CN102382819B - 一种罹病植物组织中香蕉穿孔线虫dna提取方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明“一种罹病植物组织中香蕉穿孔线虫DNA提取液、提取方法及其应用”，涉及植物病害的分子生物学检测技术。所述DNA提取液其组分及各组分的终浓度如下：Tris-HCl200mM，PH 8.0；NaCl 400mM；EDTA 10mM，PH 8.0；CTAB 3％(W/V)；β-巯基乙醇4％(V/V)。该提取液作为罹病植物香蕉穿孔线虫DNA的裂解液，能够将感染植物组织的极少量的香蕉穿孔线虫的DNA完好地提取出来，而不受植物组织的酚类、蛋白酶类、解酶等物质的降解。本发明提供的DNA提取液及提取方法是采用PCR等分子生物学手段早期监测香蕉穿孔线虫感染以便于早期治理预防感染的重要基础。

Description

一种罹病植物组织中香蕉穿孔线虫DNA提取方法及其应用

技术领域

本发明涉及植物病害的分子生物学检测技术，特别涉及一种香蕉穿孔线虫DNA提取液、提取方法及早期分子检测方法。

背景技术

香蕉穿孔线虫(Radopholus similis), 英文俗名the burrowing nematode；Blackhead or toppling disease of bananas)，又叫相似穿孔线虫，它是一种极具毁灭性的外来入侵植物检疫性有害线虫，也是我国对外植物检疫对象^[58]。香蕉穿孔线虫（Radopholus similis）为迁移性内寄生线虫，在全世界范围内的热带及亚热带均有分布^[5]。它的寄主范围也非常广泛，已报道的寄主多达360多种，其中大多数属偶然寄主 (在罹病香蕉树附近存在)和人工接种寄主。

近年来，随着我国加入WTO，农产品国际贸易往来迅速发展、人员交流的日益频繁和旅游业的发展，从香蕉穿孔线虫疫区国家或地区引进各种花卉苗木及种质材料的种类和数量迅速增加，由寄主植物携带而将该线虫传入中国的可能性和传入风险日益剧增。近年来不断由我国各口岸截获香蕉穿孔线虫^、，事实上香蕉穿孔线虫已经逼近国门，入侵后将对我国农业生产带来毁灭性的打击和极度严重的损失。由于香蕉穿孔线虫寄主范围广，这些寄主植物在中国广泛分布。所以，如果香蕉穿孔线虫一旦从中国的温室中扩散到大田，则极易定殖和流行。这将给中国的农业生产造成严重危害。

在香蕉穿孔线虫的鉴定与检测方面，往往主要以形态鉴定为主, 但因为形态特征变化幅度较大及表型特征不稳定问题，传统形态鉴定往往比较困难，导致误诊。并且传统的形态坚定耗时、费力，往往需要专业人士操作，并且需要大量线虫样本，在单头线虫水平上不能达到要求。而在PCR技术上建立起来的分子鉴定方法的一系列研究进展克服了传统鉴定方法上的缺陷。目前已有许多有关利用分子和生化方法鉴定香蕉穿孔线虫的方法，如RFLP、同工酶 、RAPD 、PCR等主要进行系统进化分析，揭示种间、种内差异。在植物检疫领域中，DNA分子标记是目前线虫学研究中发展较快的一种鉴定手段。线虫种特异性引物PCR扩增检测或双重PCR扩增检测是近年重要植物线虫分子诊断的重要进展之一。通过一次PCR测验就可以在混合样品中特异性地检测出一个或多个线虫种。

基于核糖体DNA（rDNA）而构建的线虫特异性引物进展较快，在诊断根腐线虫、根结线虫中取得了突破性进展，形成了特异性诊断4种重要根腐线虫如穿刺根腐线虫 P. penetrans、 斯克里布根腐线虫P. scribneri、咖啡根腐线虫P. Coffeae 和 卢赛根腐线虫P. loosi的特异性引物，以及3种根结线虫如戚乌得根结线虫M. Chitwoodi、法拉克斯根结线虫M. fallax 和北方根结线虫 M. Hapla (Zijlstra, C. 1997 , Petersen et al., 1997, Williamson et al., 1997)的特异性引物，诊断的水平达到单条幼虫的水平。

Mulholland et al.(1996)分别构建了马铃薯金线虫和马铃薯白线虫的特异性引物，描述了一种基于rDNA-ITS区域特异性等位多重PCR技术检测这两种线虫的方法，能快速鉴定马铃薯白线虫和马铃薯金线虫及其复合种群。与标准的PCR途径不同，这一技术在每个PCR反应中应用了3个引物，通用引物5.8SrRNA、马铃薯金线虫的特异性引物ITS1-Gr和马铃薯白线虫的特异性引物ITS1-Gp。 Bulman & Marshall（1997）成功应用多重PCR技术快速诊断马铃薯孢囊线虫。在研究了秘鲁和澳大利亚的马铃薯金线虫和马铃薯白线虫的rDNA-ITS的序列结构基础上，构建了马铃薯金线虫的特异性引物PITSr3 和白线虫的特异性引物PITSp4，通用引物ITS5与PITSr3可以扩增343bp马铃薯金线虫的特异性片段，与PITSp4可以扩增出265bp特异性识别马铃薯白线虫的DNA片段。在一个PCR反应中，使用PITSr3，PITSp4和ITS5这3个引物，即使复合种群中金线虫DNA的含量仅为白线虫的百分之一，也能从复合种群检测出金线虫。

欧师琪 彭德良（Ou SQ，Peng DL，2008）设计构建了大豆孢囊线虫特异性SCAR标记引物SCNFI和SCNRI，发明了大豆孢囊线虫的一步双重PCR检测方法，检测的特异性片段长度为494bp，建立快速准确检测和早期诊断大豆孢囊线虫的分子生物学方法和技术规程，可以检测大豆孢囊线虫单个孢囊、单头二龄幼虫和雄虫，该项检测技术获得国家发明专利（ZL200510012246.1）.

Subbotin， Peng DL（彭德良 2001）等构建了基于rDNA-ITS区域上的大豆孢囊线虫特异性引物GlyF1，应用两组引物D3A和D3B及大豆孢囊线虫种特异性引物GlyF1和引物rDNA2成功地对大豆孢囊线虫进行了分子诊断研究。第一对引物D3A和D3B是证实PCR扩增的成功性，第二对引物GlyFI和rDNA2是特异性检测大豆孢囊线虫。用这两对引物进行的双倍PCR扩增，从所有52个大豆孢囊线虫群体都扩大豆孢囊线虫的特异性DNA片段（181bp），而在所有测试的其他8种孢囊线虫22群体没有181bp片段。大豆孢囊线虫种特异性引物GlyF1灵敏性非常高，能从单条幼虫的微量DNA中扩增出大豆孢囊线虫种特异性片段。 

宛飞 彭德良等（2008）根据马铃薯腐烂茎线虫rDNA-ITS区的序列特征，对我国甘薯茎线虫两个不同型群体各设计了一对特异性引物。A型甘薯茎线虫特异引物为DDS1/DDS2，特异扩增片段为252bp；B型甘薯茎线虫特异引物为DDL1/DDL2，特异扩增片段为485bp；引入线虫通用引物D3A/D3B作内标，研究出一步双重PCR特异性检测甘薯茎线虫不同类型群体的分子技术和方法，该分子检测技术具有特异性强、方法可靠、灵敏性高、操作简便，检测的精确度达到单条线虫的水平。

Amiri, Subbotin 等（2002）构建了基于rDNA-ITS的甜菜孢囊线虫（H. schachtii）特异性引物SHF6。将特异性引物SHF6与通用引物AB28引物结合，同时将通用引物D2A和D3B放在一个PCR反应体系中，从58个孢囊线虫群体中成功地鉴定出甜菜孢囊线虫，从36个甜菜孢囊线虫群体中扩增200bp特异性片段，而非甜菜孢囊线虫（H. schachtii）DNA的样品没有目的片段。

而基于基因组DNA的SCAR标记方面，Fullanodo, A. et. al.（1999）用随机引物OPG5分别扩增出区分马铃薯金线虫特异性RAPD标记片段为826bp，马铃薯白线虫特异性RAPD标记片段为1100bp。对扩增出的马铃薯金线虫和白线虫的RAPD标记片段进行全序列分析，将RAPD标记转化成SCAR标记，设计出马铃薯金线虫FullGrf和FullGrr以及马铃薯白线虫的SCAR特异性标记引物FullGpf和FullGpr，用FullGrf和FullGrr扩增出了315bp马铃薯金线虫的特异性片段,  用FullGpf和FullGpr扩增出798bp的马铃薯白线虫的特异性片段。

在香蕉穿孔线虫的分子检测方面也进行了相关研究。Kaplan D.T.et al.(1996)根据Kesseli R.V.（1992）的方法，筛选380个随机引物，从基因组DNA中找到6条差异片段，克隆、测序后设计了一对24bp的特异性引物，可特异扩增Radopholus similis。 Falls et al.(1996)利用PCR方法扩增rDNA片段来比较两个ITS区及5.8S基因。基于rDNA片段的RFLPs可用于比较全世界不同的香蕉种植区域的10个香蕉穿孔种群。Elbadri et al. (2002)也对香蕉穿孔线虫的rDNA-ITS做了相关研究^，通过研究穿孔线虫(R..similis)种内rDNA - ITS的变异，测定ITS序列并进行RFLP分析发现，香蕉穿孔线虫种内ITS序列稳定，变异很小。但穿孔线虫（Radopholus）属的不同种间ITS存在差异。国外的研究表明，曾经认为是香蕉穿孔线虫的一个来自澳大利亚种群，经过对rDNA-ITS序列特征和RFLP分析研究，发现该群体实际上是香蕉穿孔线虫的近缘种，最近重新命名和描述为澳洲穿孔线虫新种(Radopholus musicola)、来自越南榴莲和咖啡根系的两个穿孔线虫群体虽然与香蕉穿孔线虫及其近似，但rDNA-ITS序列和RFLP酶谱都存在差异，分别描述为“榴莲穿孔线虫新种(Radopholus duriophilus)和阿拉伯咖啡穿孔线虫新种(Radopholus arabocoffeae)。近年的分子和细胞遗传学证据表明，香蕉穿孔线虫与柑桔穿孔线虫为同一个种。

近年来我国也相继开展了香蕉穿孔线虫的分子特征的相关研究。自多次截获香蕉穿孔线虫以来，国内相关单位加大了对香蕉穿孔线虫的检疫检验力度，相继开展了香蕉穿孔线虫风险分析、培养技术及其种群繁殖力、入侵中国适生区的GIS 预测等相关研究。葛建军等根据NCBI已登录的香蕉穿孔线虫序列聚类比对后根据保守区域设计出穿孔线虫属水平上的特异性引物Rl、R2(R1／2)和香蕉穿孔线虫种水平上的特异性引物RS1、RS2(RS1／2)进行双重PCR扩增香蕉穿孔线虫，检测精度可达单条水平和实时荧光定量PCR检测单头香蕉穿孔线虫技术。但是没有从罹病植物组织中检测香蕉穿孔线虫。周春娜谢辉等（2006）等利用国外的通用引物研究了香蕉穿孔线虫rDNA-ITS, 没有涉及特异性引物。

对于从罹病植物中对香蕉穿孔线虫的侵染情况进行早期检测，除了香蕉穿孔线虫特异性引物这个必要条件外，首先必须能够从罹病寄主植物中有效地提取香蕉穿孔线虫的DNA，由于在提取过程中线虫DNA与植物DNA的比例相当悬殊，且植物组织中的蛋白、植物酚等物质都容易导致线虫DNA在提取过程中降解，当检测早期感染的植物时，由于寄生的线虫非常少，有效提取其DNA更是困难。

发明内容

本发明提供了一种从植物中提取微量香蕉穿孔线虫DNA的提取液和提取方法，以及香蕉穿孔线虫特异性引物及双重PCR的早期检测方法。本发明的提取液、提取方法及特异性引物和双重PCR检测方法能够从罹病植物组织中有效地提取香蕉穿孔线虫DNA的难题，建立了罹病植物中香蕉穿孔线虫的早期快速准确检测和诊断的分子生物学方法，可以检测罹病植物组织中的单头香蕉穿孔线虫。达到早检测、早治理和早控制的效果。

一种罹病植物组织中香蕉穿孔线虫DNA提取液，其组分如下：200 mM Tris - HCl， pH 8.0; 400 mM NaCl;  10 mM EDTA, pH 8.0; 质量体积比为3% CTAB;  体积比为4% 的β- 巯基乙醇; 2 mg / ml ProK。

一种罹病植物组织中香蕉穿孔线虫DNA的提取方法，步骤是：

（1）液氮研磨待测寄主植物组织成粉末状；

（2）向500~1000ul 经65 ℃预热的上述DNA提取液中加入0.1~0.5g粉末状植物组织，再加入50~100u l  ProK溶液后，充分混合均匀；

（3）将上一步混合液 于65℃温浴（0.5~2）h，期间每隔15min颠倒混匀一次；4 ℃下12000 rmf/min离心10 min，取上清液转移至另一离心管中，加等体积酚/氯仿抽提2~3次直至分界面看不到白色沉淀物后，4 ℃下12000 rmf/min离心10 min，取上清转移至另一离心管中；

（4）向上清液中加入2 倍体积的预冷的无水乙醇和1/10体积pH 5.2 ，3 M NaAC溶液，混合均匀后于-70℃沉降DNA至少 0.5 h，4 ℃下12000 rmf/min离心10 min，去上清， 70％乙醇洗涤沉淀2次，干燥后，沉淀复溶于30 μl Tris-HCl缓冲液中。

所述提取方法，

所述步骤（2）在600μl的经65 ℃预热的上述裂解液中加入0.5g上述粉末，60u lProk ；

所述步骤（3）上一步混合液在65℃温浴0.5h，4 ℃ 12000 rmf/min离心10 min，取上清液盛于另一管中，加等体积酚/氯仿抽提2次直至分界面看不到白色沉淀物后，4 ℃12000 rmf/min离心10 min。

一种香蕉穿孔线虫早期分子检测方法，其特征在于以香蕉穿孔线虫DNA为模板，采用上述特异性引物进行PCR扩增：

上游引物：RsF1   5’-TGTCATCGCCTTTGGCAGCT-3’

下游引物：RsR1   5’-TGGTAAACGACCCTGAACCAG-3’。

所述PCR扩增的体系为：5 μl 10×含Mg²⁺的PCR Buffer， 4 μl 10 mM dNTPS，1 μl 0.1％BSA，1.5 μl 20 uM引物对RSF1/RSR1，0.5 μl 5 U/ul的 Taq DNA聚合酶，1 μl 香蕉穿孔线虫DNA，灭菌ddH₂O补足至25 μl。

所述PCR扩增的程序为：95℃ 4min，95℃变性45s，56℃退火30s，72℃延伸1min，40个循环；72℃再延伸10min，4℃保存。

所述PCR扩增的体系中还包括如下序列的通用引物:

5’- ACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTG -3’

5’- TCGGAAGGAACCAGCTACTA -3’。

所述香蕉穿孔线虫DNA采用上述提取方法提取。

上述任一检测方法在诊断罹病植物、土壤香蕉穿孔线虫感染情况或鉴别香蕉穿孔线虫中的应用。

本发明提供一种专门能从待测患病植物之中提取香蕉穿孔线虫DNA的提取液及提取方法，能够防止植物组织、蛋白、酚等物质降解线虫DNA，能有效地将微量线虫DNA从寄主植物中提取出来，以便于进行分子检测。

本申请单位对香蕉穿孔线虫的分子诊断进行了一系列研究。对香蕉穿孔线虫的种群繁殖能力进行了研究，并验证了香蕉穿孔线虫可以孤雌生殖。利用rDNA - D2D3区分析鉴定香蕉穿孔线虫发现，香蕉穿孔线虫D2／D3区具有较大的保守性。对rDNA - ITS也进行了相关研究，ITS位点是用于线虫分子分类和鉴定的经典遗传位点，ITS位点的比较分析目前在根结线虫、孢囊线虫、球孢囊线虫、茎线虫及其它重要植物线虫分类鉴定中得到了成功应用。

本发明利用线虫rDNA -ITS区通用引物(FerF/FerR)扩增核糖体DNA的ITS1和ITS2全序列以及18S、28S部分序列，通过生物信息学分析后设计特异性引物（RsF1/RsR1），可以直接用来进行香蕉穿孔线虫的PCR特异性检测；本发明还提供了结合28S区的D3扩展区的通用引物D3A/D3B（Amiri, S., Subbotin, S.A. & Moens, M. 2002. Identification of the beet cyst nematode Heterodera schachtii by PCR. European Journal of Plant Pathology 108:497-506.）作为内标，采用一步双重PCR方法检测香蕉穿孔线虫的方法，进一步保证了检查的可靠性，降低假阳性。

本发明提供的检测方法的灵敏度可达到检测单头线虫的水平，与重复性较差的RAPD技术（RAPD-PCR）、核糖体DNA限制性内切酶技术（RFLP-PCR）检测方法相比，更能够省时、准确、灵敏，更能建立快速、准确的香蕉穿孔线虫检测技术。该技术可应用于对香蕉穿孔线虫田间土壤样品及植物上香蕉穿孔线虫病发生的早期快速分子检测，具有实际的应用价值。本发明的检测方法还可以用于香蕉穿孔线虫分类鉴别。

附图说明

图1.香蕉穿孔线虫rDNA-ITS的PCR扩增

M: DL2000标准DNA ,1-7:HLH,SHH,LZH,SZH,HN13H,HN12H,HN12F,8:阴性对照(代码见表1)

图2.香蕉穿孔线虫特异引物RsF1/RsR1的PCR扩增

M:DL2000标准DNA ,1-7:HLH,SHH,LZH,SZH,HN13H,HN12H,HN12F,8:阴性对照(代码见表1)

图3.香蕉穿孔线虫RsF1/RsR1结合D2A/D3B的一步双重PCR检测

M：DL2000标准DNA，1 ~ 5：RSSH, RSSZ, RSHZ, RSLZ, HK; 6:阴性对照(代码见表1、表2)

图4.香蕉穿孔线虫RsF1/RsR1联合D2A/D3B的双重PCR特异性检测

M：DL2000标准DNA，1 ~ 5：RSSH，RSSZ，RSHZ，RSLZ，HK；6 ~ 14：PLD, PXM, DdCL, DdSH, GS-4, GS-14, GS-11, GS-18, MiLF, 15: 阴性对照(代码见表1、表2)

图5.香蕉穿孔线虫特异性引物的灵敏度检测

M:DL2000 plus ，1-9: 1×， 1/2×， 1/4×， 1/8×， 1/16×， 1/32×， 1/64×， 1/128×，  1/256×，10:阴性对照

图6.植物组织中香蕉穿孔线虫的直接检测

M: DNA Marker DL2000， 1: 样本DNA，2:阴性对照

图7.罹病红掌苗样本中香蕉穿孔线虫的特异性检测　

用香蕉穿孔线虫特异性引物对RsF1/RsR1检测3.1.1中所提取的总DNA为泳道1，泳道2、3为对应的无虫红掌苗木总DNA对照没有扩增出特异性条带，泳道4为阳性对照的纯香蕉穿孔线虫DNA模板扩增出很亮的特异性条带，泳道5为无DNA模板的阴性对照没有扩增出特异性条带。

图8.罹病红掌苗样本中香蕉穿孔线虫的梯度检测

初始浓度DNA模板的扩增条带最亮(泳道1)，随1/2 浓度稀释扩增条带逐渐减弱(泳道2 ~ 6)，1/32×稀释浓度的DNA模板仍然能扩增出明显条带（泳道6）， 无DNA模板阴性对照无目的条带。

图9.罹病植物组织中香蕉穿孔线虫的一步双重PCR检测D2A/D3B、RsF1/RsR1检测

M: DNA Marker DL2000, 1: rZ, 2: CK1, 3: CK2, 4: 阴性对照

具体实施方式

实验材料

共收集7个香蕉穿孔线虫种群(HN13H，HN12H，HN12F，HLH，SHH，LZH，SZH ) (表1)。两个香蕉穿孔线虫种群样品（HLH，SHH）为中国检疫科学院葛建军老师惠赠，一个样品SZH为深圳动植物检疫局李一农老师惠赠，一个样品LZH为华南农业大学廖金玲教授惠赠，其它种群为本实验室自行采集。供试香蕉穿孔线虫线虫均为纯培养试验种群。

表1　供试香蕉穿孔线虫种群及其来源

                                                       

主要试剂：Taq DNA聚合酶、DNA普通琼脂糖凝胶回收试剂盒购自天根公司；DNA marker 购自TaKaRa公司；引物由上海生工生物技术有限公司合成；pGEM-T Easy Vector（Promega，美国）购自北京绿生源科技有限公司，Pro K（蛋白酶K）购自Roche公司。

本发明的实验所采用的表1、表2所列的各种属的线虫，其中本实验室采集的线虫种群，均采用常规方法采集，传统形态学方法鉴定种类后供试；所有供试线虫本实验室均有保存，可向公众发放作为实验验证使用。

实施例1香蕉穿孔线虫DNA 的提取、rDNA-ITS扩增及序列分析与注册

香蕉穿孔线虫DNA的提取

所有样本的DNA提取均参照彭德良等（2003）的方法并在此基础上略加改动。挑取单头至10头线虫放入装有10 μl ddH2O的 Eppendorf 管中，- 20℃冷冻过夜，取出后，用75％酒精消毒的玻璃棒研磨至冰块融化，加入7 μl WLB（worm lysis buffer）和3 μl蛋白酶K（2 mg/ml）溶液，混匀于5000 rmp点动离心，- 20℃冷冻30 min以上，然后转入PCR仪，65℃温浴60 min，95℃反应10 min，取出后点动离心，取上清液进行PCR扩增或于－20℃保存备用。

罹病植物组织中香蕉穿孔线虫DNA的直接提取

采用改进的CTAB法，提取液成分：200 mM Tris - HCl， pH 8.0; 400 mM NaCl;  10 mM EDTA, pH 8.0; 3% CTAB(W/V);  4% β- 巯基乙醇（V/V）。提取步骤：液氮研磨感病红掌根至细粉末状，每0.5 g植物组织加入60 μl prok 和600 μl 经65 ℃预热的DNA 裂解液，充分混匀后65℃温浴0.5~2 h，期间，每15min颠倒混匀一次。4 ℃ 12000 rmf/min离心10 min，取上清液用等体积酚/氯仿抽提2次直至分界面看不到白色沉淀物后4 ℃ 12000 rmf/min离心10 min，上清用2 V无水乙醇和1/10 V 3 M NaAC（pH 5.2）于-70℃沉降DNA 0.5 h，4 ℃ 12000 rmf/min离心15min，70％乙醇洗涤沉淀2次，干燥沉淀后后用30 μl Tris-HCl复溶DNA。

1.3香蕉穿孔线虫rDNA-ITS扩增及序列分析

采用通用引物Ferris et al.(1993)引物（Phap等，2004），序列如下：

FerF:(5’-CGTAACAAGGTAGCTGTAG-3’) 和 FerR:(5’-TCCTCCGCTAAATGATATG-3’) 。 扩增香蕉穿孔线虫的rDNA-ITS，PCR反应体系为 10×Buffer(含Mg2+) 5μl， 10mM dNTP 4μl，ddH2O 32.6μl， 引物Ferris F和Ferris FR(20 μmol/L）各1.5μl，Taq酶（5U/μl ,Takara）0.4μl，模板DNA 5μl，总计 50μl。PCR扩增条件为：95℃ 预变性5min，50℃ 退火30s，72℃延伸 2min；94℃变性45s，50℃ 退火30s，72℃延伸2min，35个循环；72℃再次延伸10min，4℃保存。PCR扩增后，取5μl扩增产物加1μl加样缓冲液在1.0%琼脂糖凝胶上电泳，用0.5×TAE作为电泳缓冲液，100V下电泳40分钟，用EB染色，在紫外灯下观测并照相。rDNA-ITS-PCR扩增结果表明：7个不同的香蕉穿孔线虫群体均产生一明显的ITS扩增条带，扩增产物长度均为706bp左右，在阴性对照中不加入线虫DNA模板，没有PCR产物(图1)。 用离心柱型普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（TIANGEN公司）回收纯化PCR产物。进行克隆和测序，序列测定由上海生工生物工程有限公司完成。测定的7个香蕉穿孔线虫ITS 序列在GenBank上的登录号分别为EF208207、EF208208、EF517226、EF208209、EF208206、EF517228、EF517227。

实施例2 香蕉穿孔线虫特异性引物的筛选及检测 

2.1 香蕉穿孔线虫特异性引物的设计和筛选

采用发明单位扩增得到的7个香蕉穿孔线虫ITS序列（NCBI登录号：EF208207、EF208208、EF517226、EF208209、EF208206、EF517228、EF517227， 具体序列见附录）及由NCBI基因库中下载的隶属于香蕉穿孔线虫属的6个近缘种的ITS序列（NCBI登录号：AF375369、AF375386、AF3753687、AF375389、AF375391、AF375393）进行比对分析，并设计筛选出一对香蕉穿孔线虫特异性引物RsF1/RsR1，此香蕉穿孔线虫上游特异性引物（RsF1）的序列位于ITS1序列第208bp至第228bp，下游特异性引物（RsR1位于458bp至479bp，扩增的特异性片段长度为271bp。

2.2 用特异性引物对香蕉穿孔线虫进行特异性PCR检测

PCR反应体系：2.5 μl  10×PCR Buffer(含Mg²⁺)，2 μl 10 mM dNTP（2.5 mM），1.5 μl 引物对RSF1/RSR1 (20 uM)，0.2 μl Taq DNA聚合酶（5 U/ul），2 μl 模板DNA，灭菌ddH₂O补足至25 μl。采用无线虫DNA模板为阴性对照。在Eppendorf PCR扩增仪上进行扩增。

PCR反应程序如下：95℃ 4min，95℃变性45s，55℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃再延伸10min，4℃保存。PCR反应结束后5000rmp点动离心取上清液于－20℃保存或进行后续实验。取5 μl扩增产物加1 μl上样缓冲液在1.0%琼脂糖凝胶上电泳，用0.5×TAE作为电泳缓冲液，100V/ 40min，用EB染色，在紫光灯下观测并照相。

7个香蕉穿孔线虫种群经特异性引物RSF1/RSR1扩增出一条稳定的条带，长度为271bp，阴性对照中无扩增条带出现，如图2所示，说明设计的特异性引物符合要求。

2.3一步双重香蕉穿孔线虫的特异性PCR检测方法

将构建的香蕉穿孔线虫特异性引物对RsF1/ RsR1与通用引物对D2A/ D3B置于同一个PCR反应中，同时互不影响。其中RsF1/RsR1特异性扩增香蕉穿孔线虫基因组DNA的ITS片段， D2A和D3B用于扩增rDNA基因D2D3扩展区域的DNA片段。所用引物序列见表2 。

表2  本发明所使用引物代码和序列

        

该香蕉穿孔线虫分子检测方法采用25μl的PCR反应体系：10 × PCR-buffer (含Mg+)2.5μl，dNTPs 2.0 μl，D2A/D3B引物对1.5 μl，RSF1/RSR1引物对1.5 μl， Taq DNA多聚酶0.2 μl（5 U/μl），模板DNA 2.0 μl，灭菌ddH₂O水补足至25 μl。

PCR反应扩增程序为：95℃ 4min，95℃变性45s，56℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃再延伸10min，4℃保存。PCR反应结束后5000rmp点动离心取上清液于－20℃保存或进行后续实验。取5 μl扩增产物加1 μl上样缓冲液在1.0%琼脂糖凝胶上电泳，用0.5×TAE作为电泳缓冲液，100V/ 40min，用EB染色，在紫光灯下观测并照相。相同样品的双重PCR至少重复两次以证实结果的准确性。同一采样地点的样品的鉴定试验重复三次。

结果显示引入D2A / D3B进行双重PCR扩增，5 个香蕉穿孔线虫群体扩增出群体均扩增出两个条带分别为780 bp和271 bp，阴性对照中无扩增条带出现。如图3所示。

2.4 香蕉穿孔线虫特异性引物的PCR验证检测

收集2个短体线虫群体（分别采集于海南PLD和北京PXM）、 2个甘薯茎线虫群体（分别采集于河北昌黎DdCL和江苏泗洪DdSH）、2个大豆孢囊线虫群体（均采集于甘肃GS-4，GS-14）、2个禾谷孢囊线虫（均采集于甘肃GS-11，GS-18）、1个根结线虫群体（采集于河北廊坊MiLF）（见表3），分别提取其DNA作为模板与香蕉穿孔线虫群体DNA模板一起进行特异性引物的双重PCR扩增，以检测RsF1/ RsR1引物的特异性。

表3  供试的其它植物线虫群体样品来源

        

PCR反应体系和程序如2.3 所述。在引物特异性检测中，1 ~5 泳道的5 个香蕉穿孔线虫群体均扩增出780 bp和271 bp的两条带；6 ~ 14 泳道的短体线虫、甘薯茎线虫、大豆孢囊线虫、禾谷孢囊线虫、根结线虫只扩增出780bp的一条带，阴性对照中无扩增条带出现。如图4所示。 

2.5 香蕉穿孔线虫特异性引物的灵敏度检测

分别提取1条、1/2条、1/4条、1/8条、1/16、1/32、1/64、1/128、1/256条香蕉穿孔线虫的 DNA，各取1 μl香蕉穿孔线虫DNA做模板用特异性引物RsF1/RsR1进行PCR扩增，以检验特异性引物的扩增检测的灵敏度。　

香蕉穿孔线虫ITS特异性引物RSF1/RSR1由上海生工生物技术有限公司合成。特异性引物灵敏度检测扩增反应体系：2.5 μl  10×PCR Buffer(含Mg²⁺)，2 μl 10 mM dNTP（2.5 mM），1.5 μl 引物对RSF1/RSR1 (20 uM)，0.2 μl Taq DNA聚合酶（5 U/ul），1 μl 模板DNA，灭菌ddH₂O补足至25 μl。采用无线虫DNA模板为阴性对照。

特异性引物灵敏度检测的增程序如2.3所述，在Eppendorf PCR扩增仪上进行扩增。PCR 扩增程序如2.2所述。电泳结果如图5所示。 

由图5可知，1条香蕉穿孔线虫的扩增产物（泳道1）非常清晰、明亮，从1/2条线虫到1/64条线虫都能够扩增出清晰的条带（泳道 2－6），而1/128、1/256条线虫的条带也能隐约可见，阴性对照没有扩增条带。这说明，只要有一小段香蕉穿孔线虫的片段就足以对其进行检测，该特异性引物及检测方法的灵敏度非常高，因此说明该方法非常可靠。 

实施例3 罹病植物组织中香蕉穿孔线虫的特异性直接检测

3.1健康植物组织中人为加入香蕉穿孔线虫后的直接检测

按照每0.05g根系加入20头香蕉穿孔线虫，根据1.2所述方法提取DNA，并将其作为模板进行特异性检测。在PCR过程中加入消减PCR反应抑制作用的物质BSA（牛血清白蛋白），并提高PCR循环数，适当降低模板浓度之后进行。

PCR反应体系：5 μl  10×PCR Buffer(含Mg²⁺)，4 μl 10 mM dNTP（2.5 mM），1 μl 0.1％BSA，1.5 μl 引物对RsF1/RsR1 (20 uM)，0.5 μl Taq DNA聚合酶（5 U/ul），1 μl不同浓度模板DNA，灭菌ddH₂O补足至25 μl。采用无线虫DNA模板为阴性对照。在Eppendorf PCR扩增仪上进行扩增。

PCR反应程序如下：95℃ 4min，95℃变性45s，56℃退火30s，72℃延伸1min，40个循环；72℃再延伸10min，4℃保存。PCR反应结束后5000rmp点动离心取上清液于－20℃保存或进行后续实验。取5 μl扩增产物加1μl上样缓冲液在1.0%琼脂糖凝胶上电泳，用0.5×TAE作为电泳缓冲液，100V/ 40min，用EB染色，在紫光灯下观测并照相。电泳图片如图6所示。

3.2 罹病植物组织中香蕉穿孔线虫的直接检测

3.2.1 罹病红掌苗样本的总DNA提取 

用于DNA 提取的罹病植物红掌样本中线虫数量的确定：样品由本实验室自海南采集所得。选取感染香蕉穿孔线虫的罹病红掌苗根系，平均分成两份，其中一份用于分离线虫，另一份用于提取总DNA。由上至下方向分成6 段对提取DNA感病红掌根系样本取样，总重量约为3.0 g，浅盆法分离48 h后，分离到约10 头香蕉穿孔线虫。称取约700 mg的含虫罹病红掌根系样本(约4 头线虫)并剪成小段，放入研钵中，按照1.2 所述提取总DNA。同样称取约700 mg健康红掌根样品提取其DNA为阴性对照。香蕉穿孔线虫样品AMRS的DNA作为阳性对照。

3.2.2 罹病红掌苗根系样本中香蕉穿孔线虫的特异性检测　

PCR 反应体系(25 μl) 和PCR 反应程序如3.1所述。独立重复试验2次。见图7，用香蕉穿孔线虫特异性引物对RsF1/RsR1检测3.1.1中所提取的总DNA为泳道1，泳道2、3为对应的无虫红掌苗木总DNA对照没有扩增出特异性条带，泳道4为阳性对照的纯香蕉穿孔线虫DNA模板扩增出很亮的特异性条带，泳道5为无DNA模板的阴性对照没有扩增出特异性条带。结果表明，特异性引物对RsF1/RsR1可成功地从含有约4 头线虫的700 mg 感病苗木样本总DNA样品中扩增出香蕉穿孔线虫的特异性条带。

3.2.3罹病红掌苗样本中香蕉穿孔线虫的梯度检测

并将该总DNA以1/2浓度稀释后检测，结果如图8 所示，初始浓度DNA模板的扩增条带最亮(泳道1)，随1/2 浓度稀释扩增条带逐渐减弱(泳道2 ~ 6)，1/32×稀释浓度的DNA模板仍然能扩增出明显条带（泳道6）， 无DNA模板阴性对照无目的条带。

3.2.3罹病植物组织中香蕉穿孔线虫的一步双重特异性PCR检测

将3.2.1中所述提取的总DNA，取1 μl作为模板进行一步双重特异性PCR检测。 PCR扩增体系在3.1 基础上有所改进：5 μl  10×PCR Buffer(含Mg²⁺)，4 μl 10 mM dNTP（2.5 mM），1 μl 0.1％BSA，0.5 μl 引物对RSF1/RSR1 (20 uM)，0.5μl 引物对D2A/D3B(20 uM)，0.5 μl Taq DNA聚合酶（5 U/ul），1 μl模板DNA，灭菌ddH₂O补足至25 μl。采用无线虫苗木的DNA为对照CK1、CK2，采用无线虫DNA模板为阴性对照。PCR扩增程序按照3.1所述进行。取5 μl扩增产物加1μl上样缓冲液在1.0%琼脂糖凝胶上电泳，用0.5×TAE作为电泳缓冲液，100V/ 40min，用EB染色，在紫光灯下观测并照相。电泳图片如图9所示：仅含有香蕉穿孔线虫的红掌根有特异性条带和D2D3条带，其余不含香蕉穿孔线虫的样本仅有D2D3条带，而阴性对照无任何条带。说明本方法能够应用于罹病香蕉穿孔线虫的早期特异性检测。

Claims (2)

1.一种罹病植物组织中香蕉穿孔线虫DNA的提取方法，提取步骤：

液氮研磨感病红掌根至细粉末状；

每0.5 g植物组织加入60μl 2 mg/ml 蛋白酶K 和600 μl 经65℃预热的DNA 裂解液；

充分混匀后65℃温浴0.5~2 小时，期间，每15分钟颠倒混匀一次；4℃ 12000 rmf/min离心10分钟，取上清液用等体积酚/氯仿抽提2次直至分界面看不到白色沉淀物后4℃12000 rmf/min离心10分钟，上清用2 倍体积的无水乙醇和1/10体积的pH 5.2的 3 M NaAC于-70℃沉降DNA 0.5 小时，4℃ 12000 rmf/min离心15分钟，70％乙醇洗涤沉淀2次，干燥沉淀后用30 μl Tris-HCl复溶DNA；

所述DNA 裂解液：200 mM Tris - HCl， pH 8.0; 400 mM NaCl； 10 mM EDTA, pH 8.0; 3% CTAB(W/V)； 4% β- 巯基乙醇（V/V）。

2.权利要求1所述的提取方法在通过提取DNA以检测诊断罹病植物香蕉穿孔线虫感染情况或鉴别香蕉穿孔线虫中的应用。

3. 一种检测植物罹患香蕉穿孔线虫感染的PCR方法，步骤如下：

称取约700 mg的含虫罹病红掌根系样本并剪成小段，放入研钵中，按照权利要求1所述的提取方法提取总DNA，将总DNA作为模板进行PCR特异性检测，所述PCR特异性检测的引物为香蕉穿孔线虫特异性引物：

RsF1   5’-TGTCATCGCCTTTGGCAGCT-3’

RsR1   5’-TGGTAAACGACCCTGAACCAG-3’。

4. 根据权利要求3所述的PCR方法，所述PCR特异性检测的反应体系为：5μl 10×含Mg²⁺的PCR缓冲液，4μl 10mM的dNTPS，1μl 0.1％BSA，1.5μl 20uM引物对RSF1/RSR1，0.5μl 5U/ul的Taq DNA聚合酶，1μl DNA模板，灭菌ddH₂O补足至25 μl，

所述PCR特异性检测的扩增程序为：95℃ 4分钟，95℃变性45秒，56℃退火30秒，72℃延伸1分钟，40个循环；72℃再延伸10分钟，4℃保存。

5. 根据权利要求3所述的PCR方法，所述PCR扩增的体系中的引物还包括如下通用引物：

D2A  5’- ACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTG -3’，

D3B  5’- TCGGAAGGAACCAGCTACTA -3’，

所述PCR反应体系为5μl 10×含Mg²⁺的PCR缓冲液，4μl 10mM的dNTPS，1μl 0.1％BSA，0.5 μl 20uM的引物对RSF1/RSR1，0.5μl 20uM的引物对D2A/D3B，0.5μl 5U/ul的Taq DNA聚合酶，1μl DNA模板，灭菌ddH₂O补足至25 μl；

所述PCR扩增的程序为：95℃ 4分钟，95℃变性45秒，56℃退火30秒，72℃延伸1分钟，40个循环；72℃再延伸10分钟，4℃保存。

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