CN105112533A - 用于番茄灰霉病菌检测的pcr引物及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及番茄灰霉病菌（<i>Botrytis？cinerea</i>）检测的PCR引物及其检测方法，所述引物包括上游引物BCF：5ˊ-？GCTCGCCAGAGAATACCAAA？-3ˊ和下游引物BCR：5ˊ-？CCTACCTGATCCGAGGTCAA？-3ˊ，在所述引物的基础上建立番茄灰霉病菌检测方法，经PCR扩增，可在番茄灰霉病菌纯DNA、番茄灰霉病发病的植株组织和携带番茄灰霉病菌的土壤样品中特异性地扩增出片段大小为386bp的扩增产物。本发明的检测引物和检测方法可用于田间番茄灰霉病菌的早期诊断和病菌的监测和鉴定，具有准确性高、特异性强、灵敏度高、检测过程操作简便快速等优点，可为番茄灰霉病的防治提供可靠的技术和理论依据。

Description

用于番茄灰霉病菌检测的PCR引物及其检测方法

技术领域

本发明涉及番茄灰霉病菌特异性PCR检测引物及其检测方法，专用于番茄灰霉病菌快速、灵敏和特异的分子检测，同时可用于田间番茄灰霉病的早期诊断和病菌的监测和鉴定，属于农作物病害检测、鉴定及防治技术领域。

背景技术

由灰葡萄孢（Botrytiscinerea）侵染引起的番茄灰霉病是番茄设施栽培中高危害、高损失且影响蔬菜产量、品质、安全的最主要病害之一。该菌可通过侵染番茄植株的叶片、茎杆、花和果实导致番茄灰霉病的发生，病原菌在土壤或病残体上能以菌丝或菌核形式休眠越过冬天或夏天，温湿度适宜时萌发形成大量的分生孢子后凭风雨飞散或借农事操作传播引起番茄植株感病，发病处新生的灰霉分生孢子能够进行重复再侵染，从而导致病情极易扩展和加重。在中国，番茄灰霉病一般年份造成20%左右的减产，严重时超过50%，甚至绝收，该病已在全国各地普通发生，且呈上升趋势，成为当前番茄生产上的重要病害。因此，建立一套快速灵敏的检测方法用于番茄灰霉病的早期诊断，防止其从发病区向未发病区传播，对番茄灰霉病的及时控制具有重要意义。

自从发现番茄灰霉病菌以来，世界各国研究人员已对其检测技术进行了研究，传统的检测方法是采用选择性培养基从发病组织中分离病原菌，再对这些病原菌的形态特征等进行鉴定，或者利用肉眼和借助显微镜技术对发病症状进行判定。传统的检测方法不仅费时、准确度低，而且要求检测人员具有丰富的经验，不能满足病害防治中病原菌准确、快速检测的需求，易遗漏潜育期或隐症的病害，以致延误病害的防治，导致病害的暴发。因此，开发出快速灵敏、易操作、易普及的检测方法对于控制病害具有十分重要的意义。

随着分子生物学技术的发展，应用聚合酶反应（polymerasechainreaction,PCR）扩增技术对植物病原菌进行特异、灵敏的快速分子检测的成功例子已越来越多。国内外已有研究人员利用真菌核糖体转录间隔区ITS（internaltranscribedspacer）基因为病原菌检测靶标，开发出了炭疽菌、疫霉菌、枯萎病菌、链格孢等不同病原真菌的特异性检测引物，并利用特异性引物进行PCR扩增，达到病原菌快速、准确的检测和鉴定。本发明通过对灰霉菌属（Botrytis）的ITS序列进行比对分析，设计出1对可用于特异性检测番茄灰霉病菌的PCR引物，为番茄灰霉病菌的准确鉴定和快速检测提供技术和方法，有利于及早有效地采取防治措施。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中对番茄灰霉病菌检测和鉴定主要基于形态学特征，方法耗时长、程序繁琐、经验性强、准确度低，难以做到对病害发生的及时监测和控制病原菌的传播、流行的问题，提供了一种用于番茄灰霉病菌特异性检测的PCR引物及其检测方法，利用本发明所述的PCR引物和检测方法检测番茄灰霉病菌准确性高、特异性强、灵敏度高、易于操作、检测时间短且结果可靠。

实现本发明的目的包括下列步骤（技术方案）：

1.通过测定番茄灰霉病菌（Botrytiscinerea）和其它灰霉病菌（Botrytisspp）的核糖体转录间隔区（ITS）基因，对灰霉菌属不同种间ITS基因序列进行比对分析，根据番茄灰霉病菌ITS基因序列的特异位点设计出对番茄灰霉病菌具有特异性扩增作用的1对引物，即特异PCR检测引物的序列为：

上游引物BCF：5'-GCTCGCCAGAGAATACCAAA-3'，

下游引物BCR：5'-CCTACCTGATCCGAGGTCAA-3'；

对番茄灰霉病菌特异性扩增出386bp的产物。

2.番茄灰霉病菌特异分子检测方法的建立

（1）提取待测样品（带菌的番茄植株组织或土壤等）基因组DNA。

用于检测番茄植株组织是否存在番茄灰霉病菌时，采用NaOH快速裂解法提取番茄植株组织基因组DNA，具体过程如下：向1.0mg番茄植株组织（花、叶或果实）中加入0.5mol/LNaOH30μL，将组织充分磨碎成糊后转入1.5mL离心管中，12,000rpm离心6min，取上清液5μl加入0.1mol/LTris-HCl（pH=8.0）495μL混合均匀，取1.0μL作为PCR模板进行扩增；

用于检测土壤中是否存在番茄灰霉病菌时，采用土壤DNA提取法提取土壤中总微生物基因组DNA，具体过程如下：取已过200目筛的土壤冷冻抽干24-48h后加入少量石英砂，倒入液氮充分研磨，将研磨后的土壤细粉分装至1.5ml离心管中，每管加入500μL重量浓度为0.4%脱脂奶粉溶液，涡旋混匀，12,000rpm离心15min，取上清液加入等体积蛋白酶K缓冲液，加终浓度为10μg/mL蛋白酶K，55℃水浴60min，水浴结束后，加入总体积1/2体积的7.5MNH₄AC溶液，上下颠倒混匀，12,000rpm离心15min，吸上清液加2倍体积无水乙醇-20℃沉淀20min以上，沉淀结束后，12,000rpm离心10min，倾掉上清液，用体积浓度为70%乙醇洗涤沉淀，室温凉干，每份样品所提DNA用20μlTE（或无菌超纯水）溶解，取1.0μL作为PCR模板进行扩增。

（2）以步骤（1）提取的DNA为模板，利用BCF/BCR这一对引物进行PCR扩增。PCR反应体系25μL，包括2×TaqPCRMasterMix（北京天根生化科技有限公司）12.5μL，10μmol/L的BCF/BCR引物各1.0μL，1.0μLDNA模板，用无菌超纯水补足至25μL；扩增参数为：95℃预变性5min，94℃变性30s，60℃退火45s，72℃延伸30s，共35个循环，最后72℃延伸10min。

（3）取步骤（2）的PCR扩增产物5.0μL用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳分离，4-5V/cm，电泳结束后经溴化乙锭染色于紫外灯下观察，根据扩增产物的有无及其片段大小对结果进行判断，如果能特异性地扩增出约386bp的产物，即可判断所述的检测样品中存在番茄灰霉病菌，否则所述的检测样品中未存在番茄灰霉病菌。

本发明与现有技术相比，具有以下的技术优势和有益效果：

1.特异性强、准确性高：本发明是根据真菌核糖体转录间隔区（internaltranscribedspacer,ITS）序列种内的保守性和科属种间可变性的特点，设计了对番茄灰霉病菌具有特异扩增作用的PCR引物，并已经对不同地理来源的番茄灰霉病菌和携带番茄灰霉病菌的样品进行了测试验证，只有番茄灰霉病菌和携带该病菌的样品中能特异性地扩增出一条386bp的电泳条带，说明本发明所设计的引物具有很强的特异性和准确性。

2.灵敏度高：病原菌传统的检测方法是通过分离、纯化和形态学鉴定等步骤，这种传统方法的成功需要发病组织中积累到足够量的病原体才能成功。而本发明将设计的特异引物与ITS基因通用引物（ITS1/ITS4）联合起来进行巢式PCR扩增后，对番茄灰霉病菌的检测灵敏度在DNA水平上可达到10fg，比常规PCR检测提高了10000倍；

3.实用性好：番茄灰霉病菌的快速检测，具有重要的实际应用价值。传统的检测方法一般是在出现症状后，借助其发病症状，对病原菌进行分离、纯化、鉴定等一系列繁琐的过程，所需时间较长，给快速而精确地检测病原物增加了难度，由于传统的方法不能在病害发病前期及时进行田间的病原菌动态的监测和检测，时常延误农业生产的防治时机。本发明可对植株和土壤样品中是否存在番茄灰霉病菌进行检测，如果能特异性地扩增出386bp的电泳条带，说明样品中存在该病菌，因此本发明可用于番茄灰霉病显症之前的早期监测，可为确定病害防治最佳时期和制定防治策略的制定提供科学依据，因此本发明具有较好的实用性；

4.操作简便、快速：应用本发明方法，对待测样品基因组DNA进行提取、PCR扩增和常规的琼脂糖电泳后即可判定结果，整个检测过程采用DNA快速提取方法，操作简单，无需对病原菌进行分离培养，大大缩短了检测时间，一般整个检测过程可在6小时内完成。

附图说明

图1为本发明所述的PCR引物对番茄灰霉病菌进行的特异PCR扩增图，图中：泳道M为2000bpDNAMarker，泳道1-3为番茄灰霉病菌，泳道4-7分别为番茄晚疫病菌、番茄早疫病菌、番茄青枯病菌和毁灭炭疽菌，泳道8为阴性对照。

图2为本发明所述引物对番茄灰霉病菌的灵敏性检测扩增结果图，图2-a为单重PCR对番茄灰霉病菌的灵敏性检测结果，图2-b为巢式PCR对番茄灰霉病菌的灵敏性检测结果，图中泳道M为2000bpDNAMarker，泳道1为100ng，泳道2为10ng，泳道3为1ng，泳道4为100pg，泳道5为10pg，泳道6为1pg，泳道7为100fg，泳道8为10fg，泳道9为1fg，泳道10为为阴性对照。

图3为本发明发病组织和带菌土壤的检测结果图，图中泳道M为2000bpDNAMarker，泳道1为阳性对照，泳道2-3为自然发病的番茄叶片，泳道4为发病田块的土壤，泳道5-6为健康番茄叶片，泳道7为高压灭菌的土样，泳道8为阴性对照。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步阐述，以便更好地理解本发明，但不限制本发明的范围。以下实施例均按照常规实验条件，或已发表相关文献中所述的操作技术规程，或按照厂商所建议的实验条件。

实施例1：PCR检测引物序列的设计及引物对番茄灰霉病菌的特异性扩增

1.引物的设计与合成

本发明的关键性技术是番茄灰霉病菌高效特异性PCR检测引物的设计及其检测方法的建立。为了获得特异PCR检测引物序列，以来源于我国福建、江西、安徽、海南、浙江和广东等不同省份的20株番茄灰霉病菌和多个灰霉菌属近缘种以及常见的几种病原真菌为供试材料，采用CTAB法提取供试菌株基因组DNA，具体方法如下：取少量菌丝粉于1.5mL离心管中（菌丝粉刚盖过半圆形底部为宜），加入900μL2%CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）提取液（2%CTAB；100mmol/LTris-HCl,pH8.0；20mmol/LEDTA，pH8.0；1.4mol/LNaCl）和90μLSDS（十二烷基苯磺酸钠）【注：CTAB，SDS需60℃预热】，使用振荡器振荡混匀，60℃水浴1h（DNA释放至缓冲液中），12000r.min^-1离心15min；取上清液700μL，加等体积酚、氯仿、异戊醇混合液（各体积比为25:24:1），轻轻振荡混匀，12000r.min^-1离心9min；取上清液500μL，加入等体积氯仿再抽提一次，12000r.min^-1离心5min；取上清液350μL，加入1/10体积3mol.L^-1NaAc和2倍体积无水乙醇，-20℃沉淀30min，12000r.min^-1离心5min；弃去上清液，加入700μL冰70%乙醇进行洗涤（稍离心；倾掉上清液），在超净工作台上晾干无酒精味，加入30~60μLTE（10mmol/LTris-HCl，0.1mmol/LEDTA，pH8.0）溶液进行溶解，得到DNA溶液，用紫外分光光度计检测DNA浓度并稀释至25ng/μL待用。以真菌核糖体基因转录间隔区(ITS)通用引物ITS1:5'-TCCGTAGGGAACCTGCGG-3'和ITS4:5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'对供试番茄灰霉病菌（Botrytiscinerea）的ITS基因进行扩增，PCR反应体系25μL，包括2×TaqPCRMasterMix（北京天根生化科技有限公司）12.5μL，10μmol/L的ITS1/ITS4引物各1.0μL，2.0×10^-5～200ngDNA模板，用无菌超纯水补足至25μL。扩增反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性1min、55℃退火30S、72℃延伸1min，35个循环，最后72℃延伸10min。将PCR扩增产物送至上海生工生物工程有限公司进行测序，将测序得到的番茄灰霉病菌（B.cinerea）的ITS序列与GenBank中Botrytis属中不同种的ITS基因序列进行同源性比较分析，根据番茄灰霉病菌与其它种间的差异位点（在BioEdit中比对），用PrimerPrimer5软件设计了番茄灰霉病菌B.cinerea的特异性引物，引物序列为：上游引物BCF：5'-GCTCGCCAGAGAATACCAAA-3'，下游引物BCR：5'-CCTACCTGATCCGAGGTCAA-3'，引物合成由上海生工生物工程有限公司合成。

2.引物特异性PCR验证

在已设计特异引物的基础上，通过PCR反应体系和扩增参数的优化，建立的番茄灰霉病菌检测方法，以供试的番茄灰霉病菌及其它病原菌的基因组DNA为模板，对番茄灰霉病菌特异性引物（上游引物BCF：5'-GCTCGCCAGAGAATACCAAA-3'，下游引物BCR：5'-CCTACCTGATCCGAGGTCAA-3'）的特异性进行验证。PCR反应体系25μL，包括2×TaqPCRMasterMix（北京天根生化科技有限公司）12.5μL，10μmol/L的BCF/BCR引物各1.0μL，2.0×10-5～200ngDNA模板，用无菌超纯水补足至25μL。扩增反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性1min、60℃退火45S、72℃延伸30s，35个循环，最后72℃延伸10min。取5μLPCR产物进行1.5%琼脂糖电泳检测，经溴化乙锭染色后于紫外灯下观察，根据DNA条带的有无及大小对番茄灰霉病菌特异性引物的特异性进行验证。

3.引物特异性验证结果

PCR扩增结果表明，引物BCF/BCR只能特异性地从供试的20个番茄灰霉病菌DNA中扩增出大小约为386bp的条带（图1），而其它灰霉病菌、病原真菌及阴性对照均无扩增条带。说明该对引物均可以将番茄灰霉病菌与其它灰霉病菌和病原真菌区分开来，具有种的特异性，可用于番茄灰霉病菌快速可靠的检测和鉴定。

实施例2：引物对番茄灰霉病菌基因组DNA的灵敏度检测

1.常规PCR扩增

用无菌超纯水对番茄灰霉病菌基因组DNA进行稀释，配制成10倍数量级的系列浓度备用。使用本发明所述引物BCF/BCR对不同系列浓度的基因组DNA进行PCR扩增，评估该引物对番茄灰霉病菌基因组DNA检测的灵敏性，扩增反应体系和反应程序如下：PCR反应体系25μL，包括2×TaqPCRMasterMix（北京天根生化科技有限公司）12.5μL，10μmol/L的BCF/BCR引物各1.0μL，2.0×10^-5～200ngDNA模板，用无菌超纯水补足至25μL。扩增反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性1min、60℃退火45S、72℃延伸1min，35个循环，最后72℃延伸10min。

巢式PCR扩增

用无菌超纯水对番茄灰霉病菌基因组DNA进行稀释，配制成10倍数量级的系列浓度备用。以真菌核糖体基因转录间隔区(ITS)通用引物ITS1:5'-TCCGTAGGGAACCTGCGG-3'和ITS4:5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'为外引物，本发明所述的特异引物BCF/BCR为内引物对番茄灰霉病菌不同系列浓度的基因组DNA进行巢式PCR扩增，评估本发明所述引物BCF/BCR通过巢式PCR对番茄灰霉病菌基因组DNA检测的灵敏性，第一轮PCR扩增：以ITS通用引物ITS1:5'-TCCGTAGGGAACCTGCGG-3'和ITS4:5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'作为第一轮反应引物对不同系列浓度的基因组DNA进行PCR扩增，扩增反应体系和反应程序如下：PCR反应体系25μL，包括2×TaqPCRMasterMix（北京天根生化科技有限公司）12.5μL，10μmol/L的ITS1/ITS4引物各1.0μL，2.0×10^-5～200ngDNA模板，用无菌超纯水补足至25μL。扩增反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性1min、55℃退火30S、72℃延伸1min，35个循环，最后72℃延伸10min。第二轮PCR扩增：待第一轮PCR扩增结果后，取1.0μl第一轮PCR产物为模板与引物BCF/BCR组合进行巢式PCR扩增。PCR反应体系25μL，包括2×TaqPCRMasterMix（北京天根生化科技有限公司）12.5μL，10μmol/L的BCF/BCR引物各1.0μL，2.0×10^-5～200ngDNA模板，用无菌超纯水补足至25μL。扩增反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性1min、60℃退火45S、72℃延伸1min，35个循环，最后72℃延伸10min。

常规PCR和巢式PCR灵敏度比较结果表明，当以本发明所述引物BCF/BCR进行常规PCR扩增时，反应灵敏度可以达到100pgDNA25μl^-1反应体系（图2中的a）。进一步以ITS基因通用引物ITS1/ITS4进行第一轮扩增得到的PCR产物作为模板，以BCF/BCR作为第二轮扩增引物进行巢式PCR扩增，从电泳图可以看出套式PCR的特异性扩增条带比常规PCR要亮得多，能够使原来看不到条带的的样品（10pg、1pg、100fg、10fg/25μl反应体系）产生可见条带(图2中的b)，灵敏度达到10fgDNA25μl^-1反应体系，比常规PCR要提高10000倍左右。

实施例3：发病番茄叶片中番茄灰霉病菌的检测

发病番茄叶片中番茄灰霉病菌DNA的提取：采用NaOH快速裂解法提取DNA，具体过程如下：向1.0mg发病叶片中加入0.5mol/LNaOH30μL，将组织充分磨碎成糊后转入1.5mL离心管中，12,000rpm离心6min，取上清液5μl加入0.1mol/LTris-HCl（pH=8.0）495μL混合均匀，取1.0μL作为PCR模板进行扩增。PCR扩增检测：利用本发明所述引物BCF/BCR进行PCR扩增。PCR反应体系25μL，包括2×TaqPCRMasterMix（北京天根生化科技有限公司）12.5μL，10μmol/L的BCF/BCR引物各1.0μL，2.0×10^-5～200ngDNA模板，用无菌超纯水补足至25μL；扩增参数为：95℃预变性5min，94℃变性30s，60℃退火45s，72℃延伸30s，共35个循环，最后72℃延伸10min。结果检测：取PCR扩增产物5.0μL用1.5%琼脂糖电泳分离，电泳结束经溴化乙锭染色后于紫外灯下观察，根据扩增产物的有无及其片段大小对结果进行判断，如果能特异性地扩增出约386bp的产物，即可判断发病叶片中存在番茄灰霉病菌。检测结果（图3）表明，番茄灰霉病发病症状典型的叶片中均可检测出番茄灰霉病菌，而健康叶片及阴性对照则无特异性条带出现，说明该套技术能用于番茄植株组织中番茄灰霉病菌的快速分子检测。

实施例4：土壤样品中番茄灰霉病菌的检测

土壤样品中总微生物基因组DNA的提取：采用土壤DNA提取法提取土壤中总微生物基因组DNA，具体过程如下：取已过200目筛的土壤冷冻抽干24-48h后加入少量石英砂，倒入液氮充分研磨，将研磨后的土壤细粉分装至1.5ml离心管中，每管加入500μL重量浓度为0.4%脱脂奶粉溶液，涡旋混匀，12,000rpm离心15min，取上清液加入等体积蛋白酶K缓冲液，加终浓度为10μg/mL蛋白酶K，55℃水浴60min，水浴结束后，加入1/2体积的7.5MNH₄AC溶液，上下颠倒混匀，12,000rpm离心15min，吸上清液加2倍体积无水乙醇-20℃沉淀20min以上，沉淀结束后，12,000rpm离心10min，倾掉上清液，用体积浓度为70%乙醇洗涤沉淀，室温凉干，每份样品所提DNA用20μlTE（或无菌超纯水）溶解，取1.0μL作为PCR模板进行扩增。PCR扩增检测：利用本发明所述引物BCF/BCR进行PCR扩增。PCR反应体系25μL，包括2×TaqPCRMasterMix（北京天根生化科技有限公司）12.5μL，10μmol/L的BCF/BCR引物各1.0μL，2.0×10^-5～200ngDNA模板，用无菌超纯水补足至25μL；扩增参数为：95℃预变性5min，94℃变性30s，60℃退火45s，72℃延伸30s，共35个循环，最后72℃延伸10min。结果检测：取PCR扩增产物5.0μL用1.5%琼脂糖电泳分离，电泳结束经溴化乙锭染色后于紫外灯下观察，根据扩增产物的有无及其片段大小对结果进行判断，如果能特异性地扩增出约386bp的产物，即可判断土壤样品中存在番茄灰霉病菌。检测结果（图3）表明，番茄灰霉病发病严重的田块土壤样品中可检测出番茄灰霉病菌，而高压灭菌的土壤样品及阴性对照则无特异性条带出现，说明该套技术能用于土壤样品中番茄灰霉病菌的快速分子检测。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCELISTING

<110>福建省农业科学院植物保护研究所

<120>用于番茄灰霉病菌检测的PCR引物及其检测方法

<130>4

<160>4

<170>PatentInversion3.3

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

gctcgccagagaataccaaa20

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

cctacctgatccgaggtcaa20

<210>3

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

tccgtagggaacctgcgg18

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

tcctccgcttattgatatgc20

Claims (3)

1.用于番茄灰霉病菌检测的PCR引物，其特征在于：引物序列为：

上游引物BCF：5'-GCTCGCCAGAGAATACCAAA-3'，

下游引物BCR：5'-CCTACCTGATCCGAGGTCAA-3'；

对番茄灰霉病菌特异性扩增出386bp的产物。

2.一种利用权利要求1所述引物的番茄灰霉病菌检测方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）提取待测样品基因组DNA；

（2）以步骤（1）提取的DNA为模板，利用BCF/BCR这一对引物进行PCR扩增，PCR扩增的条件为：PCR反应体系25μL，包括2×TaqPCRMasterMix12.5μL，10μmol/L引物BCF/BCR各1.0μL，2.0×10^-5～200ngDNA模板，用无菌超纯水补足至25μL；扩增参数为95℃预变性5min，94℃变性30s，60℃退火45s，72℃延伸30s，共35个循环，最后72℃延伸10min；

（3）取5.0μL步骤（2）的PCR扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳分离，电压为4-5V/cm，电泳结束后经溴化乙锭染色于紫外灯下观察，根据扩增产物的有无及其片段大小对结果进行判断，如果能特异性地扩增出386bp的产物，即判断所述的检测样品中存在番茄灰霉病菌。

3.如权利要求1所述的引物在田间番茄灰霉病的早期诊断和病菌的监测和鉴定上的应用。