CN101643788B

CN101643788B - 马铃薯晚疫病菌分子检测引物及其用法

Info

Publication number: CN101643788B
Application number: CN2009101117350A
Authority: CN
Inventors: 李本金; 翁启勇; 陈庆河; 兰成忠
Original assignee: Institute of Plant Protection of FAAS
Current assignee: Institute of Plant Protection of FAAS
Priority date: 2009-05-12
Filing date: 2009-05-12
Publication date: 2011-08-24
Anticipated expiration: 2029-05-12
Also published as: CN101643788A

Abstract

本发明公开了一种马铃薯晚疫病菌分子检测引物及其用法，专用于马铃薯晚疫病菌特异分子检测。主要采用设计了一对马铃薯晚疫病菌的特异引物(上游引物INF1和下游引物INF2，经过PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳，可在马铃薯晚疫病菌纯DNA、带菌的植株和薯块中特异性地扩增出片段长度为324bp的特异扩增产物。所发明的特异分子检测引物及其用法可被用于生产实践中马铃薯晚疫病菌感染的植株和薯块中晚疫病菌的快速、灵敏、特异的检测，同时可用于田间病害的早期诊断和病菌的监测和鉴定，为马铃薯晚疫病菌引起的病害的防治提供可靠的技术和理论依据。

Description

马铃薯晚疫病菌分子检测引物及其用法

技术领域

本发明属于农作物病害检测、鉴定及防治技术的领域，更具体涉及一种马铃薯晚疫病菌分子检测引物及其用法。

背景技术

由致病疫霉(Phytophthora infestans(Mont)de Bary)引起的晚疫病是导致马铃薯茎叶死亡和块茎腐烂的一种毁灭性的世界病害，自1845年首次在爱尔兰大流行以后，在世界各马铃薯主产区均有发生和流行，严重威胁着马铃薯的生产，特别是进入20世纪80年代以来，晚疫病在世界各马铃薯主产区的频频发生及其所造成危害的严重程度已引起了国际社会的极大关注。为此，国内外学者对马铃薯晚疫病进行了大量研究，并在分子检测等方面取得了一定进展。

马铃薯晚疫病可危害叶片、叶柄、茎、薯块，不但造成当年生产减产，同时也是次年的初侵染来源，其中潜存于马铃薯块茎中的晚疫病菌是来年晚疫病发生的最主要的初侵染源。带菌种薯播种后，病菌便在发芽形成的幼苗上沿其表皮纵向侵染，形成中心病株。病部产生的孢子囊也可借助风雨传播而侵染附近植株的下部叶片，进而使地上部表现症状，形成发病中心，致该病由点到面，迅速蔓延扩大。病叶上的孢子囊还可随雨水或灌溉水渗入土中侵染薯块，形成病薯，成为翌年主要侵染源。该病的发生和流行受品种和气象条件的影响较大，其中又以气象条件为主。在适宜的温、湿度条件下，晚疫病菌产生的孢子囊能迅速繁殖，多次再侵染，很快引致大流行。同时，马铃薯晚疫病菌是由A1、A2两种交配型进行异宗配合的卵菌，A2交配型的出现，意味着有性生殖可以顺利实现，从而产生更具有侵染力和适合度更高的生理小种以及致病力更强的菌株，加重了病害的发生与流行。因此建立马铃薯晚疫病菌分子检测体系，早期对发病植株及种薯进行晚疫病菌快速检测，进而监测晚疫病的发生发展情况，对防止该病从发病区向未发病区扩散蔓延以及马铃薯晚疫病早期预测预报和有效防治策略的制定都具有重要的理论和实际意义。

马铃薯晚疫病具有很强的传染性，一旦扩散蔓延则难以控制。目前对晚疫病菌的检测大多仍沿用传统的培养及鉴定方法，但该病在按常规方法分离的过程中，由于晚疫病菌生长速度较慢，经常被包括腐霉在内的其它杂菌所掩盖，给该菌的成功分离和病害的准确诊断造成很大困难。因此，以形态特征为基础的常规病害诊断技术，由于其耗时长，效率和灵敏度均较低，难以满足对马铃薯晚疫病诊断的实际需要，因其很容易错过病害防治的最佳时期。因此，建立一套结果可靠、易于操作、灵敏度高的马铃薯晚疫病菌快速检测诊断技术不仅非常必要，而且十迫切。

随着科学技术的发展，许多新的技术方法不断引入该领域，其中PCR技术以其快速、灵敏和准确等优点已广泛应用于植物病害的研究。核糖体转录间隔区是20世纪90年代发展起来的全新的分子标记。利用核糖体转录间隔区ITS序列在物种进化过程中的保守性和异变性设计引物进行PCR扩增已在棉花、番茄、西瓜等作物的病害检测中得到了广泛的应用。随着卵菌不同种ITS序列数据的积累，以该区域为靶标序列设计特异引物用于疫霉菌的检测已有成功报道。但我国在马铃薯晚疫病菌分子检测方面研究甚少，并且存在检测特异性不强，灵敏度低的问题，因此研制快速检测马铃薯晚疫病菌的技术，在植物病害的症状还未显现出来之前，就能对植物体内病原菌进行可靠的检测，这对制订病害防治最佳时期至关重要。

发明内容

本发明的目的是提供一种马铃薯晚疫病菌分子检测引物及其用法，针对现有技术中马铃薯晚疫病菌的生物学检测方法所需周期长、目前马铃薯晚疫病菌分子检测方法特异性差，灵敏度低的问题，本发明的马铃薯晚疫病菌的特异分子检测引物以及方法结果可靠、易于操作、特异性强、灵敏度高，该方法可用于带菌的植株和种薯的高灵敏度快速分子检测，此技术对于马铃薯晚疫病菌引起病害显症之前的早期监测，对于确定病害防治最佳时期具有重要的作用，为防治策略的制定提供科学依据。

本发明的马铃薯晚疫病菌分子检测引物：所述马铃薯晚疫病菌分子检测的一对PCR引物，即特异分子检测引物的序列为：

上游引物INF1：5‘-CGGTTGGTTTTCGGACCGA-3’

下游引物INF2：5‘-CATTTCCCAAATGGATCGACC-3’；所述引物INF1/INF2对马铃薯晚疫病菌特异性扩增出324bp的产物。

所述的马铃薯晚疫病菌分子检测引物的序列获得方法为：采用CTAB法提取供试菌株基因组DNA，具体方法如下：取50mg冷冻干燥后的菌丝粉于1.5ml离心管中，加入900μl重量浓度为2％十六烷基三甲基溴化铵CTAB提取液和90μl重量浓度10％十二烷基苯磺酸钠SDS后振荡混匀，于55～60℃水浴1.5h，每10min颠倒混匀一次，水浴1.5h后离心8min，离心速度为12,000rpm，取上清液加入等体积的酚、氯仿和异戊醇混合溶液，所述混合溶液中酚∶氯仿∶异戊醇的体积比为：25∶24∶1，颠倒使充分混匀，离心12min，离心速度为12,000rpm，取上清液，即水相，加入等体积氯仿和异戊醇的混合溶液抽提一次，所述混合溶液中氯仿∶异戊醇的体积比为：24∶1，颠倒使充分混匀，离心5min，离心速度为12,000rpm，吸上清液，加0.1体积的3mol/LNaAC溶液和2体积的-20℃无水乙醇，置-20℃下沉淀30min以上，12,000rpm离心5min，轻轻地倒去上清液，加入700μl体积浓度70％的-20℃乙醇进行洗涤，在超净工作台上自然晾干无酒精味后用1×TE溶液进行溶解，得到DNA溶液，用紫外分光光度计检测DNA浓度并稀释至50ng/μl待用，在马铃薯晚疫病菌特异DNA片段序列的基础上应用ClustalX软件比对设计特异引物，经对供试菌株和28株马铃薯晚疫病菌的特异性进行PCR验证，所述马铃薯晚疫病菌分子检测引物在马铃薯晚疫病菌中特异性地扩增出324bp的产物，说明该引物可被用于生产实践中发病植株和薯块中马铃薯晚疫病菌快速可靠的检测和鉴定。

所述十六烷基三甲基溴化铵CTAB提取液为重量浓度2％CTAB；100m mol/L Tris-HCl，PH 8.0；20mmol/L EDTA，pH8.0；1.4mol/L NaCl。

所述1×TE溶液为10mmol/LTris-HCL，0.1mmol/LEDTA，pH8.0。

所述经对供试菌株和28株马铃薯晚疫病菌的特异性进行PCR验证的具体的反应体系是：PCR反应体系25μl，包括2.5μl 10×PCR反应缓冲液，2.0mmol/L Mg²⁺，200μmol/LdNTPs，1.0U Taq DNA聚合酶，引物INF1/INF2各0.08μmol/L和50ng模板DNA，d.d.H₂O补足25μl；PCR反应条件为：94℃预变性2.5min；94℃变性30sec，68℃退火45sec，72℃延伸45sec，共35个循环；72℃延伸7min。

本发明的所述的马铃薯晚疫病菌分子检测引物的用法：按照以下步骤使用：

从被所述的马铃薯晚疫病菌、被马铃薯晚疫病菌感染的植株和存在马铃薯晚疫病菌的薯块中提取DNA：从马铃薯晚疫病菌、被马铃薯晚疫病菌感染的植株和存在马铃薯晚疫病菌的薯块中提取DNA为(如以我国福建、黑龙江、河北、内蒙古、甘肃、吉林、宁夏和云南等省的28株马铃薯晚疫病菌和15种不同真菌及7种疫霉属和腐霉属卵菌为供试材料，采用CTAB法提取供试菌株基因组DNA)：从述马铃薯晚疫病菌感染的植株或存在马铃薯晚疫病菌的薯块中按NaOH快速裂解法提取DNA，具体过程如下：将马铃薯病叶或病茎洗净、晾干，剪取发病部位；按1mg病叶加入10uL 0.5mol/L NaoH，0.5％PVP计量，将组织充分磨碎成糊，在12,000g离心机中离心6min；取上清20uL与等体积的0.1mol/L的Tris-HCl混合pH8.0；取1uL作为PCR模板进行扩增。

以该DNA为模板用所述引物INF1/INF2通过聚合酶链式反应PCR扩增；PCR反应体系25μl，包括2.5μl 10×PCR反应缓冲液，2.0mmol/L Mg²⁺，200μmol/L dNTPs，1.0U Taq DNA聚合酶，引物INF1/INF2各0.08μmol/L和50ng模板DNA，d.d.H₂O补足25μl，PCR反应条件为：94℃预变性2.5min；94℃变性30sec，68℃退火45sec，72℃延伸45sec，共35个循环；72℃延伸7min；

然后取10μl步骤(2)PCR产物于含0.5μg/mL EB的1.5％琼脂糖凝胶电泳，经溴化乙锭染色后于紫外灯下观察，根据扩增产物的大小判定结果，如果能特异性地扩增出324bp的产物，即可判断所述的植株和薯块样品中存在马铃薯晚疫病菌。

本发明有益效果：本发明方法适用于种薯和植株中马铃薯晚疫病菌的快速可靠的检测和鉴定，对于农业生产中马铃薯晚疫病菌引起的病害防治具有重要的实用价值。本发明与现有技术相比，具有以下的技术优势和积极效果：

1、特异性强：本发明检测方法是利用核糖体内转录间隔区(rDNA-ITS)序列在真菌种间高度变异和种内稳定性设计马铃薯晚疫病菌特异引物进行检测。已经对来自我国福建、黑龙江、河北、内蒙古、甘肃、吉林、宁夏和云南等省的马铃薯晚疫病菌和其它不同真菌及卵菌进行验证，结果具有很强的特异性；

2、实用性好：本发明所设计出的一对特异性引物，可用于带马铃薯晚疫病菌的植株和薯块的高灵敏度快速分子检测，因此本方法的实用性强，可满足对带菌植株和薯块中存在的马铃薯晚疫病菌进行快速可靠的检测和鉴定的需要；

3、操作简便快速：应用本发明方法，对带马铃薯晚疫病菌的植株和种薯进行病菌DNA提取、PCR扩增和常规的琼脂糖电泳后即可判定结果，无需对扩增产物进行限制性内切酶酶切。一般整个检测过程可在数小时内完成。

附图说明：

图1为本发明所要检测的马铃薯晚疫病菌的特异PCR扩增图。图中：泳道1为阴性对照，泳道2-9为马铃薯晚疫病菌，泳道10为黄瓜疫霉菌，泳道11为辣椒疫霉菌，泳道12为烟草疫霉菌，泳道13为大豆疫霉菌，泳道14为掘氏疫霉菌，泳道15为瓜果腐霉菌，泳道16为尖镰孢菌，M为100bp DNA marker。

图2为本发明马铃薯晚疫病菌的灵敏性检测扩增结果图。图中：泳道1为3ug，泳道2为300ng，泳道3为30ng，泳道4为3ng，泳道5为300pg，泳道6为30pg，泳道7为3pg，泳道8为300fg，泳道9为30fg，泳道10为3fg，泳道11为阴性对照，M：为100bp或DL 2000 DNA marker

图3为本发明发病植株和薯块的检测结果图。图中：泳道1为阳性对照，泳道2为阴性对照，泳道3为发病的马铃薯晚疫病植株，泳道4为马铃薯晚疫病发病薯块，泳道5为健康的马铃薯植株，M为100bp DNA marker。

具体实施方式：

本发明的技术内容包括马铃薯晚疫病菌的特异检测引物，所设计的引物及其序列为：INF1(5‘-CGGTTGGTTTTCGGACCGA-3’)和INF2(5‘-CATTTCCCAAATGGATCGACC-3’)。利用该引物可从马铃薯晚疫病菌上特异扩增出324bp的产物。

以下结合实施例具体阐述本发明

实施例1：引物对马铃薯晚疫病菌的特异性扩增

1.马铃薯晚疫病菌的特异检测

PCR反应体系25μl，包括2.5μl 10×PCR反应缓冲液，2.0mmol/L Mg²⁺，200μmol/LdNTPs，1.0U Taq DNA聚合酶，引物INF 1/INF2各0.08μmol/L和50ng模板DNA，d.d.H₂O补足25μl。PCR反应条件为：94℃预变性2.5min；94℃变性30sec，68℃退火45sec，72℃延伸45sec，共35个循环；72℃延伸7min。

2.检测结果

检测的特异性：除了来自我国福建、黑龙江、河北、内蒙古、甘肃、吉林、宁夏和云南等省的马铃薯晚疫病菌DNA可特异地扩增出324bp的产物外，检测了15种不同真菌和7种疫霉属和腐霉属卵菌DNA均未能扩增出任何产物，具有很强的特异性。

实施例2：引物对马铃薯晚疫病菌的灵敏性检测

1.DNA浓度稀释：提取的马铃薯晚疫病菌基因组DNA，经分光光度计测定浓度后，采用系列浓度稀释。

2.马铃薯晚疫病菌的灵敏性检测

PCR反应体系25μl，包括2.5μl 10×PCR反应缓冲液，2.0mmol/L Mg²⁺，200μmol/LdNTPs，1.0U Taq DNA聚合酶，引物INF1/INF2各0.08μmol/L和50ng模板DNA，d.d.H₂O补足25μl。PCR反应条件为：94℃预变性2.5min；94℃变性30sec，68℃退火45sec，72℃延伸45sec，共35个循环；72℃延伸7min。

3.检测结果：在25μl反应体系中，马铃薯晚疫病菌基因组DNA可获得明显扩增条带，检测灵敏度可达3fg。

实施例3：发病植株或薯块样品中马铃薯晚疫病菌的检测。

1.样品采集：植物组织样品采自云南省旬甸县马铃薯生产基地；薯块样品采自福建省连城县马铃薯生产基地。

2.DNA提取及检测

发病植物组织或薯块采用NaoH快速裂解法提取DNA，按上述方法进行PCR扩增，PCR反应体系25μl，包括2.5μl 10×PCR反应缓冲液，2.0mmol/L Mg²⁺，200μmol/L dNTPs，1.0U TaqDNA聚合酶，引物INF1/INF2各0.08μmol/L和50ng模板DNA，d.d.H₂O补足25μl。PCR反应条件为：94℃预变性2.5min；94℃变性30sec，68℃退火45sec，72℃延伸45sec，共35个循环；72℃延伸7min。电泳检测扩增产物。

3.检测结果

结果见图3，见到一条清晰的分子量为324bp的特异条带，因而判断发病组织或薯块感染马铃薯晚疫病菌。

序列表

<110>福建省农业科学院植物保护研究所

<120>马铃薯晚疫病菌分子检测引物及其用法

<160>2

<210>1

<211>19

<212>DNA

<213>马铃薯晚致病疫霉(Phytophthora infestans(Mont)de Bary)

<220>

<400>1

5‘-cggttggttttcggaccga-3’

<210>2

<211>21

<212>DNA

<213>马铃薯晚致病疫霉(Phytophthora infestans(Mont)de Bary)

<220>

<400>2

5‘-catttcccaaatggatcgacc-3’

Claims

1.一种马铃薯晚疫病菌分子检测引物，其特征在于：所述马铃薯晚疫病菌分子检测的一对PCR引物，即特异分子检测引物的序列为：

上游引物INF1：5‘-CGGTTGGTTTTCGGACCGA-3’

下游引物INF2：5‘CATTTCCCAAATGGATCGACC-3’

2.根据权利要求1所述的马铃薯晚疫病菌分子检测引物，其特征在于：所述引物INF1和INF2对马铃薯晚疫病菌特异性扩增出324bp的产物。

3.根据权利要求1所述的马铃薯晚疫病菌分子检测引物，其特征在于：所述的马铃薯晚疫病菌分子检测引物的序列获得方法为：采用CTAB法提取供试菌株基因组DNA，具体方法如下：取50mg冷冻干燥后的菌丝粉于1.5ml离心管中，加入900μl重量浓度为2％十六烷基三甲基溴化铵CTAB提取液和90μl重量浓度10％十二烷基苯磺酸钠SDS后振荡混匀，于55～60℃水浴1.5h，每10min颠倒混匀一次，水浴1.5h后离心8min，离心速度为12,000rpm，取上清液加入等体积的酚、氯仿和异戊醇混合溶液，所述混合溶液中酚∶氯仿∶异戊醇的体积比为：25∶24∶1，颠倒使充分混匀，离心12min，离心速度为12,000rpm，取上清液，即水相，加入等体积氯仿和异戊醇的混合溶液抽提一次，所述混合溶液中氯仿∶异戊醇的体积比为：24∶1，颠倒使充分混匀，离心5min，离心速度为12,000rpm，吸上清液，加0.1体积的3mol/L NaAC溶液和2体积的-20℃无水乙醇，置-20℃下沉淀30min以上，12,000rpm离心5min，轻轻地倒去上清液，加入700μl体积浓度70％的-20℃乙醇进行洗涤，在超净工作台上自然晾干无酒精味后用1×TE溶液进行溶解，得到DNA溶液，用紫外分光光度计检测DNA浓度并稀释至50ng/μl待用，在马铃薯晚疫病菌特异DNA片段序列的基础上应用ClustalX软件比对设计特异引物，所述特异引物为上游引物INF1：5‘-CGGTTGGTTTTCGGACCGA-3’，下游引物INF2：5‘-CATTTCCCAAATGGATCGACC-3’；经对供试菌株和28株马铃薯晚疫病菌的特异性进行PCR验证，所述马铃薯晚疫病菌分子检测引物在马铃薯晚疫病菌中特异性地扩增出324bp的产物。

4.根据权利要求3所述的马铃薯晚疫病菌分子检测引物，其特征在于：所述十六烷基三甲基溴化铵CTAB提取液为重量浓度2％CTAB；100m mol/L Tris-HCl，PH 8.0；20mmol/LEDTA，pH8.0；1.4mol/LNaCl。

5.根据权利要求3所述的马铃薯晚疫病菌分子检测引物，其特征在于：所述1×TE溶液为10mmol/LTris-HCL，0.1mmol/LEDTA，pH8.0。

6.根据权利要求3所述的马铃薯晚疫病菌分子检测引物，其特征在于：所述经对供试菌株和28株马铃薯晚疫病菌的特异性进行PCR验证的具体的反应体系是：PCR反应体系25μl，包括2.5μl 10×PCR反应缓冲液，2.0mmol/L Mg²⁺，200μmol/L dNTPs，1.0U Taq DNA聚合酶，引物INF1和INF2各0.08μmol/L和50ng模板DNA，d.d.H₂O补足25μl；PCR反应条件为：94℃预变性2.5min；94℃变性30sec，68℃退火45sec，72℃延伸45sec，共35个循环；72℃延伸7min。

7.一种如权利要求1、2、3、4、5或6所述的马铃薯晚疫病菌分子检测引物的用法，其特征在于：按照以下步骤使用：

(1)从马铃薯晚疫病菌、被马铃薯晚疫病菌感染的植株和存在马铃薯晚疫病菌的薯块中提取DNA；

(2)以该DNA为模板用所述引物INF1和INF2通过聚合酶链式反应PCR扩增；PCR反应体系25μl，包括2.5μl 10×PCR反应缓冲液，2.0mmol/L Mg²⁺，200μmol/L dNTPs，1.0U Taq DNA聚合酶，引物INF1和INF2各0.08μmol/L和50ng模板DNA，d.d.H₂O补足25μl，PCR反应条件为：94℃预变性2.5min；94℃变性30sec，68℃退火45sec，72℃延伸45sec，共35个循环；72℃延伸7min；

(3)然后取10μl步骤(2)PCR产物于含0.5μg/mLEB的1.5％琼脂糖凝胶电泳，经溴化乙锭染色后于紫外灯下观察，根据扩增产物的大小判定结果，如果能特异性地扩增出324bp的产物，即可判断所述的植株和薯块样品中存在马铃薯晚疫病菌。

8.根据权利要求7所述的马铃薯晚疫病菌分子检测引物的用法，其特征在于：从马铃薯晚疫病菌、被马铃薯晚疫病菌感染的植株和存在马铃薯晚疫病菌的薯块中提取DNA为：从马铃薯晚疫病菌感染的植株或存在马铃薯晚疫病菌的薯块中按NaOH快速裂解法提取DNA，具体过程如下：将马铃薯病叶或病茎洗净、晾干，剪取发病部位；按1mg病叶加入10uL 0.5mol/L NaoH，0.5％PVP计量，将组织充分磨碎成糊，在12,000g离心机中离心6min；取上清20uL与等体积的0.1mol/L的Tris-HCl混合pH8.0；取1uL作为PCR模板进行扩增。