CN115873979B - 一种用于检测耳念珠菌的恒温核酸扩增raa引物探针组合及其应用 - Google Patents
一种用于检测耳念珠菌的恒温核酸扩增raa引物探针组合及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于检测耳念珠菌的恒温核酸扩增RAA引物探针组合及其应用，所述引物探针组合的扩增效率高、特异性强且无明显的假阳性，此外，其能够将耳念珠菌与临床微生物鉴定系统中常常误诊的三种近缘菌有效区分开，本发明基于RAA‑侧流层析技术建立了一种快速检测耳念珠菌的方法，并通过特异性和灵敏度评价，可用于实际样品的检测中，为耳念珠菌的现场快速检测提供了一种快速、灵敏、可靠、有效的新方法，且所述方法不需要复杂仪器，尤其适用于基层实验室和检疫现场的耳念珠菌快速筛查检测。
Description
技术领域
本发明属于病原微生物检测技术领域，具体涉及一种用于检测耳念珠菌的恒温核酸扩增RAA引物探针组合及其应用。
背景技术
耳念珠菌(Candida auris)是于2009年在一名日本患者的外耳道分泌物中首次发现的病原真菌，至今为止，耳念珠菌已经在除南极洲以外其他六大洲的40多个国家被报道。耳念珠菌感染可以发生在各个年龄段的人群，其中，在老年人中最为常见，新生儿和儿童也偶有感染。耳念珠菌常见的宿主可以分为三类：一是患有严重免疫缺陷疾病或自身免疫能力较弱的人群，二是开放性手术患者或侵入性导管使用患者，三是使用广谱抗菌药物治疗的人群。该真菌主要引起持续性、侵袭性感染，对氟康唑等常用抗真菌药物呈多重耐药性，感染患者的病死率高达30％-60％，可快速播散并能引起医院感染的暴发流行，故被称为“超级真菌”。耳念珠菌作为一种新出现的多重耐药的酵母菌，具有较大的基因组多样性、多重耐药性和高致死亡率，其极易传播并感染院内患者，从而造成医院内爆发式感染，且感染多见于念珠菌血症。由于目前常见的表型鉴定及微生物鉴定系统均无法准确鉴定耳念珠菌，因此，常导致临床微生物学实验室对该菌株的鉴定错误，进而导致误诊，为临床上及时预防和控制耳念株菌的传播带来了极大困难。
病原体的准确鉴定是任何传染病治疗的前提条件，及时准确的诊断才能保证实施最快的合理治疗，并有效控制进一步传染的风险，从而降低传染性疾病在环境中爆发的机会。耳念珠菌在表型及生理生化方面与其他念珠菌具有普遍的相似性，因此导致其在临床诊断过程中容易被误诊。因此该真菌感染的诊断需要使用相对特殊的生化检测或分子生物学检测手段，例如，基于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪(matrix-assisted laserdesorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)检测特异性蛋白或基于核糖体内转录间隔区(internal transcribed spacer，ITS)及28S rDNA(ribosomal DNA)D1/D2区的序列分析鉴定。其中，虽然MALDI-TOF MS可用于鉴定耳念珠菌，但是该方法依赖于数据库的更新，并非所有的MALDI-TOF MS设备都可以用于耳念珠菌的检测，并且其必须基于纯培养物，可用于菌株特异性鉴定的蛋白质种类有限，因此在实际应用中往往受到限制。此外，上述用于耳念珠菌鉴别诊断的方法均需要配合相应的仪器使用，通常需要高成本的额外设备和经过专业培训的技术人员，鉴定成本高，很多医疗机构难以负担。
此外，常规真菌鉴定手段，包括念珠菌显色培养基和微生物商业检测系统，不仅耗时费力，而且阳性率低、错误率高。其中，最常用的临床微生物鉴定系统，例如VITEK2、API-20CAUX和BD酵母鉴定系统经常将耳念珠菌误诊为其他近缘念珠菌如C.haemulonii、C.duobushaemulonii、C.pseudohaemulonii、C.guilliermondii、C.parapsilosis等，导致耳念珠菌感染患者漏诊、误诊率极高。韩国于2011年报告3例由耳念珠菌引起的医院内真菌感染，同时该研究表明耳念珠菌通常被VITEK和API-20C AUX等商业鉴定系统错误地鉴定为希木龙念珠菌和黏红酵母菌。印度的一项综合研究经ITS测序证实，先前用VITEK系统鉴定为希木龙念珠菌或无名假丝酵母菌的102株菌株中有90株应为耳念珠菌，错误鉴定的比例高达88.2％。可见现有的诊断工具成本高、准确度低，可能导致耳念珠菌以及其近缘种的发病率在全球范围内被低估，尤其是医疗资源受限地区(如非洲和东南亚)。这也一定意义上解释了现有的爆发流行以及感染个案均来自于发达国家(如美国，英国和德国)或低收入地区的医疗发达城市(如新德里，印度)的原因。
等温核酸扩增技术是近年来新发展起来的一类分子生物学技术的总称。其可在特定温度下扩增特定的DNA或RNA。无论是在实际操作还是仪器要求方面，都比PCR技术更为简单方便，它摆脱了对精良设备的依赖，反应时间大大缩短，在临床和现场快速诊断中显示出了良好的应用前景。目前已开发出了多种等温扩增方法，如依赖核酸序列扩增(Nucleicacid sequence-based amplification，NASBA)、链替代扩增(Strand displacementamplification，SDA)、环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)、解链酶扩增(Helicase-dependent amplification，HAD)、重组酶聚合酶等温扩增技术(Recombinase polymerase amplification，RPA)、重组酶介导的等温扩增技术(Recombinase aided amplification，RAA)、转录依赖的扩增系统(Transcription-basedAmplification System，TAS)、滚环扩增(Rolling circleamplification，RCA)等。其中，RAA是一种新型核酸恒温扩增技术，能够在20分钟内进行常温下的单分子核酸检测。其不依赖于昂贵的实验室设备和专业操作人员，对于在经济卫生条件不发达的地区以及疾病爆发现场开展耳念珠菌的监测和鉴定工作具有重要的意义和良好的应用前景。然而，目前尚未见RAA技术用于耳念珠菌检测的相关报道，更无合适高效的RAA引物探针组能够用于耳念珠菌的检测。
因此，如何克服现有技术存在的上述不足，建立一种特异性高、准确、灵敏、快速、方便、成本低廉的耳念珠菌检测方法是目前本领域亟需解决的技术问题之一。
发明内容
针对现有技术存在的上述不足，本发明的目的在于提供一种用于检测耳念珠菌的恒温核酸扩增RAA引物探针组合及其应用。
本发明的上述目的通过以下技术方案得以实现：
本发明的第一方面提供了一种用于耳念珠菌检测的恒温核酸扩增RAA引物探针组合。
进一步，所述引物探针组合包括上游引物、下游引物和探针；
所述上游引物的核苷酸序列为F10’-1：5’-AAGGATCATTATTGATATTTTGCATACACA-3’；
所述下游引物的核苷酸序列为R10’：5’-Biotin-TTCAAAGATTCGATGATTCACGTCTGCAAG-3’；
所述探针的核苷酸序列为P：5’-FAM-ACTGATTTGGATTTTAAAACTAACCCAACG[THF]TAAGTTCAACTAAAC-C3spacer-3’。
在本发明的具体实施方案中，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:22所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:26所示，并在其5’端用生物素(Biotin)进行修饰；所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:21所示，并在其5’端用荧光基团(FAM)修饰，3’端用阻断基团(C3-spacer)进行阻断，第31个碱基用四氢呋喃([THF])替换。
本发明的第二方面提供了一种用于检测耳念珠菌的试剂盒。
进一步，所述试剂盒包含由本发明第一方面所述的引物探针组合组成的引物探针混合液。
进一步，所述试剂盒还包含A Buffer、B Buffer、RAA反应干粉试剂、ddH2O；
优选地，所述A Buffer为20％PEG；
优选地，所述B Buffer为280mM MgAc；
优选地，所述RAA反应干粉试剂中包含如下的组分：dNTP、SSB蛋白、recA重组酶蛋白或Rad51、Bsu DNA聚合酶、Tricine、PEG、二硫苏糖醇、肌酸激酶、Nfo核酸内切酶；
更优选地，所述RAA反应干粉试剂中各组分的浓度如下：1mmol/L dNTP、90ng/μLSSB蛋白、120ng/μL recA重组酶蛋白或30ng/μL Rad51、30ng/μL Bsu DNA聚合酶、100mmol/LTricine、20％PEG、5mmol/L二硫苏糖醇、100ng/μL肌酸激酶、Nfo核酸内切酶。
进一步，所述试剂盒还包含侧流层析试纸条。
本发明的第三方面提供了一种基于RAA-侧流层析技术非诊断和治疗目的地检测耳念珠菌的方法。
进一步，所述方法包括如下步骤：
(1)提取待测样本DNA；
(2)以待测样本DNA为模板，进行RAA扩增反应，得到扩增产物，其中，RAA扩增的上游引物的核苷酸序列为F10’-1：5’-AAGGATCATTATTGATATTTTGCATACACA-3’；下游引物的核苷酸序列为R10’：5’-Biotin-TTCAAAGATTCGATGATTCACGTCTGCA AG-3’；探针的核苷酸序列为P：5’-FAM-ACTGATTTGGATTTTAAAACTAACCCAACG[THF]TAAGTTCAACTAAAC-C3spacer-3’；
(3)应用侧流层析试纸条对扩增产物进行检测，当试纸条出现两条红色条带，一条位于质控区，一条位于检测区，则结果为阳性，表明样本中含有耳念珠菌；当试纸条只有质控区出现一条红色条带，检测区没有条带，则结果为阴性，表明样本中不含耳念珠菌。
进一步，步骤(2)中所述扩增反应的过程包括如下步骤：在装有RAA反应干粉试剂的检测单元管中加入上游引物、下游引物、探针、A Buffer、ddH2O、模板，于管盖上添加BBuffer，盖上管盖，低速离心后继续进行扩增反应，得到扩增产物。
进一步，所述各物质的用量分别为：2μM上游引物2μL，2μM下游引物2μL，2μM探针0.6μL，A Buffer 25μL，15.9μL ddH2O，2μL模板，B Buffer 2.5μL。
进一步，步骤(2)中所述扩增反应的反应条件为：37℃的条件下反应15min。
在本发明的具体实施方案中，所述RAA技术的扩增原理如下：RAA技术主要利用重组酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶对目的基因进行大量的扩增。从细菌或真菌中获得的重组酶在常温下可与引物DNA紧密结合，形成重组酶/引物复合体，侵入DNA双链核酸模板，在侵入位点重组酶将双链打开，同时单链结合到重组酶打开的单链上，维持双链模板处于开链的状态。重组酶/引物复合体开始对双链进行扫描，当引物在模板上搜索到与之完全匹配的互补序列时，重组酶/引物复合体解体，DNA聚合酶结合到引物3’端，开始合成新链。合成的新链又可以作为模板，最终扩增产物以指数级增长，完成靶标基因的扩增。
在本发明的具体实施方案中，下游引物和探针在5’末端分别用生物素(Biotin)和羧基荧光素(FAM)(Tsingke Biotechnology Co.,Ltd.,Beijing,China)修饰。经过荧光标记的探针与扩增产物结合，反应体系中的核酸内切酶识别并切割无嘌呤和无嘧啶的[THF]位点，当探针被核酸内切酶酶切后，与生物素标记的引物共同扩增形成两端有荧光标记及生物素标记的片段，可采用侧流层析试纸条进行判读。所述侧流层析试纸条是一种通用型核酸检测试纸条，只需少量产品即可检测，产品浓度过高时需适当稀释。当稀释的产物滴加到样品垫上时，扩增产物的两端都用生物素和FAM标记，FAM与AuNPs结合，通过链霉亲和素检测线时，生物素与链霉亲和素结合，另一端通过金纳米颗粒(AuNPs)呈阳性信号。将侧流层析试纸条(Hangzhou Zhongce Bio-Sci&Tech Co.,Ltd.,Hangzhou,China)样品垫朝下插入稀释后的反应液中2分钟即可目测读取检测结果。
在本发明的具体实施方案中，本发明通过进一步反应条件的优化，筛选得到所述RAA方法中扩增反应的最佳温度和时间分别为37℃、15min。并且该方法表现出极高的特异性和良好的灵敏度，可以检测到低至101fg/reaction的耳念珠菌基因组DNA，且检测灵敏度不会受其他真菌DNA存在的影响。
本发明的第四方面提供了本发明第一方面所述的引物探针组合、本发明第二方面所述的试剂盒在制备用于检测耳念珠菌和/或鉴别诊断耳念珠菌和C.persedohaemulonii、C.duobushaemulonis、C.haemulonii的产品中的应用。
本发明的第五方面提供了本发明第一方面所述的引物探针组合、本发明第二方面所述的试剂盒在检测耳念珠菌和/或鉴别诊断耳念珠菌和C.persedohaemulonii、C.duobushaemulonis、C.haemulonii中的应用。
在本发明的具体实施方案中，本发明经验证发现，本发明提供的引物探针组合能够准确有效鉴别区分耳念珠菌与临床微生物鉴定系统中常常误诊的三种近缘菌C.persedohaemulonii、C.duobushaemulonis、C.haemulonii。
相对于现有技术，本发明具有的优点和有益效果：
(1)本发明提供了一种快速检测耳念珠菌的恒温核酸扩增RAA引物探针组合，所述引物探针组合包括引物对(如SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:26所示)和探针(如SEQ ID NO:21所示)，所述引物对能够特异性扩增耳念珠菌，除耳念珠菌外没有与其他病原菌产生交叉反应，也即本发明提供的引物对具有较强的特异性扩增特点，并且可以明显将耳念珠菌与临床微生物鉴定系统中常常误诊的近缘菌—C.haemulonii、C.pseudohaemulonii和C.duobushaemulonis区分开。此外，本发明通过对比实验证明了所述RAA引物探针组合的扩增效率最高、特异性最强且无明显的假阳性，显著优于同样是针对耳念珠菌rDNA基因的ITS序列设计的其他三种RAA引物探针组合，这一效果属于本领域技术人员所预料不到的技术效果。
(2)本发明还提供了一种快速检测耳念珠菌的POCT(现场快速检测)方法，即将侧流层析试纸条(Lateral flow strip detection，LFS)和重组酶介导等温核酸扩增技术(Recombinase aided amplification，RAA)结合的检测方法(RAA-LFS)，通过简易的Chelex-100煮沸方法进行DNA的提取和纯化节省了该检测系统的检测时间，该检测不再需要荧光检测设备及电泳装置，仅需要一台恒温水浴锅即可提供反应所需温度，甚至用体温供热便可以完成有效扩增，能够在15min内获得检测结果，且特异性高、灵敏度高、仪器依赖性低、不需要经过专业培训的实验室人员、可操作性强。可用于现场满足床边诊断的需要或条件较弱的偏远医院的需要，对耳念珠菌的快速检测具有重要意义。
(3)本发明首次采用RAA-侧流层析技术建立了一种快速检测耳念珠菌的方法，并通过特异性和灵敏度评价，可用于实际血液样品的检测中，为耳念珠菌的现场快速检测提供一种灵敏、可靠、有效的新方法。本发明选用的引物对是经大量实验筛选获得的，特异性好，且与其它病原菌无交叉反应。本发明所使用的引物探针组合扩增效率高、条带特异性强、能够在检测区形成较高浓度的引物-探针异二聚体，因而使试纸条呈现强阳性反应，增加了检测的灵敏度。本发明建立的RAA技术和侧流层析技术结合检测耳念珠菌的方法，既具有分子生物学检测的高灵敏、高通量，又具有免疫学检测的特异性好、操作简便的优点，还不需复杂仪器，且检测速度快，尤其适用于基层实验室和检疫现场的耳念珠菌快速筛查检测。
附图说明
图1为RAA-LFS示意图，其中，A图：RAA-nfo探针设计，B图：荧光标记的探针与模板结合，C图：侧流层析试纸条(LFS)工作示意图；
图2为检测结果判读方法示意图；
图3为通过RAA的扩增性能筛选引物对的琼脂糖凝胶电泳结果图，其中，NTC泳道是相应引物对的无模板对照，DNA ladder的条带大小显示在左侧，引物二聚体由白色箭头表示；
图4为使用不同引物-探针组的重组酶介导的等温核酸扩增(RAA)的侧流层析试纸条(LFS)的结果图，其中，NTC是相应引物-探针组的无模板对照，测试线和对照线的位置标在右侧，模板是耳念珠菌基因组DNA，反应条件为在39℃下反应15分钟；
图5为对耳念珠菌和其他常见病原念珠菌的全基因组做系统发育树的结果图；
图6为引物-探针组合靶向片段图，将三个密切相关的菌株C.persedohaemulonii、C.duobushaemulonis和C.haemulonii的ITS序列片段与耳念珠菌的ITS序列切片进行比较，并在每个序列的开头显示菌株名称，对应于引物和探针的序列写在比对中的位置下，箭头表示引物和探针延伸的方向，四氢呋喃(THF)位点用“□”表示；
图7为不同反应温度和反应时间条件下的RAA-LFS的检测结果图，其中，RAA反应的温度显示在每个条带的顶部，RAA反应时间显示在每行左侧，扩增模板为耳念珠菌基因组DNA，对照线和测试线的位置显示在图像的右侧；
图8为不同参考菌株的检测结果图，其中，菌株名称显示在每个条带的顶部，NTC为无模板对照，对照线和测试线的位置显示在图像的右侧，反应在37℃的条件下进行15min；
图9为其他近缘真菌和致病性细菌的检测结果图，其中，A图：RAA-LFS检测C.haemulonii、C.Perudohaemulonii和C.Duobushaemulonis菌株的结果图，B图：RAA-LFS检测其他相关念珠菌和常见病原菌的结果图，菌株的种类显示在每个条带的顶部，NTC为无模板对照，对照线和测试线的位置显示在图像的右侧，反应在37℃的条件下进行15min；
图10为RAA-LFS技术检测耳念珠菌灵敏性的结果图，其中，A图：RAA扩增与不同数量的耳念珠菌培养物的LFS结果图，B图：用不同数量的耳念珠菌基因组DNA进行RAA扩增的LFS结果图；
图11为在其他真菌干扰下RAA-LFS技术检测耳念珠菌灵敏性的结果图，其中，A图：不同耳念珠菌培养物加入105CFU/μL白色念珠菌培养基后RAA扩增的LFS结果图，B图：除了耳念珠菌基因组DNA外，还向反应中添加了1ng白色念珠菌基因组DNA进行RAA扩增的LFS结果图；
图12为RAA-LFS技术对人体血液样本的检测性能测试结果图，其中，A图：在人血液样本中混入不同浓度的耳念珠菌液进行RAA-LFS检测的结果图，B图：将耳念珠菌基因组DNA与人血提取的DNA按1：10混匀后进行RAA-LFS检测的结果图，其中，NTC为无模板对照，对照线和测试线的位置显示在图像的右侧，反应在37℃的条件下进行15min。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解为：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、生物材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1 RAA-LFS系统引物探针组的设计和筛选
1.1材料与方法
1.1.1菌株来源
本发明实施例中涉及到的实验菌株来源如表1所示。
表1实验材料
1.1.2主要实验仪器
本发明实施例中涉及到的主要实验仪器如表2所示。
表2主要实验仪器
1.1.3主要试剂耗材
本发明实施例中涉及到的主要试剂耗材如表3所示。
表3主要试剂耗材
1.1.4生物信息学软件
引物和探针设计：Primer 5.0；
序列比对、拼接处理软件：MEGA7.0、BoEidt软件；
核苷酸与氨基酸对比工具：美国生物技术信息中心在线工具。
1.2实验方法
1.2.1菌株复苏
取甘油保种的菌株，按照无菌操作原则，将真菌涂布于SDA固体培养基，细菌涂布于LB固体培养基，于培养箱中倒置培养。于生物安全柜中挑取单克隆于液体培养基中培养。
1.2.2菌株DNA提取
使用Chelex-100煮沸法提取所有菌株基因组DNA，使用所有提取的DNA均用Qubit2荧光计(Thermo Fisher Scientific)进行定量测量，并保存在-20℃冰箱中直至使用。提取基因组DNA具体步骤如下：
(1)培养好的菌液离心后去上清收集菌体；
(2)在菌体沉淀中加入Chelex-100裂解液，置于金属浴或者恒温水浴锅中煮沸；
(3)上述加热煮沸后的粗提取液充分离心，取上清加入等体积的DNA提取酚试剂(Beijing Solarbio Science&Technology Co.,Ltd.,Beijing,China)混匀，充分离心后吸取上清，用Qubit 2.0定量后，标记好后-20℃冻存备用。
1.2.3 RAA检测方法建立
1.2.3.1引物设计
从NCBI的核酸数据库GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)检索获得耳念珠菌rDNA基因的ITS序列(NCBI Reference Sequence:NR_154998.1)，耳念珠菌rDNA基因ITS1和ITS2为耳念珠菌具有特异性的保守序列作为靶序列，根据引物设计原则用PrimerPremier 5.0软件(Premier Biosoft International，CA，USA)设计引物及探针，共设计出10对候选引物对(ITS-1—ITS-10)，如表4所示。并且使用NCBI上的BLAST工具(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)对所设计的引物对进行筛选。所用引物对和探针均由擎科公司合成。
表4设计得到的10对候选引物对
1.2.3.2引物筛选体系及反应步骤
首先在NCBI对已经设计的10对候选引物进行初步验证，后根据制造商说明书，用基础型RAA核酸扩增试剂(Hangzhou Zhongce Bio-Sci&Tech Co.,Ltd.,Hangzhou,China)进行引物筛选，这些引物通过用无模板对照扩增靶基因片段来初步筛选。扩增产物在琼脂糖凝胶上进行电泳，以比较无模板对照中靶标和引物二聚体形成的扩增性能。选择了显示最佳扩增性能且没有交叉二聚体形成迹象的引物对。
RAA引物筛选体系共50μL：在装有反应干粉的检测单元管中加入10μM的上下游引物各2μL，A Buffer 25μL，双蒸水13.5μL，耳念珠菌基因组DNA 5μL，将以上共计47.5μL体系配制完成后混匀离心，于管盖上添加B Buffer 2.5μL。盖上管盖，上下颠倒轻甩充分混匀5-6次，通过离心的方式将其加入到体系中催化反应的发生。低速离心10s后在PCR仪(或恒温金属浴或水浴锅)中39℃孵育30min。反应结束后，在检测单元管中加入50μL DNA提取酚试剂(Beijing Solarbio Science&Technology Co.,Ltd.,Beijing,China)，充分混匀后12000rpm/min离心5min，取6μL上清与1μL 6×上样缓冲液(Loading Buffer)混匀后经2.5％琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后用凝胶成像系统观察结果。
1.2.3.3适用于RAA-nfo的引物及探针设计
根据RAA-nfo核酸扩增试剂(试纸条型)试剂盒(Hangzhou Zhongce Bio-Sci&TechCo.,Ltd.,Hangzhou,China)中的制造商说明书，使用Primer Premier 5.0软件(PremierBiosoft International，CA，USA)进行引物及探针的设计。
1.2.3.4引物-探针组的筛选体系及RAA反应步骤
基于上述引物筛选结果，通过将正向引物F10在3’端延伸16bp获得作为用于RAA-nfo检测候选探针。预测了该探针和反向引物产生的所有可能的交叉二聚体，最后在探针上游序列设计四条新的用于RAA-nfo检测上游引物，在原有下游引物序列的5’端用生物素修饰作为用于RAA-nfo检测下游引物。上述设计的引物探针序列如表5所示。其中，FAM为荧光基团；THF为四氢呋喃；C3-spacer为阻断基团。
表5设计得到的4对候选引物-探针组合
图1为RAA-LFS示意图。在本实施例中，为筛选最佳的引物-探针组，根据制造商说明书，使用RAA-nfo核酸扩增试剂(试纸条型)试剂盒(Hangzhou Zhongce Bio-Sci&TechCo.,Ltd.,Hangzhou,China)进行筛选。RAA反应过程如下：反应体系共50μL，在装有RAA反应干粉试剂的检测单元管中加入2μM的上下游引物各2μL，2μM的探针0.6μL，A Buffer(20％PEG)25μL，双蒸水(ddH2O)15.9μL，耳念珠菌基因组DNA 2μL，于管盖上添加B Buffer(280mMMgAc)2.5μL。盖上管盖，上下颠倒轻甩充分混匀5-6次，通过离心的方式将其加入到体系中催化反应的发生。低速离心10s后在PCR仪(或恒温金属浴或水浴锅)中39℃孵育15min。反应结束后，将50μL扩增产物添加到300μL的无菌水或1×PBS溶液中稀释，将一次性核酸检测试纸条(侧流层析试纸条)(Hangzhou Zhongce Bio-Sci&Tech Co.,Ltd.,Hangzhou,China)样品垫朝下插入稀释后的反应液中2分钟，待样品吸收至吸收垫处，然后目测对结果判读。
上述结果判读方法如下：试纸条出现两条红色条带，一条位于质控区(C线)，一条位于检测区(T线)。阳性结果为C线与T线同时出现，表明样本中含有耳念珠菌；阴性结果为只出现C线，不出现T线，表明样本中不含耳念珠菌或数量低于最低检出限；当C线与T线均未出现表明结果无效。如图2所示。
1.3实验结果
1.3.1耳念珠菌引物探针设计结果
设计得到的10对候选引物对如表4所示，通过用无模板对照扩增靶基因片段来对上述候选引物对进行初步筛选，扩增产物在琼脂糖凝胶上进行电泳，以比较无模板对照中靶标和引物二聚体形成的扩增性能，结果如图3所示，根据电泳结果可知：引物对ITS-10的条带最亮，扩增效率最高，且无明显的引物二聚体，因此，可根据F10、R10的位置设计探针。根据上述探针设计原则，通过将正向引物F10在3’端延伸16bp获得候选探针。预测了该探针和反向引物产生的所有可能的交叉二聚体。在探针上游设计了4个新的上游引物，并对其进行测试筛选。在探针的5’端用FAM修饰，3’端用C3-spacer进行阻断，第31个碱基用[THF]替换。在探针上游序列设计四条新的用于RAA-nfo检测上游引物，在原有下游引物序列的5’端用生物素修饰作为用于RAA-nfo检测下游引物。适用于RAA-nfo的引物及探针设计结果如表5所示。
1.3.2最佳引物-探针组筛选结果
为筛选最佳引物-探针组，对表5中所述的4种组合(F10’-1/R10’/P、F10’-2/R10’/P、F10’-3/R10’/P、F10’-4/R10’/P)进行了测试筛选，结果如图4所示，RAA-LFS结果显示只有F10’-1/R10’/P在四种组合里扩增效率最高，且NTC结果无假阳性，即F10’-1/R10’/P组合扩增效率最高且无明显的假阳性，满足检测要求，这一结果属于本领域技术人员在未经实验验证之前所预料不到的技术效果，因此在随后的实验中使用了F10’-1/R10’/P为最佳引物-探针组合。
此外，对耳念珠菌和其他常见病原念珠菌的全基因组做系统发育树(如图5所示)，与其中最近缘的三种念珠菌的ITS序列比对表明，经筛选得到的引物探针组合F10’-1/R10’/P能检测区分耳念珠菌(C.auris)和C.persedohaemulonii、C.duobushaemulonis、C.haemulonii(如图6所示)，进一步表明了本发明经设计筛选得到的引物-探针组合具有较高的特异性。
实施例2耳念珠菌RAA检测最佳反应条件的筛选
1、实验方法
为了筛选本次实验的最佳反应参数，选用103fg/reaction的基因组浓度，将相同的反应体系置于不同的反应温度进行测试。具体筛选方法如下：
反应中模板浓度选取103fg/reaction的耳念珠菌基因组DNA，对反应条件的摸索验证，将反应温度设置为35～45℃(每2℃设置为一梯度)，将反应时间设置为5～35min(每5min一梯度)分别孵育结合试纸条结果以分析适合反应温度范围，实验方法同实施例1中的1.2.3.4。
2、实验结果
扩增结果采用LFS分析，实验结果显示，测试线上的粉红色在45℃的反应条件下一直未出现，可能是因温度过高导致酶失活。其余纸条测试线上的粉红色在39℃、10min时出现，15min时各条带颜色开始变暗，其中37℃与39℃条带最为明显。20分钟后，条带的暗度没有显著变化(如图7所示)。因此，选择37℃和15min作为RAA的最佳反应温度和时间。
实施例3 RAA-LFS技术检测耳念珠菌特异性评价
1、实验方法
为了确认引物-探针组的包容性和特异性，对12株耳念珠菌参考菌株、4株C.haemulonii、3株C.pseudohaemulonii、4株C.duobushaemulonis和其他近缘念珠菌及常见致病性细菌进行RAA-LFS扩增测试，实验方法同实施例1中的1.2.4.4，即根据制造商的说明，使用RAA-nfo核酸扩增试剂(Hangzhou Zhongce Bio-Sci&Tech Co.,Ltd.,Hangzhou,China)进行RAA反应。RAA反应过程如下：反应体系共50μL，在装有RAA反应干粉试剂的检测单元管中加入2μM的上下游引物各2μL，2μM的探针0.6μL，A Buffer 25μL，双蒸水(ddH2O)15.9μL，DNA模板2μL，于管盖上添加B Buffer 2.5μL。盖上管盖，上下颠倒轻甩充分混匀5-6次，通过离心的方式将其加入到体系中催化反应的发生。低速离心10s后在PCR仪(或恒温金属浴或水浴锅)中37℃孵育15min。反应结束后，将50μL扩增产物添加到300μL的无菌水或1×PBS溶液中稀释，将一次性核酸检测试纸条(侧流层析试纸条)(Hangzhou Zhongce Bio-Sci&Tech Co.,Ltd.,Hangzhou,China)样品垫朝下插入稀释后的反应液中2分钟，待样品吸收至吸收垫处，然后目测对结果判读。结果判读方法同实施例1中所述。
2、实验结果
12株参考菌株的耳念珠菌结果呈阳性(如图8所示)，其他近缘真菌和致病性细菌为阴性(如图9A和9B所示)，表明F10’-1/R10’/P引物-探针组对耳念珠菌表现出良好的包容性和特异性，并且不会与其他病原细菌和真菌发生交叉反应。所有C.haemulonii、C.pseudohaemulonii和C.duobushaemulonis在测试中均为阴性(如图9A所示)，表明了该系统可以检测到耳念珠菌的同时可以准确的区分开其与C.haemulonii、C.pseudohaemulonii和C.duobushaemulonis，特异性极好。
实施例4 RAA-LFS技术检测耳念珠菌灵敏性评价
1、实验方法
为了确定RAA-LFS检测系统对耳念珠菌的检测限，测试了耳念珠菌基因组和菌液的10倍系列稀释度，基因组浓度梯度为107fg/reaction-100fg/reaction，菌液浓度梯度为105CFU/μL-100CFU/μL(反应体积：50μL，2μL C.auris基因组被添加到每个反应中)。同时为了确定其他菌株的污染是否会干扰检测灵敏度，将白念珠菌105CFU/μL处理后的培养物或1ng/μL基因组DNA添加到10倍稀释的耳念珠菌培养物(105-100CFU/μL)或基因组DNA(107fg/reaction-100fg/reaction)，实验方法同实施例3所述的RAA反应过程。
2、实验结果
为了确定RAA-LFS系统对耳念珠菌的检测限，本实施例测试了耳念珠菌菌液的10倍系列稀释度，范围从105到100CFU/μL(反应体积：50μL，2μL耳念珠菌基因组被添加到每个反应中)。尽管颜色较浅，但在100CFU/μL的测试线上仍出现粉红色条带。此外，随着耳念珠菌菌液浓度的增加，粉红色带变暗(如图10A所示)。以类似的方式，对纯化的耳念珠菌基因组DNA进行了10倍系列稀释。可以检测到低至101fg/reaction的耳念珠菌基因组DNA(如图10B所示)。为了测试系统是否能够抵抗其他常见病原真菌DNA的干扰，将白念珠菌105CFU/μL的菌液或1ng/μL基因组DNA添加到10倍稀释的耳念珠菌菌液(105-100CFU/μL)或基因组DNA(107fg/reaction-100fg/reaction)，结果表明C.albicans菌液(如图11A所示)或基因组DNA(如图11B所示)不会干扰RAA-LFS对耳念珠菌的检测。可见RAA-LFS系统的检测限为每反应2CFU，或10fg基因组DNA/50μL。检测灵敏度不受其他真菌DNA存在的影响。
实施例5 RAA-LFS技术检测耳念珠菌应用性评价
1、实验方法
(1)血液DNA中掺入不同浓度耳念珠菌基因组DNA
为了确定人类DNA对耳念珠菌检测的影响，将耳念珠菌基因组DNA与人血提取的DNA按1:10混匀后进行10倍系列稀释梯度，使耳念珠菌基因组最终浓度为107fg/reaction-100fg/reaction进行RAA-LFS检测，观察检测限变化，实验方法同实施例3所述的RAA反应过程。
(2)直接检测血液中耳念珠菌
从掺入了耳念珠菌的全血中直接提取DNA进行RAA检测，初步评价其对临床血液样本快速检测的应用。具体步骤如下：每200μL全血样本中混入耳念珠菌的10倍系列稀释菌液进行RAA-LFS检测，菌液浓度梯度为105CFU/μL-100CFU/μL，实验方法同实施例3所述的RAA反应过程。
2、实验结果
本实施例模拟了临床血液样本，在人血液样本中混入不同浓度的耳念珠菌液进行RAA-LFS检测，实验结果表明：RAA-LFS检测耳念珠菌的方法可以应用于人血液样本且检测的灵敏度不变(如图12A所示)；同时为了确定人DNA对耳念珠菌检测的影响，将耳念珠菌基因组DNA与人血提取的DNA按1：10混匀后进行RAA-LFS检测，结果显示，人DNA对检测没有显著的抑制作用且不改变其检测限(如图12B所示)。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
Claims (13)
1.一种用于耳念珠菌检测的恒温核酸扩增RAA引物探针组合，其特征在于，所述引物探针组合包括上游引物、下游引物和探针；
所述上游引物的核苷酸序列为F10’-1： 5’-AAGGATCATTATTGATATTTTGCATACACA-3’；
所述下游引物的核苷酸序列为R10’ ：5’-Biotin-TTCAAAGATTCGATGATTCACGTCTGCAAG-3’；
所述探针的核苷酸序列为P ：5’-FAM-ACTGATTTGGATTTTAAAACTAACCCAACG[THF]TAAGTTCAACTAAAC-C3spacer-3’。
2.一种用于检测耳念珠菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含由权利要求1所述的引物探针组合组成的引物探针混合液。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含A Buffer、B Buffer、RAA反应干粉试剂、ddH2O。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述A Buffer为20% PEG。
5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述B Buffer为280 mM MgAc。
6.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述RAA反应干粉试剂中包含如下的组分：dNTP、SSB蛋白、recA重组酶蛋白或Rad51、Bsu DNA聚合酶、Tricine、PEG、二硫苏糖醇、肌酸激酶、Nfo核酸内切酶。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述RAA反应干粉试剂中各组分的浓度如下：1 mmol/L dNTP、90 ng/μL SSB蛋白、120 ng/μL recA重组酶蛋白或30 ng/μL Rad51、30 ng/μL Bsu DNA聚合酶、100 mmol/L Tricine、20% PEG、5 mmol/L二硫苏糖醇、100 ng/μL肌酸激酶。
8.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含侧流层析试纸条。
9.一种基于RAA-侧流层析技术非诊断和治疗目的地检测耳念珠菌的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1) 提取待测样本DNA；
(2) 以待测样本DNA为模板，进行RAA扩增反应，得到扩增产物，其中，RAA扩增的上游引物的核苷酸序列为F10’-1：5’-AAGGATCATTATTGATATTTTGCATACACA-3’；下游引物的核苷酸序列为R10’：5’-Biotin-TTCAAAGATTCGATGATTCACGTCTGCAAG-3’；探针的核苷酸序列为P：5’-FAM-ACTGATTTGGATTTTAAAACTAACCCAACG[THF]TAAGTTCAACTAAAC-C3spacer-3’；
(3) 应用侧流层析试纸条对扩增产物进行检测，当试纸条出现两条红色条带，一条位于质控区，一条位于检测区，则结果为阳性，表明样本中含有耳念珠菌；当试纸条只有质控区出现一条红色条带，检测区没有条带，则结果为阴性，表明样本中不含耳念珠菌。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述扩增反应的过程包括如下步骤：在装有RAA反应干粉试剂的检测单元管中加入上游引物、下游引物、探针、A Buffer、ddH2O、模板，于管盖上添加B Buffer，盖上管盖，充分混匀，低速离心后继续进行扩增反应，得到扩增产物。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，各物质的用量分别为：2 µM上游引物2 µL，2 µM下游引物2 µL，2 µM探针0.6 µL，A Buffer 25 μL，15.9 µL ddH2O，2 μL模板，BBuffer 2.5 μL。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述扩增反应的反应条件为：37℃的条件下反应15 min。
13.权利要求1所述的引物探针组合、权利要求2-8中任一项所述的试剂盒在制备用于检测耳念珠菌和/或鉴别诊断耳念珠菌和
C. persedohaemulonii、C. duobushaemulonis、C. haemulonii
的产品中的应用。
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