CN103667451A

CN103667451A - 感染中四小麦条锈菌新菌系t4的快速分子检测方法

Info

Publication number: CN103667451A
Application number: CN201310563758.1A
Authority: CN
Inventors: 李强; 王保通; 樊玉
Original assignee: Northwest A&F University
Current assignee: Northwest A&F University
Priority date: 2014-01-03
Filing date: 2014-01-03
Publication date: 2014-03-26

Abstract

本发明公开了一种感染“中四”小麦条锈菌新毒性菌系T4的快速分子检测方法，利用189条RAPD随机引物在新菌系T4和我国小麦条锈菌流行菌系CYR29、CYR31、CYR32、CYR33、Su11-4以及感染抗条锈病基因Yr26的新菌系V26之间筛选，得到两个T4的特异性RAPD标记S1311和S1363，将特异性条带经过回收、纯化、克隆、测序后，根据测序结果，设计SCAR引物，成功地将RAPD标记转化为稳定的SCAR标记T4SP8-1/T4SP8-2（序列为5′GGGCGTGGATGAAGAG3′/5′GGAGCAGAAGCAGGTTT3′）。该标记可以在700bp处稳定的扩增出新菌系T4的特异性条带。利用本发明开发的新菌系T4的特异性SCAR标记T4SP8-1/T4SP8-2可以实现大田中T4新菌系的早期快速分子检测，了解病菌的变异动态，为监测该菌系及小麦条锈病的防治决策提供可靠的技术保障和理论依据。

Description

感染中四小麦条锈菌新菌系T4的快速分子检测方法

技术领域

本发明涉及分子生物学中的PCR（Polymerase Chain Reaction）技术、RAPD（Random Amplified Polymorphic DNA）和SCAR（Sequence Characterized Amplified Regions）分子标记技术，通过对感染小麦条锈菌鉴别寄主和重要抗源“中四”的小麦条锈菌新菌系T4特异性分子标记的筛选，开发的一种利用SCAR标记在小麦发病早期快速检测新毒性菌系T4的新方法；

背景技术

小麦条锈病是由小麦条锈菌（Puccinia striformis f. sp. tritici）引起的气传叶部病害，是世界范围内小麦上最重要的病害之一。我国是小麦条锈病发生的重灾区，主要分布于西北、西南、华北、淮北等地冬麦区和西北春麦区。在流行年份可使小麦减产20-30％，特大流行年份减产50%以上，甚至绝收。1950、1964、1990和2002年4次全国范围内大流行分别给我国小麦生产造成60亿、32亿、18亿和13亿公斤的产量损失。2002年以来，由于小麦条锈菌新小种条中32号（CYR32）和条中33号（CYR33）的相继出现和扩展，导致小麦条锈病在我国部分地区连年成灾，年均发生面积6000万亩左右，损失小麦10亿公斤以上；

利用抗病品种是防治该病最有效、经济和对环境安全的措施。然而由于小麦条锈菌的高度变异性，抗病品种在大面积推广应用后其抗病性很容易被条锈菌新小种所克服，一般3-5年便会“丧失”抗病性。新的病菌毒性小种的产生和发展是引致小麦品种抗条锈性“丧失”的主要原因。由于条锈菌新小种的出现并成为优势小种，常常造成生产上大面积推广品种“丧失”抗锈性，导致条锈病大流行。自1950年以来，我国先后发生7-8次大面积主栽品种“丧失”抗锈性而被更替。因此，监测条锈菌新毒性小种的出现，并对其毒性进行科学评价，寻求简单、便捷、快速的检测方法，对于超前预测新小种在未来病害发展中的作用以及有针对性的进行抗条锈育种，实现病害的持续控制均具有重要的理论和现实意义；

“中四”是中国小麦条锈菌生理小种重要鉴别寄主之一, 是以普通小麦Triticum aestivum L. ( 2n = 6x =42, AABBDD)与中间偃麦草Thinopyrum intermedium(2n = 6x = 42, E1E1E2E2XX)经有性杂交、选育获得的异源八倍体小偃麦(AABBDDXX)。具有综合农艺性状突出、结实正常、抗逆性强的特点。是多种小麦病害的抗源, 尤其对我国小麦条锈菌现有所有已知生理小种或致病类型均表现免疫。已成为国内外小麦育种的重要种质资源, 近年来以“中四”为亲本相继选育出了数十个生产品种或高代品系；

2003年，本课题组从采自陕西省宝鸡市太白县嘴头镇小麦品种宝麦1号田间条锈病自然发病叶片上分离到能够稳定感染“中四”的新毒性菌系T4，这是我国首次发现能稳定感染“中四”的条锈菌新菌系。随着“中四”小麦作为抗锈资源被广泛应用，我国未来将会培育出以“中四”为抗源背景的一大批抗锈性品种，这些品种作为新的抗锈性品种将被大面积推广和应用。而T4新菌系的出现无疑对于以“中四“为血缘的小麦品种的大面积推广应用造成潜在的威胁。因此，监测能够感染“中四”的小麦条锈菌新菌系T4的变化动态，对于超前预测新菌系的变异动态、指导抗锈育种以及品种合理布局具有重要意义；

然而，传统的利用鉴别寄主检测方法具有工作量大、周期长、难以进行大量标样鉴定、准确性也易受人员、鉴定条件等外界因素的影响等缺点。而且病菌检测往往只有等小麦发病后才能采集叶片进行鉴定检测，具有一定滞后性，不适于病菌小种的早期检测。因此，开发一种快速、简便、高效的分子检测方法能够克服传统方法的弊端，对于该菌系的早期检测和病害控制具有重大意义；

发明内容

本发明的目的是针对传统利用鉴别寄主法鉴定新毒性小种技术存在的缺陷和不足，提供一种快速、准确、简便的检测小麦条锈菌新毒性菌系T4的分子检测方法；

实现上述发明目的技术方案是一种快速检测小麦条锈菌新菌系T4的分子检测方法，包括以下步骤：

1. 小麦条锈菌新毒性菌系T4特异性引物的筛选和设计

采用189条RAPD随机引物对T4进行多态性扩增，筛选出该菌系的特异性条带S1311和S1363。用DNA纯化回收试剂盒对特异性条带进行回收、纯化，然后用pGM-T克隆试剂盒进行连接、转化、克隆。将带有目标插入片段的阳性克隆进行测序。根据测序结果，设计并将特异性RAPD标记转化为稳定的SCAR标记；

2. 小麦条锈菌新毒性菌系T4分子检测体系的建立

（1）提取条锈菌夏孢子基因组DNA

采用CTAB/SDS法提取T4、CYR29、CYR31、CYR32、CYR33、Su11-4、V26等条锈菌夏孢子的基因组DNA；

（2）用RAPD分子标记进行T4特异性引物的筛选

采用189条RAPD随机引物对T4、CYR29、CYR31、CYR32、CYR33、Su11-4、V26等条锈菌菌系进行扩增。RAPD反应体系为15μL：10×Reaction Buffer1.5μL、MgCl₂（25mmol/L）1.2μL、dNTP_S (10mmol/L ) 0.3μL、Taq DNA聚合酶(5 U/μL，Fermentas公司)0.08μL、引物 (10ng/μL) 0.6μL、模板DNA (50ng/μL) 1μL、ddH₂O 10.32μL。每次反应均设无菌去离子水为阴性对照。扩增反应在伯乐S1000 PCR热循环仪上进行，扩增程序为：94℃ 5min；94℃ 30s，35℃ 40s，72℃ 90s，44个循环；72℃ 10min；4℃终止。扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶、1×TAE电泳缓冲液电泳分离，以ULTRA-URLET PRODUCTS凝胶成像系统记录分析RAPD谱型；

结果：RAPD引物S1311和S1363分别在1000bp和850bp处能稳定扩增出T4的特异性条带；

（3）采用DNA纯化回收试剂盒对特异性条带回收纯化

利用DNA纯化回收试剂盒（北京天根生化科技有限公司）对T4的特异性条带进行回收纯化；

（4）利用蓝白斑筛选法克隆目的条带，然后对目的条带进行测序

采用pGM-T克隆试剂盒（北京天根生化有限公司）进行连接、转化，每个克隆反应挑取10个单克隆提取质粒DNA对纯化得到的条带进行蓝白斑筛选，用2%琼脂糖凝胶电泳检测插入片段的大小。通过蓝白斑筛选克隆到目的条带后，取新鲜菌液送北京奥克鼎盛生物技术有限公司用测序引物M13R和M13F进行双向测序；

（5）SCAR标记的转化

依据测序结果，设计出SCAR标记T4SP8-1/T4SP8-2能在T4和其他菌系间稳定扩增出T4的特异性条带。T4SP8-1/T4SP8-2引物序列如下：

T4SP8-1: 5′ GGGCGTGGATGAAGAG 3′

T4SP8-2: 5′ GGAGCAGAAGCAGGTTT 3′

该引物15μL反应体系包括：10×Reaction Buffer 1.5μL、MgCl₂（25mmol/L）0.9μL、dNTP_S (10mmol/L ) 0.3μL、上下游引物 (10ng/μL) 各1.0μL、模板DNA (50ng/μL) 1.5μL、Taq DNA聚合酶(5U/μL，Fermentas公司)0.15μL、ddH₂O 8.65μL。设无菌去离子水为阴性对照。扩增反应在伯乐S1000 PCR热循环仪上进行，扩增程序为：94℃ 预扩增5min；94℃ 1min，50.5℃ 1min，72℃ 90s，34个循环；72℃ 延伸10min；4℃终止。扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶、1×TAE电泳缓冲液电泳分离，以ULTRA-URLET PRODUCTS凝胶成像系统记录分析RAPD谱型；

结果：SCAR标记T4SP8-1/T4SP8-2大约在700bp处能稳定扩增出T4 的特异性条带；

本发明所开发的特异性SCAR标记对小麦条锈菌新毒性菌系T4具有很高的特异性，能够用于提前预测田间小麦条锈菌侵染是否是由毒性菌系T4所致，可明显区别小麦条锈菌不同生理小种，如目前条锈菌流行菌系CYR29、CYR31、CYR32、CYR33、Su11-4以及感染抗条锈病基因Yr26的新菌系V26等；

附图说明

图1： RAPD随机引物S1363扩增出的小麦条锈菌新毒性菌系T4的特异性条带，泳道1-8分别为DL2000 marker、新菌系T4、Su11-4、V26、CYR29、CYR31、CYR32、CYR33

图2：新开发的SCAR标记T4SP8-1/T4SP8-2扩增出的小麦条锈菌新毒性菌系T4的特异性条带，泳道1-8分别为DL2000 marker、新菌系T4、Sull-4、V26、CYR29、CYR31、CYR32、CYR33

具体实施方式

实施案例

1. 样品采集

2013年9月30日，在西北农林科技大学太白小麦条锈病试验站，分别采集接种过条锈菌T4、Su11-4、V26、CYR29、CYR31、CYR32、CYR33但未显症的小麦叶片标样，去离子水冲洗小麦叶片，-80℃保存备用；

2. 小麦条锈菌新毒性菌系T4的分子检测

（1）采用CTAB法提取小麦叶片样本基因组DNA；

（2）PCR扩增: 15μL反应体系包括：10×Reaction Buffer 1.5μL、MgCl₂（25mmol/L）0.9μL、dNTP_S (10mmol/L ) 0.3μL、Taq DNA聚合酶(5U/μL，Fermentas公司)0.15μL、上下游引物 (10ng/μL) 各1.0μL、模板DNA (50ng/μL) 1.5μL、ddH₂O 8.65μL。设无菌去离子水为阴性对照。扩增反应在伯乐S1000 PCR热循环仪上进行，扩增程序为： 94℃ 5min；94℃ 1min，50.5℃ 1min，72℃ 90s，34个循环；72℃ 10min；4℃终止；

（3）条带检测：PCR扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶、1×TAE电泳缓冲液电泳分析，电泳结束后用ULTRA-URLET PRODUCTS凝胶成像系统记录分析；

3. 检测结果

接种条锈菌新毒性菌系T4的5个小麦标样在700bp处均扩增出了特异性条带，而接种其它条锈菌小种叶片、未接种叶片和清水对照等处理在该位置处均没有出现T4的特异性条带。研究结果表明，该检测体系能够在小麦条锈菌田间侵染早期检测田间带菌是否是由新毒性菌系T4侵染引起。

Claims

1.小麦条锈菌新毒性菌系T4的特异性RAPD标记的筛选和特异性引物的设计，其特征在于：

根据小麦条锈菌新菌系T4 DNA序列的特性，筛选到两个特异性RAPD标记S1311（5′ CTGCCACGAG 3′）和S1363（5′ GGCTGTGTGG 3′），利用这两个引物能稳定的扩增出条锈菌T4的特异性条带，经过对特异性条带进行回收、纯化、克隆并测序，其特异性条带的长度分别为999bp和821bp：据此，设计并开发特异性SCAR引物，成功地将特异性RAPD标记转化为小麦条锈菌新菌系T4稳定的SCAR标记；

特异性SCAR标记的碱基序列：

T4SP8-1: 5′ GGGCGTGGATGAAGAG 3′

T4SP8-2: 5′ GGAGCAGAAGCAGGTTT 3′。

2.小麦条锈菌新毒性菌系T4快速分子检测体系的建立，权利要求1所述必须遵循以下程序：

提取田间小麦叶片或采集的小麦条锈菌夏孢子基因组DNA；

利用以下优化体系进行扩增：15μL反应体系分别在PCR中依次加入：10×Reaction Buffer 1.5μL、25mmol/L 的MgCl₂0.9μL、10mmol/L dNTP_S 0.3μL、10ng/μL的T4SP8-1和T4SP8-2引物各1.0μL、50ng/μL模板DNA 1.5μL、5U/μL 的Taq DNA聚合酶(Fermentas公司) 0.15μL、最后用无菌ddH₂O补齐至15μL；

离心10Sec，将PCR管放入PCR仪中扩增；

扩增反应在伯乐S1000 PCR热循环仪上进行，扩增程序为：94℃ 预扩增5min；然后 94℃ 1 min、50.5 ℃ 1 min、72℃ 90 sec，共34个循环；72℃ 延伸10 min，4℃终止反应，扩增完成；

PCR扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶、1×TAE电泳缓冲液电泳分析，电泳结束后用ULTRA-URLET PRODUCTS凝胶成像系统记录分析；大约在700bp处出现毒性菌系T4的特异性条带。