和TaqMan探针，其特征在于：所述探针为经过荧光标记的，其5’端标记有报告荧光基团，3’端标记有淬灭荧光基团；所述报告荧光基团为HEX、FAM等，优选为FAM；所述荧光淬灭基团为ECLIPSE、TAMRA等。
10.用于对烟曲霉进行实时荧光定量PCR检测试剂盒，包括权利要求8或9所述用于对烟曲霉进行实时荧光定量PCR检测的引物和TaqMan探针。
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