JP6381771B1 - 萎黄病菌由来の核酸を増幅するためのプライマーセットおよび萎黄病菌の検出方法 - Google Patents
萎黄病菌由来の核酸を増幅するためのプライマーセットおよび萎黄病菌の検出方法Info
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Abstract
【解決手段】LAMP法により、萎黄病菌由来の核酸を増幅するためのプライマーセットであって、FIPプライマー、BIPプライマー、F3プライマー、B3プライマーがそれぞれ特定の4種の配列により示されるポリヌクレオチド等であるプライマーセット、ならびに上記プライマーセットを用いて、検体から抽出された核酸を鋳型にLAMP法によってDNAの増幅反応を行うことを含む萎黄病菌の検出方法。
【選択図】なし
Description
LAMP法をイチゴ感染性の病原性糸状菌の検出に適用とした例としては、炭疽病菌の検出に用いた報告が非特許文献4にある。
<1>LAMP法により、萎黄病菌由来の核酸を増幅するためのプライマーセットであって:
配列番号1の配列により示されるポリヌクレオチドもしくは配列番号1の配列により示されるポリヌクレオチドにおいて、萎黄病菌由来の核酸を増幅可能な範囲で変異を含むポリヌクレオチドからなるFIPプライマー、
配列番号2の配列により示されるポリヌクレオチド、もしくは配列番号2の配列により示されるポリヌクレオチドにおいて、萎黄病菌由来の核酸を増幅可能な範囲で変異を含むポリヌクレオチドからなるBIPプライマー、
配列番号3の配列により示されるポリヌクレオチドもしくは配列番号3の配列により示されるポリヌクレオチドにおいて、萎黄病菌由来の核酸を増幅可能な範囲で変異を含むポリヌクレオチドからなるF3プライマー、および
配列番号4の配列により示されるポリヌクレオチド、もしくは配列番号4の配列により示されるポリヌクレオチドにおいて、萎黄病菌由来の核酸を増幅可能な範囲で変異を含むポリヌクレオチドからなるB3プライマー、または、
前記のFIPプライマー、BIPプライマー、F3プライマー、およびB3プライマーをそれぞれ構成するポリヌクレオチドの配列の相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるFIPプライマー、BIPプライマー、F3プライマー、およびB3プライマーを含むプライマーセット。
配列番号5の配列により示されるポリヌクレオチドもしくは配列番号5の配列により示されるポリヌクレオチドにおいて、萎黄病菌由来の核酸を増幅可能な範囲で変異を含むポリヌクレオチドからなるLFプライマー、および
配列番号6の配列により示されるポリヌクレオチドもしくは、配列番号6の配列により示されるポリヌクレオチドにおいて、萎黄病菌由来の核酸を増幅可能な範囲で変異を含むポリヌクレオチドからなるLBプライマーから選択される1つ以上、または、
前記のLFプライマーおよびLBプライマーをそれぞれ構成するポリヌクレオチドの配列の相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるLFプライマーおよびLBプライマーから選択される1つ以上を含む<1>に記載のプライマーセット。
<3>前記LFプライマーおよび前記LBプライマーの双方を含む<2>に記載のプライマーセット。
検体から核酸を抽出すること、
<1>〜<3>のいずれかに記載のプライマーセットを用いて、前記核酸を鋳型にLAMP法によってDNAの増幅反応を行うこと、
増幅産物があると判断された場合に検体に萎黄病菌が存在すると判断することを含む、検出方法。
<5>検体が土壌である<4>に記載の検出方法。
<6>LAMP法により、萎黄病菌および炭疽病菌からなる群より選択される1つ以上の細菌由来の核酸を増幅するための複合プライマーセットであって:
<1>〜<3>のいずれかに記載のプライマーセット、ならびに
配列番号11の配列により示されるポリヌクレオチドもしくは配列番号11の配列により示されるポリヌクレオチドにおいて、炭疽病菌由来の核酸を増幅可能な範囲で変異を含むポリヌクレオチドからなるFIPプライマー、
配列番号12の配列により示されるポリヌクレオチド、もしくは配列番号12の配列により示されるポリヌクレオチドにおいて、炭疽病菌由来の核酸を増幅可能な範囲で変異を含むポリヌクレオチドからなるBIPプライマー、
配列番号13の配列により示されるポリヌクレオチドもしくは配列番号13の配列により示されるポリヌクレオチドにおいて、炭疽病菌由来の核酸を増幅可能な範囲で変異を含むポリヌクレオチドからなるF3プライマー、および
配列番号14の配列により示されるポリヌクレオチド、もしくは配列番号14の配列により示されるポリヌクレオチドにおいて、炭疽病菌由来の核酸を増幅可能な範囲で変異を含むポリヌクレオチドからなるB3プライマー、または、
前記のFIPプライマー、BIPプライマー、F3プライマー、およびB3プライマーをそれぞれ構成するポリヌクレオチドの配列の相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるFIPプライマー、BIPプライマー、F3プライマー、およびB3プライマーを含む複合プライマーセット。
配列番号15の配列により示されるポリヌクレオチドもしくは配列番号15の配列により示されるポリヌクレオチドにおいて、炭疽病菌由来の核酸を増幅可能な範囲で変異を含むポリヌクレオチドからなるLFプライマー、および
配列番号16の配列により示されるポリヌクレオチドもしくは、配列番号16の配列により示されるポリヌクレオチドにおいて、炭疽病菌由来の核酸を増幅可能な範囲で変異を含むポリヌクレオチドからなるLBプライマーから選択される1つ以上、または、
前記のLFプライマーおよびLBプライマーをそれぞれ構成するポリヌクレオチドの配列の相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるLFプライマーおよびLBプライマーから選択される1つ以上を含む<6>に記載の複合プライマーセット。
<8>前記LFプライマーおよび前記LBプライマーの双方を含む<7>に記載の複合プライマーセット。
<9>萎黄病菌および炭疽病菌からなる群より選択される1つ以上の細菌の検出方法であって、
検体から核酸を抽出すること、
<6>〜<8>のいずれかに記載の複合プライマーセットを用いて、前記核酸を鋳型にLAMP法によってDNAの増幅反応を行うこと、
前記増幅反応後のDNAの二本鎖への会合曲線解析により、検体における上記細菌の存在の有無および存在する細菌の種類を判断することを含む、検出方法。
<10><1>〜<3>のいずれかに記載のプライマーセット、鎖置換型DNA合成酵素、dNTPs及び緩衝液を含む、萎黄病菌の検出用キット。
配列番号17または22の配列により示されるポリヌクレオチドからなるFIPプライマー、
配列番号18の配列により示されるポリヌクレオチドからなるBIPプライマー、
配列番号19の配列により示されるポリヌクレオチドからなるF3プライマー、
配列番号20の配列により示されるポリヌクレオチドからなるB3プライマー、および、
配列番号21の配列により示されるポリヌクレオチドからなるLFプライマーを含むプライマーセット。
本明細書中において、核酸の塩基配列中のA、G、T、Cは、デオキシリボヌクレオチド中のアデニン塩基、グアニン塩基、チミン塩基、シトシン塩基を示す。
LAMP法におけるプライマーおよびプライマー設計について、以下説明する。
LAMP法に用いられるプライマーセットは、少なくとも、FIPプライマー、F3プライマー、BIPプライマー、B3プライマーを含む。図1は、FIPプライマー、F3プライマー、BIPプライマー、B3プライマーと標的二本鎖DNAとの位置関係を示した図である。
FIPプライマーおよびBIPプライマーは、各々二つの領域を含む。即ち、FIPはF1cとF2を含み、BIPはB2とB1cを含む。F3プライマーはF3領域を含んでいる。B3プライマーはB3領域を含む。各プライマーはそれぞれ以下のように設計する。
(2)F3プライマー:標的核酸のF3領域を持つように設計する。
(3)BIPプライマー:標的核酸のB2領域を3´端に持ち、5´末端側に標的核酸のB1cと同じ配列を持つように設計する。
(4)B3プライマー:標的核酸のB3領域を持つように設計する。
本発明のプライマーセットはLAMP法により萎黄病菌由来の核酸を増幅するためのプライマーセットである。
上記プライマーセットは、リボゾームDNA配列情報に基づき、保存性の高い領域において、F3、F2、F1c、B1c、B2、B3領域を選択して設計された。
表1に複数の萎黄病菌株のリボゾームDNA配列情報のアライメントを示す。
具体的には、上記FIPプライマーは、配列番号1で示されるポリヌクレオチドの何れかの位置の1〜5個、好ましくは1〜数個のヌクレオチドが置換しているかまたは、欠失および/もしくは挿入を有していてもよい。特に1〜数個のヌクレオチドが置換していてもよい。そのようなポリヌクレオチドの例は、アライメントに用いたいずれかの株におけるF2領域の配列を3´端に持ち、5´末端側に各株におけるF1領域の相補配列を持つポリヌクレオチドである。
プライマーは上記の範囲のポリヌクレオチドが、混合プライマーとして調製されたものであってもよい。
具体的には、上記BIPプライマーは、配列番号2の配列で示されるポリヌクレオチドの何れかの位置の1〜5個、好ましくは1〜数個のヌクレオチドが置換しているかまたは、欠失および/もしくは挿入を有していてもよい。特に1〜数個のヌクレオチドが置換していてもよい。そのようなポリヌクレオチドの例は、アライメントに用いたいずれかの株におけるB2領域の配列を3´端に持ち、5´末端側に表1で示される各株におけるB1領域の相補配列を持つポリヌクレオチドである。
プライマーは上記の範囲のポリヌクレオチドが、混合プライマーとして調製されたものであってもよい。
具体的には、それぞれ配列番号3から6それぞれの配列で示されるポリヌクレオチドの何れかの位置の1〜5個、好ましくは1〜数個のヌクレオチドが置換しているかまたは、欠失および/もしくは挿入を有していてもよい。特に1〜数個のヌクレオチドが置換していてもよい。そのようなポリヌクレオチドの例は、アライメントに用いた示されるいずれかの株における、それぞれF3領域、B3領域、LF2領域、LB2領域の配列を持つポリヌクレオチドである。
プライマーは上記の範囲のポリヌクレオチドが、それぞれ混合プライマーとして調製されたものであってもよい。
LAMP法によるDNAの増幅反応においては、検体から抽出された核酸と、プライマーセットと、鎖置換型DNA合成酵素と、dNTPs(dATP、dTTP、dGTP及びdCTP)と、緩衝液とを含む反応液を、等温で一定時間静置すればよい。RT−LAMP法を行う場合は、さらに逆転写酵素を上記反応液に添加すればよい。
またLAMP法用DNA増幅試薬セット-動物種・植物病検査専用A-(ニッポンジーン) 及び LAMP法用DNA増幅試薬セット-動物種・植物病検査専用B-(ニッポンジーン)も使用可能である。等温増幅蛍光測定装置GelyzerTM Fシリーズ(TOSHIBA MEDICAL)もしくは等温増幅蛍光測定装置Genie(登録商標)III(ニッポンジーン)を使用する際は遺伝子増幅用試薬Isothermal Master Mix(TOSHIBA MEDICAL)もしくはIsothermal Master Mix for Genie(登録商標)III(ニッポンジーン)も使用可能である。
上記のプライマーセットを用いて核酸の増幅を行うことにより、簡便、安価、高速に、萎黄病菌を検出することが可能である。具体的には、検体に含まれる核酸をLAMP増幅反応に供し、増幅反応の結果生じた増幅産物の有無を判定することにより、検体中の萎黄病菌を検出することができる。
植物において検体とする部位としては、葉、実、茎、根等、いずれの部位を用いてもよいが、葉を用いることが好ましい。
い。
増幅産物の有無の判断は、例えば、LAMP法による核酸の増幅反応を行った後の反応液を肉眼で観察し、反応液の白濁が確認された場合に菌が存在すると判断できる。また、この反応液にSYBR Green I等の蛍光インターカレーターを加え、UV照射下で核酸の増幅を示す発光が確認された場合に菌が存在すると判断できる。この判断は目視で行うことも可能である。
また、本発明の検出方法を使用するために必要な各種の試薬類は、予めパッケージングしてキット化することができる。具体的には、上記プライマーセット、核酸合成の基質となる4種類のdNTPs(dATP、dCTP、dGTP及びdTTP)、鎖置換活性を有する鎖置換型DNA合成酵素、酵素反応に好適な条件を与える緩衝液、補助因子としての塩類(マグネシウム塩又はマンガン塩等)、酵素や鋳型を安定化する保護剤、さらに必要に応じて反応生成物の検出に必要な試薬類をキットとして提供できる。
リボゾームDNA配列情報に基づき設計された上記のプライマーセットを、さらに非特許文献4により報告されている炭疽病菌由来の核酸を増幅するためのプライマーセットと組み合わせた複合プライマーセットとすることにより、萎黄病菌および炭疽病菌のいずれか一方または双方に感染した検体を検出することが可能である。後述の実施例で示すように、複合プライマーセットを用いても、偽陽性は確認されないため、複合プライマーセットを用いることにより、萎黄病菌および炭疽病菌のいずれか1つ以上への感染を容易、迅速に低コストで検出することができる。
上述のように、プライマーセットを設計した。イチゴ萎黄病菌のリボゾームDNAのITS領域(accession No. FITP0003)でプライマーを設計に用いた。既知の菌株間で保存性が高い領域を選抜し、ループプライマーを含む、上記表2に示す配列番号1〜6の配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセットを設計した。
設計されたプライマーセット(プライマー)を、標準的なオリゴDNAで合成し、さらにHPLC精製後、滅菌蒸留水で100μMに希釈したものをマスターミックスとして冷凍保存した。夫々のプライマーについて、所定の濃度に希釈して一定量確保した。希釈したプライマーも−20℃で冷凍保存した。
[イチゴ萎黄病菌の胞子の準備]
PDA培地上で培養したイチゴ萎黄病菌の菌体を、白金耳でマングビーン液体培地に移し、常温で数日間振とう培養もしくは静置培養したあと、発生した胞子を回収した。顕微鏡で胞子数を数え、段階的に希釈した胞子懸濁液を準備した。あらかじめ50ml三角フラスコに入れておいたオートクレーブ済み土壌(10ml相当)に上記胞子懸濁液を滴下してそれぞれ検体とした。
「平成23年度 成果普及技術資料」イチゴ炭疽病・萎黄病・疫病感染苗検査マニュアルに沿ってDNA抽出を行った。各検体(土壌)入り三角フラスコに滅菌蒸留水20mlを加え1分間振とうした。懸濁液1mlを新しいチューブに移した。小型遠心機で1分間遠心し、上清を除去した。ガラスビーズ(径0.6mm、約0.2g、6粒相当)とスキムミルク(0.2g/ml)10μL、抽出バッファー(100mM Tris−HCl pH9.0、40mM EDTA)250μL、10%SDS 50μL、塩化べンジル150μLを加え、ボルテックスで激しく攪拌した。60℃で15分間処理した。3M酢酸ナトリウム150μLを加えて、ボルテックスで激しく攪拌した。その後氷上で15分間静置した。小型遠心機で1分間遠心し、上清約300μLを新しいチューブに入れた。上清液に吸着液(MgEx Kit)600μLと磁気ビーズ(MgEx Kit)40μLを加えて、チューブミキサーで1分間攪拌した。磁気スタンド(商品名:Magical Trapper(TOYOBO)にセットし、30秒間静置し、その後上清を除去した。洗浄液900μLを加えて、チューブミキサーで10秒間攪拌した。磁気スタンドにセットして30秒間静置し、その後上清を除去した。70%エタノール900μLを加えて、チューブミキサーで10秒間攪拌した。チューブミキサーで10秒間攪拌した。さらに、滅菌蒸留水100μLを加えて、チューブミキサーで1分間攪拌した。磁気スタンドにセットして30秒間静置し、上清を新しいチューブに回収した。このように得られた調製物をPCRまたはLAMP法の鋳型に用いた。
Loopamp(登録商標)DNA増幅試薬キットとLoopamp蛍光・目視検出試薬(栄研化学https://genome.e-mp.jp/products/mokusi.html)と上記プライマーセットを使用した。1サンプル当たり、1μLの上記調製物と6.25μLの2×Reaction mixture、0.5μLのEnzyme mix、0.5μLの蛍光試薬、0.5μLのF3プライマー(5μM)、0.5μLのB3プライマー(5μM)、0.5μLのFIPプライマー(40μM)、0.5μLのBIPプライマー(40μM)、0.5μLのLFプライマー(20μM)、0.5μLのLBプライマー(20μM)、1.25μLの滅菌蒸留水を加えることで計12.5μLに調製した。
あるいは、2.0μLの上記調製物と12.5μLの2×Reaction mixture、1.0μLのEnzyme mix、1.0μLの蛍光試薬、1.0μLのF3プライマー(5μM)、1.0μLのB3プライマー(5μM)、1.0μLのFIPプライマー(40μM)、1.0μLのBIPプライマー(40μM)、1.0μLのLFプライマー(20μM)、1.0μLのLBプライマー(20μM)、2.5μLの滅菌蒸留水を加えることで計25μLに調製した。ネガティブコントロールとしてDNAではなく滅菌蒸留水2.0μLを添加した。
LAMP反応は63℃90分のあと95℃2分とすることで行った。
LAMP法においても、PCR法と同等の検出感度の結果が得られていることがわかる。なお、それぞれの方法に要した時間は、PCR法が3時間、LAMP法が90分であった。
Loopamp(登録商標)DNA増幅試薬キットとカネカ温調機能付き吸光度計MyAbscope(登録商標)を用いた。2.0μLの上記調製物と12.5μLの2×Reaction mixture、1.0μLのEnzyme mix、1.0μLのF3プライマー(5μM)、1.0μLのB3プライマー(5μM)、1.0μLのFIPプライマー(40μM)、1.0μLのBIPプライマー(40μM)、1.0μLのLFプライマー(20μM)、1.0μLのLBプライマー(20μM)、3.5μLの滅菌蒸留水を加えることで計25μLに調製した。ネガティブコントロールとしてDNAではなく滅菌蒸留水2.0μLを添加した。LAMP反応は63℃60分、85℃10分で行った。Gセンサで吸光度変化をリアルタイム測定した。
結果を図3に示す。リアルタイム測定により、目視判定した場合と比較して、さらなる迅速化が図られていることが分る。
イチゴ苗にイチゴ萎黄病菌胞子懸濁液(1.0×105個/ml)を滴下摂取し、1週間常温で静置した。この苗と健全苗(非感染苗)につき、それぞれ、最外葉の葉柄基部をカミソリで数mm切り取り、50ml滅菌蒸留水と小さい薬さじ1杯分のpolyclar VTを含む500μLチューブに入れ電子レンジで500W1分間処理した。遠心後得られる調製物を、PCRまたはLAMP法の鋳型として使用した。
1サンプル当たり、1μLの上記調製物と6.25μLの2×Reaction mixture、0.5μLのEnzyme mix、0.5μLの蛍光試薬、0.5μLのF3プライマー(5μM)、0.5μLのB3プライマー(5μM)、0.5μLのFIPプライマー(40μM)、0.5μLのBIPプライマー(40μM)、0.5μLのLFプライマー(20μM)、0.5μLのLBプライマー(20μM)、1.25μLの滅菌蒸留水を加えることで計12.5μLに調製した。LAMP反応は63℃1時間、95℃2分で行った。
健全苗は陰性、感染苗は陽性(蛍光)である結果が得られた。
[DNA抽出]
イチゴ炭疽病菌およびイチゴ萎黄病菌をそれぞれPDA培地上で数日間培養し、伸長した菌糸からSaitohら(Gen Plant Pathol 72:348−350,2006)の手法でDNAを抽出した。DNAは50μLの蒸留水に希釈した。抽出したDNAを−20℃で保管した。
Loopamp(登録商標)DNA増幅試薬キットとLoopamp 蛍光・目視検出試薬、上記のイチゴ炭疽病菌検出用プライマーセットとKATOH et al.,2016(非特許文献4)に記載のイチゴ萎黄病菌検出用プライマーセット(表4)とを使用した。
LAMP反応は63℃90分、95℃2分で偽陽性を生じないことを確認後、63℃60分、95℃2分で行った。
ネガティブコントロール以外の3サンプルで陽性(蛍光)である結果が得られた。
1.0μLの調製物(または滅菌蒸留水)、15μLのISO−004(Genelyzer F用試薬)、1.0μLのCgF3プライマー(5μM)、1.0μLのCgB3プライマー(5μM)、0.5μLのCgFIPプライマー(40μM)、0.5μLのCgBIPプライマー(40μM)、0.5μLのCgLFプライマー(20μM)、0.5μLのCgLBプライマー(20μM)、1.0μLのFoF3プライマー(5μM)、1.0μLのFoB3プライマー(5μM)、0.5μLのFoFIPプライマー(40μM)、0.5μLのFoBIPプライマー(40μM)、0.5μLのFoLFプライマー(20μM)、0.5μLのFoLBプライマー(20μM)、1.0μL滅菌蒸留水を加えることで計25.0μLに調製した。調製したサンプルをGenelyzer F(TOSHIBA MEDICAL)にセットし、63℃30分処理後、95℃2分間処理でLAMP反応を停止させた後、徐々に80℃まで下げた。その間に会合による蛍光をモニタリングした。結果を図4に示す。混合調製物サンプルは2つのピークを示した。
[プライマーセットの設計]
萎黄病菌の染色体にある遺伝子配列を標的にして、表5に示すプライマーセットAを設計した。萎黄病菌FOF10株のトランスポゾン領域Han_Skippy(アクセッション番号JX204304,Suga et al.2013)の塩基配列にHanRCプライマー配列(Pasquali et al.,2007)(表6において小文字表記の部分)を繋ぎ合わせた配列(表6)に基づき、ループプライマーを含むプライマーセットをデザインした。Tm値について、F1cおよびB1領域で65℃前後(64〜66℃)、F2領域、B2領域、F3領域、B3領域で60℃前後(59〜61℃)、ループプライマーは65℃前後(64〜66℃)にできるよう設定した。それぞれのTm値の推算式はNearest―Neigbor法で計算した。それぞれのプライマーについてGC含量が40〜65%、好ましくは50〜65%になるように設定した。F2領域の外側からB2領域の外側まで(LAMP法の増幅領域)が120から160塩基になるように設計した。F2領域の5’末端からF1領域の5’末端まで(ループを形成する部分)は40から60塩基になるように設計した。F2領域とF3域の間の距離は0から60塩基になるように設計した。B2領域の5’末端からB1領域の5’末端まで(ループを形成する部分)は40から60塩基になるように設計した。B2領域とB3域の間の距離は0から60塩基になるように設計した。
上記プライマーセットAを用いてLAMP法によるDNA増幅を行った。LAMP 法用DNA 増幅試薬セット(動物種・植物病検査専用B、ニッポンジーン)とプライマーセットAを使いLifeECOサーマルサイクラー(Bioer Technology Co.,Ltd.)で反応させた。2.5μLの10×反応バッファーB、5μLの5×反応添加液、1.4μLのdNTPs Mixture、1μLの検出液、1μLの増幅酵素、40pmolのFIP51プライマーとBIP51プライマー、20pmolのLF352プライマー、5pmolのF351プライマーとB351プライマーを添加したあと蒸留水で23μLにメスアップした。最後にPDA培地上で数日間培養したイチゴ萎黄病菌の菌糸からSaitohら(2006)の手法で抽出したDNA(2μL)を添加し反応させた。調製物においてはDNA濃度を100pgから10ngまで段階的に希釈した。LAMP反応は61℃、62℃、63℃、63.5℃、64℃、65℃そして66℃のそれぞれ処理温度で1時間反応させた。その後94℃2分の処理でLAMP反応を停止させた。LAMP反応による増幅の有無は目視で判別した。反応液が空色の場合はイチゴ萎黄病菌の存在を示す陽性反応、紫色は陰性反応を示す。結果を表7に示す。
PCRによる検出試験を同じ段階的に希釈したDNAを鋳型にして検定した。PCR反応液(20μL)は0.5μLのTakara EX Taq DNA polymerase、2μLの10×Ex Taq buffer (Mg2+ plus)、1.6μLのdNTP、それぞれ1μLの5μM FofraFプライマーとFofraRプライマー(Suga et al. 2013)、そしてLAMP法で用いたものと同じ調製物2μLで反応させた。LifeECOサーマルサイクラーにセットし、94℃で2分間処理の後、94℃30秒から55℃30秒、72℃30秒までを40回繰り返した。その後72℃で8分間処理して反応を終了させた。PCRによる増幅産物は3%アガロースゲル上で電気泳動した。次にエチジウムブロマイドでゲルを染色後、紫外線照射で増幅産物を確認した。結果を図5に示す。図5中、MはDNAマーカー、1は鋳型無し、2は10ng、3は1ng、4は100pgの結果である。
萎黄病菌(F.oxysporum f.sp.Fragariae)ub−2株、KNK,UKA−1株;非病原性糸状菌F.oxysporum FOF13、FOF25、FOF55、FOF113、FOF121株、Colletotrichum acutatum ia−1株、C.gloeosporioides OTT−512株、Phytophthora cactorum PC15株;非病原性糸状菌F. oxysporum MAFF727519株、F. verticillioides 9c−1−1株について陽性を示すか否かを確認した。これら菌株は室温下のPDA培地で保管した。これらPDA培地上で伸長した菌糸から、Saitohら(2006)の手法でDNAを抽出した。DNAは50μLの蒸留水に希釈した。抽出したDNAを−20℃で保管し、PCRとLAMP反応に使用した。DNA濃度は分光光度計(NanoDrop Lite; Thermo Scientific)で計測した。DNAが確実に抽出されているか、糸状菌DNAならば普遍的に増幅するPCRプライマーセットで確認した。
PDA上で生育させた糸状菌から抽出したDNAを鋳型にして、上記手順と同様に、プライマーセットAを用いたLAMP法の選択的特異性を検定した。
結果を表8に示す。
高圧滅菌した土壌10mL相当に胞子数が異なる萎黄病菌懸濁液を加え、FOG2培地を添加して4日間前培養した後に抽出したDNAを鋳型として上記手順と同様に、プライマーセットAを用いてLAMP反応による核酸増幅、検出を行った。その結果、102個、103個、104、および105個の胞子を含む土壌全てが陽性反応を示した(表10)。
Claims (11)
- LAMP法により、萎黄病菌由来の核酸を増幅するためのプライマーセットであって:
配列番号1の配列により示されるポリヌクレオチドもしくは配列番号1の配列により示されるポリヌクレオチドにおいて、萎黄病菌由来の核酸を増幅可能な範囲で変異を含み、該変異がF2領域(配列番号8)とF1c領域(配列番号7)との間への1〜6ヌクレオチドの配列の挿入であるポリヌクレオチドからなるFIPプライマー、
配列番号2の配列により示されるポリヌクレオチドもしくは配列番号2の配列により示されるポリヌクレオチドにおいて、萎黄病菌由来の核酸を増幅可能な範囲で変異を含み、該変異がB2領域(配列番号10)とB1c領域(配列番号9)との間への1〜6ヌクレオチドの配列の挿入であるポリヌクレオチドからなるBIPプライマー、
配列番号3の配列により示されるポリヌクレオチドからなるF3プライマー、および
配列番号4の配列により示されるポリヌクレオチドからなるB3プライマー
を含むプライマーセット。 - 配列番号1の配列により示されるポリヌクレオチドからなるFIPプライマー、
配列番号2の配列により示されるポリヌクレオチドからなるBIPプライマー、
配列番号3の配列により示されるポリヌクレオチドからなるF3プライマー、および
配列番号4の配列により示されるポリヌクレオチドからなるB3プライマーを含む請求項1に記載のプライマーセット。 - さらに、
配列番号5の配列により示されるポリヌクレオチドからなるLFプライマー、および
配列番号6の配列により示されるポリヌクレオチドからなるLBプライマーから選択される1つ以上
を含む請求項1または2に記載のプライマーセット。 - 前記LFプライマーおよび前記LBプライマーの双方を含む請求項3に記載のプライマーセット。
- 萎黄病菌の検出方法であって、
検体から核酸を抽出すること、
請求項1〜4のいずれか一項に記載のプライマーセットを用いて、前記核酸を鋳型にLAMP法によってDNAの増幅反応を行うこと、
増幅産物があると判断された場合に検体に萎黄病菌が存在すると判断することを含む、検出方法。 - 検体が土壌である請求項5に記載の検出方法。
- LAMP法により、萎黄病菌および炭疽病菌からなる群より選択される1つ以上の糸状菌由来の核酸を増幅するための複合プライマーセットであって:
請求項1〜4のいずれか一項に記載のプライマーセット、ならびに
配列番号11の配列により示されるポリヌクレオチドからなるFIPプライマー、
配列番号12の配列により示されるポリヌクレオチドからなるBIPプライマー、
配列番号13の配列により示されるポリヌクレオチドからなるF3プライマー、および
配列番号14の配列により示されるポリヌクレオチドからなるB3プライマーを含むプライマーセット
を含む複合プライマーセット。 - さらに、
配列番号15の配列により示されるポリヌクレオチドからなるLFプライマー、および
配列番号16の配列により示されるポリヌクレオチドからなるLBプライマーから選択される1つ以上
を含む請求項7に記載の複合プライマーセット。 - 前記LFプライマーおよび前記LBプライマーの双方を含む請求項8に記載の複合プライマーセット。
- 萎黄病菌および炭疽病菌からなる群より選択される1つ以上の糸状菌の検出方法であって、
検体から核酸を抽出すること、
請求項7〜9のいずれか一項に記載の複合プライマーセットを用いて、前記核酸を鋳型にLAMP法によってDNAの増幅反応を行うこと、
前記増幅反応後のDNAの二本鎖への会合曲線解析により、検体における上記糸状菌の存在の有無および存在する糸状菌の種類の数を判断することを含む、検出方法。 - 請求項1〜4のいずれか一項に記載のプライマーセット、鎖置換型DNA合成酵素、dNTPs及び緩衝液を含む、萎黄病菌の検出用キット。
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