CN112359133A

CN112359133A - 用于检测耳念珠菌的rpa引物组、试剂盒及快速检测方法

Info

Publication number: CN112359133A
Application number: CN202011450274.2A
Authority: CN
Inventors: 胡静; 付雷雯; 王玲; 刘志华; 乐婷婷
Original assignee: Southern Medical University Zhujiang Hospital
Current assignee: Southern Medical University Zhujiang Hospital
Priority date: 2020-12-09
Filing date: 2020-12-09
Publication date: 2021-02-12

Abstract

本发明公开了用于检测耳念珠菌的RPA引物组，引物长度为30bp，DF1如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，DR1如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；或者是F2如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，R2如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。本发明还公开了基于上述RPA引物组的试剂盒和快速检测方法。本发明提供的耳念珠菌的RPA引物组能有效地鉴定耳念珠菌，即使在混合感染中仍可准确鉴别耳念珠菌。

Description

用于检测耳念珠菌的RPA引物组、试剂盒及快速检测方法

技术领域

本发明涉及耳念珠菌的检测，具体涉及用于检测耳念珠菌的RPA引物组、试剂盒及快速检测方法。

背景技术

耳念珠菌是于2009年在一名日本患者的外耳道分泌物中首次发现并得名，该真菌主要引起持续性、侵袭性感染，对氟康唑等常用抗真菌药物呈多重耐药性，感染患者的病死率高达30％-60％，可快速播散并能引起医院感染的暴发流行，故被称为“超级真菌”。目前，全球五大洲至少30个国家已有耳念珠菌感染病例的报道，2018年，我国的3个研究团队陆续报道了北京和辽宁省发现累计有18例耳念珠菌感染的散发病例，证实了耳念珠菌在我国本土的存在。

耳念珠菌作为一种新出现的多重耐药的酵母菌，具有较大的基因组多样性、多重耐药性和高致死亡率，其极易传播并感染院内患者，从而造成医院内爆发式感染，感染多见于念珠菌血症。由于常见的表型鉴定及微生物鉴定系统均无法准确鉴定耳念珠菌，因此，常导致临床微生物学实验室对该菌株的鉴定错误，为临床上及时预防和控制耳念株菌的传播带来极大困难。

目前，耳念珠菌的诊断方法主要有分子鉴定方法和基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术(MALDI-TOF MS)。通过聚合酶链式反应(PCR)技术或实时荧光定量PCR(qPCR)技术，扩增耳念珠菌的内转录间隔区(internal transcribed spacer，ITS)和D1/D2区域基因序列，后将扩增产物测序后在GenBank上进行碱基局部对准检索工具(BLAST)比对以鉴定到种，这一方法也是目前耳念珠菌鉴定的金标准。Kordalewska等设计出一种qPCR检测耳念珠菌方法，可通过溶解曲线实现耳念珠菌与希木龙念珠菌、葡萄牙念珠菌和Candidaduobushaemulonii的鉴别诊断。其次，MALDI-TOF MS也可以快速准确的鉴定耳念珠菌。然而，该方法依赖于数据库的更新，并非所有MALDI-TOF设备都可以用于耳念珠菌的检测。

常用的鉴定念珠菌的方法主要为念珠菌显色培养基和微生物商业检测系统如Vitek 2 YST ID卡，BD Phoenix和API20C等。目前，白色念珠菌为临床上最为常见的致病念珠菌，科玛嘉显色培养基可将念珠菌鉴定为四类，即白色念珠菌(绿色)、热带念珠菌(蓝色或灰色)、克柔念珠菌(粉色粗糙菌落)和其他类念珠菌，可基本满足临床鉴定需求。耳念珠菌在科玛嘉培养基上呈粉色，但如近平滑念珠菌和葡萄牙念珠菌等其他念珠菌在科玛嘉培养基上亦呈粉色，因此科玛嘉显色培养基无法准确的鉴定耳念珠菌。韩国于2011年报告3例由耳念珠菌引起的医院内真菌感染，同时该研究表明耳念珠菌通常被VITEK和API-20C AUX等商业鉴定系统错误的鉴定为希木龙念珠菌和黏红酵母菌。印度的一项综合研究经ITS测序证实，先前用VITEK系统鉴定为希木龙念珠菌或无名假丝酵母菌的102株菌株中有90株应为耳念珠菌，错误鉴定的比例高达88.2％。

目前，基于内转录间隔区(internal transcribed spacer，ITS)或D1/D2区域的rDNA测序和基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术(MALDI-TOF MS)可以准确的鉴定耳念珠菌。Kordalewska等，已开发了用于检测耳念珠菌的PCR检测和实时定量PCR检测方法，可通过溶解曲线的不同将耳念珠菌与希木龙念珠菌、葡萄牙念珠菌和Candidaduobushaemulonii区分开来。MALDI-TOF质谱方法仅在数据库中包含耳念珠菌数据时可起到鉴定作用，如Bruker公司的MALDI-TOF系统配合CA system数据库或VITEK MS RUO数据库可精确鉴定耳念珠菌。日本帝京大学已针对耳念珠菌建立了LAMP的检测方法，利用实时扩增浊度仪在恒温条件下约1小时完成检测，特异度可达到100％。但上述三种方法均需要配合相应的仪器使用，高昂的仪器价格限制了其在临床中的应用。

等温核酸扩增技术是近年来新发展起来的一类分子生物学技术的总称。其可在特定温度下扩增特定的DNA或RNA。无论是在实际操作还是仪器要求方面，都比PCR技术更为简单方便，它摆脱了对精良设备的依赖，反应时间大大缩短，在临床和现场快速诊断中显示了其良好的应用前景。目前已开发出了多种等温扩增方法，如环介导等温扩增技术(LAMP)、依赖核酸序列型扩增技术(NASBA)、链置换扩增技术(SDA)、滚环扩增技术(RCA)、单引物等温扩增(SPIA)、交叉引物等温扩增技术(CPA)、新型等温多自配引发扩增技术(IMSA)、解旋酶依赖性扩增(HAD)等。

重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification，RPA)是由英国TwistDx Inc公司于2006年开发的，目前全球最新的等温扩增检测技术，其被称为是可以替代PCR的核酸检测技术。以此为基础的

核酸扩增产品，能够在20分钟内进行常温下的单分子核酸检测。其不依赖于昂贵的实验室设备和专业操作人员，对于在经济卫生条件不发达的地区以及疾病爆发现场开展耳念珠菌的监测和鉴定工作具有重要的意义和良好的应用前景。目前，RPA检测技术已在检测细菌、病毒、真菌和寄生虫中得到广泛应用，也可用于资源贫乏的地区HIV诊断。RPA技术主要依赖于三种酶：能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶。这三种酶的混合物在常温下也有活性，最佳反应温度在37℃左右。目前，RPA技术扩增产物检测方法主要为以下三种：琼脂糖凝胶电泳检测法、实时荧光定量检测法和侧流层析试纸条检测法。英国TwistDxInc公司根据以上三种检测方法开发了多款商业RPA检测试剂盒，包括：Twist

Basickit、Twist

Basic RT kit、Twist

exo kit、Twist

exo RT kit、Twist

fpgkit、Twist

nfo kit。

发明内容

本发明目的之一涉及用于检测耳念珠菌的RPA引物组。

本发明人对耳念珠菌(GenBank accession no.MH071441.1)、白色念珠菌(GenBank accession no.L28817.1)、热带念珠菌(GenBank accession no.EF568042.2)、光滑念珠菌(GenBank accession no.EF568002.1)、近平滑念珠菌(GenBank accessionno.EF568035.1)和克柔念珠菌(GenBank accession no.EF568018.1)的5.8S，ITS2区域基因序列作为靶序列进行比对，设计耳念珠菌特引物，可对耳念珠菌进行鉴别。

实现本发明的第一目的技术方案之一如下：用于检测耳念珠菌的RPA引物组，引物长度为30bp，其氨基酸序列为：

DF1:5’-GTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTG-3’

DR1:5’-TAAGTTCAGCGGGTAGTCCTACCTGATTTG-3’。

以上RPA引物组经验证，其虽然对近平滑念珠菌、热带念珠菌、白色念珠菌、克柔念珠菌和光滑念珠菌同时具有作用，但是在特定的浓度的念珠菌混合感染的样品中，仍能有效检测是否存在耳念珠菌。耳念珠菌、近平滑念珠菌、光滑念珠菌的条带大小分别为195bp，237bp，270bp，可明显区分，即根据扩增产物片段大小的不同，通过琼脂糖凝胶电泳可以实现白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌和克柔念珠菌与耳念珠菌的初步鉴别诊断，且试验证明，该RPA引物组可以在白色念珠菌与耳念珠菌菌量比为5:1、1:1及1:5的情况下产生两种易于区分的条带。因此，在实际应用中，该RPA引物组可作为常见念珠菌属通用引物，用于耳念珠菌的初步排查。

实现本发明的第一目的的技术方案之二如下：用于检测耳念珠菌的RPA引物组，引物长度为30bp，其氨基酸序列为：

F2:5’-GACTTGCAGACGTGAATCATCGAATCTTTG-3’

R2:5’-GTAGTCCTACCTGATTTGAGGCGACAACAA-3’。

经发明人试验验证，上述RPA引物组对耳念珠菌特异性较强，为耳念珠菌的特异性RPA引物，在65株真菌和细菌的菌株中，可以100％地检测出耳念珠菌菌株，特异度为100％。可以在都其检测的敏感度与PCR检测相同，最低限均为10³拷贝/反应，可以在不同浓度的念珠菌混合感染的样品中，能够鉴定出是否存在耳念珠菌。

本发明目的之二涉及RPA引物组的应用。

方案之一为，所述的RPA引物组作为耳念珠菌的检测试剂的应用，RPA引物组为：

正向引物DF1:5’-GTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTG-3’

反向引物DR1:5’-TAAGTTCAGCGGGTAGTCCTACCTGATTTG-3’。

方案之二为，所述的RPA引物组作为耳念珠菌的检测试剂的应用，RPA引物组为：

正向引物F2:5’-GACTTGCAGACGTGAATCATCGAATCTTTG-3’

反向引物R2:5’-GTAGTCCTACCTGATTTGAGGCGACAACAA-3’。

本发明目的之三涉及用于检测耳念珠菌的RPA试剂盒。

具体地，用于检测耳念珠菌的RPA试剂盒，包含RPA引物组，具体如下：

正向引物F2:5’-GACTTGCAGACGTGAATCATCGAATCTTTG-3’

反向引物R2:5’-GTAGTCCTACCTGATTTGAGGCGACAACAA-3’。

进一步地，所述的RPA试剂盒，还包含通用RPA引物组，该通用RPA引物组为：

正向引物DF1:5’-GTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTG-3’

反向引物DR1:5’-TAAGTTCAGCGGGTAGTCCTACCTGATTTG-3’。

进一步地，所述的RPA试剂盒，还包含重泡胀缓冲液(Rehydration Buffer)、耳念珠菌DNA模板、双蒸水和醋酸镁。

本发明目的之四涉及耳念珠菌的RPA的快速检测方法。

本发明目的之四通过以下技术方案来实现：耳念珠菌的RPA的快速检测方法，包括如下步骤：

(1)构建RPA反应体系：RPA反应体系共50μl，RPA引物组的正向引物F2 2.4μl、RPA引物组的反向引物R2 2.4μl、重泡胀缓冲液29.5μl、耳念珠菌DNA模板和双蒸水共13.2μl，配制完成后混匀离心；

(2)RPA反应：将2.5μl醋酸镁加入反应管的盖子上，后通过离心的方式将其加入到RPA反应体系中催化反应的发生，然后将反应管于37℃恒温培养箱中先放置4分钟，后混匀，再继续放置20分钟，得到RPA产物；

(3)取RPA产物与上样缓冲液(Loading Buffer)混匀后经2％琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后用凝胶成像系统观察结果。

所述步骤(1)中耳念珠菌DNA模板的含量为3-4μl，能在琼脂糖凝胶电泳中得到更加清晰的条带。

本发明上述检测方法可用于检测包括动物体、环境、食物等是否存在耳念珠菌。

相比现有技术，本发明具有如下有益效果：

1.本发明提供的耳念珠菌RPA引物能够有效地鉴定出耳念珠菌的存在2.。本发明提供的检测方法中所使用的琼脂糖凝胶电泳法属于RPA的基础反应体系，其引物不需要修饰，也不需要添加探针，仅需要恒温箱或水浴锅即可完成反应。

2.本发明提供的检测方法可以在2.5小时内检测出血液中的耳念珠菌，其检测下限为1.02×10³CFU/ml，优于PCR检测技术(1.02×10⁴CFU/ml)。。

3.本发明提供的高效、特异和可靠的RPA检测方法，可用于耳念珠菌的分子诊断和鉴别诊断，并能在2.5小时之内直接检测血液样本中的耳念珠菌，不依赖于昂贵的仪器，对于采取措施控制耳念珠菌的院内传播至关重要。

附图说明

图1耳念珠菌特异性RPA检测下限琼脂糖凝胶电泳结果。M：DL500 DNA Marker；NTC：双蒸水(ddH₂O)阴性对照。

图2PCR检测下限琼脂糖凝胶电泳结果。M：DL500 DNA Marker；NTC：双蒸水(ddH₂O)阴性对照。

图3耳念珠菌与临床常见念珠菌鉴别RPA检测琼脂糖凝胶电泳结果。M：DL500Marker。泳道1-6分别为：耳念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌、白色念珠菌、克柔念珠菌和光滑念珠菌。NTC：双蒸水(ddH2O)阴性对照。

图4RPA(左)和PCR(右)快速检测全血中不同浓度的耳念珠菌。M：DL500DNAMarker，泳道1-6：全血中念珠菌浓度梯度(1.02×10⁷-1.02×10²CFU/mL)，NTC：双蒸水(ddH₂O)阴性对照。

图5用念珠菌通用鉴别引物(左)和耳念珠菌特异性引物(右)分别进行RPA检测结果。M：DL500 DNA Marker；泳道1-5：混合菌液中耳念珠菌与白色念珠菌含量比例分别为5:1、1:1、1:5、1:8、1:10；NTC：双蒸水(ddH₂O)阴性对照。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细说明。本实施案例在以本发明技术为前提下进行实施，现给出详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于以下的实施例。

1.1 材料与方法

1.1.1 菌株来源

本实验所用标准菌株购买自荷兰CBS、美国ATCC和广东省微生物菌种保藏管理中心，所用临床菌株来自于南方医科大学附属第三医院。3株耳念珠菌中，一株于2012年分离于印度一名男性患者(CBS12766)，另两株于印度新德里医院患者血液中分离(INCa-1，INCa-2)。所有菌株经分子生物学方法鉴定后确认菌种。所用具体菌株如表1-1所示。

表1-1：

1.1.2 主要仪器

生物安全柜(Thermo公司，美国)

台式小型高速离心机(Thermo公司，美国)

漩涡振荡器(方通达公司，中国北京)

PCR扩增仪(Bio-Rad公司，美国)

水平式核酸电泳仪(上海精益玻璃仪器厂)

Gel Doc 1000紫外凝胶成像仪(宾达英创有限公司，中国北京)

37℃恒温培养箱(SHEL-LAB)

超微量分光光度计(JENWAY公司，英国)

电热恒温水槽(天根公司，中国北京)

-80°冰箱((Eppendorf，德国)

微量加样器(Thermo公司，美国)

灭菌高压锅(Sanyo公司,日本)

微波炉(Panasonic公司，日本)

标准型圆周摇床(SCILOGEX公司，美国)

1.1.3 主要实验试剂

沙保氏葡萄糖琼脂(OXOID，英国)

DNA抽提试剂＝25:24:1(PH>7.8)(索莱宝，中国)

真菌基因组DNA提取试剂盒(美伦，中国)

TwistAmp Basic Kit(TwistDx Inc公司，英国)

念珠菌显色培养基(Chromagar公司，法国)

Green Master Mix(Promega，美国)

Ex Taq(Mix)(宝生物工程生物有限公司，大连)

DNA电泳Marker(宝生物工程生物有限公司，大连)

6X loading buffer(宝生物工程生物有限公司，大连)

50X TAE缓冲液(生物生工股份有限公司，上海)

核酸染料(天根生化科技有限公司，北京)

琼脂糖(宝生物工程有限公司，中国)

1.1.4 生物信息软件

引物和探针设计：Primer Express、Primer Premier

序列比对、拼接处理软件：MEGA7.0、BoEidt软件

核苷酸与氨基酸对比工具：美国生物技术信息中心在线工具。

1.2 方法

1.2.1 菌株复苏

将保存于30％甘油肉汤的所用菌株从-80℃冰箱取出，待解冻后振荡混匀，取200ul菌悬浊液接种到5mL LB肉汤，后置于37℃摇床(180r/min)增菌过夜；根据菌种不同，用接种环将真菌接种于SDA培养基，将细菌接种于血平板或营养平板，后置于37℃恒温培养箱中培养3天。

1.2.2 菌株DNA提取

使用美伦真菌基因组DNA试剂盒提取所有真菌基因组DNA，使用TIANamp细菌DNA试剂盒提取细菌基因组DNA。所有提取的DNA均用超微量分光光度计进行定量测量，并保存在-20℃冰箱中直至使用。提取基因组DNA具体步骤如下：

(1)取1-2ml培养好的菌液，离心收集，弃上清。加入200ul溶液A，加入20ul RNaseA，再加入100mg玻璃珠，在高速振荡器上振荡，约5-10min。

(2)加入20ul的蛋白酶K(10mg/ml)，充分混匀，55℃水浴消化30min，消化期间可颠倒离心管混匀数次。12000rpm离心2min。将上清转移到一个新的离心管中。如有沉淀，可再次离心。

(3)在上清中加入200ul溶液B，充分混匀。如出现白色沉淀，可放55℃水浴5min，沉淀即会消失。

(4)再加入200ul无水乙醇，充分混匀，此时可能会出现絮状沉淀，不影响DNA的提取，将溶液和絮状沉淀都加入吸附柱中，放置2分钟。

(5)12000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。

(6)向吸附柱中加入600ul漂洗液(使用前先检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。

(7)向吸附柱中加入600ul漂洗液，12000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。

(8)12000rpm离心2min，将吸附柱置于室温或50℃温箱放置数分钟。

(9)将吸附柱放入一个干净的离心管中，向吸附膜中央悬空滴加50-200ul经65℃水浴预热的洗脱液，室温放置5min，12000rpm离心1min。

(10)离心所得洗脱液再加入吸附柱中，室温放置2min，12000rpm离心2min。

(11)利用超微量分光光度计测量所提取DNA浓度和吸光值。按照浓度梯度将耳念珠菌标准株CBS12766的DNA按浓度分别稀释到10⁰-10⁶拷贝/反应，并于负80℃冰箱保存。

1.2.3 RPA检测方法建立

(1)PCR扩增

利用念珠菌通用引物ITS1和ITS4对分离出的DNA进行PCR扩增

ITS-1 5’-TCCGTAGGTGAACCTTGCGG-3’

ITS-4 5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’

PCR反应体系和反应条件如下：

扩增条件：95℃预变性3min；95℃1min，54℃30s，72℃1min，35个循环；充分延伸72℃10min。

取7μl PCR产物经2％琼脂糖凝胶电泳，以DL500 Marker作参照，120V电压下电泳30分钟，电泳结束后用凝胶成像系统观察结果。

(2)RPA扩增

1)引物设计

以耳念珠菌(GenBank accession no.MH071441.1)、白色念珠菌(GenBankaccession no.L28817.1)、热带念珠菌(GenBank accession no.EF568042.2)、光滑念珠菌(GenBank accession no.EF568002.1)、近平滑念珠菌(GenBank accessionno.EF568035.1)和克柔念珠菌(GenBank accession no.EF568018.1)的5.8S，ITS2区域基因序列作为靶序列来设计耳念珠菌特异性引物和常见念珠菌属通用引物。参考Twist

Basic试剂盒产品说明书要求，通过Premier 5软件设计了两对引物。并且使用NCBI上的BLAST工具(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)对所设计的引物进行特异性检验。所有的引物均上海美吉生物公司合成。

上述耳念珠菌特异性引物：

正向引物F2:5’-GACTTGCAGACGTGAATCATCGAATCTTTG-3’

反向引物R2:5’-GTAGTCCTACCTGATTTGAGGCGACAACAA-3’。

上述常见念珠菌属通用引物：

正向引物DF1:5’-GTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTG-3’

正向引物DR1:5’-TAAGTTCAGCGGGTAGTCCTACCTGATTTG-3’。

2)RPA反应体系和反应步骤

RPA反应体系共50μl，其中包括正向引物F2(10μM)2.4μl、反向引物R2(10μM)2.4μl、Rehydration Buffer 29.5μl、DNA模板和双蒸水共13.2μl，将以上共计47.5μl体系配制完成后混匀离心，将2.5μl醋酸镁加入反应管的盖子上，后通过离心的方式将其加入到体系中催化反应的发生。将反应管于37℃恒温培养箱中先放置4分钟，后倒置8次混匀，再继续放置20分钟。

取6μl RPA产物与1μl 6×上样缓冲液(Loading Buffer)混匀后经2％琼脂糖凝胶电泳，以DL500 Marker作参照，120V电压下电泳30分钟，电泳结束后用凝胶成像系统观察结果。

1.2.4 RPA技术检测耳念珠菌检测下限评价

用RPA方法和PCR方法分别检测连续10倍稀释的耳念珠菌(CBS12766)的DNA，DNA浓度范围为10⁰-10⁶拷贝/反应。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察两种检测方法产生阳性条带对应的最低DNA浓度。用双蒸水(ddH₂O)作为阴性对照。每个稀释梯度每种检测方法重复独立实验3次。

1.2.5 RPA技术检测耳念珠菌特异度评价

共计采用65株菌株进行耳念珠菌特异性RPA检测方法的特异度评价，其中包括3株耳念珠菌，58株临床常见真菌分离株和4株常见院内感染细菌分离株，具体菌株种类及数量见表1-1。

1.2.6 应用初步评价

(1)血液中掺入不同浓度耳念珠菌

用接种环挑取平板上的耳念珠菌(CBS12766)于1mL PBS中配制菌悬浊液，并按10倍稀释法连续稀释6个浓度梯度。将每个浓度梯度的菌液分别取6μl掺入到肝素钠采血管194μl全血中。同时，取10μl每个浓度梯度的菌液均匀的接种于SDA平板上，并置于37℃恒温培养箱培养。

(2)直接检测血液中耳念珠菌

从掺入了耳念珠菌的全血中直接提取DNA进行RPA检测，初步评价其在快速检测方面的应用。具体步骤如下：

1)按1:3的比例向样本中加入红细胞裂解缓冲液(RCLB)(10mM Tris[pH＝7.6]，5mM MgCl₂，10mM NaCl)600μl，于37℃低渗裂解10分钟；

2)5000g离心10分钟后弃掉上清液，加入300μl PBS缓冲液；

3)加入玻璃珠100mg，在高速振荡器上振荡3分钟；

4)加入180U裂解酶后于37℃恒温培养箱中静置30分钟；

5)取200μl上清液转移至另一无菌EP管中，按照QIAamp血液DNA提取试剂盒说明书提取耳念珠菌DNA，具体步骤如下：

6)吸取20μl QIAGEN蛋白酶(或者蛋白酶K)至1.5ml离心管的底部，后加入已提取的上清液200μl；

7)加入200μl Buffer AL至样品中，涡旋振荡15s混匀；

8)56℃孵育10分钟；

9)加入200μl的乙醇(96-100％)，涡旋振荡15s混匀；

10)将步骤9得到的混合物转移至QIAamp Mini离心管柱，8000rpm离心1分钟，弃滤液；

11)打开QIAamp Mini离心柱，加入500μl Buffer AW1，8000rpm离心1分钟，弃滤液；

12)打开QIAamp Mini离心柱，加入500μl Buffer AW2，14000rpm离心3分钟，弃滤液；

13)将QIAamp Mini离心柱转移到一个新的1.5ml收集管，打开离心柱，加入200μlBuffer AE或双蒸水，8000rpm离心1分钟，所得到的洗脱液即含有耳念珠菌DNA；

14)将2μl所得溶液作为待检测DNA加入到RPA体系中，具体反应步骤如1.2.3所述。

(3)模拟血液中的混合感染

念珠菌的混合感染以白色念珠菌为主，并且可能会影响分子检测方法的特异性和敏感性。用接种环挑取耳念珠菌(CBS12766)和白色念珠菌(ATCC14053)至PBS缓冲液中，并在超微量分光光度计上调整至0.5麦氏浊度，分别按5:1、1:1、1:5、1:8、1:10的比例加入到5支无菌EP管中。从中每个EP管中吸取10μl混合菌液分别掺入到5支装有190ul的新鲜人全血中。然后立即按上述步骤提取全血中念珠菌DNA，并使用耳念珠菌特异性引物和念珠菌通用引物进行RPA反应，以评价其在检测混合念珠菌感染时的应用。

1.3 结果

1.3.1 耳念珠菌特异性RPA特异度和检测下限

根据琼脂糖凝胶电泳的扩增条带情况，耳念珠菌特异性引物对正向引物F2:5’-GACTTGCAGACGTGAATCATCGAATCTTTG-3’、反向引物R2:5’-GTAGTCCTACCTGATTTGAGGCGACAACAA-3’，引物长度为30bp，产物长度为195bp。检测结果表明，在特异性评价中，只有3株耳念珠菌样本可以在琼脂糖凝胶电泳中产生特异性扩增条带，而其他62株真菌和常见院内感染细菌样本均未产生扩增条带，特异度为100％(表1-2)。

将耳念珠菌标准品DNA进行10倍连续稀释(对应10⁰至10⁶拷贝/反应)。RPA及PCR敏感性实验琼脂糖凝胶电泳结果显示，在耳念珠菌DNA 7个稀释浓度扩增中，RPA和PCR均只在前四个稀释浓度(即10⁶至10³拷贝/反应)的扩增中显示有特异性扩增条带，检测结果表明RPA和PCR具有相同的检测下限，在用琼脂糖凝胶电泳作为检测平台时，两者的最低检测限度均为10³拷贝/反应。该实验独立重复3次，结果稳定。

表1-2耳念珠菌特异性RPA特异度检测结果

1.3.2 耳念珠菌与常见念珠菌属通用引物RPA检测

本发明提供的耳念珠菌与其他念珠菌通用鉴别引物，RPA扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果如图3所示，从左到右分别为耳念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌、白色念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌和阴性对照。引物长度为30bp，各念珠菌扩增产物大小如表2所示，扩增产物大小符合设计引物时比对的结果，可以清晰的分辨出条带的高度不同。本发明选取六种念珠菌标准株进行(表1-3)检测。

表1-3耳念珠菌与临床常见念珠菌鉴别引物及扩增产物长度

1.3.3 应用初步评价

本实验将不同浓度的耳念珠菌掺入健康人血，并用RPA快速检测方法和PCR方法测定检出病原微生物的能力。平板计数结果表明，掺入血液中的耳念珠菌浓度梯度为3.4×10⁷-3.4×10²CFU/ml，即表明各个血液样本耳念珠菌浓度为1.02×10⁷-1.02×10²CFU/ml。RPA和PCR反应检测的下限分别为1.02×10³CFU/ml和1.02×10⁴CFU/ml(图4)。

在模拟耳念珠菌与白色念珠菌混合感染的实验中，RPA结果表明，通用型引物可以在白色念珠菌与耳念珠菌菌量比(5:1，1:1，1:5)的情况下产生两种易于区分的条带，1:8和1:10的情况下只能观察到白色念珠菌的条带(图5)。耳念珠菌特异性引物可以在白色念珠菌与耳念珠菌菌量比(5:1，1:1，1:5，1:8)的情况下均可以鉴定出耳念珠菌的存在。

本发明可用其他的不违背本发明的精神或主要特征的具体形式来概述。本发明的上述实施例都只能认为是对本发明的说明而不是限制。如可采用上述实施例的引物组和检测方法对水体、食品等进行检测，以判断是否存在耳念珠菌。因此凡是依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何细微修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。

序列表

<110> 南方医科大学珠江医院

<120> 用于检测耳念珠菌的RPA引物组、试剂盒及快速检测方法

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gtgaatcatc gaatctttga acgcacattg 30

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

taagttcagc gggtagtcct acctgatttg 30

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gacttgcaga cgtgaatcat cgaatctttg 30

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gtagtcctac ctgatttgag gcgacaacaa 30

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tccgtaggtg aaccttgcgg 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tcctccgctt attgatatgc 20

Claims

1.用于检测耳念珠菌的RPA引物组，引物长度为30bp，其氨基酸序列为：

DF1:5’-GTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTG-3’

DR1:5’-TAAGTTCAGCGGGTAGTCCTACCTGATTTG-3’。

2.权利要求1所述的RPA引物组作为耳念珠菌的检测试剂的应用。

3.用于检测耳念珠菌的RPA引物组，引物长度为30bp，其氨基酸序列为：

F2:5’-GACTTGCAGACGTGAATCATCGAATCTTTG-3’

R2:5’-GTAGTCCTACCTGATTTGAGGCGACAACAA-3’。

4.权利要求3所述的RPA引物组作为耳念珠菌的检测试剂的应用。

5.用于检测耳念珠菌的RPA试剂盒，其特征是，包含权利要求3所述RPA引物组。

6.根据权利要求5所述用于检测耳念珠菌的RPA试剂盒，其特征是，还包含权利要求1所述的RPA引物组。

7.根据权利要求5或6所述用于检测耳念珠菌的RPA试剂盒，其特征是，还包含重泡胀缓冲液(Rehydration Buffer)、耳念珠菌DNA模板、双蒸水和醋酸镁。

8.应用权利要求1或3的RPA引物组的耳念珠菌的RPA的快速检测方法，其特征是，包括如下步骤：

(1)构建RPA反应体系：RPA反应体系共50μl，RPA引物组的正向引物2.4μl、RPA引物组的反向引物2.4μl、重泡胀缓冲液29.5μl、耳念珠菌DNA模板和双蒸水共13.2μl，配制完成后混匀离心；

(3)取RPA产物与上样缓冲液混匀后经2％琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后用凝胶成像系统观察结果。

9.根据权利要求8所述的RPA的快速检测方法，其特征是，所述步骤(1)中耳念珠菌DNA模板的含量为3-4μl。