CN104120124B - 用于特异性检测小麦条锈菌的scar标记及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于特异性检测小麦条锈菌的SCAR标记及检测方法，属于生物技术和植物检疫技术领域。所述SCAR标记的核苷酸序列长度为237bp，对小麦条锈菌的检测具有高度的专化性，在检测来自我国不同麦区的小麦条锈菌标样中，该标记均稳定显现，而在小麦叶锈、秆锈及其它麦类病原真菌上均没有“污染性”扩增，可用于小麦条锈菌病害的诊断、检测和测报调查。本发明提供的检测方法，在小麦条锈菌的检测中具有较高的特异性、灵敏度和可靠性，可以在病害潜育阶段进行PCR检测，根据条锈菌特异性SCAR标记的出现概率进行病害早期预警，以提早开展病害流行测报和及时指导病害防治。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于特异性检测小麦条锈菌的SCAR标记及检测方法，属于生物技术和植物检疫技术领域。
背景技术
小麦锈病包括条锈病(Puccinia striiformis West.f.sp.tritici Eriks.)、叶锈病(Puccinia recondita Rob.ex Desm.f.sp.tritici Erikss.Et Henn.)和秆锈病(Puccinia graminis Pers.f.sp.tritici Erikss.Et Henn.)三种，是一类由锈菌引致的真菌性病害。该类病害是中国乃至全世界所有产麦国家的一类重要病害，世界上不同国家或地区三种锈病发生的种类、分布与危害程度等各不相同。
由小麦条锈菌Puccinia striiformis f.sp.tritici引起的小麦条锈病是世界性的禾谷类病害，据统计，其每年在全世界范围内就可造成约40％的损失(Ullerup,1991)。我国是世界上最大的小麦条锈病流行区(万安民，2000)，发生范围涉及16个省市，病害流行时，面积超过400×104-500×104hm2，造成10％-70％的产量损失，年均产量损失100×107kg，严重情况甚至绝收(李振岐和曾士迈,2002；Chen,2005；Chen et al.,2009)。建国以来，条锈病曾于1950、1964、1990和2002年大流行，分别引起产量损失达60×108、30×108、26×108和10×108kg(Chen et al.,2009)。近年来由于新的毒性小种CY32和CY33的发展，致使我国80％的小麦生产品种丧失抗性。21世纪以来，条锈病在2001年到2009年在我国西南、西北片区连年流行，发生频率越来越高，已成为制约我国小麦可持续发展的影响因素。
小麦条锈病的危害一直严重地影响着小麦生产，该类病害使谷物大量减产，品质降低，被条锈菌侵染的种子活力低，萌发率低，成活率减少。病原菌以无性孢子的形式随高空气流传播，广泛分布于我国及世界上其它的小麦种植区，是危害最重的病害。若条锈菌在小麦早期侵染，发生在生长季节，可造成小麦100％的损失。小麦条锈病曾于1950，1964，1990和2002年四次大流行，给我国小麦生产造成沉重损失。当前，小麦条锈病仍是威胁我国西南、华北和淮北等冬麦区和西北春麦区的最重要病害之一，由于其流行频率高、暴发性强、发生范围广等特点，容易造成全国大面积流行。同时，近年来新小种和新致病类型的不断出现和发展使此病害流行的可能性更高，潜在威胁更大，涉及范围更广，严重威胁小麦高产和稳产。据统计，2004年小麦条锈病发病面积近4000万亩，2005年发病面积高达1亿亩次以上，2006年小麦条锈病有所缓和，但发病面积仍高达7000万亩，2007年，发病早，流行速度快，前期危害严重，因及时防治，后期干旱，同比下降23.5％，发病面积累计约为5400万亩，虽有所缓和，仍为当前病虫害防治的重点。
长期以来，小麦锈病的预测预报主要基于定期、大规模的田间病情调查和室内病菌小种的活体分离、培养和鉴定。不仅耗时费工，而且其结果的准确性和可信度也在很大程度上取决于调查测报人员的技术水平和经验，难以满足快速、高通量诊断检测的实际需求。叶锈病和条锈病的苗期症状区别不甚明显，一些基层植物保护人员常常将二者混淆，不能准确区分。在小麦叶锈菌的潜育阶段，寄主的发病症状不易观察，难以界定初侵染的时期和规模。因此，有必要利用现代生物技术，研发简单易行、灵敏准确的小麦叶锈菌快速诊断和检测手段。
近年来，随着基因芯片和实时PCR技术的发展，基于特定基因序列开发的特异PCR引物或探针，已被越来越多地用在病原菌的生物学、群体结构、流行动态、基因漂移等研究中。对病害诊断、病原菌鉴定而言，靶标序列的获得通常源自保守基因的序列比较或染色体组的随机探查。DNA/RNA探针技术和聚合酶链式反应(PCR)具有强专化性、高灵敏度以及程序化试验操作等特点，现已被广泛用于丝核菌Rhizoctonia solani、R.oryzae、R.oryzaesativae、炭疽菌Colletotrichum acutatum、多黏菌Polymyxa betae、黑粉菌Tilletia indic、T.walkeri、Ustilago hordei、镰刀菌Fusarium oxysporum、F.culmorum、F.graminearum、F.avenaceum、叶枯菌Stagonospora nodorum、Septoria tritici等多种植物病原真菌的鉴定检测。鉴于症状诊断的局限性以及形态学鉴定的复杂性，已有学者成功研发出基于PCR技术的三种锈病的诊断检测技术。在小麦条锈菌的研究方面，中国农业科学院植物保护研究所采用PCR方法，建立了以β-微管蛋白序列为基础的小麦条锈菌和叶锈菌特异性分子诊断检测技术(曹丽华等，2007；Cao et al.,2008)。此外，美国明尼苏达大学的学者采用RT-PCR的方法，建立了以ITS1序列为区分标准的小麦三种锈菌的检测技术(Barnes and Szabo，2007)；西北农林科技大学亦采用PCR方法，建立了直接从受感染的小麦叶片中区别条锈菌的检测技术(Wang et al.,2008)。该类技术体系均是建立在核酸技术基础上，依靠病原菌基因组中的特异性DNA序列进行检测，包括样品提取、PCR扩增以及扩增产物的分析，用于病害诊断检测的准确性和可靠性均较高。
发明内容
本发明请求保护的技术方案如下：
小麦条锈菌(Puccinia striiformis)检测的SCAR标记，其核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示。
用于小麦条锈菌(Puccinia striiformis)检测的SCAR标记引物，其核苷酸序列为：
PSTF117：5’-CACGCGGGACGTACTTATTGTC-3’，
PSTR363：5’-CATTTCTGGCGAACATGGAATC-3’。
一种检测小麦感染条锈菌(Puccinia striiformis)的方法，包括如下步骤：
(1)以待测小麦为材料，提取样品DNA；
(2)以样品DNA为模板，采用上述SCAR标记引物进行PCR反应，得到扩增产物；
(3)琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，若扩增产物中出现237bp特征条带，则所述样品DNA中含有小麦条锈菌；若扩增产物的大小不是237bp，则样品DNA中不含有小麦条锈菌。
所述PCR反应的体系为：20ng/μL模板DNA1μL，10μM引物PSTF1171μL，10μM引物PSTR3631μL，2×EasyTaq PCR SuperMix12.5μL，ddH2O9.5μL。
所述PCR反应的条件为：94℃预变性4min；94℃变性30s、55.5℃退火30s、72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸8min。
用于检测小麦条锈菌的试剂盒，其特征在于：包括液态的或粉状的用于小麦条锈菌(Puccinia striiformis)检测的SCAR标记引物，其核苷酸序列为：
PSTF117：5’-CACGCGGGACGTACTTATTGTC-3’，
PSTR363：5’-CATTTCTGGCGAACATGGAATC-3’。
本研究根据真菌的保守基因合成引物Bt2a/Bt2b，其核苷酸序列为：
Bt2a：5’-GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC-3’，
Bt2b：5’-ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3’。
以小麦条锈菌、小麦叶锈菌、小麦秆锈菌等病原菌的基因组DNA为模板，进行PCR比较扩增。扩增及测序结果显示，该引物在小麦条锈菌的DNA中扩增出361bp长度的片段，在小麦叶锈菌、小麦秆锈菌的DNA中都扩增出495bp片段。为了获得能够特异地将条锈菌从叶锈、秆锈菌及其它类似麦类病原真菌中鉴别出来，需要进一步设计特异引物。
本发明进一步设计出了专化性检测引物PSTF117/PSTR363，对条锈菌进行PCR扩增，获得了小麦条锈菌的特异性SCAR(sequence characterized amplified region)标记，其核苷酸序列的长度为237bp。所述SCAR标记对小麦条锈菌的检测具有高度的专化性，在检测来自我国不同麦区的小麦条锈菌标样中，该标记均稳定显现，而在小麦叶锈、秆锈及其它麦类病原真菌上均没有“污染性”扩增。因此，所述SCAR标记可用于小麦条锈菌病害的诊断、检测和测报调查。
本发明还提供一种特异性检测小麦条锈菌的方法，采用专化引物PSTF117/PSTR363，以待测样品的基因组DNA为模板，按照优选的PCR反应体系和反应条件进行PCR反应，琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物的大小，若扩增产物中含有237bp特征条带，则待测样品中含有小麦条锈菌，反之亦然。所述方法在小麦条锈菌的检测中具有较高的特异性、灵敏度和可靠性，其灵敏度可达0.00001ng/μL模板DNA浓度水平。
本发明还提供用于检测小麦条锈菌的试剂盒，用于小麦条锈菌的分子诊断，供我国县级以上植保植检部门推广应用。小麦条锈菌成功侵染寄主小麦后，一般需要9～14天甚至更长时间才能产生新的传播体(病菌夏孢子)。室内接种试验表明，小麦条锈菌侵入寄主后9h，即可利用该SCAR标记检测到小麦条锈菌的特异性DNA片段。因此，在小麦生产实践中，可以在病害潜育阶段进行PCR检测，根据条锈菌特异性SCAR标记的出现概率进行病害早期预警，以提早开展病害流行测报和及时指导病害防治。这对于降低小麦条锈病的防治成本、阻断病害的扩散蔓延、确保我国小麦安全生产具有重要意义。
附图说明
图1.小麦条锈菌、叶锈菌和秆锈菌的gDNA的PCR比较扩增结果，
其中，点样孔中的样品从左至右依次为2个条锈、2个叶锈、2个秆锈；Marker条带大小从下往上依次为100bp，250bp，500bp，750bp，1000bp，2000bp。
图2.小麦秆锈菌与叶锈菌的特异性DNA片段比对结果，
其中，6-1片段为小麦秆锈菌的特异性DNA片段，3-1片段为小麦叶锈菌的特异性DNA片段，其同源性为100％。
图3.小麦条锈菌与叶锈菌的特异性DNA片段比对结果，
其中，1-5片段为小麦条锈菌的特异性DNA片段，3-1片段为小麦叶锈菌的特异性DNA片段，其同源性为31.23％。
图4.小麦条锈菌SCAR标记的特异性验证，
其中，点样孔中的样品从左至右依次为5个小麦条锈菌CY17，CY18，CY19，CY32，CY33；3个小麦叶锈菌PHT，THT，PHP；3个小麦秆锈菌34C1，MFM，MFC；2个小麦白粉菌；2个小麦赤霉菌PH-1，PH-2；1个光腥黑粉菌TFL；1个网腥黑粉菌TCT；灭菌水(对照)；Maker条带大小从下往上依次为100bp，200bp，300bp，400bp，500bp，750bp，1000bp。
图5.小麦条锈菌SCAR标记的灵敏度检测结果，
其中，点样孔中小麦条锈菌模板DNA的浓度从左至右依次为20ng/μL、10ng/μL、1ng/μL、0.1ng/μL、0.01ng/μL、0.001ng/μL、0.0001ng/μL、0.00001ng/μL、0.000001ng/μL；Maker条带大小从下往上依次为100bp，200bp，300bp，400bp，500bp，750bp，1000bp。
图6.感病小麦叶片内条锈菌的检测结果，
其中，点样孔中的样品从左至右依次为接种小麦条锈菌后9h；12h；20h；24h；48h；72h；96h；120h；健康叶片；Maker条带从下往上依次为100bp，200bp，300bp，400bp，500bp，750bp，1000bp。
具体实施方式
以下参考具体实施例对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅作为解释和说明，而不能理解为对本发明的限制。
生物材料：
小麦品种：
铭贤169、郑麦5389，已知品种，均来自于中国农业科学院植物保护研究所。
小麦病原真菌菌种及来源：
小麦条锈菌菌种：CY33，CY32，CY17，CY18，CY19，均来自于中国农业科学院植物保护研究所；
小麦叶锈菌菌种：PHT，THT，THD，PHK，PHP，PHJ，均来自于中国农业科学院植物保护研究所；
小麦秆锈菌菌种：34C1，MFM，MFC，21C3，34C2均来自于中国农业科学院植物保护研究所；
小麦白粉菌菌种：1，10，均来自于中国农业科学院植物保护研究所；
小麦赤霉菌菌种：PH-1，PH-2，均来自于中国农业科学院植物保护研究所；
光腥黑粉菌菌种：TFL，来自于中国农业科学院植物保护研究所；
网腥黑粉菌菌种：TCT，来自于中国农业科学院植物保护研究所。
上述生物材料本实验室亦有保存，可自申请日起二十年内向公众发放用于验证实验。
供试小麦病原真菌的繁殖与保藏：
供试小麦条锈菌真菌在铭贤169(已知小麦品种)上进行；
小麦叶锈菌、小麦秆锈菌的夏孢子以及小麦白粉菌的菌丝、分生孢子均在郑麦5389上繁殖；
其它小麦病原真菌在铺垫有赛璐玢膜的PDA培养基上培养。
备用菌种在4℃冰箱内暂存，或真空封存后于液氮内长期保存。
试剂耗材：深圳依诺金生物有限公司Catcher Sp in GEK2050凝胶回收试剂盒。
仪器设备：M J Research,Inc.的PTC2220型PCR仪、ULTRA-URLET PRODUCTS凝胶成像系统。
本发明未特别说明的实验试剂均为本领域常规试剂，或采用本领域常规方法配制而得，可商购获得，规格为实验室纯级即可。
实施例1.小麦病原真菌基因组DNA(gDNA)的提取
采用等的方法。
小麦3种锈菌和白粉菌gDNA分别提取自潜育期的感病小麦叶片和病原菌夏孢子或分生孢子，其它小麦病原真菌的gDNA则来源于营养体菌丝。感病小麦叶片或营养体菌丝直接用液氮冷冻研磨至粉状，锈菌、白粉菌孢子则采用玻璃珠震荡法破壁，其余DNA提取操作按照常规方法进行。以适量RNase消化RNA后，采用紫外分光光度法测定gDNA的质量与浓度。
实施例2.PCR比较分析及小麦条锈菌特异性核酸序列的克隆、测序
参照“Glass and Donaldson，1995.”在真菌的保守基因的报道，合成引物Bt2a/Bt2b，其核苷酸序列为：Bt2a：5’-GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC-3’，Bt2b：5’-ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3’。
PCR分析均在M J Research,Inc.的PTC2220型PCR仪上进行。
小麦条锈菌、叶锈菌和秆锈菌gDNA的PCR比较扩增体系为25μL，其中包括10×PCRBuffer(Mg2+Plus)2μL，dNTP Mixture(各2.5mmol/L)0.3μL，Bt2a/Bt2b(10μmol/L)1μL，模板DNA(20ng/μL)1.0μL，TaKaRa Taq(5U/μL)0.3μL，ddH2O16.9μL。
PCR反应条件为：94℃2min，1个循环；94℃15s，55℃30s，72℃90s，30个循环；72℃10min，1个循环。
扩增产物用质量分数为1.5的琼脂糖凝胶、0.5×TBE电泳缓冲液电泳分离，以ULTRA-URLET PRODUCTS凝胶成像系统记录分析电泳谱型。在紫外灯下快速切取小麦条锈菌的特异性PCR条带，以深圳依诺金生物有限公司Catcher Sp in GEK2050凝胶回收试剂盒回收纯化，交上海生工技术公司双向测序。测序结果以NCBI的BasicLocalAlignment SearchTool进行序列拼接，得到特异性PCR片段的序列全长，继而以BLASTN程序与Gen2Bank、EMBL、DDBJ、PDB中的序列进行同源性比对。
实验结果：用引物Bt2a和Bt2b组合对小麦条锈菌、叶锈菌和秆锈菌的gDNA进行PCR比较扩增。结果表明，小麦条锈菌具有长度为361bp的特异性DNA片段，而小麦叶锈菌和小麦秆锈菌具有长度为495bp的特异性DNA片段(图1)。研究发现，小麦叶锈菌和小麦秆锈菌的特异性DNA片段同源性为100％(图2)，而小麦条锈菌与其同源性为31.23％(图3)。
实施例3.小麦条锈菌SCAR标记的获得及其特异性验证
根据PCR比较扩增获得的小麦条锈菌特异性DNA片段序列，设计并筛选获得特异性引物PSTF117/PSTR363，其核苷酸序列为：
PSTF117：5’-CACGCGGGACGTACTTATTGTC-3’，
PSTR363：5’-CATTTCTGGCGAACATGGAATC-3’，
交北京赛百盛基因技术有限公司进行化学合成。通过进一步优化PCR反应体系及循环条件，获得了长度为237bp的小麦条锈菌特异性SCAR标记。
PCR反应体系为：20ng/μL模板DNA1μL，10μM引物PSTF1171μL，10μM引物PSTR3631μL，2×EasyTaq PCR SuperMix12.5μL，ddH2O9.5μL。
PCR反应条件为：94℃预变性4min；94℃变性30s、55.5℃退火30s、72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸8min。
以小麦主要病原真菌即小麦条锈菌Puccinia striiformis、秆锈菌Pucciniagraminis、赤霉菌Fusarium gram inearum、白粉菌Erysiphe graminis、光腥黑粉菌Tilletia foetida(Wallr.)Liro、网腥黑粉菌Tilletia caries为对照，检测小麦条锈菌标样。结果表明，该SCAR标记对小麦条锈菌的检测具有高度的专化性，在所有参检的5个小麦条锈菌标样中均呈现阳性扩增，而在对照的3个小麦叶锈菌菌株、3个小麦秆锈菌株及其它检测的小麦病原真菌(赤霉菌Fusarium gram inearum、白粉菌Erysiphe graminis、光腥黑粉菌Tilletia foetida(Wallr.)Liro、网腥黑粉菌Tilletia caries)中则没有扩增到该标记(图4)。
实施例4.小麦条锈菌SCAR标记的灵敏度检测
梯度稀释小麦条锈菌模板DNA浓度为20ng/μL、10ng/μL、1ng/μL、0.1ng/μL、0.01ng/μL、0.001ng/μL、0.0001ng/μL、0.00001ng/μL、0.000001ng/μL。以稀释的小麦条锈菌gDNA为模板，采用特异性引物PSTF117/PSTR363，按照实施例3中优化的PCR反应体系及循环条件进行扩增。
结果表明，从0.00001ng/μL的模板DNA中还能检测到长度为237bp的SCAR标记(图5)。
实施例5.感病小麦叶片内条锈菌的检测
以小麦条锈菌菌株室内苗期接种铭贤169，接种菌量为5mg每盆，对照处理喷滑石粉。接种小麦叶片样品，以无菌水清洗叶面后，液氮速冻，储存于-80℃冰箱中，用于小麦锈病显症前条锈菌的检测。分别提取小麦条锈菌接种后9h、12h、20h、24h、48h、72h、96h、120h及健康的小麦叶片gDNA，采用特异性引物PSTF117/PSTR363，按照实施例3中优化的PCR反应体系及循环条件进行扩增。结果表明，在锈病显症前的小麦叶片中均成功地检测到相应的小麦条锈菌SCAR标记，并且最早于接种后9h可检测出相应的小麦条锈菌SCAR标记(图6)。
Claims (6)
1.小麦条锈菌(Puccinia striiformis)检测的SCAR标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.用于小麦条锈菌(Puccinia striiformis)检测的SCAR标记引物，其核苷酸序列为：
PSTF117：5’-CACGCGGGACGTACTTATTGTC-3’，
PSTR363：5’-CATTTCTGGCGAACATGGAATC-3’。
3.一种检测小麦感染条锈菌(Puccinia striiformis)的方法，包括如下步骤：
(1)以待测小麦为材料，提取样品DNA；
(2)以样品DNA为模板，采用权利要求2所述的SCAR标记引物进行PCR反应，得到扩增产物；
(3)琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，若扩增产物中出现237bp特征条带，则所述样品DNA中含有小麦条锈菌；若扩增产物的大小不是237bp，则样品DNA中不含有小麦条锈菌。
4.根据权利要求3所述的方法，所述PCR反应的体系为：20ng/μL模板DNA1μL，10μM引物PSTF1171μL，10μM引物PSTR3631μL，2×EasyTaq PCR SuperMix12.5μL，ddH2O9.5μL。
5.根据权利要求3或4所述的方法，所述PCR反应的条件为：94℃预变性4min；94℃变性30s、55.5℃退火30s、72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸8min。
6.用于检测小麦条锈菌的试剂盒，其特征在于：包括液态的或粉状的用于小麦条锈菌(Puccinia striiformis)检测的SCAR标记引物，其核苷酸序列为：
PSTF117：5’-CACGCGGGACGTACTTATTGTC-3’，
PSTR363：5’-CATTTCTGGCGAACATGGAATC-3’。
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