CN104928397A

CN104928397A - 豇豆疫霉菌pcr检测引物及其检测方法

Info

Publication number: CN104928397A
Application number: CN201510414609.8A
Authority: CN
Inventors: 兰成忠; 阮宏椿; 姚婂爱; 吴玮
Original assignee: Institute of Plant Protection of FAAS
Current assignee: Institute of Plant Protection of FAAS
Priority date: 2015-07-15
Filing date: 2015-07-15
Publication date: 2015-09-23
Anticipated expiration: 2035-07-15
Also published as: CN104928397B

Abstract

本发明提供豇豆疫霉菌PCR检测引物及其检测方法，所述引物包括上游引物PVF：5^，- CTCAGAATGGCCAAGGT TTC-3^，和下游引物PVR：5^，- CGTTCCG CGAGACTTT TCTA-3^，），在所述引物的基础上建立豇豆疫霉菌PCR检测方法，经琼脂糖凝胶电泳，可在豇豆疫霉菌纯DNA、带豇豆疫霉菌的发病组织中特异性地扩增出片段大小为375bp的扩增产物。本发明的检测引物和检测方法检测豇豆疫霉菌具有特异性强、灵敏度高、检测过程操作简便快速的优点，可用于田间豇豆疫病的早期诊断和病菌的监测和鉴定，为豇豆疫霉菌引起病害的防治提供可靠的技术和理论依据。

Description

豇豆疫霉菌PCR检测引物及其检测方法

技术领域

本发明涉及豇豆疫霉菌PCR检测引物及其检测方法，专用于豇豆疫霉菌快速、灵敏和特异的分子检测，同时可用于田间豇豆疫病的早期诊断和病菌的监测和鉴定，属于农作物病害检测、鉴定及防治技术领域。

背景技术

由豇豆疫霉菌（Phytophthora vignae Purss）侵染引起的豇豆疫病是豇豆生产上不容忽视的主要病害之一，该病害俗称“死藤”，流行性强，年度间病情差异大，常常造成豇豆植株大面积的枯死，并日趋危害严重，平均发病率为3-11%，严重田块发病率高达65%，甚至告成绝收，极大地影响了豇豆的产量和质量。豇豆疫霉菌主要以厚垣孢子、卵孢子及病残体在土壤中越冬，在适宜的环境条件下，越冬体产生游动孢子，借土壤、灌溉水和风雨等传播到寄主表面，产生芽管侵入，继而在其受害部位再产生孢子囊进行再侵染，尤其在潮湿、多雨条件下，该病害传播与蔓延迅速，常造成豇豆植株大面积死亡。豇豆疫霉菌侵染部位主要为植株根部和近土表茎部，侵染点带有一定的隐蔽性，在发病前期如果未能准确地对病原菌进行检测和鉴定，一旦病害显症发生就很难控制。豇豆疫病还常与豇豆其它病害（如枯萎病、蔓枯病）混合发生，而且发病症状具一定的相似性，常给病害的正确诊断造成极大的困难，在生产中常因病害诊断不准确，未能达到实施“对症下药”的正确防治措施而致使病害造成惨重损失的现象时有发生。因此建立豇豆疫霉菌快速检测体系，在发病前期对植株及土壤是否携带豇豆疫霉菌进行快速准确的检测，这对于病害的准确预测预报、制定适时有效的防治措施、控制病害的传播和流行（蔓延）以及减少病害造成的经济损失都具有重要的理论和实际意义。

豇豆疫霉菌传统的检测鉴定主要依据形态学特征、致病性测定、生理生化特性等，这种传统检测鉴定方法不仅程序繁琐、所需时间较长、鉴定时还易受人为及环境等诸多因素的干扰，难以满足病害防治中快速、准确和稳定的检测要求，很容易错过病害防治的最佳时期。

随着分子生物学技术的发展，以聚合酶链式反应（PCR）技术为代表的病原菌快速分子检测方法得到了迅猛的发展和应用，PCR技术具有特异性强、灵敏度高、快速且不需要进行病原菌分离培养的特点，可用于病害显症之前的早期诊断、监测。国内外已有研究人员利用核糖体转录间隔区（rDNA – ITS）基因为病原菌检测靶标，开发出了灰霉菌、炭疽菌、枯萎病菌、链格孢等不同病原真菌的特异性检测引物，并利用特异性引物进行PCR扩增，达到病原菌快速、准确的检测和鉴定。豇豆疫霉菌属于疫霉属卵菌，大量研究表明，rDNA – ITS基因序列在疫霉菌不同种间差异很小，以ITS为靶标设计的引物难以将疫霉属中不同种区分开，因此，目前大部分疫霉菌高灵敏性和特异性检测的主要靶标为Ypt1（ras-related protein）基因。

Ypt1基因包含有多个外显子和内含子，多个外显子具有保守性，而这些内含子在疫霉菌不同种之间具有多变性，该基因可适合作为疫霉菌分子检测靶标。目前尚无针对该靶基因设计的特异性豇豆疫霉菌检测引物和检测方法的报道，因此，可以通过测定豇豆疫霉菌和其它疫霉菌的Ypt1基因，对疫霉菌不同种间Ypt1基因序列进行比对分析，设计出豇豆疫霉菌特异性引物，达到豇豆疫霉菌的快速检测和鉴定。

发明内容

本发明的目的是针对现在技术中对豇豆疫霉菌检测和鉴定主要基于形态学特征，方法耗时长、程序繁琐、经验性强、准确度低，难以做到对病害发生的及时监测和鉴定的问题，提供了一种豇豆疫霉菌PCR检测引物及其检测方法，利用本发明所述的PCR检测引物和检测方法检测豇豆疫霉菌准确性高、特异性强、灵敏度高、易于操作、快速且结果可靠。

实现本发明的目的包括下列步骤（技术方案）：

1. 通过测定豇豆疫霉菌和其它疫霉菌的Ypt1基因，对疫霉菌不同种间Ypt1基因序列进行比对分析，设计出对豇豆疫霉菌具有特异性扩增作用的1对引物，即特异PCR检测引物的序列为：

上游引物PVF：5^，- CTCAGAATGGCCAAGGTTTC-3^，，

下游引物PVR：5^，- CGTTCCGCGAGACTTT TCTA-3^，；

对豇豆疫霉菌特异性扩增出375bp的产物。

2.豇豆疫霉菌特异分子检测方法的建立

（1）被豇豆疫霉菌侵染（感染）的植物组织DNA的提取.

用于检测植株组织中存在豇豆疫霉菌时，采用NaOH快速裂解法提取DNA，具体过程如下：向1.0 mg发病植物组织（洗净的发病豇豆根或茎）中加入0.5 mol/L NaOH 10 μL，将组织充分磨碎成糊后转入1.5 mL离心管中，12,000 rpm离心6 min，取上清液5 μl加入0.1 mol/L Tris-HCl（pH=8.0）495μL混合均匀，取1.0 μL作为PCR模板进行扩增。

（2）以步骤（1）提取的DNA为模板，利用PVF/PVR这一对引物进行PCR扩增。PCR反应体系25 μL，包括2.5 μL 10×PCR buffer（Mg²⁺ free），2.0 mmol/L MgCl₂，0.2 mmol/L dNTP，1.0 U TaqDNA聚合酶（Takara大连宝生物工程有限公司），引物PVF/PVR各0.4 μmol/L，25 ng DNA 模板，不足部分用无菌超纯水补足；扩增参数为：95 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，共35个循环，最后72 ℃延伸10 min。

（3）取步骤（2）的PCR扩增产物5.0 μL用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳分离，70-100V，40min后经溴化乙锭染色于紫外灯下观察，根据扩增产物的有无及其片段大小对结果进行判断，如果能特异性地扩增出约375bp的产物，即可判断所述的检测样品中存在豇豆疫霉菌，否则所述的检测样品中未存在豇豆疫霉菌。

本发明的关键性技术是豇豆疫霉菌高效特异性PCR检测引物的设计及其检测方法的建立。为了获得豇豆疫霉菌的特异PCR检测引物序列，以来源于我国不同省份的26株豇豆疫霉菌和多个疫霉属近缘种以及常见的几种病原真菌为供试材料，采用 CTAB 法提取供试菌株基因组 DNA，具体方法如下：取少量菌丝粉于1.5 mL离心管中（菌丝粉刚盖过半圆形底部为宜），加入900 μL 2%CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）提取液（2% CTAB；100 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0；20 mmol/L EDTA，pH8.0；1.4 mol/L NaCl）和90 μL SDS（十二烷基苯磺酸钠）【注：CTAB，SDS需60℃预热】，使用振荡器振荡混匀，60℃水浴1h（DNA释放至缓冲液中），12000 r.min^-1离心15 min；取上清液700 μL，加等体积酚、氯仿、异戊醇（25:24:1），轻轻振荡混匀，12000 r.min^-1离心9 min；取上清液500 μL，加入等体积氯仿再抽提一次，12000 r.min^-1离心5 min；取上清液350 μL，加入1/10体积3 mol.L^-1 NaAc和2倍体积无水乙醇，-20℃沉淀30 min，12000 r.min^-1离心5 min；弃去上清液，加入700μL 冰70%乙醇进行洗涤（稍离心；倾掉上清液），在超净工作台上晾干无酒精味，加入30~60 μL TE（10 mmol/L Tris-HCl，0.1 mmol/L EDTA，pH 8.0）溶液进行溶解，得到 DNA 溶液，用紫外分光光度计检测 DNA 浓度并稀释至25 ng/μL待用。根据GenBank中Phyophthora属不同种的Ypt1基因序列间的差异（在BioEdit中比对），用Primer Primer5软件设计了豇豆疫霉菌Phytophthora vignae的特异性引物，引物序列为：上游引物PVF：5'- CTCAGAAT GGCCAAGGTTTC -3'，下游引物PVR：5'- CGTTCCGCGAGACTTT TCTA -3'，引物合成由上海生工生物工程有限公司合成。在已设计特异引物的基础上，通过PCR反应体系和扩增参数的优化，建立的豇豆疫霉菌检测方法，以供试的豇豆疫霉菌及其它病原菌的基因组DNA为模板，对豇豆疫霉菌特异性引物PVF/PVR的特异性进行验证，结果表明，引物PVF/PVR只能特异性地从供试的26个豇豆疫霉DNA中扩增出大小约为375bp的条带，而其它疫霉菌、病原真菌及阴性对照均无扩增条带。说明该对引物可以将豇豆疫霉与其它疫霉菌和病原真菌区分开来，具有种的特异性，可用于豇豆疫霉菌快速可靠的检测和鉴定。

本发明的显著优点

本发明与现有技术相比，具有以下的技术优势和有益效果：

1.特异性强、准确性高：本发明是根据疫霉菌Ypt1基因含有多个外显子和内含子，且其基因序列保守区和进化区相互间隔的特点，设计了对豇豆疫霉菌具有特异扩增作用的PCR引物，并已经对不同地理来源的豇豆疫霉菌和携带豇豆疫霉菌的植物组织进行了测试验证，只有豇豆疫霉菌和携带该病菌的样品能特异性地扩增出一条375bp的电泳条带，说有本发明所设计的引物具有很强的特异性和准确性。

2.灵敏度高：传统的病原菌检测方法是通过分离、纯化和形态学鉴定等步骤，这种传统方法的成功需要发病组织中积累到足够量的病原体才能成功。而本发明将设计的特异引物与Ypt1基因通用引物联合起来进行巢式PCR扩增后，对豇豆疫霉菌的检测灵敏度在DNA水平上可达到1fg，比常规PCR检测高10000倍，说明可以检测出一个游动孢子或一个卵孢子，只要样品中有带菌即可检测出来；

3.实用性强：豇豆疫霉菌的快速检测，具有重要的实际应用价值。传统的豇豆疫霉的检测方法一般是在植物出现症状后，借助其发病症状，对病原菌进行分离、纯化、鉴定等一系列繁琐的过程，所需时间较长，而且病原菌在分离时也存在一定的困难，给快速而精确地检测病原物增加了难度，传统的方法由于不能在病害发病前期及时进行田间的病原菌动态的监测和检测，时常给农业生产的防治延误时机。本发明可对植物组织中是否带豇豆疫霉菌进行检测，如果能特异性地扩增出375bp的电泳条带，说明植物组织中存在豇豆疫霉菌，因此本发明可用于豇豆疫霉菌引起病害显症之前的早期监测，可为确定病害防治最佳时期和制定防治策略的制定提供科学依据，因此本发明具有较好的实用性；

4.操作简便、快速：应用本发明方法，对带豇豆疫霉菌的植物组织进行DNA提取、PCR扩增和常规的琼脂糖电泳后即可判定结果，整个检测过程采用DNA快速提取方法，操作简单，无需对病原菌进行分离培养，大大缩短了检测时间。

附图说明

图1为本发明所要检测的豇豆疫霉菌的特异PCR扩增图，图中：泳道M为2000bp Marker，泳道1为阳性对照，泳道2-3为豇豆疫霉菌，泳道4为大豆疫霉菌，泳道5为辣椒疫霉菌，泳道6为黄瓜疫霉菌；

图2为本发明豇豆疫霉菌的灵敏性检测扩增结果图，图2-a为单重PCR对豇豆疫霉菌的灵敏性检测结果，图2-b为巢式PCR对豇豆疫霉菌的灵敏性检测结果，图中泳道M为2000bp Marker，泳道1为10 ng，泳道2为1 ng，泳道3为100 pg，泳道4为10 pg，泳道5为1 pg，泳道6为100 fg，泳道7为10 fg，泳道8为1 fg，泳道9为 100 ag，泳道10为阴性对照；

图3为本发明发病组织的检测结果图，图中泳道M为2000bp Marker，泳道泳道1为阳性对照，泳道2-4为发病的豇豆组织，泳道5-7为健康的豇豆组织，泳道8为阴性对照。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但不用来限制本发明的范围。以下实施例均按照常规实验条件，或已发表相关文献中所述的操作技术规程，或按照厂商所建议的实验条件。

实施例 1：PCR检测引物序列的设计及引物对豇豆疫霉菌的特异性扩增

1.引物的设计与合成

根据GenBank中Phyophthora属不同种的Ypt1基因序列间的差异（在BioEdit中比对），用Primer Primer5软件设计了豇豆疫霉菌Phytophthora vignae的特异性引物，引物序列为：上游引物PVF：5'- CTCAGAATGGCCAAGGTTTC -3'，下游引物PVR：5'- CGTTCCGCGAGACTTT TCTA -3'，引物合成由上海生工生物工程有限公司合成。

2. 供试菌株基因组 DNA 的提取

采用 CTAB 法提取供试菌株基因组 DNA，具体方法如下：取少量菌丝粉于1.5 mL离心管中（菌丝粉刚盖过半圆形底部为宜），加入900 μL 2%CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）提取液（2% CTAB；100 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0；20 mmol/L EDTA，pH8.0；1.4 mol/L NaCl）和90 μL SDS（十二烷基苯磺酸钠）【注：CTAB，SDS需60℃预热】，使用振荡器振荡混匀，60℃水浴1h（DNA释放至缓冲液中），12000 r.min^-1离心15 min；取上清液700 μL，加等体积酚、氯仿、异戊醇（25:24:1），轻轻振荡混匀，12000 r.min^-1离心9 min；取上清液500 μL，加入等体积氯仿再抽提一次，12000 r.min^-1离心5 min；取上清液350 μL，加入1/10体积3 mol.L^-1 NaAc和2倍体积无水乙醇，-20℃沉淀30 min，12000 r.min^-1离心5 min；弃去上清液，加入700μL 冰70%乙醇进行洗涤（稍离心；倾掉上清液），在超净工作台上晾干无酒精味，加入30~60 μL TE（10 mmol/LTris-HCl，0.1 mmol/L EDTA，pH 8.0）溶液进行溶解，得到 DNA 溶液，用紫外分光光度计检测 DNA 浓度并稀释至25 ng/μL待用。

3.引物特异性PCR验证

以供试的豇豆疫霉菌及其它病原菌的基因组DNA为模板，对豇豆疫霉菌特异性引物（上游引物PVF：5'- CTCAGAATGGCCAAGGTTTC -3'，下游引物PVR：5'- CGTTCCGCGAGACTTT TCTA -3'）的特异性进行验证。PCR反应体系25 μL，包括2.5 μL 10×PCR buffer（Mg²⁺ free），2.0 mmol/L MgCl₂，0.2 mmol/L dNTP，1.0 U TaqDNA聚合酶（Takara大连宝生物工程有限公司），引物PVF/PVR各0.4 μmol/L，25 ng DNA 模板，不足部分用无菌超纯水补足。扩增反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性1 min、60℃退火45S、72℃延伸30 s，35个循环，最后72℃延伸10 min。取5 μL PCR产物进行1.5%琼脂糖电泳检测，经溴化乙锭染色后于紫外灯下观察，根据DNA条带的有无及大小对豇豆疫霉菌特异性引物的特异性进行验证。

4.引物特异性验证结果

PCR扩增结果表明，引物PVF/PVR只能特异性地从供试的26个豇豆疫霉DNA中扩增出大小约为375bp的条带（图1），而其它疫霉菌、病原真菌及阴性对照均无扩增条带。说明该对引物均可以将豇豆疫霉与其它疫霉菌和病原真菌区分开来，具有种的特异性，可用于豇豆疫霉菌快速可靠的检测和鉴定。

实施例2：引物对豇豆疫霉菌基因组DNA的灵敏度检测

1.常规PCR扩增

用无菌超纯水对豇豆疫霉菌基因组DNA进行稀释，配制成10倍数量级的系列浓度备用。使用本发明所述引物PVF/PVR对不同系列浓度的基因组DNA进行PCR扩增，评估该引物对豇豆疫霉菌基因组DNA检测的灵敏性，扩增反应体系和反应程序如下：PCR反应体系25 μL，包括2.5 μL 10×PCR buffer（Mg²⁺ free），2.0 mmol/L MgCl₂，0.2 mmol/L dNTP，1.0 U TaqDNA聚合酶（Takara大连宝生物工程有限公司），引物PVF /PVR各0.4 μmol/L，25 ng DNA 模板，不足部分用无菌超纯水补足。扩增反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性1 min、60℃退火45 S、72℃延伸1 min，35个循环，最后72℃延伸10 min。

巢式PCR扩增

用无菌超纯水对豇豆疫霉菌基因组DNA进行稀释，配制成10倍数量级的系列浓度备用。以Ypt1基因通用引物（ph1F：5'-CGACC ATTGGCGTGGACTTT-3'和Yph2R：5'-ACGTTCTCGCAGGCGTATCT-3'）为外引物，本发明所述的特异引物PVF/PVR为外引物对豇豆疫霉菌不同系列浓度的基因组DNA进行巢式PCR扩增，评估本发明所述引物PVF/PVR通过巢式PCR对豇豆疫霉菌基因组DNA检测的灵敏性，第一轮PCR扩增：以Ypt1基因通用引物（ph1F：5'-CGACC ATTGGCGTGGACTTT-3'和Yph2R：5'-ACGTTCTCGCAGGCGTATCT-3'）作为第一轮反应引物对不同系列浓度的基因组DNA进行PCR扩增，扩增反应体系和反应程序如下：PCR反应体系25 μL，包括2.5 μL 10×PCR buffer（Mg²⁺ free），2.0 mmol/L MgCl₂，0.2 mmol/L dNTP，1.0 U TaqDNA聚合酶（Takara大连宝生物工程有限公司），引物ph1F /Yph2R各0.4 μmol/L，25 ng DNA 模板，不足部分用无菌超纯水补足。扩增反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性1 min、58℃退火30 S、72℃延伸1 min，35个循环，最后72℃延伸10 min。第二轮PCR扩增：待第一轮PCR扩增结果后，取1 μl 第一轮PCR产物为模板与引物PVF/PVR组合进行巢式PCR扩增。PCR反应体系25 μL，包括2.5 μL 10×PCR buffer（Mg²⁺ free），2.0 mmol/L MgCl₂，0.2 mmol/L dNTP，1.0 U TaqDNA聚合酶（Takara大连宝生物工程有限公司），引物PVF /PVR各0.4 μmol/L，25 ng DNA 模板，不足部分用无菌超纯水补足。扩增反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性1 min、60℃退火45 S、72℃延伸1 min，35个循环，最后72℃延伸10 min。

常规PCR和巢式PCR灵敏度比较结果表明，当以本发明所述引物PV1F /PVR进行常规PCR扩增时，反应灵敏度可以达到10pg DNA 25μl^-1反应体系（图2中的a）。进一步以Ypt1基因通用引物ph1F/Yph2R进行第一轮扩增得到的PCR产物作为模板，以PV1F /PVR作为第二轮扩增引物进行巢式PCR扩增，从电泳图可以看出套式PCR的特异性扩增条带比常规PCR要亮得多，能够使原来看不到条带的的样品（1pg、100fg、10fg、1pg/25μl反应体系）产生可见条带(图2中的b)，灵敏度达到1fg DNA 25μl^-1反应体系，比常规PCR要提高10000倍左右。

实施例3：发病植物组织中豇豆疫霉菌的检测

发病植物组织中豇豆疫霉菌DNA的提取：采用NaOH快速裂解法提取DNA，具体过程如下：向1.0 mg发病植物组织（洗净的发病豇豆根或茎）中加入0.5 mol/L NaOH 10 μL，将组织充分磨碎成糊后转入1.5 mL离心管中，12,000 rpm离心6 min，取上清液5 μl加入0.1 mol/L Tris-HCl（pH=8.0）495μL混合均匀，取1.0 μL作为PCR模板进行扩增。PCR扩增检测：利用本发明所述引物PVF/PVR进行PCR扩增。PCR反应体系25 μL，包括2.5 μL 10×PCR buffer（Mg²⁺ free），2.0 mmol/L MgCl₂，0.2 mmol/L dNTP，1.0 U TaqDNA聚合酶（Takara大连宝生物工程有限公司），引物PVF/PVR各0.4 μmol/L，25 ng DNA 模板，不足部分用无菌超纯水补足；扩增参数为：95 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，共35个循环，最后72 ℃延伸10 min。结果检测：取PCR扩增产物5.0 μL用1.5%琼脂糖电泳分离，电压为70-100V，电泳结束经溴化乙锭染色后于紫外灯下观察，根据扩增产物的有无及其片段大小对结果进行判断，如果能特异性地扩增出约375bp的产物，即可判断发病植物组织中带有豇豆疫霉菌。检测结果（图3）表明，豇豆疫病发病症状典型的植株根部及近土表茎部均可检测出豇豆疫霉菌，而健康植株组织及阴性对照则无特异性条带出现，说明该套技术能用于植物病组织中豇豆疫霉菌的快速分子检测。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建省农业科学院植物保护研究所

<120> 豇豆疫霉菌PCR检测引物及其检测方法

<130> 4

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ctcagaatgg ccaaggtttc 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cgttccgcga gacttttcta 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cgaccattgg cgtggacttt 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

acgttctcgc aggcgtatct 20

Claims

1. 豇豆疫霉菌PCR检测引物，其特征在于引物序列为：

上游引物PVF：5'- CTCAGAATGGCCAAGGTTTC -3'，

下游引物PVR：5'- CGTTCCGCGAGACTTT TCTA -3'；

对豇豆疫霉菌特异性扩增出375bp的产物。

2. 利用权利要求1所述引物的豇豆疫霉菌检测方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）从被豇豆疫霉菌感染的植物组织中提取DNA；

（2）以步骤（1）提取的DNA为模板，利用PVF/PVR这一对引物进行PCR扩增，PCR扩增的条件为：PCR反应体系25 μL，包括2.5μL 10×PCR buffer，2.0 mmol/L MgCl₂，0.2 mmol/L dNTP，1.0 U TaqDNA聚合酶，引物PVF/PVR各0.4 μmol/L，25 ng DNA 模板，不足部分用无菌超纯水补足；扩增参数为95 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，共35个循环，最后72 ℃延伸10 min；

（3）取5.0 μL步骤（2）的PCR扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳分离，电压为70-100V，40 min后经溴化乙锭染色于紫外灯下观察，根据扩增产物的有无及其片段大小对结果进行判断，如果能特异性地扩增出375bp的产物，即可判断所述的检测样品中存在豇豆疫霉菌。

3. 根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于：所述从被豇豆疫霉菌感染的植物组织中提取DNA，其具体步骤如下：向1.0 mg洗净的发病豇豆根或茎中加入0.5 mol/L NaOH 10 μL，将组织充分磨碎成糊后转入1.5 mL离心管中，12,000 rpm离心6 min，取上清液5 μl加入0.1 mol/L、pH8.0 Tris-HCl 495μL混合均匀，取1.0 μL作为PCR扩增模板。

4.如权利要求1所述的引物在田间豇豆疫病的早期诊断和病菌的监测和鉴定上的应用。