CN1752215A - 灰霉病的分子诊断方法 - Google Patents

灰霉病的分子诊断方法 Download PDF

Info

Publication number
CN1752215A
CN1752215A CN 200510029141 CN200510029141A CN1752215A CN 1752215 A CN1752215 A CN 1752215A CN 200510029141 CN200510029141 CN 200510029141 CN 200510029141 A CN200510029141 A CN 200510029141A CN 1752215 A CN1752215 A CN 1752215A
Authority
CN
China
Prior art keywords
pcr
primer
dna
result
amplification
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN 200510029141
Other languages
English (en)
Inventor
马雅军
王娜
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Second Military Medical University SMMU
Shanghai Jiaotong University
Original Assignee
Second Military Medical University SMMU
Shanghai Jiaotong University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Second Military Medical University SMMU, Shanghai Jiaotong University filed Critical Second Military Medical University SMMU
Priority to CN 200510029141 priority Critical patent/CN1752215A/zh
Publication of CN1752215A publication Critical patent/CN1752215A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Landscapes

  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及番茄灰霉病的分子诊断。本发明设计了一对番茄灰霉病病原灰葡萄孢特异性的PCR引物，用该引物对待检样品进行PCR扩增，根据扩增结果判定待检植株是否发生番茄灰霉病。本发明的方法能够区分番茄灰霉病菌和黄瓜霜霉病菌、黄瓜白粉病菌和辣椒疫霉病菌等其他病原菌，具有很好的特异性。本发明的方法可检测到0.2微克灰葡萄孢菌丝体提取的DNA，具有很高的灵敏度。与常规的培养纯病原体，在显微镜下形态鉴别方法相比，本发明的方法快速，灵敏，特异性好，能更好的进行番茄灰霉病菌的早期诊断。

Description

灰霉病的分子诊断方法
技术领域
本发明涉及植物病虫害防治领域，尤其涉及灰霉病病原的检测和鉴别。
背景技术
灰霉病在我国北方菜区是一种危害性很大的病害，塑料大棚、温室、小拱棚等保护设施栽培的葡萄、番茄、辣椒、黄瓜、菜豆等蔬菜常发生并流行，严重时减产达20％～30％以上。我国南方菜区，过去较少发生此病，但近年来由于保护设施栽培的发展，灰霉病也开始发生并有逐年加重的趋势。
灰霉病主要危害果实，也可侵害叶片和茎等部位。果实受害一般先从残留的花瓣、花托等处开始，出现湿润状、灰褐色不定形的病斑，逐渐发展成湿腐，从萼片部向四周发展，可使1/3以上的果实腐烂，病部长出一层鼠灰色、茸毛状的霉层。一般幼果发病较多，即将转熟的大果也可受害，且常见整穗果实都发病受害。叶片染病多从叶尖或叶缘开始，发生不定形的灰褐色病斑，可造成叶片湿腐凋萎。茎部染病发生长椭圆形或不定形的长条状、灰褐色病斑，潮湿时亦长出灰色霉层，严重的可引致病斑以上的茎、叶枯死。
灰霉病的病原是灰葡萄孢(Botrytis cinerea)，根据Ainsworth分类系统，其属于半知菌亚门(Deuteromycotina)，丝孢目(Hyphomycetales)，淡色孢科(Moniliaceae)，葡萄孢属(Botrytis)。其形态特征如下：分生孢子梗成丛地从菌丝体或菌核上生出，大小为280～550×12～24μm，长度变化大，灰色，后转褐色；分生孢子近球形或卵形，单细胞、淡色，大小为9～15×6.5～10μm；常形成小分生孢子，无色，球形，直径3μm。病菌还可产生黑褐色、不规则形的菌核。有性阶段为富氏葡萄孢盘菌(Botryotiniafuckeliana)，并存在一个同物异名为Sclerotinia fuckeliana。
灰葡萄孢主要以菌丝体或微菌核随病残体遗留在土壤中越冬，成为下一个生长季侵染的菌源，我国南方的病菌也可以在保护栽培设施内终年存活。病菌的分生孢子可通过风雨、昆虫、甚至农事操作传播，条件适宜时即可萌发，多从伤口或衰老、坏死组织侵入。侵染发病后又长出大量新的分生孢子，通过传播可不断进行再侵染。
灰葡萄孢感染的适宜气候条件是温度20℃左右、相对湿度75％以上。这种气候条件在我国南方主要出现在5月份的梅雨期和10～11月份的秋雨期，北方为6月份和9～10月份。
在大田和保护地灰霉病发病初期肉眼很难判定，待肉眼可辨时，病情会发展迅速，而难以控制，甚至喷药也无济于事，对该病发病的预报预测，通常农业技术人员依据温度、湿度以及经验判断，给予菜农以指导，误判难以避免。
实验室的常规研究是通过分离、培养纯的病原体，在显微镜下形态鉴别以定种，该方法所需时间周期长，形态鉴别需要操作者具有丰富的经验。
本领域迫切需要建立新的病原体检测技术，能够在病害早期客观、灵敏和稳定的鉴别和诊断灰霉病，以便进行及时、有针对性的治疗，避免损失。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种灰葡萄孢特异性的PCR引物，用于灰霉病分子诊断。
本发明的另一目的是建立一种检测灰霉病病原体灰葡萄孢的分子检测技术，以弥补现有技术之不足。
本发明的再一目的是提供一种用于诊断和鉴别灰霉病的试剂盒。
本发明的构思是这样的：在灰葡萄孢基因组的保守区设计一对种特异性PCR扩增引物，用该引物对待检样品进行PCR扩增，根据扩增结果判定待检植株是否发生灰霉病。
本发明的第一方面，提供一种用于检测灰葡萄孢的PCR引物，序列为：
p729+    5’-AGC TCG AGA GAG ATC TCT GA-3’
p729-    5’-CTG CAA TGT TCT GCG TGG AA-3’
本发明的第二方面，提供一种检测灰葡萄孢的方法，包括如下步骤：
取待检植物组织提取基因组DNA，得到的DNA样品复溶到50μL，作为PCR反应的模板；
按PCR反应总体积的1/50～1/25体积比加入模板，引物p729+、p729-在PCR反应体系中的终浓度为0.1μM，按常规方法及剂量加入其他试剂；
94℃预变性1min45s；94℃变性30s，45～55℃复性30s，72℃延伸30s，循环30次；
电泳检测扩增结果。
在一个优选的方案中，检测灰葡萄孢的方法，包括如下步骤：
取待检植物组织0.03g，常规方法提取基因组DNA，得到的DNA样品复溶到50μL，作为PCR反应的模板；
加入2μL模板，加入浓度为20μmol/L的p729+、p729-引物各0.25μL，按常规方法及剂量加入Taq酶及其他试剂，PCR反应总体积为50μL；
94℃预变性.1min45s；94℃变性30s，50℃复性30s，72℃延伸30s，循环30次；
电泳检测扩增结果，如果出现729bp的特异性扩增条带，结果为阳性；反之，结果为阴性。
本发明的第三方面，提供一种用于诊断和鉴别灰霉病的PCR检测试剂盒，包含：
(1)灰葡萄孢特异性引物
p729+   5’-AGC TCG AGA GAG ATC TCT GA-3’
p729-   5’-CTG CAA TGT TCT GCG TGG AA-3’；
(2)10xPCR reaction Buffer，25mM MgCl2，2.0mM dNTP，5U/ul Taq酶；
(3)DNA提取缓冲液：0.05mmol/L Tris-Cl(pH 8.8)，0.25mol/L EDTA，0.5％SDS，2％聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。
本发明的有益效果体现在：
(1)特异性。用本发明的引物和方法检测灰霉病菌4个地理株和容易混淆的黄瓜霜霉病菌、黄瓜白粉病菌和辣椒疫霉病菌，结果灰霉病菌4个地理株均为阳性，而黄瓜霜霉病菌、黄瓜白粉病菌和辣椒疫霉病菌均为阴性，说明本发明的方法有很好的特异性。
(2)灵敏度。本发明的方法可检测到0.2微克灰葡萄孢菌丝体提取的DNA，具有很高的灵敏度。
与常规的培养纯的病原体，在显微镜下形态鉴别方法相比，本发明的方法快速，灵敏，特异性好，能更好的进行灰霉病菌的早期诊断。
附图说明
图1种间及不同地理株之间的特异性检测结果。
泳道1-4：hm1-4；泳道5-6：sm1、sm2；泳道7-8：bf1、bf2；泳道9：LJYM；M：DNA标记物。
其中hm指灰霉病菌，sm指黄瓜霜霉病菌，bf指黄瓜白粉病菌，LJYM指辣椒疫霉病菌。
图2不同起始材料的DNA提取物灵敏性检测结果。
泳道+：纯灰葡萄孢基因组DNA；泳道1-5：不同比例混合的病菌与番茄叶片组织基因组DNA(代号同表1)；泳道-：模板为水；M为DNA Marker。
图3梯度稀释4号模板后的灵敏性检测结果。
泳道1：4号基因组DNA模板；泳道2-6：4号模板稀释2倍、5倍、10倍、20倍和50倍；M：DNA标记物。
具体实施方式
本发明的灰葡萄孢特异性的PCR引物，是根据Rigotti S等公开的灰葡萄孢DNA序列(Rigotti S，Gindro K，Richter H，et al.，Characterization of molecular markers forspecific and sensitive detection of Botrytis cinerea Pers.：Fr.In strawberry(Fragaria ananassaDuch.)using PCR.FENS Microbiology Letters，2002，209：169-174)，使用Bioedit软件设计得到，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。本发明采用的Taq酶购于上海生工生物工程技术服务有限公司，其他试剂为国产分析纯试剂。
本发明所采用的生物材料种类和来源如下：
  名称   来源地
 hm1   番茄灰葡萄饱   上海市闵行区
 hm2   番茄灰葡萄饱   上海市松江区
  hm3   番茄灰葡萄饱   上海市金山区
  hm4   番茄灰葡萄饱   广西
  bf1   黄瓜白粉病菌   上海市闵行区
  bf2   黄瓜白粉病菌   上海市浦东新区
  sm1   黄瓜霜霉病菌   上海市闵行区
  sm2   黄瓜霜霉病菌   上海市金山区
  LJYM   辣椒疫霉病菌   广西
下面结合实施例，对本发明做进一步地说明，但本发明并不受限于下述实施例。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，参见《分子克隆》(科学出版社，第二版，2002年)。
实施例1、特异性试验
称取hm1、hm2、hm3、hm4、bf1、bf2、sm1、sm2、LJYM共9种植物组织各0.03g，分别加入抽提缓冲液200μL，充分研磨后，再加入300μL抽提缓冲液，混匀，65℃水浴10min；加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，混匀，置冰上10min；12000rpm/min离心10min；取上清液，加入0.6倍体积的异丙醇，混匀，-20℃放置30min，12000rpm/min离心10min，弃上清；用预冷的70％乙醇洗涤沉淀2次，干燥；加入50μLddH2O溶解。
在9个反应管中分别加入模板2μL，10×PCR缓冲液5μL，dNTP(2.0mmol/L)2.5μL，Taq酶(5U/μL)0.04μL，正反向引物(20μmol/L)各0.25μL，加ddH2O至总体积50μL。
按以下程序进行PCR扩增：94℃预变性1min45s；94℃变性30s，50℃复性30s，72℃延伸30s，循环30次；最后72℃延伸5min。
取10μL扩增产物，加2μL载样缓冲液，1％琼脂糖凝胶电泳，100V，15min后在紫外灯下观察，见图1。结果显示结果灰霉病菌4个地理株均为阳性，而黄瓜霜霉病菌2株、黄瓜白粉病菌2株和辣椒疫霉病菌1株均为阴性，说明p729+/p729-引物的特异性较强，番茄植物组织对扩增没有影响。
实施例2灵敏性试验
按表1所示的比例，将健康番茄叶片和体外培养灰葡萄孢菌丝混合，称取混有一定量灰葡萄孢菌丝的植物组织约0.03g，按实施例1相同的方法提取模板DNA，进行PCR扩增，结果如图2所示。结果显示2、3和4号可扩增出清晰明亮的条带，1号和5号无扩增。
表1  健康番茄叶片和体外培养灰葡萄孢菌丝的不同混合比例表
  标号   健康番茄叶片量(g)   灰葡萄孢菌丝量(g)
  12345   0.0140.0170.0160.0170.019   0.0000.0160.0090.0040.001
将4号模板按2倍、5倍、10倍、20倍和50不同比例稀释后，再按实施例1相同的方法进行PCR扩增。结果如图3所示。可见稀释2倍、5倍、10倍、20倍和50倍后均可获得阳性扩增，但扩增效率也随之下降。在紫外透射下检测时，稀释20倍为肉眼可见的最低量，其中病菌的量为0.2μg。

Claims (6)

1、一种灰葡萄孢特异性的PCR引物，其特征在于，具有如下序列：
p729+5’-AGC TCG AGA GAG ATC TCT GA-3’
p729-5’-CTG CAA TGT TCT GCG TGG AA-3’。
2、一种利用PCR技术诊断灰霉病的方法，其特征在于，包括如下步骤：
提取待检样品基因组DNA；用提取的DNA为模板，用p729+、p729-引物进行PCR扩增；电泳检测PCR扩增结果。
3、如权利要求2所述的方法，其特征在于，取待检植物组织提取基因组DNA，得到的DNA样品复溶到50μL，作为PCR反应的模板；
按PCR反应总体积的2/50～1/25体积比加入模板，加入引物p729+、p729-使得引物在PCR反应体系中的终浓度为0.1μM，按常规方法及剂量加入Taq酶及其他试剂；
94℃预变性1min45s；94℃变性30s，45～55℃复性30s，72℃延伸30s，循环30次；
电泳检测扩增结果，如果出现729bp的特异性扩增条带，结果为阳性；反之，结果为阴性。
4、如权利要求3所述的方法，其特征在于：取待检植物组织0.03g，常规方法提取基因组DNA，得到的DNA样品复溶到50μL，作为PCR反应的模板；
加入2μL模板，加入浓度为20μmol/L的p729+、p729-引物各0.25μL，按常规方法及剂量加入Taq酶及其他试剂，PCR反应总体积为50μL；
94℃预变性1min45s；94℃变性30s，50℃复性30s，72℃延伸30s，循环30次；
电泳检测扩增结果，如果出现729bp的特异性扩增条带，结果为阳性；反之，结果为阴性。
5、如权利要求2-4的任一项所述的方法，其特征在于，所说的灰霉病指灰葡萄孢侵染葡萄、番茄、辣椒、黄瓜、菜豆等蔬菜后引发的病变。
6、一种用于诊断灰霉病的PCR检测试剂盒，包含：
(1)灰葡萄孢特异性引物
p729+5’-AGC TCG AGA GAG ATC TCT GA-3’
p729-5’-CTG CAA TGT TCT GCG TGG AA-3’；
(2)10xPCR reaction Buffer，25mM MgCl2，2.0mM dNTP，5U/ul Taq酶；
(3)DNA提取缓冲液。
CN 200510029141 2005-08-26 2005-08-26 灰霉病的分子诊断方法 Pending CN1752215A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN 200510029141 CN1752215A (zh) 2005-08-26 2005-08-26 灰霉病的分子诊断方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN 200510029141 CN1752215A (zh) 2005-08-26 2005-08-26 灰霉病的分子诊断方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN1752215A true CN1752215A (zh) 2006-03-29

Family

ID=36679219

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN 200510029141 Pending CN1752215A (zh) 2005-08-26 2005-08-26 灰霉病的分子诊断方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN1752215A (zh)

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101974651A (zh) * 2010-12-02 2011-02-16 中国农业科学院植物保护研究所 辣椒疫霉荧光定量pcr检测法及检测试剂盒
CN102181522A (zh) * 2011-03-07 2011-09-14 中国检验检疫科学研究院 黄瓜细菌性角斑病菌检测用引物
CN103146812A (zh) * 2013-01-24 2013-06-12 华中农业大学 一种灰葡萄孢特异性pcr检测方法
CN103276057A (zh) * 2013-04-03 2013-09-04 南京农业大学 一种基于lamp技术快速检测灰葡萄孢的方法
CN105112533A (zh) * 2015-09-16 2015-12-02 福建省农业科学院植物保护研究所 用于番茄灰霉病菌检测的pcr引物及其检测方法
CN106687604A (zh) * 2014-09-11 2017-05-17 阿格洛法士公司 用于对肉类、植物或植物部分进行病原体检测和病害治理的方法
CN107119139A (zh) * 2017-06-14 2017-09-01 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 快速检测百合灰霉病致病病原菌灰葡萄孢的方法

Cited By (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101974651A (zh) * 2010-12-02 2011-02-16 中国农业科学院植物保护研究所 辣椒疫霉荧光定量pcr检测法及检测试剂盒
CN101974651B (zh) * 2010-12-02 2012-06-27 中国农业科学院植物保护研究所 辣椒疫霉荧光定量pcr检测法及检测试剂盒
CN102181522A (zh) * 2011-03-07 2011-09-14 中国检验检疫科学研究院 黄瓜细菌性角斑病菌检测用引物
CN102181522B (zh) * 2011-03-07 2012-11-21 中国检验检疫科学研究院 黄瓜细菌性角斑病菌检测用引物
CN103146812A (zh) * 2013-01-24 2013-06-12 华中农业大学 一种灰葡萄孢特异性pcr检测方法
CN103146812B (zh) * 2013-01-24 2014-08-06 华中农业大学 一种灰葡萄孢特异性pcr检测方法
CN103276057A (zh) * 2013-04-03 2013-09-04 南京农业大学 一种基于lamp技术快速检测灰葡萄孢的方法
CN103276057B (zh) * 2013-04-03 2014-10-15 南京农业大学 一种基于lamp技术快速检测灰葡萄孢的方法
CN106687604A (zh) * 2014-09-11 2017-05-17 阿格洛法士公司 用于对肉类、植物或植物部分进行病原体检测和病害治理的方法
CN105112533A (zh) * 2015-09-16 2015-12-02 福建省农业科学院植物保护研究所 用于番茄灰霉病菌检测的pcr引物及其检测方法
CN105112533B (zh) * 2015-09-16 2018-02-27 福建省农业科学院植物保护研究所 用于番茄灰霉病菌检测的pcr引物及其检测方法
CN107119139A (zh) * 2017-06-14 2017-09-01 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 快速检测百合灰霉病致病病原菌灰葡萄孢的方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Calvente et al. Analysing natural diversity of arbuscular mycorrhizal fungi in olive tree (Olea europaea L.) plantations and assessment of the effectiveness of native fungal isolates as inoculants for commercial cultivars of olive plantlets
Terhonen et al. The effect of latitude, season and needle age on the mycota of Scots Pine (Pinus sylvestris) in Finland
CN1752215A (zh) 灰霉病的分子诊断方法
Jiang et al. Neopestalotiopsis rosicola sp. nov. causing stem canker of Rosa chinensis in China
CN103013852B (zh) 一种对黄瓜疫霉菌有抑制作用的放线菌及其筛选方法
Abreo et al. Phaeomoniella chlamydospora and Phaeoacremonium spp. in grapevines from Uruguay
Poletto et al. Characterization and pathogenicity of Fusarium oxysporum associated with Carya illinoinensis seedlings
Daengsuwan et al. Morphological and molecular identification of Neopestalotiopsis clavispora causing flower blight on Anthurium andraeanum in Thailand
CN101643788A (zh) 马铃薯晚疫病菌分子检测引物及其用法
Carisse et al. Evidence for differences in the temporal progress of Plasmopara viticola clades riparia and aestivalis airborne inoculum monitored in vineyards in eastern Canada using a specific multiplex quantitative PCR assay
Shadmani et al. Biocontrol activity of endophytic fungus of barley, Microdochium bolleyi, against Gaeumannomyces graminis var. tritici
El-Fallal et al. Podaxis pistillaris (L.) Fr. and Leucocoprinus birnbaumii (Corda) Singer; new addition to macrofungi of Egypt
CN103555589A (zh) 杀叶甲科害虫的白僵菌菌株及其应用
CN103205504A (zh) 一种检测甘蔗黑穗病菌的实时荧光定量pcr方法
CN102643903B (zh) 辣椒疫霉的pcr检测引物、含有该引物的试剂盒及应用
Elmer et al. Investigation of an outbreak of Fusarium foot and fruit rot of pumpkin within the United States
Ammad et al. Diversity of fungal trunk pathogens associated with grapevine dieback of grapevine in Algeria
Abdullahi et al. Isolation and identification of bacteria associated with aerial part of rice plant from Kware lake
CN102559670B (zh) 辅助鉴定尖镰孢菌菜豆专化型的引物对及其应用
CN102382819B (zh) 一种罹病植物组织中香蕉穿孔线虫dna提取方法及其应用
CN106119387A (zh) 一种检测马铃薯青枯病菌的引物及其pcr检测方法
CN109182574B (zh) 一种检测南洋楹溃疡病菌的巢式pcr试剂盒及方法
CN103882108A (zh) 检测甘蔗梢腐病温度敏感型小种gx2的方法
Yan et al. Simulation of the spreading trend of Camellia oleifera Anthracnose in Guangdong Province
CN104164501B (zh) 一个大豆抗锈病基因位点及应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication