CN112063747B

CN112063747B - 一种基于荧光pcr技术快速高效检测耳念珠菌用引物探针组、试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN112063747B
Application number: CN202011048071.0A
Authority: CN
Inventors: 李萌; 方园; 张人友; 任云
Original assignee: Hangzhou Derlead Biotech Co ltd
Current assignee: Hangzhou Derlead Biotech Co ltd
Priority date: 2020-09-29
Filing date: 2020-09-29
Publication date: 2023-11-14
Anticipated expiration: 2040-09-29
Also published as: CN112063747A

Abstract

本发明提供了一种基于荧光PCR技术快速高效检测耳念珠菌用引物探针组、试剂盒及其应用，属于病原微生物体外分子技术领域。一种用于检测耳念珠菌的特异性DNA片段，核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。一种基于荧光PCR技术快速高效检测耳念珠菌用引物探针组，包括引物对和探针；包括核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的反向引物；探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。本发明提供的引物探针组及其试剂盒基于荧光PCR技术快速高效检测耳念珠菌，检测灵敏度高，耗时短，而且操作简单。

Description

一种基于荧光PCR技术快速高效检测耳念珠菌用引物探针组、试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于病原微生物体外分子技术领域，具体涉及一种基于荧光PCR技术快速高效检测耳念珠菌用引物探针组、试剂盒及其应用。

背景技术

耳念珠菌(Candida auris)是新发的多重耐药真菌。侵袭性念珠菌病主要由白念珠菌引起，现正逐渐向非白假丝酵母转变。耳念珠菌是多重耐药菌，常规真菌治疗可能存在问题。在美国发现的耳念珠菌，不仅对经典抗真菌药物—氟康唑高度耐药，且50％以上的菌株对伏立康唑耐药，约1/3的菌株对两性霉素B耐药，而临床常见的念珠菌菌种中对两性霉素B耐药十分少见，使得该菌更受关注。尽管加强了感染预防和控制措施，耳念珠菌还是会在重症监护室的危重病人间迅速蔓延，而常规表型和分子技术鉴定困难，不利于感染预防控制，因此建立一种特异性高、准确、灵敏、快速、方便、成本低廉的耳念珠菌检测方法是降低侵袭性念珠菌病发生和危害的重要途径。

目前，常用的侵袭性念珠菌检测方法包括镜检、组织病理学检查、培养法和血清学检测。其中，镜检和组织病理学检查的检测结果中阳性率较低，无法排除假阴性的干扰；培养法检测周期长，敏感度低，对技术条件以及操作人员的专业水平要求较高，而且耳念珠菌在系统发育上与希木龙念珠菌(Candida haemulonii)物种的同源性很高，C.haemulonii分离株经常被错误鉴别为耳念珠菌，生色琼脂可以用来区分C.auris和C.haemulonii分离株，但是耗时长，远不能满足临床上对耳念珠菌进行快速准确检测的需要；血清学检测仅能判断患者是否存在真菌感染，无法实现侵袭性真菌种水平的区分。因此，开发一种能够快速准确检测耳念珠菌的方法很有必要。

荧光PCR法是在PCR引物扩增过程中利用荧光标记释放的荧光能量的变化值，直接反映出PCR扩增产物量的变化，荧光信号变量与扩增产物变量成正比，并通过对荧光光强度的采集和分析以达到对原始模板定性或定量进行分析的PCR方法。目前已有关于采用荧光PCR法检测C.auris的报道，例如申请号201911055696.7的专利报道了耳念珠菌的实时荧光定量PCR检测试剂盒及其专用引物、TaqMan探针，同时201910726815.0的专利报道了一种高分辨率熔解曲线鉴定耳念珠菌的方法，其中公开了一组扩增用引物探针；再例如申请号201911228264.1的专利公开了用于耳念珠菌的LAMP引物组、试剂盒以及检测方法。上述这些专利均能够实现耳念珠菌与相近菌种的准确区分，但是也存在目标扩增片段长度较长的缺陷。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种用于检测耳念珠菌的特异性DNA片段，不仅能准确区分耳念珠菌与近源菌种，而且具有快速高效的检测特点。

本发明的目的还在于提供一种基于荧光PCR技术快速高效检测耳念珠菌用引物探针组、试剂盒及其应用，所述引物探针组通过检测所述特异性DNA片段，实现快速高效检测耳念珠菌的目的。

本发明提供了一种用于检测耳念珠菌的特异性DNA片段，所述特异性DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明提供了一种用于扩增所述特异性DNA片段的引物对，所述引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的反向引物。

本发明提供了所述特异性DNA片段或所述引物对在制备检测耳念珠菌的试剂或试剂盒中的应用。

本发明提供了一种基于荧光PCR技术快速高效检测耳念珠菌用引物探针组，包括所述引物对和探针；所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

本发明提供了所述引物对或所述引物探针组在制备检测耳念珠菌的试剂或试剂盒中的应用。

本发明提供了一种基于荧光PCR技术快速高效检测耳念珠菌的试剂盒，包括所述引物对或所述引物探针组。

优选的，还包括检测内参基因用引物探针组；

所述检测内参基因用引物探针组包括核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示的正向引物、核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示的反向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示的探针。

优选的，还包括阴性对照、阳性对照和PCR反应液；

所述阳性对照包括含耳念珠菌的靶向DNA片段的重组质粒和含耳念珠菌的内参基因DNA片段的重组质粒；所述耳念珠菌的靶向DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；

所述阴性对照为含耳念珠菌的内参基因DNA片段的重组质粒；所述耳念珠菌的内参基因DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示。

优选的，扩增所述耳念珠菌的靶向DNA片段扩增用引物包括核苷酸序列如SEQ IDNO:10所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示的反向引物。

优选的，扩增所述耳念珠菌的内参基因DNA片段用引物对包括核苷酸序列如SEQID NO:12所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示的反向引物。

本发明提供了一种用于检测耳念珠菌的特异性DNA片段，所述特异性DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明提供的特异性DNA片段长度仅为74bp，能从临床常见的真菌(如白念珠菌、热带念珠菌等)、细菌中准确区分出耳念珠菌，即得到一条序列长度短、且特异性强，能够特异性地检测耳念珠菌的特异性DNA片段。

本发明提供了一种用于扩增所述特异性DNA片段的引物对，所述引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的反向引物。所述引物对仅能特异性扩增耳念珠菌，与临床上常见真菌(如白念珠菌、热带念珠菌等)、细菌不发生交叉反应，因此，本发明提供的引物对具有针对靶标检测DNA片段具有较强的特异性扩增特点。

本发明提供了一种基于荧光PCR技术快速高效检测耳念珠菌用引物探针组，包括所述引物对和探针；所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。基于荧光PCR技术检测耳念珠菌时具有较高的检测灵敏度，靶基因的检测限为25copies/μL。同时本发明提供的引物探针组可以直接检测从样本中提取DNA进行检测，而且操作简单，耗时短，检测周期仅为2小时左右。

附图说明

图1为耳念珠菌标准曲线图(Standard Curve)；图1A是扩增曲线图(Amplification Plot)，以反应循环数(Cycle)与荧光强度的变化值(△Rn)作图而形成；扩增曲线一般呈S形，图中曲线根据核酸浓度由大到小从左到右依次排列；图1B是标准曲线(Standard Curve)，是由核酸浓度(Quantity)与所对应的循环阈值(CT)作图而形成，图中8个点，由质粒浓度小(左侧)向浓度大(右侧)呈直线分布，其相关系数R²为0.999，扩增效率为96.29％；

图2为耳念珠菌培养菌株样本验证扩增曲线图；本发明的引物和探针与含耳念珠菌的临床分离培养的菌株样本能产生特异性阳性反应(菌株1、3、4、6、7)；对于非耳念珠菌的菌株不产生有效的扩增反应(本试剂盒的cutoff值是Ct>36，菌株2、5、8)；

图3为耳念珠菌特异性实验图；该对引物与肺炎链球菌、铜绿假单胞菌、粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、肺炎克雷伯、屎肠杆菌、大肠杆菌、奇异变形杆菌、杂色曲霉、土曲霉、黑曲霉、黄曲霉、烟曲霉、白念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌、酵母菌、人基因组DNA均不产生交叉反应。

具体实施方式

本发明提供了一种用于检测耳念珠菌的特异性DNA片段，所述特异性DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示(ATGCCTGTTTGAGCGTGATGTCTTCTCACCAATCTTCGCGGTGGCGTTGCATTCACAAAATTACAGCTTGCACG)。本发明提供的特异性DNA片段能够特异性将耳念珠菌与临床常见的真菌近缘真菌菌种区分开，且其片段长度较短适合作为荧光PCR扩增目标片段使用。本发明对所述特异性DNA片段的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的DNA片段长度即可，例如基因合成或特异性引物对扩增得到。在本发明实施例中，所述特异性DNA片段委托上海捷瑞生物技术有限公司合成。

本发明提供了一种用于扩增所述特异性DNA片段的引物对，所述引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO:2(5'-ATGCCTGTTTGAGCGTGATG-3')所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:3(5'-CGTGCAAGCTGTAATTTTGTGAA-3')所示的反向引物。所述引物对优选委托上海捷瑞生物技术有限公司合成。

本发明提供了所述特异性DNA片段或所述引物对在制备检测耳念珠菌的试剂或试剂盒中的应用。在所述试剂或试剂盒中，所述特异性DNA片段可以作为阳性对照使用。本发明对所述试剂或试剂盒的检测方法没有特殊限制采用本领域所熟知的检测方法即可，例如普通PCR方法扩增目标片段，采用琼脂糖凝胶电泳分离扩增条带，以扩增的目标条带与所述特异性DNA片段的长度相同可判断检测样本含耳念珠菌。

本发明提供了一种基于荧光PCR技术快速高效检测耳念珠菌用引物探针组，包括所述引物对和探针；所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:4(5'-ACCAATCTTCGCGGTGGCGTTG-3')所示。在本发明中，所述探针优选在探针的5’端标记一个报告荧光基团。报告荧光基团优选包括FAM、VIC等。所述探针的3’末端优选标记一个淬灭荧光基团。所述淬灭荧光基团BHQ1、TAMRA等。所述探针由上海捷瑞生物技术有限公司合成。

本发明提供了所述引物对或所述引物探针组在制备检测耳念珠菌的试剂或试剂盒中的应用。所述引物对中每条引物的工作浓度优选为10μM。所述引物探针组中探针的工作浓度优选为10μM。每条引物和探针需独立分装。

本发明提供了一种基于荧光PCR技术快速高效检测耳念珠菌的试剂盒，包括所述引物对或所述引物探针组。所述试剂盒优选还包括检测内参基因用引物探针组；所述检测内参基因用引物探针组优选包括核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示的正向引物、核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示的反向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示的探针。所述检测内参基因用引物探针组优选由上海捷瑞生物技术有限公司合成。

在本发明中，所述试剂盒优选还包括阴性对照和阳性对照。所述阳性对照包括含耳念珠菌的靶向DNA片段的重组质粒和含耳念珠菌的内参基因DNA片段的重组质粒。所述含耳念珠菌的靶向DNA片段的重组质粒的工作浓度为20ng/mL。所述含耳念珠菌的内参基因DNA片段的重组质粒的工作浓度为10ng/mL。

在本发明中，所述含耳念珠菌的靶向DNA片段的重组质粒的构建方法，优选如下：

将耳念珠菌的靶向DNA片段用pUC-T载体(T-A载体)进行克隆。TA载体是一种高效克隆PCR产物的专用载体，它是由pUC18载体在EcoRV酶切位点处切开，在两侧的3′端添加T而成。由于大部分耐热聚合酶反应时都会在PCR产物的3′端添加一个A，它可以与pUC-T 3′端的T互补连接，因此使用本产品可大大提高PCR产物的连接和克隆效率。将耳念珠菌的靶向DNA片段插入pUC-T载体的多克隆位点处，得到的连接产物筛选，形成重组质粒；所述耳念珠菌的靶向DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:8(CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTATTGATATTTTGCATACACACTGATTTGGATTTTAAAACTAACCCAACGTTAAGTTCAACTAAACTATAAAGAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAGTATGACTTGCAGACGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCTTGGGGTATTCCCCAAGGCATGCCTGTTTGAGCGTGATGTCTTCTCACCAATCTTCGCGGTGGCGTTGCATTCACAAAATTACAGCTTGCACGAAAAAAATCTACGCTTTTTTTTCGTTTTGTTGTCGCCTCAAATCAGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGAAAAGAAACCAACAGGGATTGCCTCAGTAACGGCGAGTGAAGCGGCAAGAGCTCAACTTTGGAATCGCTCCGGCGAGTTGTAGTCTGGAGGTGGCCACCACGAGGTGTTCTAGCAGCAGGCAAGTCCTTTGGAACAAGGCGCCAGCGAGGGTGACAGCCCCGTACCTGCTTTTGCTAGTGCTTCCTGTGGCCCACCGACGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAGGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGCACTTTGAAAAGAGAGTGAAACAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCTTGCACCCAGACACGGTTTCGGCCGGGCCAGCATCAAGTAGAACGGGGTTAAAAGACCTGGGGAATGTAGCTACCTCTTGGTAGTGTTATAGCCCTTGGGTGATGACCCCTGTTTTGCTTGAGGACAGCGGTCTCTAGGATGCTGGCGCAATGG)所示；扩增所述耳念珠菌的靶向DNA片段扩增用引物优选包括核苷酸序列如SEQ IDNO:10(5'-CTAGGATGCTGGCGCAATG-3')所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:11(5'-CCGCAGGTTCACCTACGG-3')所示的反向引物。该对引物扩增目的片段的反应程序为：95℃3min变性，1次；95℃20s，变性，59℃30s退火，72℃45s延申，35cycles；72℃5min，最后延申1次；12℃保存。所述基础载体优选为质粒载体(pUC-T)。所述多克隆位点优选为EcoRV部位。所述筛选优选将所述连接产物转化大肠杆菌DH5α，重组转化子测序验证，重组转化子培养后提取质粒。所述重组质粒的具体构建过程交由北京擎科生物科技有限公司杭州分公司完成。

在本发明中，所述阴性对照为含耳念珠菌的内参基因DNA片段的重组质粒。所述含耳念珠菌的内参基因DNA片段的重组质粒的构建方法，优选包括以下步骤：将耳念珠菌的内参基因DNA片段连入PUC-T载体中，构建获得内参照质粒。所述耳念珠菌的内参基因DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:9(ATGAATGGGCAGCCGTTAGGAAAGCCTGCCGGTGACTAACCCTGCGCTCCTGCCTCGATGGGTGGAGTCGCGTGTGGCGGGGAAGTCAGGTGGAGCGAGGCTAGCTGGCCCGATTTCTCCTCCGGGTGATGCTTTTCCTAGATTATTCTCTGGTAAATCAAAGAAGTGGGTTTATGGAGGTCCTCTTGTGTCCCCTCCCCGCAGAGGTGTGGTGGCTGTGGCATGGTGCCAAGCCGGGAGAAGCTGAGTCATGGGTAGTTGGAAAAGGACATTTCCACCGCAAAATGGCCCCTCTGGTGGTGGCCCCTTCCTGCAGCGCCGGCTCACCTCACGGCCCCGCCCTTCCCCTGCCAGCCTAGCGTTGACCCGACCCCAAAGGCCAGGCTGTAAATGTCACCGGGAGGATTGGGTGTCTGGGCGCCTCGGGGAACCTGCCCTTCTCCCCATTCCGTCTTCCGGAAACCAGATCTCCCACCGCACCCTGGTCTGAGGTTAAATATAGCTGCTGACCTTTCTGTAGCTGGGGGCCTGGGCTGGGGCTCTCTCCCATCCCTTCTCCCCACACACATGCACTTACCTGTGCTCCCACTCCTGATTTCTGGAAAAGAGCTAGGAAGGACAGGCAACTTGGCAAATCAAAGCCCTGGGACTAGGGGGTTAAAATACAGCTTCCCCTCTTCCCACCCGCCCCAGTCTCTGTCCCTTTTGTAGGAGGGACTTAGAGAAGGGGTGGGCTTGCCCTGTCCAGTTAATTTCTGACCTTTACTCCTGCCCTTTGAG)所示。扩增所述耳念珠菌的内参基因DNA片段用引物对优选包括核苷酸序列如SEQ ID NO:12(5'-GAATGGGCAGCCGTTAGGA-3')所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:13

(5'-CTCAAAGGGCAGGAGTAAAGGTC-3')所示的反向引物。该对引物扩增目的片段的反应程序为：95℃5min变性，1次；95℃30s，变性，56℃30s退火,72℃1min延申，35cycles；72℃5min,最后延申1次；12℃保存。所述引物对由本公司设计，质粒构建交由北京擎科生物科技有限公司杭州分公司完成。

在本发明中，所述试剂盒还优选包括PCR反应液。所述PCR反应液优选为Universal U+Probe MasterMix V2，包含dNTP/dUTP Mix，Mg²⁺，AceTaq DNAPolymerase，Heat-labile UDG，Specific ROX Reference Dye.。在本发明实施例中，所述PCR反应液购自南京诺唯赞生物科技有限公司，货号Q513。

在本发明中，所述试剂盒对耳念珠菌的检测方法，优选以下步骤：

1)提取待检测样本的DNA；

2)配制荧光PCR反应体系；

3)将制备的反应体系进行荧光PCR扩增及荧光检测；

4)分析扩增曲线图，判断检测结果。

在本发明中，所述提取优选采用试剂盒方法进行提取DNA；所述提取后，优选包括纯化。所述纯化优选采用DNA纯化试剂盒进行。在本发明实施例中，提取DNA的试剂盒和纯化DNA试剂盒优选采用缔蓝核酸提取或纯化试剂盒。

在本发明中，所述荧光PCR反应体系优选包括以下含量组分：PCR反应液10μL、引物各0.5μL、探针1μL、灭菌纯化水4.5μL、样本/对照品4μL总体积为20μL。

在本发明中，所述荧光PCR扩增反应程序优选如下：

a.如模板GC含量较高，可将预变性时间延长为10min；

b.使用ABI7300至少31sec；使用ABI7500至少34sec。

在本发明中，质控标准包括如下：阴、阳性对照应同时满足以下条件，否则本次实验视为无效，需要重做：阴性质控：阴性对照Ct值＞36或“Undetermined”，同时内参照Ct值＜40；阳性质控：阳性对照Ct值≤36，同时内参照Ct值＜40。

实验结果的读取

以ABI7500为例，其它机型以该机型所配套的软件说明书为准。根据ABI7500仪器配套的分析软件说明书，首先将基线和阈值设定好(建议基线设定选自动，阈值设定选自动)，然后在软件内点击分析(Analyse)，系统将自动生成结果，观察每个样本扩增曲线的Ct值，并下载到Excel文件中。

在本发明中，利用仪器配套软件进行自动分析，得到各样本Ct值，根据如下判断：

1	样本Ct值≤36，内参照Ct值＜40*	阳性结果
			2	样本Ct值＞36或“Undetermined”，内参照Ct值＜40	阴性结果

*在高浓度目的基因存在的情况下，其扩增有可能导致内参照检验结果为阴性。

下面结合实施例对本发明提供的一种基于荧光PCR技术快速高效检测耳念珠菌用引物探针组、试剂盒及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

基于荧光PCR技术快速高效检测耳念珠菌的试剂盒的组成见表1。

表1试剂盒的组成

扩增耳念珠菌的特异性DNA片段的上、下游引物和探针以及扩增内参照的引物对和探针的信息见表2。

表2试剂盒中上、下游引物和探针的信息

引物名称	编号	引物序列(5'--3')
			扩增耳念珠菌特异性正向引物	SEQ ID NO:2	ATGCCTGTTTGAGCGTGATG
扩增耳念珠菌特异性反向引物	SEQ ID NO:3	CGTGCAAGCTGTAATTTTGTGAA
			耳念珠菌探针	SEQ ID NO:4	ACCAATCTTCGCGGTGGCGTTG
扩增内参照特异性正向引物	SEQ ID NO:5	CAAAGGCCAGGCTGTAAATGTC
			扩增内参照特异性反向引物	SEQ ID NO:6	TGCGGTGGGAGATCTGGTT
内参照探针	SEQ ID NO:7	TGCCCTTCTCCCCATTCCGTCTTC

实施例2

试剂盒的检测方法

在使用本试剂盒进行检测前，需提取待检测样本的DNA，可用缔蓝核酸提取或纯化试剂盒进行DNA的提取。

1、PCR反应管的准备(试剂准备区)

(1)确定需要进行的反应管数n(样本数+阴性对照+阳性对照)；取出灭菌纯化水(用户自备)和PCR反应液；取出试剂盒中的其他组分，放冰上或室温融化。所有试剂盒组分使用前均需要瞬时离心。每份反应体系如表3：

表3荧光PCR反应体系

PCR反应液	引物	探针	灭菌纯化水	样本/对照品	总体积
						10μL	1μL	0.5μL	4.5μL	4μL	20μL

按反应管数n计算上述各试剂(除了样本/对照品)的用量，并加入至离心管中，充分混匀(建议用移液器缓慢反复吹打混匀，同时避免液体飞溅或产生大量气泡)，瞬时离心后，向每个PCR反应管分装16μL。

2、加样(样本处理区或者加样区)

向准备好的PCR反应管中分别加入4μL待测样本的DNA或阴性对照或阳性对照样本，盖紧管盖(或贴上封板膜)后瞬时离心，转移到样本检测区。

3、PCR扩增及荧光检测(样本检测区)

将准备好的反应管放置在荧光PCR仪中，依照已编辑的样本信息按下列条件进行扩增反应及检测(表4)：

表4荧光PCR扩增反应程序

a.如模板GC含量较高，可将预变性时间延长为10min；

b.使用ABI7300至少31sec；使用ABI7500至少34sec；

4、结果分析条件设定

(1)分析扩增曲线图(Amplification Plot)结果时，一般可设定成图类型(Plottype)为：ΔRn vs Cycle。

(2)基线(Baseline)设定：荧光PCR仪的分析软件可以自动设置基线，通常是循环数2至最先扩增曲线之前3个循环数为基线。

(3)阈值(Threshold)设定：荧光PCR仪的分析软件可以自动设置阈值线，也可手动设置，通常阈值线设在基线以上扩增曲线的指数增长期内呈线性的部位，扩增曲线与阈值线相交的点即为Ct值，代表了标准化后报告集团荧光强度(Rn，The Normalized Intensityof the Reporter)扩增前后的变量值ΔRn[ΔRn＝Rn(PCR扩增后读数)-Rn(PCR扩增前读数)]，Ct值与反应初始目的DNA片段的量对数值呈线性负相关。

5、质控标准

本试剂盒阴、阳性对照应同时满足以下条件，否则本次实验视为无效，需要重做：

阴性质控：阴性对照Ct值＞36或“Undetermined”，同时内参照Ct值＜40。

阳性质控：阳性对照Ct值≤36，同时内参照Ct值＜40。

6、实验结果的读取

利用仪器配套软件进行自动分析，得到各样本Ct值，根据表5进行判定。

表5 Ct值结果判定方法

实施例3

菌种鉴定

为保证研究的准确性，对实验所用的8株不同的耳念珠菌培养的菌株样本进行测序验证，测序针对ITS区，ITS区测序引物如下：

ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’,SEQ ID NO:14；

ITS4：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’,SEQ ID NO:15。

测序结果在NCBI数据库中进行比较有5个菌株是耳念珠菌，1个是热带念珠菌，1个是毕赤酵母，最后1个不是真菌。上述结果与本发明耳念珠菌试剂盒所检测的结果完全符合，表明本方法及试剂盒的特异性很好。

实施例4

试剂盒的性能评价

1、检测限

本试剂盒耳念珠菌阳性参考品的剂量效应曲线，耳念珠菌阳性参考品：即采用10倍梯度稀释的不同浓度的耳念珠菌克隆质粒。

采用本发明实施例1的试剂盒，按照实施例2的方法，对耳念珠菌阳性参考品进行检测。

表6检测限实验结果(见图1)

浓度(ng/μL)	Ct值
		1	10.11
10^-1	13.60
		10^-2	16.80
10^-3	20.26
		10^-4	23.58
10^-5	26.86
		10^-6	30.56
10^-7	34.58
		10^-8	37.06
10^-9	Undetermined

由表6可知，本发明提供的试剂盒的检测限为10^-7ng/μL。

2、特异性

2.1阳性反应

本公司获得8例由上海长征医院赠与的相关耳念珠菌菌株培养物样本所提取的基因组DNA(菌株由来源于沈阳、北京、上海、南京等地医院的患者的临床样本培养而成)，由本公司将DNA样本送北京擎科生物科技有限公司杭州分公司测序验证。并且采用本发明实施例1的试剂盒，按照实施例2的方法进行检测(见图2)。测序结果发现有5例是耳念珠菌，1例是热带念珠菌，1例是毕赤酵母，1例是非真菌。上述测序结果与荧光PCR结果完全吻合(表7)。

表7耳念珠菌菌株培养物样本DNA检测结果

2.2交叉反应

分别取肺炎链球菌、铜绿假单胞菌、粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、肺炎克雷伯、屎肠杆菌、大肠杆菌、奇异变形杆菌、杂色曲霉、土曲霉、黑曲霉、黄曲霉、烟曲霉、白念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌、酵母菌的基因组DNA，以及人的基因组DNA，采用本发明实施例1的试剂盒，按照实施例2的方法进行特异性检验。上述微生物菌株均购自南京乐诊生物技术有限公司，由本公司提取其基因组DNA。人的基因组DNA购自南京金斯瑞生物科技有限公司。

由表8结果可知，设计的引物特异性良好，不与人及临床常见的细菌和真菌产生交叉反应(见图3)。

表8交叉反应实验结果

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2.3机型等效性

采用本发明实施例1的试剂盒，按照实施例2的方法，在公司现有的ABI7500荧光PCR仪、ABI7300 Plus荧光PCR仪、ABI StepOnePlus荧光PCR仪上进行。

由结果可知，ABI7500荧光PCR仪、ABI7300 Plus荧光PCR仪和ABI StepOnePlus荧光PCR仪，结果等效。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 杭州缔园生物技术有限公司

<120> 一种基于荧光PCR技术快速高效检测耳念珠菌用引物探针组、试剂盒及其应用

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 74

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgcctgttt gagcgtgatg tcttctcacc aatcttcgcg gtggcgttgc attcacaaaa 60

ttacagcttg cacg 74

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgcctgttt gagcgtgatg 20

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cgtgcaagct gtaattttgt gaa 23

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

accaatcttc gcggtggcgt tg 22

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

caaaggccag gctgtaaatg tc 22

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tgcggtggga gatctggtt 19

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tgcccttctc cccattccgt cttc 24

<210> 8

<211> 949

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cttggtcatt tagaggaagt aaaagtcgta acaaggtttc cgtaggtgaa cctgcggaag 60

gatcattatt gatattttgc atacacactg atttggattt taaaactaac ccaacgttaa 120

gttcaactaa actataaaga aaactttcaa caacggatct cttggttctc gcatcgatga 180

agaacgcagc gaaatgcgat acgtagtatg acttgcagac gtgaatcatc gaatctttga 240

acgcacattg cgccttgggg tattccccaa ggcatgcctg tttgagcgtg atgtcttctc 300

accaatcttc gcggtggcgt tgcattcaca aaattacagc ttgcacgaaa aaaatctacg 360

cttttttttc gttttgttgt cgcctcaaat caggtaggac tacccgctga acttaagcat 420

atcaataagc ggaggaaaag aaaccaacag ggattgcctc agtaacggcg agtgaagcgg 480

caagagctca actttggaat cgctccggcg agttgtagtc tggaggtggc caccacgagg 540

tgttctagca gcaggcaagt cctttggaac aaggcgccag cgagggtgac agccccgtac 600

ctgcttttgc tagtgcttcc tgtggcccac cgacgagtcg agttgtttgg gaatgcagct 660

ctaagtgggt ggtaaattcc atctaaggct aaatattggc gagagaccga tagcgaacaa 720

gtacagtgat ggaaagatga aaagcacttt gaaaagagag tgaaacagta cgtgaaattg 780

ttgaaaggga agggcttgca cccagacacg gtttcggccg ggccagcatc aagtagaacg 840

gggttaaaag acctggggaa tgtagctacc tcttggtagt gttatagccc ttgggtgatg 900

acccctgttt tgcttgagga cagcggtctc taggatgctg gcgcaatgg 949

<210> 9

<211> 780

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

atgaatgggc agccgttagg aaagcctgcc ggtgactaac cctgcgctcc tgcctcgatg 60

ggtggagtcg cgtgtggcgg ggaagtcagg tggagcgagg ctagctggcc cgatttctcc 120

tccgggtgat gcttttccta gattattctc tggtaaatca aagaagtggg tttatggagg 180

tcctcttgtg tcccctcccc gcagaggtgt ggtggctgtg gcatggtgcc aagccgggag 240

aagctgagtc atgggtagtt ggaaaaggac atttccaccg caaaatggcc cctctggtgg 300

tggccccttc ctgcagcgcc ggctcacctc acggccccgc ccttcccctg ccagcctagc 360

gttgacccga ccccaaaggc caggctgtaa atgtcaccgg gaggattggg tgtctgggcg 420

cctcggggaa cctgcccttc tccccattcc gtcttccgga aaccagatct cccaccgcac 480

cctggtctga ggttaaatat agctgctgac ctttctgtag ctgggggcct gggctggggc 540

tctctcccat cccttctccc cacacacatg cacttacctg tgctcccact cctgatttct 600

ggaaaagagc taggaaggac aggcaacttg gcaaatcaaa gccctgggac tagggggtta 660

aaatacagct tcccctcttc ccacccgccc cagtctctgt cccttttgta ggagggactt 720

agagaagggg tgggcttgcc ctgtccagtt aatttctgac ctttactcct gccctttgag 780

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ctaggatgct ggcgcaatg 19

<210> 11

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ccgcaggttc acctacgg 18

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gaatgggcag ccgttagga 19

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ctcaaagggc aggagtaaag gtc 23

<210> 14

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

tccgtaggtg aacctgcgg 19

<210> 15

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

tccgtaggtg aacctgcgg 19

Claims

1.一种用于检测耳念珠菌的特异性DNA片段，其特征在于，所述特异性DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.一种用于扩增权利要求1所述特异性DNA片段的引物对，其特征在于，所述引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的反向引物。

3.权利要求1所述特异性DNA片段或权利要求2所述引物对在制备检测耳念珠菌的试剂或试剂盒中的应用。

4.一种基于荧光PCR技术快速高效检测耳念珠菌用引物探针组，其特征在于，包括权利要求2所述引物对和探针；所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

5.权利要求2所述引物对或权利要求4所述引物探针组在制备检测耳念珠菌的试剂或试剂盒中的应用。

6.一种基于荧光PCR技术快速高效检测耳念珠菌的试剂盒，其特征在于，包括权利要求2所述引物对或权利要求4所述引物探针组。

7.根据权利要求6所述试剂盒，其特征在于，还包括检测内参基因用引物探针组；

8.根据权利要求6或7所述试剂盒，其特征在于，还包括阴性对照、阳性对照和PCR反应液；

9.根据权利要求8所述试剂盒，其特征在于，扩增所述耳念珠菌的靶向DNA片段扩增用引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示的反向引物。

10.根据权利要求8所述试剂盒，其特征在于，扩增所述耳念珠菌的内参基因DNA片段用引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示的反向引物。