CN105331716B

CN105331716B - 豇豆疫霉菌lamp检测引物及其检测方法

Info

Publication number: CN105331716B
Application number: CN201510822386.9A
Authority: CN
Inventors: 陈庆河; 翁启勇; 李本金; 刘裴清; 刘小丽
Original assignee: Institute of Plant Protection of FAAS
Current assignee: Institute of Plant Protection of FAAS
Priority date: 2015-11-24
Filing date: 2015-11-24
Publication date: 2018-10-02
Anticipated expiration: 2035-11-24
Also published as: CN105331716A

Abstract

本发明公开了一种豇豆疫霉菌LAMP检测引物及其检测方法，专用于豇豆疫霉菌特异检测。主要采用设计了一种豇豆疫霉菌的LAMP引物，经过LAMP恒温扩增后显色反应或琼脂糖凝胶电泳检测，可观察到绿色荧光或出现LAMP特征性的梯形带。所发明的LAMP引物及其用法可被用于生产实践中豇豆疫病的快速、灵敏、准确的检测，同时可用于田间病害的早期诊断和病菌的监测和鉴定，为豇豆疫病的防治提供可靠的技术和理论依据。

Description

豇豆疫霉菌LAMP检测引物及其检测方法

技术领域

本发明豇豆疫霉菌LAMP检测引物及其检测方法，专用于豇豆疫霉菌高灵敏度快速LAMP检测，同时可用于田间豇豆疫病的早期诊断和病菌的监测和鉴定，属于农作物病害检测、鉴定及防治技术的领域。

背景技术

由豇豆疫霉菌(Phytophthora vignae)侵染所致的豇豆疫病是豇豆成株期主要病害，适宜发病温度为25-28 ℃，并且随着雨水增多、湿度增大，病害亦趋严重，所以春季连续阴雨和梅雨期间是疫病高发期。其次，若通风不好、排水不良、施用不腐熟基肥或连作地，发病亦较重。其病原豇豆疫霉菌(Phytophthora vignae)是疫霉属卵菌，隶属于藻菌界，卵菌门，卵菌纲，霜霉目，腐霉科。目前为止，对该病害的检测诊断主要是症状诊断和病原分离鉴定。症状识别方法如下：（1）茎部发病症状：茎部发病多发生在节部，初呈水渍状，无明显边缘，病斑扩展绕茎一周后，表皮变褐色，病茎以上叶片迅速萎蔫死亡；（2）叶片发病症状：叶片发病初生暗绿色水渍状圆形病斑，边缘不明显，天气潮湿时，病斑迅速扩大，可蔓延至整个叶片，表面有明显的白色霉状物，引起腐烂，天气干燥时，病斑变淡褐色，叶片干枯；（3）豆荚发病症状：豆荚产生暗绿色水渍状病斑，边缘不明显，后期病部软化，表面产生白霉；病原菌鉴定方法如下：在培养茎上菌丝体生长茂密；菌丝无隔透明，粗4-7μm；菌丝膨大体不规则结节状。在皮氏液中形成大量孢子囊，孢囊梗不分枝，与菌丝无明显区别。孢子囊多为卵形，椭圆形或倒梨形，形状和大小变化较大，在PDA上为21-42μm×10-19μm，平均28.1μm×16.3μm，在豇豆病荚上为35-57μm×25-38μm，平均53.0μm×33.8μm，长宽比值为1.4-2.2，平均1.65；绝大多数无乳突或无明显乳突，平均高0.57μm；成熟后不脱落，具内层出现象。未见厚垣孢子。产生大量有性器官，藏卵器近球形，无色，直径24-38（平均28.4）μm。雄器近球形，围生。卵孢子近球形，淡黄色，平滑，18-25μm×14-24μm，平均23.0μm×20.8μm。而关于豇豆疫霉菌的PCR分子检测国内外尚未见报道，传统的病原菌检测方法程序繁琐，所需时间长，且必须拥有病原菌详细的分类资料，满足不了病害控制中快速、灵敏、稳定的检测要求。因此，建立一套快速、灵敏、准确的豇豆疫霉菌检测技术非常必要且十分迫切。

目前，对植物病害的传统检测鉴定方法是首先进行病菌分离，通过对已经分离并纯化的病菌进行培养，观察，完成形态上的鉴定工作。同时，将病原菌回接到植株中，进行致病性的验证。最后，对照已有的分类资料确定引起病害的病原菌的分类和地位。该法作为最基本的病原菌鉴定方法在一直以来被广泛使用，有着很强实用性，是病原菌的鉴定及病害检测的方法之一，但是该方法受人为因素和环境的影响，对操作者的实验技能和实际经验有很高的要求，十分耗时，无法达到快速检验的要求。

免疫学检测技术（Immunological technology）具有操作简单、特异性强，以及检测时间短的优点，适合开发检测试剂盒。但其不能对检测对象进行扩增，所以灵敏度不及核酸检测技术高。另外，抗体的制作过程耗时、复杂，提高了检测的成本。这两点缺点限制了免疫学检测技术的推广使用。

聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是一种利用DNA聚合酶在体外大量扩增靶序列的技术，该技术是病原检测最常规的方法之一，广泛应用于病原鉴定、变异检测等分子生物学研究。PCR检测技术灵敏度高、特异性强，已成为病原菌检测重要的技术之一，主要包括常规PCR、巢式PCR（Nest-PCR）和实时荧光定量PCR等，主要的缺点是需要依靠PCR等仪器设备，不利于基层生产上推广应用。

环介导等温扩增（Loop-mediated Isthermal Amplification，LAMP）技术是由日本科学家开发的一种最新的简便、快速、准确及廉价的核酸高效扩增方法（Notomi et al.,2000）。LAMP技术是一种新型的核酸恒温扩增方法。该技术在等温条件下，可在短时间内使产物得到大量扩增，在短短的30min~60min内就能实现10⁹~10¹⁰倍的扩增，同时具有很高的灵敏度和特异性，且操作简便，检测结果可肉眼判断，反应结束后用肉眼观察是否产生焦磷酸镁沉淀，即可判断靶序列是否存在。亦可在反应液中加入荧光指示剂，使反应结果的肉眼观察更加的方便、直观和可靠。LAMP技术操作简单、快速高效，而且检测特异性非常强，其最大的优势就是在恒温条件即可进行扩增反应，无需特殊实验设备，相较于普通PCR技术，其有很多优点。

综上，目前病害检测方法主要采用传统的病原分离检测方法和分子检测等技术。传统检测方法耗时、耗力，且检测结果可靠性低，免疫学检测技术的灵敏度较低，且抗体的制作过程耗时、复杂，检测成本高，PCR技术虽然快速、准确，但需昂贵的仪器设备，检测成本高，不适宜在基层部门推广应用。而最近科学家们研发出的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技术是一种高效率的核酸等温扩增方法，该方法短时间内实现产物的大量扩增，灵敏度比PCR高，且操作步骤简便，无需特殊设备，检测结果可由肉眼判断，极适合于在基层生产部门推广应用。基于环介导等温扩增（LAMP）技术，建立豇豆疫霉菌的LAMP检测技术，根据LAMP技术原理，选取豇豆疫霉菌的核糖体基因上的内转录间隔区(Internal Transcribed Spacer, ITS)靶序列的6个区域，进而设计出4条特异性引物，通过对反应体系和反应条件的优化，以钙黄绿素（Calcein）的荧光显色指示剂作用，建立可视化LAMP检测技术。该体系对豇豆疫霉菌检测具有高的特异性与灵敏性。该技术是一种操作简单、灵敏度和特异性高的快速检测手段；无需特殊仪器设备，同时开发的快速检测试剂盒适合田间作物生产中开展实地检测与监测，从而保障作物健康生产及食品安全。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中豇豆疫霉菌的传统检测方法所需周期长、检测方法特异性差，PCR检测需要依靠扩增仪等设备，且灵敏度低的问题，提供一种豇豆疫霉菌的LAMP检测引物以及结果可靠、易于操作、特异性强、灵敏度高的检测方法。

实现本发明的目的包括下列步骤：

1．LAMP引物的设计

根据豇豆疫霉菌核糖体内转录间隔区（rDNA-ITS）序列在疫霉菌种间高度变异和种内稳定性，采用PrimerExplorer V4软件设计了对豇豆疫霉菌具有特异扩增作用的LAMP检测引物，包括2条外引物(F3 和 B3) 和 2条内引物 (FIP 和 BIP)，引物序列分别为：

F3: CTTGGCTCTCTTCCTTCCG；

B3: TCCTCCATTAAACGCCGC ；

FIP: TTCAAGGGACTCGCAGGCAG-TGTAGTCGGTGGATGGAGAC ；

BIP: TTGCTCGAAAAGCGTGACGTTG-AGCAGACAAACTGGTCGC；

2．豇豆疫霉菌快速检测体系的建立

LAMP检测：25μl反应体系中F3和B3引物浓度各为0.2 mmol/L，FIP和BIP引物浓度各1.6 mmol/L，20mM Tris-HCl，10mM (NH₄)₂SO₄，10mM KCl，8mM MgSO₄，甜菜碱0.8 mol/L，Bst 聚合酶为8 U，dNTPs 1.0 mmol/L，钙黄绿素50 μmol/L，氯化锰500 μmol/L，TWeen-200.1%，模板DNA 50~100 ng，不足部分用无菌双蒸水补足；LAMP反应条件为在63-65℃温育45-60 min，85℃灭活5-10min。

所述的检测方法为荧光染料目测观察法或琼脂糖凝胶电泳法。所述荧光染料目测观察法：在LAMP反应后，显色结果观察到绿色荧光判断为阳性，橙色判断为阴性。所述琼脂糖凝胶电泳法：取2μl PCR扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，如果出现LAMP特征性的梯形带判断为阳性，没有出现扩增条带判断为阴性。

该方法可用于带菌的植株的高灵敏度快速检测。建立豇豆疫霉菌快速、简便、特异性强、灵敏度高的监测技术体系，对于豇豆疫病显症之前的早期监测，确定病害防治最佳时期具有十分重要的意义。

本发明的关键性技术是豇豆疫霉菌的高效特异扩增的引物序列及其扩增方法。为了验证豇豆疫霉菌检测的特异性，本发明以采集分离的20株豇豆疫霉菌和25种其它疫霉菌或病原真菌为供试材料，对检测的特异性进行LAMP验证。

除了20株豇豆疫霉菌显色结果可观察到绿色荧光或琼脂糖凝胶电泳检测出现LAMP特征性的梯形带外，检测了25种其它疫霉菌或病原真菌菌株的显色结果为橙色或琼脂糖凝胶电泳没有出现扩增条带。这说明该引物可被用于生产实践中豇豆疫霉菌快速可靠的检测和鉴定。

当在用于豇豆组织中存在疫霉病菌的检测时，采用NaOH快速裂解法提取豇豆疫霉菌的DNA，具体过程如下：(1)将豇豆病叶或病茎洗净、晾干，剪取发病部位；(2)按1mg病叶加入10μl（0.5mol/L NaOH，0.5%PVP）计量，将组织充分磨碎成糊，在12,000g离心机中离心5min；(3)取上清20μl与等体积的0.1 mol/L的Tris-HCl（pH8.0）混合；(4)稀释10倍、100倍、1000倍液，分别取1μl原液、10倍、100倍、1000倍液作为PCR模板进行扩增。

按如下LAMP反应体系和反应条件用所设计的引物进行检测：

①LAMP反应体系25μl：25μl反应体系中F3和B3引物浓度各为0.2 mmol/L，FIP和BIP引物浓度各1.6 mmol/L，20mM Tris-HCl，10mM (NH₄)₂SO₄，10mM KCl，8mM MgSO₄，甜菜碱0.8 mol/L，Bst 聚合酶为8 U，dNTPs 1.0 mmol/L，钙黄绿素50 μmol/L，氯化锰500 μmol/L，TWeen-20 0.1%，模板DNA 50~100 ng，不足部分用无菌双蒸水补足；LAMP反应条件为在63-65℃温育45-60 min，85℃灭活5-10min。

②在LAMP反应后，显色结果观察到绿色荧光，或取2μl扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，结果出现LAMP特征性的梯形带，即可判断所述的豇豆植物组织中存在豇豆疫霉病菌；否则所述的豇豆植物组织中未存在豇豆疫霉病菌。

本发明有益效果：本发明方法适用于植株中豇豆疫霉病菌的LAMP检测和鉴定，对于豇豆种植中豇豆疫霉菌引起的病害防治具有重要的实用价值。本发明与现有技术相比，具有以下的技术优势和积极效果：

1、结果可靠：本发明所设计出的LAMP检测引物，已经对采集分离的20株豇豆疫霉菌和25种其它疫霉菌或病原真菌为供试材料进行了测试验证，因此结果可靠性具有充分的保证；

2、特异性强：本发明所采用的LAMP引物是针对豇豆疫霉菌核糖体内转录间隔区（rDNA-ITS）序列中6个不同区域设计出4条特异性引物，6个区域中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增，故特异性强。

3、灵敏度高： LAMP对豇豆疫霉菌的检测灵敏度在DNA水平上可达到100fg，具有很高的灵敏性。

4、实用性好：本发明所设计出的LAMP引物，可用于豇豆疫霉菌的高灵敏度快速检测，因此本方法的实用性强，可满足豇豆疫霉菌进行快速可靠的检测和鉴定的需要；

5、操作简便快速：应用本发明方法，对豇豆疫霉菌进行检测可在1小时内完成，且LAMP核酸扩增是在等温条件下进行，只需一个恒温设备即可，不需要复杂的仪器设备和昂贵的分子试剂，结果肉眼直接可见。

附图说明

图1为本发明豇豆疫霉菌的LAMP特异性检测结果图。图1（下）表示琼脂糖凝胶电泳检测结果，图1（上）表示可视化显色结果，其中：泳道1为DL 2000 DNA marker，泳道2-6为豇豆疫霉菌DNA，泳道7-12为其他真菌菌株DNA（见实施例1）。

图2为本发明豇豆疫霉菌的LAMP灵敏性检测结果图。图2（上）表示PCR检测扩增后的琼脂糖凝胶电泳检测结果，图2（下）表示LAMP扩增后的显色结果，其中：泳道M为DNAmarker，泳道1–9模板DNA 浓度分别为100 ng, 10 ng,1 ng, 100 pg, 10 pg, 1 pg, 100fg, 10 fg, 1 fg/ 25 μL LAMP反应体系。（见实施例2）。

具体实施方式

本发明的技术内容包括豇豆疫霉菌的LAMP检测引物，LAMP引物及其序列分别为：

F3: CTTGGCTCTCTTCCTTCCG；

B3: TCCTCCATTAAACGCCGC；

FIP: TTCAAGGGACTCGCAGGCAG-TGTAGTCGGTGGATGGAGAC；

BIP: TTGCTCGAAAAGCGTGACGTTG-AGCAGACAAACTGGTCGC；

利用LAMP引物检测豇豆疫霉菌显色结果可观察到绿色荧光或琼脂糖凝胶电泳出现LAMP特征性的梯形带。

主要试剂：BstDNA 聚合酶大片段购自英国NEB公司；DNA marker 购自宝生物工程大连有限公司；其余试剂均购自生工生物（上海）技术有限公司。引物由生工生物（上海）技术有限公司合成。

实施例1：LAMP引物对豇豆疫霉菌的特异性扩增

1．豇豆疫霉菌的LAMP特异检测

①LAMP反应体系：25μl反应体系中F3和B3引物浓度各为0.2 mmol/L，FIP和BIP引物浓度各1.6 mmol/L，20mM Tris-HCl，10mM (NH₄)₂SO₄，10mM KCl，8mM MgSO₄，甜菜碱0.8mol/L，Bst 聚合酶为8 U，dNTPs 1.0 mmol/L，钙黄绿素50 μmol/L，氯化锰500 μmol/L，TWeen-20 0.1%，模板DNA 50 ng，不足部分用无菌双蒸水补足；LAMP反应条件为在65℃温育50 min，85℃灭活10min。

②在LAMP反应后，显色结果观察到绿色荧光判断为阳性，橙色判断为阴性。或取2μl扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，如果出现LAMP特征性的梯形带判断为阳性，没有出现扩增条带判断为阴性。

2．检测结果

检测的特异性：除了20株豇豆疫霉菌显色结果可观察到绿色荧光或琼脂糖凝胶电泳检测出现LAMP特征性的梯形带外，检测了25种其它疫霉菌或病原真菌的显色结果为橙色或琼脂糖凝胶电泳没有出现扩增条带。（部分结果见图1），说明此引物具有很强的特异性。

实施例2：LAMP引物对豇豆疫霉菌的灵敏性检测

1．豇豆疫霉菌的LAMP灵敏性检测

采用10倍浓度系列稀释法将提取的豇豆疫霉菌DNA稀释成100 ng, 10 ng,1 ng,100 pg, 10 pg, 1 pg, 100 fg, 10 fg, 1 fg /μL，共9个不同浓度梯度。

①LAMP反应体系：25μl反应体系中F3和B3引物浓度各为0.2 mmol/L，FIP和BIP引物浓度各1.6 mmol/L，20mM Tris-HCl，10mM (NH₄)₂SO₄，10mM KCl，8mM MgSO₄，甜菜碱0.8mol/L，Bst 聚合酶为8 U，dNTPs 1.0 mmol/L，钙黄绿素50 μmol/L，氯化锰500 μmol/L，TWeen-20 0.1%，模板DNA100 ng，不足部分用无菌双蒸水补足；LAMP反应条件为在65℃温育60 min，85℃灭活5min。

2．检测结果：豇豆疫霉菌LAMP灵敏性检测，显色结果可观察到绿色荧光或琼脂糖凝胶电泳出现LAMP特征性的梯形带，检测灵敏度可达100fg（见图2）。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建省农业科学院植物保护研究所

<120> 豇豆疫霉菌LAMP检测引物及其检测方法

<130> 4

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cttggctctc ttccttccg

19

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tcctccatta aacgccgc

18

<210> 3

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ttcaagggac tcgcaggcag tgtagtcggt ggatggagac

40

<210> 4

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ttgctcgaaa agcgtgacgt tgagcagaca aactggtcgc

40

Claims

1.一种豇豆疫霉菌LAMP检测引物，其特征在于：所述LAMP引物如下：

F3: CTTGGCTCTCTTCCTTCCG；

B3: TCCTCCATTAAACGCCGC；

FIP: TTCAAGGGACTCGCAGGCAG-TGTAGTCGGTGGATGGAGAC；

BIP: TTGCTCGAAAAGCGTGACGTTG-AGCAGACAAACTGGTCGC。

2.一种如权利要求1所述的豇豆疫霉菌LAMP检测引物在田间豇豆疫病病菌的监测和鉴定中的应用。