KR20060004246A - 고추역병균 파이토프쏘라 캡시사이 진단용 디엔에이표지인자 - Google Patents

Abstract

본 발명은 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)을 이용하여 고추역병균 파이토프쏘라 캡시사이(Phytophthora capsici) 균주의 DNA를 특이적으로 증폭할 수 있는 올리고뉴클레오티드, 이들 올리고뉴클레오티드를 프라이머쌍으로 하여 증폭된 DNA 단편 및 이를 프로브(probe)로 고추역병균 파이토프쏘라 캡시사이의 작물체내 및 재배 토양내 존재여부를 특이적으로 신속 정확하게 분석할 수 있는 방법과 그 키트에 관한 것이다.

고추역병균 파이토프쏘라 캡시사이 균주, DNA, 중합효소연쇄반응, 프라이머, 프로브

Description

고추역병균 파이토프쏘라 캡시사이 진단용 디엔에이 표지인자 {A DNA marker for detection of Phytophthora capsici in red pepper}

도 1은 고추역병균 파이토프쏘라 캡시사이(Phytophthora capsici)의 게놈 DNA 라이브러리(genomic DNA library)로부터 선발된 종특이적 DNA 단편의 염기서열과 파이토프쏘라 캡시사이의 특이적 검출을 위해 사용된 올리고뉴클레오티드 프라이머 CSP-1과 CSP-2 의 위치를 나타낸다.

도 2는 서열목록 1의 클론 PC22를 프로브(probe)로 11종의 다른 파이토프쏘라속 균들의 genomic DNA와 서던 하이브리다이제이션 교잡(Southern hybridization)시의 반응결과이다.

도 3의 윗 그림은 표2에 기재된 파이토프쏘라 종으로부터 분리된 DNA를 주형 DNA로 하고, CSP-1 및 CSP-2 프라이머쌍으로 PCR한 결과이고, 아래 그림은 증폭된 단편을 프로브로 하여 위에서 사용된 DNA에 대하여 서던 블롯한 결과이다.

도 4는 주형DNA의 양을 달리하였을 때, 본 발명의 검색방법의 민감도를 테스트한 결과로, 프라이머를 이용한 주형DNA의 양에 따른 프라이머의 민감도를 검토한 것이다.

도 5는 파이토프쏘라 캡시사이로부터 분리된 DNA를 유사종의 파이토프쏘라로부터 분리된 DNA와 혼합한 후 이들에 대하여 CSP-1 및 CSP-2를 프라이머쌍으로 하 여 증폭시킨 결과이다.

도 6은 고추조직으로부터 분리된 DNA의 농도를 달리하여 파이토프쏘라 캡시사이로부터 분리된 DNA와 혼합한 후 이들에 대하여 CSP-1 및 CSP-2를 프라이머쌍으로 하여 증폭시킨 결과이다.

도 7은 고추 역병에 감염된 식물조직으로부터 DNA를 분리하고 CSP-1 및 CSP-2를 프라이머쌍으로 하여 증폭시킨 결과이다.

본 발명은 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)을 이용하여 고추역병균 파이토프쏘라 캡시사이(Phytophthora capsici) 균주의 DNA를 특이적으로 증폭할 수 있는 올리고뉴클레오티드, 이들 올리고뉴클레오티드를 프라이머쌍으로 하여 증폭된 DNA 단편 및 이를 프로브(probe)로 재배 포장내 고추역병균 파이토프쏘라 캡시사이의 존재여부를 검출할 수 있는 방법과 그 키트에 관한 것이다.

고추역병균 파이토프쏘라 캡시사이는 세계적으로 널리 분포하여 경제적으로 막대한 피해를 일으키는 중요한 병원균으로 국내에서는 거의 모든 고추 재배지역에 전국적으로 분포하며 가지, 토마토, 수박, 오이, 참외, 호박 등 다양한 작물에 병을 일으킨다. 이처럼 다수의 작물에 피해를 주는 파이토프쏘라 캡시사이는 형태적으로 매우 다양하며 유전적으로도 많은 다양성을 나타내 정확한 균동정에 어려움을 주고 있다.

파이토프쏘라 캡시사이를 포함하는 파이토프쏘라(Phytophthora)속 균의 분류는 형태적 특성과 생리적 특성 및 유·무성 번식기관의 생성방법과 형태를 기준으로 총 67 종으로 분류되며 국내에는 20여종의 발생이 보고 되어 있다. 하지만 이들의 유주자낭의 형태나 형성방법 등은 여러 가지 환경조건에 민감하여 매우 가변적이며 유성생식 기관의 모양이나 형성방법도 균주와 배양조건에 따라 다소 다르게 나타나므로 형태적인 특징만으로 종을 분류하는 것은 많은 시간을 요하며 또한 전문성을 필요로 한다.

1980년대부터 분자생물학을 이용한 다양한 방법의 균분류 동정법이 등장하였는데 최근에는 게놈에 존재하는 종특이적 서열을 이용하여 좀 더 신속하고 정확하게 종을 동정할 수 있는 PCR (Polymerase Chain Reaction)법을 많이 이용하고 있다. 최근 형태적 유사종인 P. infestans에 대하여 PCR을 사용하여 특이적으로 검출하고 정량하는 방법이 알려졌지만 고추역병균 파이토프쏘라 캡시사이(P. capsici)에 있어서는 연구결과가 보고된 바 없다. 한편 ribosomal RNA의 전사영역내 ITS DNA 영역을 바탕으로 파이토프쏘라 캡시사이 검출용 primer가 제작되었으나 이 균에만 특이적으로 작용하지 못하고 다른 유사한 병원균들의 DNA와도 반응을 나타내는 문제점이 지적되었으며, 현재 파이토프쏘라 캡시사이 균주에만 특이적으로 반응하는 프라이머들은 국내외에서 개발되지 않은 실정이다.

파이토프쏘라 캡시사이는 한번 발병하면 단시간내에 급속도로 확산되어 전체 고추재배포장에 막대하게 피해를 주기 때문에 조기 진단이 필수적인데 효과적인 병 방제를 위해서는 병발생 초기에 병원균의 유무를 정확히 진단하는 것이 매우 중요하다. 따라서 이러한 종특이적인 PCR 프라이머의 개발은 빠른 시간에 파이토프쏘라 캡시사이를 손쉽게 동정하고 검출하는 것을 가능하게 하여 고추재배에 있어서 예방 및 치료에 큰 효과가 있을 것이다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하고자, 고추역병균 파이토프쏘라 캡시사이(Phytophthora capsici) 균주의 DNA 만을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머를 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 고추역병균 파이토프쏘라 캡시사이(P. capsici) 균주의 DNA에만 특이적으로 혼성화되는 DNA 프로브를 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 상기 프라이머 또는 프로브를 이용하여 이병식물체로부터 고추역병균 파이토프쏘라 캡시사이 균주를 신속하고 정확하게 검출 및 동정하는 방법과 그에 사용되는 키트를 제공하는 것이다.

본 발명은 고추역병균 파이토프쏘라 캡시사이(Phytophthora capsici) 균주의 게놈 DNA(genomic DNA) 서열정보를 이용하여 파이토프쏘라 캡시사이 균주의 DNA에 특이적으로 작용하는 프라이머를 선발하고 증폭된 단편을 프로브로 하여 파이토프쏘라 캡시사이 균주를 효과적으로 탐지 또는 동정방법 및 그에 사용될 수 있는 키트에 관한 것이다.

고추역병균 파이토프쏘라 캡시사이(P. capsici) 진단용 프라이머 제작은 다음과 같이 한다.

파이토프쏘라 캡시사이에 특이적인 게놈 DNA 단편의 분리

파이토프쏘라 캡시사이에 특이적인 게놈 DNA 단편을 분리하고자, 먼저 국내 고추재배포장으로부터 파이토프쏘라 캡시사이의 균주 95CY3119 를 분리하고 그로부터 genomic DNA 라이브러리를 구축하였다. 라이브러리에 삽입된 다양한 단편을 이용하여 11종의 파이토프쏘라 속 균주의 DNA에 대하여 서던 하이브리다이제이션을 행하였다. 그 결과 2.4kb의 단편이 파이토프쏘라 캡시사이에만 특이적으로 결합하는 영역을 포함하는 것을 확인하였다(도면2). 이 단편의 염기서열을 결정한 결과가 도면1 및 서열목록1에 나타나 있다.

파이토프쏘라 캡시사이 동정에 사용될 수 있는 프로브 및 프라이머 선별

위에서 얻은 2.4Kb의 단편으로부터 파이토프쏘라 캡시사이에 특이적인 단편을 더욱 세밀하게 분리하고자 서열목록1의 서열을 바탕으로 진리너 프로그램을 이용하여 프라이머를 설계하였다. 그 결과 프라이머쌍 CSP-1(염기목록의 서열번호 2): 5′- GACTGTACCAAAGCCCTGA - 3′와 CSP-2(염기목록의 서열번호 3): 5′- TTCATTCAGGACTTACCCG - 3′이 적절한 프라이머로 선택되었다.

CSP-1, CSP-2 프라이머쌍을 이용한 PCR 반응

표 1, 표 2에서 제시한 수종의 곰팡이들의 게놈 DNA를 추출한 후 선발한 CSP-1과 CSP-2를 이용하여 PCR 증폭을 실시하였다. 그 결과 파이토프쏘라 캡시사이의 DNA를 사용한 경우에만 350bp의 단편이 증폭되는 것이 관찰되었고 이 단편을 프로브로 하여 서던 하이브리다이제이션하였을 때에도 역시 파이토프쏘라 캡시사이의 DNA에 대해서만 양성반응을 나타내었다. 이러한 결과는 CSP-1과 CSP-2 프라이머쌍을 이용하거나 또는 이에 의해 증폭되는 단편을 프로브로 사용함으로써 파이토프쏘라 캡시사이의 존재를 동정해낼 수 있음을 구체적으로 뒷받침한다. 이하 실시예에서 구체적으로 설명한다.

[표 1] 본 발명에 사용된 고추역병으로부터 얻어진 파이토프쏘라 캡 시사이 균주

[표 2] 본 연구에서 사용된 파이토프쏘라 종 및 기타 균주

실시예 1 : 파이토프쏘라속 곰팡이 및 기타 식물병원균 DNA에 대한 CSP-1 및 CSP-2 프라이머쌍의 특이성 확인 시험

CSP-1: 5′- GACTGTACCAAAGCCCTGA - 3′와 CSP-2: 5′- TTCATTCAGGACTTACCCG - 3′를 프라이머쌍으로 이용하여 표 1 및 표2에 제시된 수 종의 곰팡이 분리균주에 대하여 다음과 같은 방법으로 DNA를 분리하였다. 동결건조된 균사체 소량을 파쇄한 뒤 400㎕의 extraction buffer [200mM Tris-HCl (pH8.0), 200mM NaCl, 30mM EDTA, 0.5% SDS]에 현탁하고 proteinase K 50㎍을 첨가, 37℃에서 1시간동안 반응시켰다. 여기에 400㎕의 2× CTAB solution을 첨가하여 섞은 뒤, chloroform : isoamyalcohol (24:1)로 추출하고 원심분리하여 얻은 상등액에 0.7 volume의 isopropanol을 첨가하여 DNA를 얻었다. TE buffer에 DNA를 녹이고 RNase를 첨가한 뒤 정량하여 4℃에 보관하였다. PCR을 행하기 위한 조건은 다음과 같다. 즉, preheating을 95℃에서 4분 한 후 95℃ 1분, 60℃ 7분, 72℃ 2분에서 각각 38회 반복하고 이후 72℃에서 8분 동안의 반응을 수행하였다. 반응산물은 total volume을 50㎕로 하고 template DNA 10ng, 각각 primer set 20pmole, 250μM dNTPs, 10× PCR buffer 5㎕, 2mM MgCl2, FastStart Taq DNA Polymerase 2unit (Promega Co.)을 첨가하였다. 그 결과는 다음 도 3에 나타낸 바와 같이, 파이토프쏘라 캡시사이(P. capsici) 균주를 사용한 1 레인의 경우만 350bp의 밴드가 증폭되었으며 그 외 다른 파이토프쏘라 종(Phytophthora sp.), 후자리움 옥시스포럼(Fusarium oxysporum)이나 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani) 등의 다른 진균성 식물병원균들에서는 증폭된 DNA 밴드를 검출할 수 없었다. 또한 증폭된 DNA단편을 프로브로 하여 서던 블롯을 수행한 실험에서도 파이토프쏘라 캡시사이를 사용한 샘플에서만 혼성화반응을 나타냈다. 이러한 사실로부터 증폭된 단편이 실제로 파이토프쏘라 캡시사이에만 특이적으로 존재하는 서열이라는 것을 더욱 구체적으로 확인할 수 있다 (도 3 아래).

실시예 2: CSP-1과 CSP-2 프라이머의 민감도 시험

DNA 샘플양에 따른 PCR에 의한 CSP-1과 CSP-2 프라이머쌍의 증폭 민감성 정도를 측정하였다. 본 발명에 따른 파이토프쏘라 캡시사이(P. capsici)의 게놈 DNA 양을 최고 10ng에서 최저 1fg까지 조절한 다음, 여기에 CSP-1과 CSP-2 프라이머를 연속적으로 반응시켜 확인하였으며, 그 결과는 다음 도 4에 나타내었다. 그 결과, 상기 프라이머쌍을 이용하였을 때 11 레인까지 증폭산물이 나타난 것으로 미루어 최저 검출 수준은 100fg이었음을 알 수 있었다.

또한 Genomic DNA를 농도별로 희석하여 증폭한 PCR 생성물에 대해 서열목록1의 2.4kb 단편인 PC22 를 프로브로하여 혼성화시킨 결과도 마찬가지로 농도별로 밴드의 강도(intensity)에 차이가 있었다(도 4). 또한 농도가 높은 쪽은 밴드가 굵고 진하게 나타났으며, 농도가 낮아질수록 밴드도 엷어졌다. 특히 이 방법에서는 50fg까지 검출이 가능하였다.

대략적으로 병원균 포자1개의 DNA 농도가 100-500fg 사이로 알려져 있으므로 CSP1 및 CSP2를 프라이머쌍으로 사용한다면 파이토프쏘라 캡시사이에 의한 감염여부를 충분히 확인할 수 있을 것이다.

실시예 3: 유사종의 파이토프쏘라 DNA 혼합액으로부터 파이토프쏘라 캡시사이(Phytophthora capsici) 의 특이적 검출

고추역병균(파이토프쏘라 캡시사이)과 형태적으로 유사한 P. parasitica, P. palmivora, P. boehmeriae, P. citrophthora, P. infestans로부터 DNA를 얻고, 이들을 P. capsici의 DNA와 같은 비율로 혼합한 후 CSP-1과 CSP-2 프라이머를 이용해 위와 동일한 방법으로 PCR 증폭을 실시하였다. 그 결과 P. capsici가 들어있는 샘플에서만 350bp의 PCR 산물이 증폭되는 것을 확인할 수 있었다. 이 결과는 본 발명 의 프라이머를 사용함으로써 파이토프쏘라 캡시사이의 감염여부를 명확하게 판단할 수 있다는 것을 의미한다.(도 5).

실시예 4: 감염 조직을 직접 이용한 파이토프쏘라 캡시사이의 동정방법

고추역병이 발생한 포장의 병든 고추 조직으로부터 직접 파이토프쏘라 캡시사이의 검출이 가능한지 알아보았다. 고추 조직의 DNA를 파이토프쏘라 캡시사이의 DNA에 대해 상대적인 농도구배를 한 후 CSP1과 CSP2의 프라이머쌍을 사용하여 PCR 증폭을 수행하여 파이토프쏘라 캡시사이가 검출될 수 있는 농도를 조사하였다. 파이토프쏘라 캡시사이의 DNA를 0.1ng으로 고정하고 고추(Capsicum annuum)의 genomic DNA의 농도와의 혼합비를 1:0, 1:1, 1:10, 1:100, 1:1000, 1:10000, 0:1로 높여가며 PCR을 실시한 결과 파이토프쏘라 캡시사이와 고추 DNA의 비율이 1 : 10,000에서도 파이토프쏘라 캡시사이 특이적 증폭반응을 볼 수 있었다(도 6). 또한 파이토프쏘라 캡시사이에 의해 감염된 고추 식물체내에서 본 병원균에 대한 검출력을 조사하기 위해 실제 재배 포장에서 고추역병균에 약하게 감염된 고추와 건전주를 채집하여 지제부의 일부를 잘라 CSP-1과 CSP-2 프라이머를 사용하여 위에 기술한 조건으로 PCR 증폭을 실시하였다. PCR을 실시한 결과 건전 부위의 식물체와 대조구에서는 증폭결과가 나타나지 않았지만 이병주에서는 정확하게 350bp의 증폭 산물을 확인할 수 있었다(도 7).

따라서 감염이 의심되는 고추의 조직을 소량 사용하여 본 발명의 프라이머쌍으로 PCR을 수행함으로써 파이토프쏘라 캡시사이에 의한 감염여부를 쉽게 확인할 수 있음을 알 수 있다.

이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명은 고추역병균 파이토프쏘라 캡시사이(Phytophthora capsici) 동정용 DNA 표지인자에 관한 것이다. 본 발명에 따른 프라이머 또는 프로브를 사용한 고추역병균의 진단방법은 포자하나의 농도인 100fg의 매우 적은 DNA 양으로도 역병균을 검출할 수 있을 정도로 매우 민감하고 특이성이 뛰어나 고추 생육 기간 중 수시로 식물체와 토양샘플을 채취해 감염여부를 확인할 수 있어 병의 확산 방지와 조기 방제가 가능한 효과가 있다. 또한 학문적으로도 형태적인 특성에 의존하고 있는 파이토프쏘라 캡시사이 종동정의 어려움을 쉽게 해결 할 수 있을 것이다.

<110> THE INDUSTRY & ACADEMIC COOPERATION IN CHUNGNAM NATIONAL UNIVERSITY(IAC) <120> A DNA marker for detection of Phytophthora capsici in red pepper <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 2401 <212> DNA <213> Phytophthora capsici <400> 1 aagctttctg gctcggggac gtggtagatc tcccacatca ccctttagga atttgatgag 60 atccgctaac actgggtctt ggttctggtg cgctttgatc cacctccatc gttccgctgg 120 aacacaagtg gtcccatagg atctccgggg agttcctcat ttcgaacttg cgcacgagtc 180 acagctatta gcaccttggc cgctaacggc aatggggcac acgctgctgc agggctcggt 240 tcttcagtcg tgtgaatcct gggaaccatg attctttgag acttgagcgt cgggctcttc 300 agagacatgg ggcttcatca acttctcgtg gatcttggac accagacgta agtgagtata 360 ctcgtcagcg tcctcgactt gcctcgattt acccataacc aacgtctttg acgtgaggta 420 atctgctgcc tggttgtatt cccgtttcac atgcaccagc cgcagaatcc ggaatttgtc 480 tttcagagat tcaaactccg ccaaacgtcg ttgcaagtac ggttgattgc agttaattat 540 gccctgggcc tgttgaatgg caatgcgtga gtctccaaca accacgggtt cttgggatcc 600 cacgcctcag ggctatcttc agcccgttca ccagtccgca atactagaat cgttgaccgt 660 gacatcagtc aaggcgaaac cttgagcttc aaggacgttt cttccgggaa gttcccagag 720 tatacatcca caacttccga ggcgtgttga tatctttggg gctccatcga aactcagaac 780 acatccactg tagtcagcct ccaacatctc cacgctaatc ggtgccggag gtttaacacg 840 ccccttggcc ggaatcaaat tctcagagac ttcatcgaga tgttctctgg gggtgatgcc 900 ggctcccagt atagcgggga gtccatcttc atcccgttgg accctgagga tttccaaatt 960 ccagtgagat aacatcagcc cccatttgac gaatctgcca tccgcagaac tcgaggtcaa 1020 tagccacttc aaggctgaat agcgggtata cacaatgatc actgggctcg actgtaccaa 1080 agccctgaaa ttttccagga ctctaagaat cgcgacaacc tccttctcgg cgatgtgata 1140 tcgtagctcg gaatcattca acacacgtcc tgtgaaacgg accggatgga ttactccatc 1200 gtattcctgg cctaggaccg ctgcagccca cgggtttgcg tgtggaataa tgacaaacgg 1260 cctcgcacga tctggatgtc tgagaagtgg agtcgacacg atcttgagtt tcagaatctc 1320 gaaggcttcc ttggcacggg tcaagtccct cccggctcgg atctgtttat ctgtcaactc 1380 gtacagcgta gcggcgatca cgggtaagtc ctgaatgaac ttattgtagt aattcagact 1440 ccccatgaag ctgtgtacgc ccttgagtgt cgacgggaat ggcaattctt ggactccttt 1500 ggcaaccttc ggagtggccc tcaatccttc agcactaatc tcgtgcgaca agtacgggat 1560 cgaaagtttt ccaaattcac tcttaggcaa actcacagaa atattccaat atcgcaacct 1620 gaaaagtagc gcgttcagat cttcacagag ctggtcccaa gttggagcac catgcgcgat 1680 gtcgtcaatg taggaacttc gacctaacac cggcccgata aaggacggga tagggatgtt 1740 tctctgaaag acagtcatct gtttggtgag tgcagttgat cctgaccttg agacgtcatt 1800 ctcagaaagc gcgaggggat tctcagaccc ttgaggcgtc atcttcagga aatccaatac 1860 gtcagaatcg acatctgctt cctcttcagg tgacagccgt gtgagattgc tatttccggt 1920 tttcgagcga acggtcgcgg ctctctatat gtgtgtgtgg gatatacggc ttcgggagaa 1980 agggggctgg gacgcggctg atatgtaccg gttctgtggt gtaatatttc gctttatgga 2040 ttcatccttc gcctgtttgt aaaggggtcc aacgggttgg aagtgctacc caagactgtg 2100 cacaagtctg ggcatactag cactcagtcc aaccaccgga ctttccccga cgacgagtgc 2160 ctaagttctg gcggaaagtc tctcagattg aatgtatctc tgagagacct cgtcccgtta 2220 cacccatgtg cgacgattga cggttcaagg atcctaacca agacccacaa gacccaagag 2280 gcccgaagtg cccaagtgtc atatgccgta cgtcgcctac ccaagacacc cctgaggacg 2340 ttgtgtgcat tgagcattga agctctgcac ccggaatcat cgtctcaagt caggatcaag 2400 c 2401 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Phytophthora capsici <400> 2 gactgtacca aagccctga 19 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Phytophthora capsici <400> 3 ttcattcagg acttacccg 19 <210> 4 <211> 350 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA fragment produced by PCR <400> 4 gactgtacca aagccctgaa attttccagg actctaagaa tcgcgacaac ctccttctcg 60 gcgatgtgat atcgtagctc ggaatcattc aacacacgtc ctgtgaaacg gaccggatgg 120 attactccat cgtattcctg gcctaggacc gctgcagccc acgggtttgc gtgtggaata 180 atgacaaacg gcctcgcacg atctggatgt ctgagaagtg gagtcgacac gatcttgagt 240 ttcagaatct cgaaggcttc cttggcacgg gtcaagtccc tcccggctcg gatctgttta 300 tctgtcaact cgtacagcgt agcggcgatc acgggtaagt cctgaatgaa 350

Claims (10)

1. 서열번호1로 구성되는 고추역병균 파이토프쏘라 캡시사이 종 특이적 폴리뉴클레오티드 및 그 단편.
2. 서열번호 1과 서열번호 2로 구성되는 프라이머 서열.
3. 제 1항에 있어서, 고추역병균 파이토프쏘라 캡시사이(Phytophthora capsici)의 고추역병 진단용 DNA 표지인자로 사용하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
4. 파이토프쏘라 캡시사이의 게놈 DNA를 주형으로 하고 제2항의 프라이머쌍을 사용하여 중합연쇄반응(PCR)을 수행하였을 때 증폭되는, 파이토프쏘라 캡시사이의 게놈 DNA에 특이적으로 혼성화 되는 폴리뉴클레오티드.
5. 제 4항에 있어서, 폴리뉴클레오티드는 염기목록 서열번호 4의 서열로 이루어 진 폴리뉴클레오티드.
6. (1) 감염된 작물의 일부 또는 시험하고자 하는 균주로부터 PCR을 수행하기 위한 표본을 제조하는 과정;

   (2) 제2항의 프라이머쌍을 사용하여 PCR을 수행하는 과정;

   (3) 350bp 단편의 증폭여부를 확인하는 과정;

   을 포함하는, 작물의 파이토프쏘라 캡시사이 감염여부를 확인하는 방법.
7. (1) 감염된 작물의 일부 또는 시험하고자 하는 균주로부터 핵산을 추출하여 표본을 제조하는 과정;

   (2) 제1항의 폴리뉴클레오티드 또는 제4항 과 제5항에서 선택되는 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드의 혼성화여부를 확인하는 과정;

   을 포함하는, 작물의 파이토프쏘라 캡시사이 감염여부를 확인하는 방법.
8. 적어도 하나의 용기에 제2항의 프라이머쌍을 포함하는, 작물의 파이토프쏘라 캡시사이 감염여부를 확인하기 위한 검출키트.
9. 적어도 하나의 용기에 제4항 또는 제5항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 작물의 파이토프쏘라 캡시사이 감염여부를 확인하기 위한 검출키트.
10. 적어도 하나의 용기에 제1항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 작물의 파이토프쏘라 캡시사이 감염여부를 확인하기 위한 검출키트.

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