WO2006123423A1 - フザリウム属菌検出用プライマー - Google Patents

フザリウム属菌検出用プライマー Download PDF

Info

Publication number
WO2006123423A1
WO2006123423A1 PCT/JP2005/009273 JP2005009273W WO2006123423A1 WO 2006123423 A1 WO2006123423 A1 WO 2006123423A1 JP 2005009273 W JP2005009273 W JP 2005009273W WO 2006123423 A1 WO2006123423 A1 WO 2006123423A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
fusarium
primer
gene
segment
group
Prior art date
Application number
PCT/JP2005/009273
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Yasukazu Nakakita
Ryouichi Kanatani
Takehiro Hoki
Original Assignee
Sapporo Breweries Limited
Eiken Kagaku Kabushiki Kaisha
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sapporo Breweries Limited, Eiken Kagaku Kabushiki Kaisha filed Critical Sapporo Breweries Limited
Priority to PCT/JP2005/009273 priority Critical patent/WO2006123423A1/ja
Publication of WO2006123423A1 publication Critical patent/WO2006123423A1/ja

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays

Definitions

  • Non-Patent Document 5 Int. J. Food Microbiol, 71, 53-61, 2001
  • the object of the present invention is to solve the above-mentioned problems and to easily determine the presence or absence of a specific Fusarium genus in the cereal at each stage of cultivation, such as 'harvesting' and storage.
  • Method for detecting Minnealum group bacteria is performed using Method for detecting Minnealum group bacteria.
  • the "specimen” used in the present specification may contain a specific Fusarium genus and is a sample to be subjected to the detection and identification method of the present invention, but is not particularly limited.
  • Examples include grains at each stage of cultivation, such as during harvesting and storage.
  • “identification” refers to a specific Fusarium genus such as Fusarium 'Daraminearum group fungus or Trichothecene-based vivitoxin producing Fusarium spp. Although it may specifically refer to the detection of bacteria and other Fusarium species, it generally refers to identifying a specific Fusarium genus that is the target of detection among multiple species.
  • determination refers to determining whether or not a detected bacterium is a specific Fusarium genus, and is sometimes used synonymously with detection.
  • the simple detection of the former includes 1) visual confirmation by the cloudiness of the amplification reaction solution (International Patent Publication WO01Z83817 pamphlet) and 2) visual confirmation of the fluorescent intercalator. V and deviation can also be visually confirmed for the presence of amplification products (presence of target gene).
  • the released pyrophosphate forms magnesium pyrophosphate with magnesium ions present in the reaction solution.
  • the reaction solution becomes cloudy only when amplification occurs. By observing the white turbidity, the presence or absence of an amplification product was determined. For some strains, 1 ⁇ L of the reaction solution was electrophoresed on a polyacrylamide gel. After staining with ethidium bromide solution for 10 minutes, the UV band was irradiated and the DNA band was observed and confirmed (results are shown in Fig. 1).
  • Table 1 summarizes the amplification results for each primer set. [0033] [Table 1]
  • NBRC Biological Resource Center, Biotechnology Center, National Institute of Technology and Evaluation, Tsukuba, Japan
  • Red mold was detected in 10 out of 16 samples by the LAMP method. DON was detected in 8 of the 10 samples. On the other hand, DON was not detected in 6 samples in which red mold was not detected by the LAMP method (detection limit (50 ppb) or less). In addition, the sample in which red mold was not detected by the LAMP method and the sample in which DON was detected was strong.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

　配列番号２４に示す塩基配列の一部又はその相補鎖から選択される標的領域の塩基配列を増幅し、 （ａ）第１のセグメントとして、フザリウム・グラミネアラムグループ菌のｒＲＮＡ遺伝子にアニールしてプライマーとして機能する塩基配列と、 （ｂ）第２のセグメントとして、第１のセグメントの３’側の塩基配列に相補的であり、第１のセグメントの５’側に位置する塩基配列と を含むことを特徴とする、プライマー。

Description

明 細 書
フザリウム属菌検出用プライマー 技術分野
[0001] 本発明は、特定のフザリウム（Fusarium)属菌の rRNA遺伝子又はトランスレーショ ン ·ェロンゲーシヨン.ファクター 1アルファ一遺伝子、もしくはフザリウム属菌のトリコテ セン生合成遺伝子 tri5に特異的なプライマーに関する。さらに詳しくは、本発明は、 フザリウム 'グラミネアラムグループ菌の rRNA遺伝子又はトランスレーション 'エロン ゲーシヨン'ファクター 1アルファ一遺伝子、もしくはフザリウム属菌のトリコテセン生合 成遺伝子 tri5の特定領域を増幅可能な特定のフザリウム菌検出用プライマー又はプ ライマーセットに関する。さらに、本発明は、前記菌検出用プライマー又はプライマー セットを等温遺伝子増幅法 (以下、「LAMP法」という。）に使用する、フザリウム'ダラ ミネアラムグループ菌又はトリコテセン系力ビ毒産生フザリウム属菌の検出.菌株の識 別方法にも関する。
背景技術
[0002] フザリウム属菌に属するフザリウム.ダラミネアラム（Fusarium graminearum：完全世 代名 uibberella zeae)、フザリウム ·セレ リス (Fusarium cerealis：另 U名 Fusarium crookwellense)、フザリウム'クノレモラム (Fusarium culmorunuなどは、ムギ類、トウモロ コシなどの穀物の赤カビ病原菌として知られている植物病原菌である（以下、「フザリ ゥム'ダラミネアラムグループ菌」という。 ) oムギ類、トウモロコシなどの穀物の赤カビ病 は単に穀物の収量を低下させるば力りでなぐデォキシュバレノール（DON)などの マイコトキシンを などで生産 '分泌される。このため、感染穀物を原料にした各種製 品を食すと中毒症状を引き起こすことがあることから、赤カビ汚染が問題視されている
[0003] コムギ赤カビ病などは、発病して力 では効果的な防除方法がないために、発病前 に農薬の予防散布を行ったりする。このため、発病前の段階で、発生をある程度予測 するための方法の開発が試みられている (非特許文献 1)。しかし、非特許文献 1に開 示されている胞子量調査は、調査期間中のスライドグラスの設置 ·取替えや、顕微鏡 下での胞子数計測など、多大な時間と労力を必要とする。
[0004] また、穀粒力も病原菌を分離培養して力も判定する手法もあるが、これらの方法は、 判定までに長時間が必要であり、専門的な知識も必要である。さらに、目的とした病 原菌を検出，同定しょうとする抗原抗体反応を応用した免疫化学的手法 (特許文献 1
)もある力 反応の特異性そのものに限界があるという欠点がある。
[0005] そこで、遺伝子解析的手法を用いた菌の識別法が提案されてきた。主に、 PCR法 を用いた方法 (特許文献 2及び非特許文献 2— 6)が提案されているが、高価な機器 を必要とし、また、煩雑な操作を伴うため、農業現場において使用するには問題があ る。
[0006] 特許文献 1 :特開平 6— 148194号公報
特許文献 2：特開平 10— 234380号公報
非特許文献 1 :防菌防黴， 30(6), 341-345, 2002
非特許文献 2 : EBC Congress 1999, 541-549
非特許文献 3 : Adv. Food Sci., 22(1/2), 38-46, 2000
非特許文献 4 :Appl. Environ. Microbiol, 67(7), 2966-2972, 2001
非特許文献 5 : Int. J. Food Microbiol, 71, 53-61, 2001
非特許文献 6 : J. Food Prot., 65(12), 1955-1961, 2002
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0007] 上記の問題点に鑑み、従来技術の手法とは別の観点から、簡便で、迅速な赤カビ 病菌 (特に、フザリウム'ダラミネアラムグループ菌）の検出および識別法の開発が望 まれている。したがって、本発明の目的は、前記の課題を解決し、栽培時 '収穫時' 保管時等の各段階における穀物中の特定のフザリウム属菌の有無について、簡便で
、迅速な検出'識別法を提供することである。
課題を解決するための手段
[0008] 本発明者らは、かかる課題を解決するべく検討を重ね、等温の遺伝子増幅反応で ある Loop— mediated isothermal amplification (LAMP)法（国際特許公開 WO00Z28 082号パンフレット）を利用することにより、特定のフザリウム属菌の検出、識別を簡便 、迅速に行い得ることを見出した。
[0009] すなわち、本発明は、特定のフザリウム属菌の rRNA遺伝子又はトランスレーション
.ェロンゲーシヨン.ファクター 1アルファ一遺伝子、及びトリコテセン生合成遺伝子 tri 5に特異的なプライマーを提供する。本発明は、また、フザリウム'ダラミネアラムダル 一プ菌の検出'識別方法、及びトリコテセン系力ビ毒産生フザリウム属菌の検出'識 別方法を提供する。本発明は、さらに、フザリウム'ダラミネアラムグループ菌の検出 用キット、及びトリコテセン系力ビ毒産生フザリウム属菌の検出用キットを提供する。
[0010] より特定的には、本発明は下記の（1)〜（13)を提供する。
(1)配列番号 24に示す塩基配列の一部又はその相補鎖力 選択される標的領域の 塩基配列を増幅し、（a)第 1のセグメントとして、フザリウム 'ダラミネアラムグループ菌 の rRNA遺伝子にァニールしてプライマーとして機能する塩基配列と、 (b)第 2のセ グメントとして、第 1のセグメントの 3，側の塩基配列に相補的であり、第 1のセグメント の 5'側に位置する塩基配列とを含むことを特徴とする、プライマー。
(2)配列番号 25に示す塩基配列の一部又はその相補鎖力 選択される標的領域の 塩基配列を増幅し、（a)第 1のセグメントとして、フザリウム 'ダラミネアラムグループ菌 のトランスレーション ·ェロンゲーシヨン'ファクター 1アルファ一遺伝子にァニールして プライマーとして機能する塩基配列と、（b)第 2のセグメントとして、第 1のセグメントの 3，側の核酸配列に相補的であり、第 1のセグメントの 5 '側に位置する塩基配列とを 含むことを特徴とする、プライマー。
(3)配列番号 26に示す塩基配列の一部またはその相補鎖力 選択される標的領域 の塩基配列を増幅し、（a)第 1のセグメントとして、トリコテセン系力ビ毒産生フザリウム 属菌のトリコテセン生合成遺伝子 tri5にァニールしてプライマーとして機能する塩基 配列と、（b)第 2のセグメントとして、第 1のセグメントの 3，側の核酸配列に相補的であ り、第 1のセグメントの 5'側に位置する塩基配列とを含むことを特徴とする、プライマ
(4)配列番号 1〜6で表される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドセットからなり、フザ リウム ·ダラミネアラムグループ菌の rRNA遺伝子の特定領域を増幅可能なフザリウム 'ダラミネアラムグループ菌検出用プライマーセット。 (5)配列番号 7〜 12で表される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドセットからなり、フ ザリウム ·グラミネアラムグノレープ菌のトランスレーション'ェロンゲーシヨン'ファクター 1アルファ一遺伝子の特定領域を増幅可能なフザリウム ·ダラミネアラムグループ菌検 出用プライマーセット。
(6)配列番号 13〜18又は配列番号 19〜23で表される塩基配列を含むオリゴヌタレ ォチドセットからなり、トリコテセン生合成遺伝子 tri5の特定領域を増幅可能なトリコテ セン系力ビ毒産生フザリウム属菌検出用プライマーセット。
(7)検体中に存在するフザリウム ·ダラミネアラムグループ菌の検出方法であって、フ ザリウム'ダラミネアラムグループ菌の rRNA遺伝子の特定領域を標的とし、（4)に記 載のプライマーセットで該 rRNA遺伝子の特定領域を選択的に、 LAMP法により増 幅させ、該増幅産物の有無を確認することを特徴とする、フザリウム'ダラミネアラムダ ループ菌の検出方法。
(8)検体中に存在するフザリウム ·ダラミネアラムグループ菌の検出方法であって、フ ザリウム ·グラミネアラムグノレープ菌のトランスレーション'ェロンゲーシヨン'ファクター 1アルファ一遺伝子の特定領域を標的とし、 (5)に記載のプライマーセットで該トラン スレーシヨン'ェロンゲーシヨン'ファクター 1アルファ一遺伝子の特定領域を選択的に 、 LAMP法により増幅させ、該増幅産物の有無を確認することを特徴とする、フザリウ ム ·ダラミネアラムグループ菌の検出方法。
(9)検体中に存在するトリコテセン系力ビ毒産生フザリウム属菌の検出方法であって 、フザリウム属菌のトリコテセン生合成遺伝子 tri5の特定領域を標的とし、 (6)に記載 のプライマーセットで該トリコテセン生合成遺伝子 tri5の特定領域を選択的に、 LAM P法により増幅させ、該増幅産物の有無を確認することを特徴とする、トリコテセン系 力ビ毒産生フザリウム属菌の検出方法。
(10)検体を増菌培養し、出現菌から DNA試料を分離し、該 DNA試料に対して、（4 )に記載のプライマーセットを用いて、 LAMP法により増幅反応を行い、フザリウム 'グ ラミネアラムグループ菌の rRNA遺伝子の特定領域を増幅させ、この増幅産物の有 無を確認することを特徴とする、フザリウム'ダラミネアラムグループ菌の識別方法。
(11)検体を増菌培養し、出現菌から DNA試料を分離し、該 DNA試料に対して、 (5 )に記載のプライマーセットを用いて、 LAMP法により増幅反応を行い、フザリウム 'グ ラミネアラムグループ菌のトランスレーション.ェロンゲーシヨン.ファクター 1アルファ一 遺伝子の特定領域を増幅させ、この増幅産物の有無を確認することを特徴とする、フ ザリゥム ·ダラミネアラムグループ菌の識別方法。
(12)検体を増菌培養し、出現菌から DNA試料を分離し、該 DNA試料に対して、 (6 )に記載のプライマーセットを用いて、 LAMP法により増幅反応を行い、トリコテセン 系力ビ毒産生フザリウム属菌のトリコテセン生合成遺伝子 tri5の特定領域を増幅させ 、この増幅産物の有無を確認することを特徴とする、トリコテセン系力ビ毒産生フザリ ゥム属菌の識別方法。
(13) (1)〜（6)のいずれか 1つに記載のプライマー又はプライマーセット、鎖置換型 DNAポリメラーゼ、 dNTPs、反応緩衝液を少なくとも含むことを特徴とする、フザリウ ム'ダラミネアラムグループ菌又はトリコテセン系力ビ毒産生フザリウム属菌検出用キッ
[0011] 上記の（1)〜（6)の所定のプライマー又はプライマーセットを LAMP法に使用する と、フザリウム ·グラミネアラムグループ菌の rRNA遺伝子又はトランスレーション'エロ ンゲーシヨン'ファクター 1アルファ一遺伝子、もしくはトリコテセン系力ビ毒産生フザリ ゥム属菌のトリコテセン生合成遺伝子 tri5の特定領域にァニールする。これを LAMP 法で定める増幅条件の下で増幅すると、特定の遺伝子領域が増幅される。このような 増幅産物の有無を、電気泳動法又は簡易検出法によって確認する。このようにして、 特定のフザリウム属菌を検出することができる。
[0012] また、本発明の検出方法を特定の検体 (例えば、穀物）に適用するとき、検体から 採取した雑菌を培養して DNA試料を分離し、この DNA試料に上記の（1)〜（6)の 所定のプライマー又はプライマーセットを作用させ、同様に増幅された DNA増幅産 物の有無を確認する。このようにして、フザリウム'ダラミネアラムグループ菌又はトリコ テセン系力ビ毒産生フザリウム属菌を検出することができる。
発明の効果
[0013] 本発明は、配列番号 1〜6、 7〜12、 13〜18又は 19〜23で表される塩基配列を 含むオリゴヌクレオチドセットからなるプライマーセットを LAMP法に使用して、特定 のフザリウム属菌の rRN A遺伝子又はトランスレーション'ェロンゲーシヨン'ファクター 1アルファ一遺伝子、もしくはトリコテセン生合成遺伝子 tri5の特定領域を増幅して、 特定のフザリウム属菌の検出を可能にする。
[0014] また、本発明による特定のフザリウム属菌の検出方法は、配列番号 1〜6、 7〜12、 13〜18、または 19〜23で表される核酸配列力もなるオリゴヌクレオチドセットからな るプライマーセットを用いて、検体カゝら得られた DNA試料に LAMP法 (等温遺伝子 増幅）を施し、増幅産物の有無を確認することからなるので、特定のフザリウム属菌の 検出'識別を簡易、迅速かつ確実に行わしめる。
図面の簡単な説明
[0015] [図 1]ITSプライマーセットを用いて LAMP法により遺伝子増幅を行った結果を示す 電気泳動図である。レーン l : Fusarium equseti NBRC30198、レーン 2 : Fusarium crookwellense NBRC32585、レーン 3 : Fusarium tricinctum NBRC33238、レーン 4 : Fusarium sporotoricnioides NBRC33237、レ ~~ン 5 : Fusarium solani JCM11488、レ ~~ ン 6 : Gibeberella zeae JCM9873,レーン M :マーカー。
発明を実施するための最良の形態
[0016] 以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。
[0017] 本発明は、栽培時 ·収穫時'保管時等の各段階における穀物中のフザリウム'グラミ ネアラムグループ菌又はトリコテセン系力ビ毒産生フザリウム属菌が存在するか否か を判定するために、前記菌に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いた LAMP 法による等温遺伝子増幅により、特定のフザリウム属菌の rRNA遺伝子又はトランス レーシヨン'ェロンゲーシヨン'ファクター 1アルファ一遺伝子、もしくはトリコテセン生合 成遺伝子 tri5の特定領域の増幅を行 ヽ、増幅産物の有無を確認することを基礎とし ている。
[0018] 本発明の検出'識別法には、サンプルとして、フザリウム属菌の検出でよく使用され る CZID (Czapek Iprodion Dicloran)寒天培地で出現した菌ゃ、穂、穀粒中などに存 在する菌を供することができる。
[0019] なお、本明細書で使用する「検体」とは、特定のフザリウム属菌を含む可能性があり 、本発明の検出'識別法の対象となるサンプルであるが、特に限定はない。例えば、 栽培時 '収穫時'保管時等の各段階における穀物等を挙げることができる。また、本 明細書で使用する「識別」とは、フザリウム属菌の 1種以上が存在する検体において、 フザリウム'ダラミネアラムグループ菌又はトリコテセン系力ビ毒産生フザリウム属菌な どの特定のフザリウム属菌とその他のフザリウム属菌を区別して、検出することを特に 指す場合もあるが、一般的には複数の菌種のなかで検出対象である特定のフザリウ ム属菌を識別することを指す。また、本明細書で使用する「判定」とは、検出した菌が 特定のフザリウム属菌である力否かを判定することを指し、検出と同義に使用されるこ とちある。
[0020] 本発明で使用される LAMP法は、 PCR法と異なり、増幅工程での温度調節（サイク ル)を不要とし、一種類の DNA合成酵素を用いて、一定温度 (等温)で増幅する遺 伝子増幅法である（国際特許公開 WO00Z28082号パンフレット、前掲)。
[0021] 本発明の該フザリウム属菌のターゲット遺伝子に特異的なプライマーは、その特定 領域を標的として、ループを形成する 2種類の内部プライマー (FIP、 BIP)と 2種類の 外部プライマー (F3、 B3)の計 4種類のセットとして、設計する。増幅する遺伝子の特 定領域は、 100〜500bp程度である。
[0022] ここで、内部プライマーは、標的領域の塩基配列を増幅し、（a)第 1のセグメントとし て、標的遺伝子にァニールしてプライマーとして機能する塩基配列と、（b)第 2のセグ メントとして、第 1のセグメントの 3，側の塩基配列に相補的であり、第 1のセグメントの 5 '側に位置する塩基配列と、を含むことを特徴とする。
[0023] また、増幅反応の起点となるダンベル構造の 5'末端側のループの 1本鎖部分に相 補的な配列を持つループプライマー（LoopB、 LoopF)を用いることにより、 DNA合 成の起点を増やすことが可能となる。このため、ループプライマーを利用すると、増幅 効率が上がり、増幅に要する時間を 1Z3〜1Z2に短縮することが可能である。そし て、外部プライマーは、標的領域 3'末端側にある塩基配列を認識し、かつ合成起点 を与える塩基配列を有する。
[0024] プライマーのオリゴヌクレオチドの核酸配列が決定されると、オリゴヌクレオチド自身 の合成は、公知の手段、例えば、パーキンエルマ一社製の自動 DNA合成装置を用 いて実施できる。 [0025] 本発明において、フザリウム'ダラミネアラムグループ菌又はトリコテセン系力ビ毒産 生フザリウム属菌に特異的なプライマーセットとして、例えば下記の 4組のプライマー セット [ITSプライマーセット（配列番号 1〜6)、 TEFプライマーセット（配列番号 7〜1 2)、 Tri5プライマーセット（配列番号 13〜18)、 nTri5プライマーセット（配列番号 19 〜23)という]を挙げることができる。ここで、フザリウム'ダラミネアラムグループ菌又は トリコテセン系力ビ毒産生フザリウム属菌に特異的なプライマーとは、その菌の rRNA 遺伝子、又はトランスレーション'ェロンゲーシヨン'ファクター 1アルファ一遺伝子、も しくはトリコテセン生合成遺伝子 tri5の特定領域を特異的に増幅可能なプライマーで ある。なお、 rRNA遺伝子、トランスレーション'ェロンゲーシヨン'ファクター 1アルファ 一遺伝子、及びトリコテセン生合成遺伝子 tri5の核酸配列（部分配列）を配列表の配 列番号 24〜26にそれぞれ示す。
[0026] 検体中に存在するフザリウム'ダラミネアラムグループ菌もしくはトリコテセン系カビ 毒産生フザリウム属菌の検出は、上記した 4組のプライマーセットの少なくとも 1組の セットを用いて、 LAMP法に従い、等温遺伝子増幅（通常 60〜65°Cで 15分〜 1時 間）を行う。すなわち、検体力も採取した菌株又は穀物検体そのものを、適当な培地 中で培養し遠心分離等で集菌した後、公知の方法によって菌株の DNAを分離して 、この DNAに対して前記プライマーセットを用いて増幅反応を行う。増幅した DNA 増幅産物の有無は、 LAMP法での簡易検出、又は通常の電気泳動によって検出で きる。前者の簡易検出には、 1)増幅反応液の白濁による目視確認 (国際特許公開 W O01Z83817号パンフレット）および 2)蛍光インターカレーターの目視確認がある。 V、ずれも、 目視により増幅産物 (標的遺伝子の存在)の有無を確認することができる。 実施例
[0027] 以下、実施例を挙げて本発明について更に詳しく説明する力 本発明はこれらの 実施例に限定されるものではな 、。
[0028] (実施例 1) 既知菌株の遺伝子 (rRNA遺伝子、トランスレーション'ェロンゲーショ ン ·ファクター 1アルファ一遺伝子、トリコテセン生合成遺伝子）の増幅
(使用したプライマーセット）
ITSプライマーセット [ITS- FIP (配列番号 1)、 ITS- BIP (配列番号 2)、 ITS- F3 (配列 番号 3)、 ITS-B3 (配列番号 4)、 ITS-LoopF (配列番号 5)、 ITS- LoopB (配列番号 6) ] 、 TEFプライマーセット [TEF- FIP (配列番号 7)、 TEF- BIP (配列番号 8)、 TEF- F3 ( 配列番号 9)、 TEF-B3 (配列番号 10)、 TEF-LoopF (配列番号 11)、 TEF-LoopB (配 列番号 12) ]、 Tri5プライマーセット [Tri5-FIP (配列番号 13)、 Tri5- BIP (配列番号 1 4)、 Tri5-F3 (配列番号 15)、 Tri5- B3 (配列番号 16)、 Tri5-LoopF (配列番号 17)、 Tri5-LoopB (配列番号 18) ]、 nTri5プライマーセット [nTri5-FIP (配列番号 19)、 nTri5- BIP (配列番号 20)、 nTri5- F3 (配列番号 21)、 nTri5- B3 (配列番号 22)、 nTri5-LoopB (配列番号 23) ]の 4種類のプライマーセットを使用した。これらのプライ マーセットによるフザリウム'ダラミネアラムグループ菌又はトリコテセン系力ビ毒産生 フザリウム属菌の遺伝子の増幅、および近縁菌の遺伝子の増幅について検討した。 供試菌株は、各菌株に対する結果と共に表 1にまとめて示した。
[0029] (ゲノム DNAの調製）
フザリウム属菌及び近縁菌をポテトデキストロース寒天培地 (バレイショ浸出液： 20 o/0、グルコース： 2%、寒天： 1. 5%、 pH5. 6±0. 2、栄研化学社製）に植菌し、 20 °Cで 3〜10日間培養を行い、試験に供した。 DNA抽出液 PrepMan (商標） Ultra (ァ プライド.バイオシステム社製)を用いて菌体力もゲノム DNAを抽出した。
[0030] (LAMP法による遺伝子増幅）
LAMP法による遺伝子増幅は Loopamp DNA増幅試薬キット (栄研化学社製)を用 いて行った。試薬反応液に上記 DNA溶液、および各プライマーセットを加え、遺伝 子の増幅反応を行った。増幅反応は 65°Cで、 60分間行った。
[0031] (増幅産物の検出）
増幅反応が進むにつれ、遊離してくるピロリン酸が、反応液中に存在するマグネシ ゥムイオンとピロリン酸マグネシウムを形成する。増幅が起こって 、る場合のみ反応液 が白濁する。この白濁を観察することで、増幅産物の有無を判断した。また、一部の 菌株については、反応液 1 μ Lをポリアクリルアミドゲル上で電気泳動にかけた。ェチ ジゥムブロマイド溶液で 10分間染色した後、紫外線を照射して DNAのバンドを観察 •確認した（図 1に結果を示した)。
[0032] 各プライマーセットについての増幅結果をまとめたものが表 1である。 [0033] [表 1]
Figure imgf000011_0001
1 ) ： 別る Fusar ι urn η ι va I e
2 ) ： デォキシニバレノール及び Toxin (毒素） の産生に関しては保存機関の情報 3 ) ： + 増幅あり 一 増幅なし
NBRC： Biological Resource Center, Biotechnology Center, National Institute of Technology and Evaluation, Tsukuba, Japan
JCM： Japan Col lection of Microorganisms, Sa i tatna, Japan
OUGZ, SBC: サッポロビール保有株
[0034] 表 1に示したように、 ITSまたは TEFプライマーセットを用いたとき、フザリウム'グラミ ネアラム（完全世代名： Gibberella zeae)及びフザリウム 'セレアリス（別名： Fusarium crookewllense)に属する供試菌株において、増幅産物を確認することができた。一方 、 Tri5または nTri5プライマーセットを用いたとき、デォキシュバレノール（DON)を 産生する供試菌株のみにおいて、増幅産物を確認することができた。そして、 4つの プライマーセットのいずれを用いても、特定のフザリウム属菌以外の菌において、増 幅産物は確認されなかった。
[0035] (実施例 2) 穂中における汚染の検出 (切り穂検定試験）
圃場力 接種適期の大麦の穂（開花数日後の穂)を第 1節の下で切り取り、 1穂当り 、 0. 7〜1. 2mLの Fusarium graminearum OUGZ 027の分生子懸濁液を散布し、穂 に胞子を接種した。接種後、 18°C、 12時間日長に設定した加湿器付き陽光低温庫 で 7日間穂を培養した。本検定法で使用した大麦はミカモゴールデンであり、試験 1 の 7日目における罹病粒の割合は R(0〜10%)から RM (10〜20%)であり、試験 2 の 7日目における罹病粒の割合は M (20〜30%)から SM (30〜50%)であった。
[0036] (各プライマーセットによる検出）
胞子接種後 0、 1、 3及び 7日目に、培養中の穂力もランダムに 6穂選び、各穂の先 端近辺にある 1粒をサンプルとして使用した。サンプル 1粒を DNA抽出液 PrepMan ( 商標） Ultra (アプライド 'バイオシステム社製）（100 L)に浸漬し、 95°C、 10分間の 加熱により DN Aを抽出した。 DNA抽出液の 1 μ Lを LAMP反応（65°C、 60分）に供 し、各プライマーセットによる検出可否を判定した。
[0037] 各プライマーセットの検出結果を表 2に示した。
[0038] [表 2]
Figure imgf000012_0001
[0039] TEFプライマーセット及び nTri5プライマーセットは、胞子接種後 0日目力ら 3日目 における汚染粒力もフザリウム属菌を検出することができな力つたが、接種 7日目の 罹病状態に近い粒力 フザリウム属菌を検出することが出来た。 ITSプライマーセット では、胞子接種後 1日目〜 3日目位でもフザリウム属菌汚染を検出ことが可能であつ たが、胞子状態のフザリウム属菌は検出できない可能性が高いと考えられる。
[0040] 上記の結果より、罹病に至る前に、初期感染の状態にて、赤カビ病菌の感染を検 出することが可能と考えられる。一方、 TEFプライマーセットや nTri5プライマーセット は、罹病粒割合とほぼ一致していることより、圃場における罹病粒の把握等に利用で きる。さらに、 ITSプライマーセットと TEFプライマーセットや nTri5プライマーセットと 組合せて検査することにより、例えば、 ITSプライマーセットで陽性、 TEFプライマー セットで陰性であれば汚染 (感染)初期の状態、 ITS及び TEFプライマーセットとも陽 性であれば、汚染 (感染）がかなり進んだ状態というように、赤カビ汚染の進行度や、 汚染の程度も推定できると考えられる。
[0041] (実施例 3) 非汚染穀粒中における汚染穀粒の検出
赤カビ病菌の汚染が見られない大麦 20g (約 500粒）に、 Fusarium graminearum OUGZ 027を汚染させた粒 1粒又は 3粒を混ぜた後、滅菌水 30mLに懸濁した。 1〜 2分間、手で振盪させた後、上清 lmLを遠心分離（10, OOOrpm, 5分)を行った。そ の残查に DNA抽出液 PrepMan (商標） Ultra (アプライド 'バイオシステム社製） (100 μ L)をカ卩え、 95°C、 10分間加熱し、 DNAを抽出した。 DNA抽出液の 1 μ Lを LAM P反応（65°C、 60分）に供し、各プライマーセットによる検出可否を判定した。
[0042] 各プライマーセットの検出結果を表 3に示した。
[0043] [表 3]
Figure imgf000013_0001
* ： 反応時間をフ 0分まで延長すると +となる
[0044] ITSプライマーセットを用いた場合、大麦 20g (約 500粒）中に汚染粒 1粒が混入し ていた場合 (混入率 0. 2%)でも、汚染の検出が可能であることが判明した。したがつ て、極少量の汚染粒をも検出可能な感度を有していることが分かる。また、 ITSプライ マーセットと TEFプライマーセットとを組合せて検査することにより、ある程度汚染の 程度も推定できると考えられる。
[0045] (実施例 4) 大麦、麦芽中の赤カビ汚染状況推測
(サンプル調製）
大麦又は麦芽 20gをプレンダ一で粉砕し、滅菌水 50mLに懸濁した。よく振盪した 後、ろ紙 (アドバンテック社製 No. 2)にて濾過を行い、サンプル溶液とした。 [0046] (デォキシュバレノール（DON)の検出）
上記サンプル溶液 0. lmLを使用し、 Neogen社製 Veratox5/5キットにて DONの定 量を行った。本キットの検出限界は 50ppbであり、この検出限界を超えたサンプルを 陽性とし、検出限界以下のものを陰性とした。
[0047] (ITSプライマーセットによる検出）
上記サンプル溶液 lmLを遠心分離し（10, 000rpm、 5分）、遠心残查に DNA抽 出液 PrepMan (商標） Ultra (アプライド 'バイオシステム社製）（100 L)を加え、 95°C で 10分間加熱し、 DNAを抽出した。 DNA抽出液の: Lを LAMP反応（65°C、 60 分)に供した。
[0048] 大麦及び麦芽 16サンプルについて、 DON含量及び LAMP法による赤カビ検出を 行った結果を表 4にまとめた。
[0049] [表 4]
Figure imgf000014_0001
[0050] 16サンプル中 10サンプルに LAMP法により赤カビが検出された。この 10サンプル 中 8サンプルに DONが検出された。一方、 LAMP法で赤カビが検出されなかった 6 サンプルには、 DONも検出されなかった (検出限界（50ppb)以下）。さらに、 LAMP 法にて赤カビ未検出となったサンプルで、 DONが検出されたサンプルはな力つた。
[0051] したがって、 ITSプライマーセットを用いることで、サンプル中における DON生産赤 カビを感度良く検出することができると供に、 DON含有の可能性の有無も推測できる と考えられる。
産業上の利用可能性
[0052] マイコトキシンを産生する赤カビ病原菌である特定のフザリウム属菌を選択的、迅速
、簡便に、識別、検出することが可能となった。
[0053] したがって、本発明のプライマーセットおよびそれを用いる特定のフザリウム属菌な どの検出方法は、穀物中における赤カビ汚染粒の検出のみでなぐ栽培時 '収穫時' 保管中等の各段階においても、使用することが可能と考えられる。つまり、赤カビ病 菌の汚染拡大の防止処置 (感染初期における農薬散布、栽培中'収穫時における汚 染穀物の選別、穀物保管場所の微生物状態把握など)を施すための検査法となり得 る。

Claims

請求の範囲
[1] 配列番号 24に示す塩基配列の一部又はその相補鎖力 選択される標的領域の塩 基配列を増幅し、
(a)第 1のセグメントとして、フザリウム'ダラミネアラムグループ菌の rRNA遺伝子にァ ニールしてプライマーとして機能する塩基配列と、
(b)第 2のセグメントとして、第 1のセグメントの 3，側の塩基配列に相補的であり、第 1 のセグメントの 5 '側に位置する塩基配列と
を含むことを特徴とする、プライマー。
[2] 配列番号 25に示す塩基配列の一部又はその相補鎖力も選択される標的領域の塩 基配列を増幅し、
(a)第 1のセグメントとして、フザリウム'ダラミネアラムグループ菌のトランスレーション · ェロンゲーシヨン.ファクター 1アルファ一遺伝子にァニールしてプライマーとして機能 する塩基配列と、
(b)第 2のセグメントとして、第 1のセグメントの 3，側の核酸配列に相補的であり、第 1 のセグメントの 5 '側に位置する塩基配列と
を含むことを特徴とする、プライマー。
[3] 配列番号 26に示す塩基配列の一部またはその相補鎖力も選択される標的領域の 塩基配列を増幅し、
(a)第 1のセグメントとして、トリコテセン系力ビ毒産生フザリウム属菌のトリコテセン生 合成遺伝子 tri5にァニールしてプライマーとして機能する塩基配列と、
(b)第 2のセグメントとして、第 1のセグメントの 3，側の核酸配列に相補的であり、第 1 のセグメントの 5 '側に位置する塩基配列と
を含むことを特徴とする、プライマー。
[4] 配列番号 1〜6で表される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドセットからなり、フザリ ゥム ·ダラミネアラムグループ菌の rRNA遺伝子の特定領域を増幅可能なフザリウム · ダラミネアラムグループ菌検出用プライマーセット。
[5] 配列番号 7〜 12で表される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドセットからなり、フザリ ゥム ·グラミネアラムグノレープ菌のトランスレーション'ェロンゲーシヨン ·ファクター 1ァ ルファー遺伝子の特定領域を増幅可能なフザリウム ·ダラミネアラムグループ菌検出 用プライマーセット。
[6] 配列番号 13〜18又は配列番号 19〜23で表される塩基配列を含むオリゴヌクレオ チドセットからなり、トリコテセン生合成遺伝子 tri5の特定領域を増幅可能なトリコテセ ン系カビ毒産生フザリウム属菌検出用プライマーセット。
[7] 検体中に存在するフザリウム'ダラミネアラムグループ菌の検出方法であって、フザ リウム'ダラミネアラムグループ菌の rRNA遺伝子の特定領域を標的とし、請求項 4に 記載のプライマーセットで該 rRNA遺伝子の特定領域を選択的に、 LAMP法により 増幅させ、該増幅産物の有無を確認することを特徴とする、フザリウム'ダラミネアラム グループ菌の検出方法。
[8] 検体中に存在するフザリウム'ダラミネアラムグループ菌の検出方法であって、フザ リウム ·グラミネアラムグノレープ菌のトランスレーション'ェロンゲーシヨン'ファクター 1 アルファ一遺伝子の特定領域を標的とし、請求項 5に記載のプライマーセットで該トラ ンスレーシヨン'ェロンゲーシヨン'ファクター 1アルファ一遺伝子の特定領域を選択的 に、 LAMP法により増幅させ、該増幅産物の有無を確認することを特徴とする、フザ リウム'ダラミネアラムグループ菌の検出方法。
[9] 検体中に存在するトリコテセン系力ビ毒産生フザリウム属菌の検出方法であって、フ ザリウム属菌のトリコテセン生合成遺伝子 tri5の特定領域を標的とし、請求項 6に記 載のプライマーセットで該トリコテセン生合成遺伝子 tri5の特定領域を選択的に、 LA MP法により増幅させ、該増幅産物の有無を確認することを特徴とする、トリコテセン 系力ビ毒産生フザリウム属菌の検出方法。
[10] 検体を増菌培養し、出現菌から DNA試料を分離し、該 DNA試料に対して、請求 項 4に記載のプライマーセットを用いて、 LAMP法により増幅反応を行い、フザリウム •ダラミネアラムグループ菌の rRNA遺伝子の特定領域を増幅させ、この増幅産物の 有無を確認することを特徴とする、フザリウム'ダラミネアラムグループ菌の識別方法。
[11] 検体を増菌培養し、出現菌から DNA試料を分離し、該 DNA試料に対して、請求 項 5に記載のプライマーセットを用いて、 LAMP法により増幅反応を行い、フザリウム 'グラミネアラムグループ菌のトランスレーション'ェロンゲーシヨン'ファクター 1アルフ ァー遺伝子の特定領域を増幅させ、この増幅産物の有無を確認することを特徴とす る、フザリウム ·ダラミネアラムグループ菌の識別方法。
[12] 検体を増菌培養し、出現菌から DNA試料を分離し、該 DNA試料に対して、請求 項 6に記載のプライマーセットを用いて、 LAMP法により増幅反応を行い、トリコテセ ン系カビ毒産生フザリウム属菌のトリコテセン生合成遺伝子 tri5の特定領域を増幅さ せ、この増幅産物の有無を確認することを特徴とする、トリコテセン系力ビ毒産生フザ リウム属菌の識別方法。
[13] 請求項 1〜6のいずれか一項に記載のプライマー又はプライマーセット、鎖置換型 DNAポリメラーゼ、 dNTPs、反応緩衝液を少なくとも含むことを特徴とする、フザリウ ム'ダラミネアラムグループ菌又はトリコテセン系力ビ毒産生フザリウム属菌検出用キッ
PCT/JP2005/009273 2005-05-20 2005-05-20 フザリウム属菌検出用プライマー WO2006123423A1 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/JP2005/009273 WO2006123423A1 (ja) 2005-05-20 2005-05-20 フザリウム属菌検出用プライマー

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/JP2005/009273 WO2006123423A1 (ja) 2005-05-20 2005-05-20 フザリウム属菌検出用プライマー

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2006123423A1 true WO2006123423A1 (ja) 2006-11-23

Family

ID=37431007

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2005/009273 WO2006123423A1 (ja) 2005-05-20 2005-05-20 フザリウム属菌検出用プライマー

Country Status (1)

Country Link
WO (1) WO2006123423A1 (ja)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102251055A (zh) * 2011-08-22 2011-11-23 山东省眼科研究所 基于环介导等温扩增技术检测镰刀菌的引物及试剂盒
CN102443590A (zh) * 2010-10-09 2012-05-09 华中农业大学 一种镰刀菌单端孢霉烯族a类毒素的分子鉴定方法
CN103436628A (zh) * 2013-09-23 2013-12-11 南京农业大学 一种快速检测禾谷镰孢菌对多菌灵中等抗性水平菌株的方法
CN108220474A (zh) * 2018-03-23 2018-06-29 山西农业大学 一种禾谷镰刀菌的lamp检测引物及其应用
CN114045358A (zh) * 2021-10-15 2022-02-15 南京农业大学 基于环介导等温扩增技术检测十二种马铃薯病害病原菌的引物组合物及检测方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000028082A1 (fr) * 1998-11-09 2000-05-18 Eiken Kagaku Kabushiki Kaisha Procede de synthese d'acide nucleique

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000028082A1 (fr) * 1998-11-09 2000-05-18 Eiken Kagaku Kabushiki Kaisha Procede de synthese d'acide nucleique

Non-Patent Citations (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BLUHM B. ET AL.: "Multiplex real-time PCR detection of fumonisin-producing and trichotthecene-producing of Fusarium species.", JOURNAL OF FOOD PROTECTION., vol. 67, no. 3, 2004, pages 536 - 543, XP002991541 *
DATABASE GENBANK UNITED STATES NATIONAL CENTER FOR BIOTECHNOLOGY INFORMATION.; 10 August 2005 (2005-08-10), PROCTOR R. ET AL.: "Reduced virulence of Gibberellazeae caused by discruption of a trichotothecene toxin biosynthetic gene.", XP002991543 *
DATABASE GENBANK UNITED STATES NATIONAL CENTER FOR BIOTECHNOLOGY INFORMATION.; 10 August 2005 (2005-08-10), WARD T. ET AL.: "Ancestral polymorphism and adaptive evolution in the trichothecene mycotoxin gene cluster of phytopathogenic Fusarium.", XP002991545 *
DATABASE GENBANK UNITED STATES NATIONAL CENTER FOR BIOTECHNOLOGY INFORMATION; 10 August 2005 (2005-08-10), O'DONNELL K. ET AL.: "Gibberella zeae NRRL 25797 internal transcribed spacer1,5.8S ribosomal RNA gene: and internal transcribed spacer 2, complete sequence.", XP002991542 *
DATABASE STN 9 August 2005 (2005-08-09), TAKAYUKI A AND O'DONNELL K. ET AL.: "Morphological and molecular characterization of Fusarium pseudograminearum sp.nov.formerly recognized as the Group 1 population of F.graminearum.", XP002991544 *
FUNQUB. GENET. BIOL., vol. 23, no. 1, 1998, pages 57 - 67 *
HERINGO O. ET AL.: "Selective amplification of rDNA internal transcribed spacer regions to detect Fusarium graminearum F.cerealis and F. culmorum.", ZUECHTUNGSFORSCHUNG., vol. 1, 1995, pages 328 - 331, XP002991540 *
MOL. PLANT MICROBE INTERACT., vol. 8, no. 14, 1995, pages 593 - 601 *
MYCOLOGIA, vol. 91, no. 4, 1999, pages 597 - 609 *
NIESSEN M. AND VOGEL R. ET AL.: "Group specific PCR-detection of potential trichothecene-producing Fusarium-species in pure cultures and cereal samples.", SYSTEMATIC AND APPLIED MICROBIOLOGY., vol. 21, no. 4, December 1998 (1998-12-01), pages 618 - 631, XP001075057 *
NOTOMI T. ET AL.: "Loop-mediated isothermal amplification of DNA.", NUCLEIC ACIDS RESEARCH., vol. 28, no. 12, 15 June 2000 (2000-06-15), pages 63, XP002312264 *
O'DONNELL K. ET AL.: "Genealogical concordance between the mating type locus and seven other nuclear genes support formal recognition of nine phylogenetically distinct species within the Fusarium graminearum clade.", FUNGAL GENETICS AND BIOLOGY., vol. 41, no. 6, 2004, pages 600 - 623, XP002991546 *
PROC. NATL. ACAD.SCI, USA., vol. 99, no. 14, 2002, pages 9278 - 9283 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102443590A (zh) * 2010-10-09 2012-05-09 华中农业大学 一种镰刀菌单端孢霉烯族a类毒素的分子鉴定方法
CN102251055A (zh) * 2011-08-22 2011-11-23 山东省眼科研究所 基于环介导等温扩增技术检测镰刀菌的引物及试剂盒
CN102251055B (zh) * 2011-08-22 2012-10-31 山东省眼科研究所 基于环介导等温扩增技术检测镰刀菌的引物及试剂盒
CN103436628A (zh) * 2013-09-23 2013-12-11 南京农业大学 一种快速检测禾谷镰孢菌对多菌灵中等抗性水平菌株的方法
CN108220474A (zh) * 2018-03-23 2018-06-29 山西农业大学 一种禾谷镰刀菌的lamp检测引物及其应用
CN114045358A (zh) * 2021-10-15 2022-02-15 南京农业大学 基于环介导等温扩增技术检测十二种马铃薯病害病原菌的引物组合物及检测方法
CN114045358B (zh) * 2021-10-15 2023-08-18 南京农业大学 基于环介导等温扩增技术检测十二种马铃薯病害病原菌的引物组合物及检测方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Niessen et al. Detection of Fusarium graminearum DNA using a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay
Niessen Current state and future perspectives of loop-mediated isothermal amplification (LAMP)-based diagnosis of filamentous fungi and yeasts
Bluhm et al. Multiplex real-time PCR detection of fumonisin-producing and trichothecene-producing groups of Fusarium species
US10093992B1 (en) Method of detecting heat-resistant fungus
Kulik et al. Development of PCR assay based on ITS2 rDNA polymorphism for the detection and differentiation of Fusarium sporotrichioides
Panek et al. Development of a qPCR assay for the detection of heat-resistant Talaromyces flavus
KR100514431B1 (ko) 십자화과 흑부병원균의 특이적 검출을 위한 프라이머 세트및 이를 이용한 흑부병원균의 검출방법
WO2006123423A1 (ja) フザリウム属菌検出用プライマー
Alaei et al. Molecular detection of Puccinia horiana in Chrysanthemum x morifolium through conventional and real-time PCR
AU2004280430B2 (en) Primer for detecting Alicyclobacillus
JP5048622B2 (ja) 乳酸菌検出用ｐｃｒプライマー
JP5654265B2 (ja) ビソクラミス属に属する菌類の検出方法
Pallez et al. Validation of a quick PCR method suitable for direct sequencing: identification of Fusarium fungal species and chemotypes for preventive approaches in food safety
JP2014003946A (ja) サーモアスカス属真菌の検出方法
JP3525259B2 (ja) ペクチネータス属菌の検出
JP2005245257A (ja) フザリウム属菌検出用プライマー
KR101961763B1 (ko) 버섯의 푸른곰팡이 병원균 검출용 조성물 및 이를 이용한 푸른곰팡이 병원균 검출 방법
JP5873356B2 (ja) モニリエラ属真菌の検出方法
JP6381771B1 (ja) 萎黄病菌由来の核酸を増幅するためのプライマーセットおよび萎黄病菌の検出方法
JP5697881B2 (ja) パエシロマイセスサトゥラタス及びパエシロマイセスディバリカタスの検出方法
GB2527728A (en) Detection of a specific fungal pathogen
Saß et al. Simple and efficient cell disruption of extremely small quantities of mycelium of phytopathogenic mycotoxin-producing moulds for quantitative extraction of genomic DNA
DURGARANI et al. RAPID MOLECULAR DETECTION AND IDENTIFICATION OF AFLATOXINS PRODUCING FUNGAL GENE, AFLQ, IN INFECTED MAIZE SAMPLES USING NORMAL PCR
Hebart et al. Polymerase Chain Reaction for Detection of Various Aspergillus Species in Clinical Samples
JP2009022168A (ja) アリサイクロバチルス・アシドカルダリウス検出のためのプライマーおよびそれを用いた検出法

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Country of ref document: DE

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: RU

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Country of ref document: RU

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 05741172

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: JP