CN103525913A - 一种辣椒疫霉菌lamp引物及其快速检测方法 - Google Patents

一种辣椒疫霉菌lamp引物及其快速检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种辣椒疫霉菌LAMP引物及其快速检测方法，专用于辣椒疫霉菌特异检测。主要设计了一种辣椒疫霉菌的LAMP引物（F3、B3，FIP、BIP），采用该引物进行恒温扩增和加入50μMCalcein-500μMMnCl2显色剂显色或琼脂糖凝胶电泳检测，可观察到绿色荧光或出现LAMP特征性的梯形带。本发明可被用于生产实践中辣椒疫霉菌感染的植株和土壤中辣椒疫霉菌的快速、灵敏、准确的检测，同时可用于田间病害的早期诊断和病菌的监测和鉴定，为辣椒疫霉菌引起的病害防治提供可靠的技术和理论依据。

Description

一种辣椒疫霉菌LAMP引物及其快速检测方法
技术领域
    本发明涉及一种辣椒疫霉菌LAMP引物及其快速检测方法，专用于辣椒疫霉菌高灵敏度快速分子检测，同时可用于田间辣椒疫病的早期诊断和病菌的监测和鉴定，属于农作物病害检测、鉴定及防治技术领域。
背景技术
辣椒疫病是一种世界范围内普遍发生的毁灭性真菌病害，其首先于1918年在美国新墨西哥州发现，引起辣椒疫病的辣椒疫霉菌Phytophthora capsici Leonian是Leon Leonian于1922年命名的，它属于植物病原卵菌。辣椒疫霉以卵孢子或厚垣孢子在土壤病残体中越冬，可以存活数月甚至更长时间，寄主范围广，主要侵染辣椒、番茄、茄子、黄瓜、南瓜等多种重要蔬菜作物。辣椒疫病露地和保护地均能发生，该病的流行致使辣椒损失严重，一般病株率为15–30％，严重时达80％以上。自1980年以来，辣椒疫病在我国蔬菜种植区域发病程度日趋加重，严重影响了蔬菜种植业的经济效益，给我国的蔬菜安全生产造成了巨大的经济损失。因此，预防与控制由辣椒疫霉引起的蔬菜疫病的爆发成为保障我国蔬菜生产的重要任务。对发病植物进行快速准确的病害诊断、对无病植物材料和植物生长环境中病原菌的及时检测和监测是控制植物病害发生、流行和成灾的重要基础。因此建立辣椒疫霉菌快速检测体系，早期对发病植株及土壤进行疫霉菌快速准确检测，对预测病害发生情况、及时采取有效的防治措施控制病原菌的传播和流行、减少经济损失都具有重要的理论和实际意义。
目前对辣椒疫霉菌的检测大多仍沿用传统的培养及鉴定方法，传统的病原菌检测技术是在分离得到病原物的基础上，通过形态学观察和柯赫氏法则来判断病原物的种类。整个过程常常需要耗费大量的劳动力和时间，一般需要几天才能完成。而且要求操作者具备专业的病原菌分离、形态学鉴定知识和丰富的经验。因此，以形态特征为基础的常规病害诊断技术，由于其耗时长，效率低，难以满足对辣椒疫病诊断的实际需要，因其很容易错过病害防治的最佳时期。因此，建立一套快速、灵敏、准确的辣椒疫霉菌检测诊断技术不仅非常必要，而且十分迫切。
PCR技术为植物病原诊断提供了快速、灵敏、准确的优势，然而目前PCR特异性检测技术仍然需要PCR仪、电泳和凝胶成像系统等昂贵的专业仪器和分子生物学试剂，且需要分子生物学专业实验人员操作，限制了PCR检测方法的推广应用。循环恒温扩增技术（Ioop-mediated isothermal amplification，简称LAMP）是2000年由日本荣研株式会社Notomi等人开发的一种新型循环恒温核酸扩增技术。LAMP反应针对靶基因的6个位点设计出4条引物，利用一种链式置换活性的DNA聚合酶（Bst DNA polymerase），在恒温条件下（60–65℃）保温30–90分钟，即可完成扩增反应。由于LAMP反应的高效性和等温快速扩增的特点，在90分钟内可扩增109–1010倍产物。LAMP扩增产物的检测一般采用荧光染料目测观察、琼脂糖凝胶电泳和浊度观察等方法。由于LAMP反应简单、快速、高效、经济等特征，因而具有极为广泛的应用前景。目前LAMP检测主要应用于人畜病原物、食品安全和环境卫生的检测，在植物病原菌检测中报道极少，辣椒疫霉菌的检测国内外均未见报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中辣椒疫霉菌的生物学检测方法所需周期长、检测方法特异性差，灵敏度低的问题，提供一种辣椒疫霉菌的LAMP检测引物以及结果可靠、易于操作、特异性强、灵敏度高的辣椒疫霉菌的快速检测方法。
实现本发明的目的包括下列步骤：
1．LAMP引物的设计
我们从GenBank中下载辣椒疫霉ITS基因（登录号：FN257934）序列，根据辣椒疫霉ITS基因序列，采用PrimerExplorer V4软件设计一种LAMP检测引物，包括2条外引物(F3 和 B3) 和 2条内引物 (FIP 和 BIP)，引物序列分别为：
F3：5’- TTGGCTTCGGCTGAACAG -3’ ；
B3：5’- GCGGGAAATTCTTGCCTGAA -3’；
FIP：5’- CGCAACAGCAAAGCCGATTCAA-ATGCTTTTCCTGCTGTGGC -3’；
BIP：5’- GGCTGTCGAGGGTCGATCCA-AGGTCCAATTGAGATGCGC -3’。
2．辣椒疫霉菌快速检测体系的建立
LAMP检测：LAMP反应体系25μl，其中F3与B3各0.25-0.30uM，FIP与BIP各1.6-1.8uM，20mM Tris-HCl，10mM (NH4)2SO4，10mM KCl，8mM MgSO4，0.1% Tween-20，0.8M Betaine，1.4 mM dNTPs，8U BstDNA 聚合酶大片段，10-50ng DNA模板，不足部分用无菌双蒸水补足；LAMP反应条件为在60-65℃温育30-90 min，80℃保温5-10min。
所述的检测方法为荧光染料目测观察法和琼脂糖凝胶电泳法。所述荧光染料目测观察法：在LAMP反应的最终扩增产物中加入1μl显色剂，所述显色剂为50μM Calcein-500μM MnCl2，显色结果观察到绿色荧光判断为阳性，橙色判断为阴性。所述琼脂糖凝胶电泳法：取2μl PCR扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，如果出现LAMP特征性的梯形带判断为阳性，没有出现扩增条带判断为阴性。
本发明建立了辣椒疫霉菌快速、简便、特异性强、灵敏度高的监测技术体系，对于辣椒疫霉菌引起病害显症之前的早期监测，确定病害防治最佳时期具有十分重要的意义。可用于带菌的植株和土壤的高灵敏度快速检测。
①当在用于辣椒组织中存在辣椒疫霉菌时，采用NaOH快速裂解法提取辣椒疫霉菌的DNA，具体过程如下：(1)将辣椒病叶或病茎洗净、晾干，剪取发病部位；(2)按1mg病叶加入10μl（0.5mol/L NaOH，0.5%PVP）计量，将组织充分磨碎成糊，在12,000g离心机中离心5min；(3)取上清20μl与等体积的0.1 mol/L的Tris-HCl（pH8.0）混合；(4)稀释10倍、100倍、1000倍液，分别取1μl原液、 10倍、100倍、1000倍液作为PCR模板进行扩增。
②当在用于辣椒土壤中存在辣椒疫霉菌时，采用土壤DNA提取法提取土壤中辣椒疫霉菌的DNA。具体方法如下：取过筛的土壤冷冻抽干24-48 h后加少量石英砂，倒入液氮充分研磨，将研磨后的土壤细粉分装至1.5 ml 离心管中，每管加入500 μl 0.4% 脱脂奶粉溶液，涡旋混匀。12000 rpm离心15 min。取上清加入等体积蛋白酶K 缓冲液，加终浓度为10 ug/ml蛋白酶K，55℃水浴1-3 h。水浴结束后，加入1/2体积的7.5 M NH4AC溶液，上下颠倒混匀。12000 rpm离心15 min。吸上清加2倍体积无水乙醇-20℃沉淀（沉淀时间1.5 h）。沉淀结束后，12000 rpm离心15 min。用70%乙醇洗涤沉淀后倾去，室温晾干。每份样品所提DNA用10 μl TE（或无菌超纯水）溶解，-20℃保存备用。
按如下LAMP反应体系和反应条件用所设计的引物进行检测：
 ①优选的LAMP反应体系25μl：包含F3与B3各0.25uM， FIP与BIP各1.6uM，20mM Tris-HCl，10mM (NH4)2SO4，10mM KCl，8mM MgSO4，0.1% Tween-20，0.8M Betaine，1.4 mM dNTPs，8U BstDNA 聚合酶大片段，25ng DNA模板，不足部分用无菌双蒸水补足；LAMP反应条件为在64℃温育60 min，80℃保温10min。
②在LAMP反应的最终扩增产物中加入1μl显色剂，所述显色剂为50μM Calcein-500μM MnCl2，显色结果观察到绿色荧光，或取2μl扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，结果出现LAMP特征性的梯形带，即可判断所述的辣椒组织或土壤中存在辣椒疫霉菌；否则所述的辣椒组织或土壤中未存在辣椒疫霉菌。
本发明适用于发病组织或土壤中辣椒疫霉菌的快速可靠的检测和鉴定，对于农业生产中辣椒疫霉菌引起的病害防治具有重要的实用价值。本发明与现有技术相比，具有以下的技术优势和积极效果：
1、结果可靠：本发明所设计出的LAMP检测引物，对辣椒疫霉菌和带辣椒疫霉菌的土样、植物组织进行了测试验证，因此结果可靠性具有充分的保证；
2、特异性强：本发明所采用的LAMP引物是针对辣椒疫霉菌ITS序列中6个不同区域设计出4条特异性引物，6个区域中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增，故特异性高。
3、灵敏度高： LAMP对辣椒疫霉菌的检测灵敏度和巢式PCR的灵敏度相当，在DNA水平上可达到10fg，比常规PCR检测高1000倍。
4、实用性好：本发明所设计出的LAMP引物，可用于带辣椒疫霉菌的组织和土壤的高灵敏度快速检测，因此本方法的实用性强，可满足对带菌组织和土壤中存在的辣椒疫霉菌进行快速可靠的检测和鉴定的需要。
5、操作简便快速：应用本发明方法，对带辣椒疫霉菌的组织和土壤进行检测可在1小时内完成，且LAMP核酸扩增是在等温条件下进行，只需一个水浴锅即可，不需要复杂的仪器设备和昂贵的分子试剂，结果肉眼直接可见。
  
附图说明
图1为本发明辣椒疫病菌的特异LAMP检测结果图。图1中A表示琼脂糖凝胶电泳检测结果，其中：泳道M为DL 2000 DNA marker，泳道5为阴性对照，泳道6为阳性对照，泳道1-3为辣椒疫霉菌，泳道4为其他卵菌和真菌菌株；图1中B表示显色结果，其中：第5管为阴性对照，第6管为阳性对照，第1–3管为辣椒疫霉菌，第4管为其他卵菌和真菌菌株。
 
图2为本发明辣椒疫病菌的LAMP灵敏性检测结果图。图2中A表示琼脂糖凝胶电泳检测结果，其中：泳道M为DL 2000 DNA marker，泳道1为阴性对照，2–8模板浓度分别为10ng, 1ng, 100 pg, 10 pg, 1 pg, 100 fg, 10 fg, and 1 fg；图2中B表示显色结果，其中：第2–8管模板浓度分别为10ng, 1ng, 100 pg, 10 pg, 1 pg, 100 fg, 10 fg, and 1 fg。
 
图3为本发明对发病植株和薯块的检测结果图。图3中A表示琼脂糖凝胶电泳检测结果，其中：泳道1为阴性对照，泳道2为阳性对照，泳道3为健康组织，泳道4为发病土壤，泳道5为发病组织；泳道M为DL 2000 DNA marker；图3中B表示显色结果，其中：第1管为阴性对照，第2管为阳性对照，第3管为健康组织，第4管为发病土壤，第5管为发病组织。
  
具体实施方式
本发明的技术内容包括辣椒疫霉菌的LAMP检测引物，LAMP引物序列分别为：
F3：5’- TTGGCTTCGGCTGAACAG -3’ ；
B3：5’- GCGGGAAATTCTTGCCTGAA -3’；
FIP：5’- CGCAACAGCAAAGCCGATTCAA-ATGCTTTTCCTGCTGTGGC -3’；
BIP：5’- GGCTGTCGAGGGTCGATCCA-AGGTCCAATTGAGATGCGC -3’。
利用LAMP引物检测辣椒疫霉菌显色结果可观察到绿色荧光或琼脂糖凝胶电泳出现LAMP特征性的梯形带。
主要试剂：BstDNA 聚合酶大片段购自英国NEB公司；DNA marker 购自宝生物工程大连有限公司；其余试剂均购自上海生工生物技术有限公司。引物由上海生工生物技术有限公司合成。
实施例1：LAMP引物对辣椒疫霉菌的特异性扩增及引物序列的验证
本发明的关键性技术是辣椒疫霉菌的高效特异扩增的引物序列及其扩增方法。为了验证辣椒疫霉菌的特异引物序列，本发明以辣椒疫霉菌、11种疫霉属和腐霉属卵菌及22种不同真菌为供试材料，采用CTAB法提取组织中辣椒疫霉菌的DNA。具体方法如下：取50mg 冷冻干燥后的菌丝粉于1.5ml离心管中，加入900μl 2% CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)提取液（提取液的配方为：2% CTAB；100 m mol/L Tris-HCl（三羟甲基氨基甲烷盐酸盐）, PH 8.0；20mmol/L EDTA（乙二胺四乙酸二钠）, pH8.0；1.4 mol/L NaCl）和90μl 10% SDS（十二烷基苯磺酸钠）后混匀,于55～60℃水浴1.5 h,每10 min振荡混匀一次,水浴1.5h后离心（12,000rpm）15min，取上清液加入与上清液等体积的酚/氯仿/异戊醇（酚、氯仿和异戊醇的体积比为25:24:1）,离心(12,000rpm)5 min，取上清液（水相），加入与上清液等体积的氯仿抽提一次（12,000rpm）离心5min，吸上清(350μl），加0.1体积(35μl)的3mol/L NaAC溶液和2体积（700μl）的冰无水乙醇,-20℃下沉淀30min后12,000rpm离心5 min,轻轻地倒去上清液，加入700μl冰70%乙醇进行洗涤（稍离心，倾掉上清），在超净工作台上自然晾干无酒精味后用1×TE（10mmol/L Tris-HCl,0.1mmol/L EDTA, pH8.0）溶液进行溶解，得到DNA溶液，用紫外分光光度计检测DNA浓度并稀释至50ng/μl待用。
对供试菌株和36株辣椒疫霉菌的特异性进行LAMP验证。
①LAMP反应体系25μl：包含F3与B3各0.25uM， FIP与BIP各1.6uM，20mM Tris-HCl，10mM (NH4)2SO4，10mM KCl，8mM MgSO4，0.1% Tween-20，0.8M Betaine，1.4 mM dNTPs，8U BstDNA 聚合酶大片段，25ng DNA模板，不足部分用无菌双蒸水补足。LAMP反应条件为在64℃温育60 min，80℃保温10min。
②在LAMP反应的最终扩增产物中加入1μl显色剂，所述显色剂为50μM Calcein-500μM MnCl2，显色结果观察到绿色荧光判断为阳性，橙色判断为阴性。或取2μl扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，如果出现LAMP特征性的梯形带判断为阳性，没有出现扩增条带判断为阴性。
结果：除了辣椒疫霉菌显色结果可观察到绿色荧光或琼脂糖凝胶电泳检测出现LAMP特征性的梯形带外，检测了11种其他卵菌及22种真菌菌株显色结果为橙色或琼脂糖凝胶电泳没有出现扩增条带，部分结果见图1。这说明该引物具有很强的特异性，可被用于生产实践中发病组织及土壤中辣椒疫霉菌快速可靠的检测和鉴定。
 
实施例2：LAMP引物对辣椒疫霉菌的灵敏性检测
1．辣椒疫霉菌的LAMP灵敏性检测
采用10倍浓度系列稀释法将提取的辣椒疫霉菌DNA稀释成10ng, 1ng, 100 pg, 10 pg, 1 pg, 100 fg, 10 fg, and 1 fg共10个不同浓度梯度。
①LAMP反应体系25μl：包含F3与B3各0.25uM， FIP与BIP各1.6uM，20mM Tris-HCl，10mM (NH4)2SO4，10mM KCl，8mM MgSO4，0.1% Tween-20，0.8M Betaine，1.4 mM dNTPs，8U BstDNA 聚合酶大片段，25ng DNA模板，不足部分用无菌双蒸水补足；LAMP反应条件为在64℃温育60 min，80℃保温10min。
②在LAMP反应的最终扩增产物中加入1μl显色剂，所述显色剂为50μM Calcein-500μM MnCl2，显色结果观察到绿色荧光判断为阳性，橙色判断为阴性。或取2μl扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，如果出现LAMP特征性的梯形带判断为阳性，没有出现扩增条带判断为阴性。
2．检测结果：辣椒疫霉菌LAMP灵敏性检测结果见图2，显色结果可观察到绿色荧光或琼脂糖凝胶电泳出现LAMP特征性的梯形带，检测灵敏度可达10fg。
实施例3：发病组织或土壤中辣椒疫霉菌的检测
1．样品采集：植物组织样品采自福建福州、广东韶关、和江西南昌辣椒生产基地；土壤样品采自福建省宁德辣椒生产基地。
2．DNA提取及检测
发病植物组织采用NaOH快速裂解法提取辣椒疫霉菌DNA。具体过程如下：(1)将辣椒病叶或病茎洗净、晾干，剪取发病部位；(2)按1mg病叶加入10μl（0.5mol/L NaOH，0.5%PVP）计量，将组织充分磨碎成糊，在12,000g离心机中离心5min；(3)取上清20μl与等体积的0.1 mol/L的Tris-HCl（pH8.0）混合；(4)稀释10倍、100倍、1000倍液，分别取1μl原液、 10倍、100倍、1000倍液作为PCR模板进行扩增。
发病土壤采用土壤DNA提取法提取辣椒疫霉菌的DNA。具体方法如下：取过筛的土壤冷冻抽干24-48 h后加少量石英砂，倒入液氮充分研磨，将研磨后的土壤细粉分装至1.5 ml 离心管中，每管加入500 μl 0.4% 脱脂奶粉溶液，涡旋混匀。12000 rpm离心15 min。取上清加入等体积蛋白酶K 缓冲液，加终浓度为10 ug/ml蛋白酶K，55℃水浴1-3 h。水浴结束后，加入1/2体积的7.5 M NH4AC溶液，上下颠倒混匀。12000 rpm离心15 min。吸上清加2倍体积无水乙醇-20℃沉淀（沉淀时间1.5 h）。沉淀结束后，12000 rpm离心15 min。用70%乙醇洗涤沉淀后倾去，室温晾干。每份样品所提DNA用10 μl TE（或无菌超纯水）溶解，-20℃保存备用。
按下述方法进行LAMP检测：
①LAMP反应体系25 μl：包含F3与B3各0.25uM， FIP与BIP各1.6uM，20mM Tris-HCl，10mM (NH4)2SO4，10mM KCl，8mM MgSO4，0.1% Tween-20，0.8M Betaine，1.4 mM dNTPs，8U BstDNA 聚合酶大片段，25ng DNA模板，不足部分用无菌双蒸水补足；LAMP反应条件为在64℃温育60 min，80℃保温10min。
②在LAMP反应的最终扩增产物中加入1μl显色剂，所述显色剂为50μM Calcein-500μM MnCl2，显色结果观察到绿色荧光判断为阳性，橙色判断为阴性。或取2μl扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，如果出现LAMP特征性的梯形带判断为阳性，没有出现扩增条带判断为阴性。
3．检测结果
如图3所示，发病组织或土壤中感染辣椒疫霉菌，显色结果可观察到绿色荧光或琼脂糖凝胶电泳出现LAMP特征性的梯形带，健康组织显色结果则观察到橙色荧光或琼脂糖凝胶电泳未出现LAMP特征性的梯形带。

Claims (4)

1.一种辣椒疫霉菌的LAMP引物，其特征在于：所述LAMP引物序列如下：
F3：5’- TTGGCTTCGGCTGAACAG -3’ ；
B3：5’- GCGGGAAATTCTTGCCTGAA -3’；
FIP：5’- CGCAACAGCAAAGCCGATTCAA-ATGCTTTTCCTGCTGTGGC -3’；
BIP：5’- GGCTGTCGAGGGTCGATCCA-AGGTCCAATTGAGATGCGC -3’。
2.一种利用权利要求1所述引物的辣椒疫霉菌LAMP快速检测方法，其特征在于： LAMP反应体系25μl，其中F3与B3各0.25-0.30uM，FIP与BIP各1.6-1.8uM，20mM Tris-HCl，10mM (NH4)2SO4，10mM KCl，8mM MgSO4，0.1% Tween-20，0.8M Betaine，1.4 mM dNTPs，8U BstDNA 聚合酶大片段，10-50ng DNA模板，不足部分用无菌双蒸水补足；LAMP反应条件为在60-65℃温育30-90 min，80℃保温5-10min。
3.根据权利要求2所述的辣椒疫霉菌LAMP快速检测方法，其特征在于：在LAMP反应的扩增产物中加入1μl显色剂，所述显色剂为50μM Calcein-500μM MnCl2，显色结果观察到绿色荧光判断为阳性，橙色判断为阴性；或取2μl扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，如出现梯形条带判断为阳性，没有出现则判断为阴性。
4.根据权利要求2所述的辣椒疫霉菌LAMP快速检测方法，其特征在于：所述的LAMP反应体系中， F3与B3优选为0.25uM， FIP与BIP优选为1.6uM，DNA模板优选为25ng；LAMP反应条件优选为在64℃温育60 min，80℃保温10min。
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