CN104513856A - 一种检测叶绿体dna鉴定辣椒细胞质雄性不育系的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种检测叶绿体DNA鉴定辣椒细胞质雄性不育系的方法，以辣椒叶片为材料，提取叶片中的总DNA，用叶绿体引物C1和C2进行PCR扩增，对扩增产物进行克隆测序，再与辣椒细胞质雄性不育的叶绿体DNA分子指纹进行比较即可简单、高效和准确的鉴定出辣椒细胞质雄性不育系。本发明的检测叶绿体DNA鉴定辣椒细胞质雄性不育系的方法，在鉴定辣椒细胞质不育系时只需对叶绿体引物C1和C2的PCR扩增产物进行克隆测序，然后进行比较即可简单、高效和准确的鉴定出辣椒细胞质雄性不育系。

Description

一种检测叶绿体DNA鉴定辣椒细胞质雄性不育系的方法
技术领域
本发明涉及一种检测叶绿体DNA鉴定辣椒细胞质雄性不育系的方法，属于细胞质雄性不育检测技术领域。
背景技术
细胞质雄性不育是植物界中常见现象，利用雄性不育进行杂交育种是有很大的优势，如不需要人工去雄、提高杂交种子的纯度和增加产量；细胞质雄性不育机理很复杂，至今没有发现两个细胞质雄性不育突变是完全相同的。细胞质雄性不育系的分子标记在很多植物中已经建立，利用该标记能很快的区分不育和可育材料；对辣椒雄性不育系遗传物质的研究主要集中在细胞核方面，很少细胞质方面的报道，能用于鉴定辣椒细胞质雄性不育系的叶绿体DNA分子标记更少，这对辣椒细胞质雄性不育系的选育和鉴别增加了难度，限制了辣椒杂交育种的发展。
发明内容
(一)要解决的技术问题
为解决上述问题，本发明提出了一种检测叶绿体DNA鉴定辣椒细胞质雄性不育系的方法，通过检测叶绿体DNA确定辣椒细胞质雄性不育系的特征位点，进行细胞质雄性不育系鉴定；其检测过程比较简单，检测结果准确。
(二)技术方案
本发明的检测叶绿体DNA鉴定辣椒细胞质雄性不育系的方法所述方法包括以下步骤：
第一步，制备完整叶绿体，采用差速离心和蔗糖密度梯度离心法制备辣椒叶片中完整叶绿体；
第二步，提取上述完整叶绿体中的DNA，采取CTAB法提取待测辣椒叶片叶绿体中的总DNA；
第三步，PCR扩增，用叶绿体引物C1和C2对上述总DNA进行PCR扩增；
第四步，对所得PCR扩增产物进行克隆测序；
第五步，将所得碱基序列与可育辣椒序列对比，确定辣椒细胞质雄性不育系的特征位点，进行细胞质雄性不育系鉴定。
进一步地，所述叶绿体引物C1：
正向序列5～GTTATCCATTAACGTAATGCTC～3，
反向序列5～CGCGCAAGGCGATTCACAATCC～3；
所述叶绿体引物C2：
正向序列5～AGTCTTAGACAATCCGATAA～3，
反向序列5～GTTGCAGAGCCATACCAC～3。
再进一步地，所述辣椒细胞质雄性不育系的特征位点的DNA分子指纹如下：
C1片段：辣椒细胞质雄性不育叶绿体DNA在位点15和29～32分别为T和ATTC，而可育辣椒在上述对应位点分别为C和TGGA。
C2片段：辣椒细胞质雄性不育叶绿体DNA在位点326～332、344～346、454～455、468～470、588、676～685、712～713和821～822为TGAGTAT、CTA、TG、CCT、T、TGATGCAGTG、CG和CG，而可育辣椒在上述对应位点分别为GTGTACG、TGT、GA、GAC、G、CCTGCAGACT、AC和GT。
(三)有益效果
与现有技术相比，本发明的检测叶绿体DNA鉴定辣椒细胞质雄性不育系的方法，在鉴定辣椒细胞质不育系时只需对叶绿体引物C1和C2的PCR扩增产物进行克隆测序，然后进行比较即可简单、高效和准确的鉴定出辣椒细胞质雄性不育系。
附图说明
图1是本发明的实施例1的3个细胞质雄性不育系供试材料表。
图2是本发明的实施例1的叶绿体引物表。
图3是本发明的实施例1的叶绿体信息位点表。
具体实施方式
实施例1：
如图1至图3所示，本发明以3份常规辣椒品种为对照，对3个细胞质雄性不育系和相应的保持系进行叶绿体C1和C2片段的扩增序列，并运用相关软件分析，建立辣椒细胞质雄性不育系的叶绿体DNA分子指纹。
其具体操作如下：
第一步，制备完整叶绿体，采用差速离心和蔗糖密度梯度离心法制备辣椒叶片中完整叶绿体；
第二步，提取上述完整叶绿体中的DNA，采取CTAB法提取待测辣椒叶片叶绿体中的总DNA；
第三步，PCR扩增，用叶绿体引物C1和C2对上述总DNA进行PCR扩增；
第四步，对所得PCR扩增产物进行克隆测序；
第五步，将所得碱基序列与可育辣椒序列对比，确定辣椒细胞质雄性不育系的特征位点，进行细胞质雄性不育系鉴定。
其中，所述叶绿体引物C1：正向序列5～GTTATCCATTAACGTAATGCTC～3，
反向序列5～CGCGCAAGGCGATTCACAATCC～3；所述叶绿体引物C2：正向序列5～AGTCTTAGACAATCCGATAA～3，反向序列5～GTTGCAGAGCCATACCAC～3。
所述辣椒细胞质雄性不育系的特征位点的DNA分子指纹如下：
C1片段：辣椒细胞质雄性不育叶绿体DNA在位点15和29～32分别为T和ATTC，而可育辣椒在上述对应位点分别为C和TGGA；C2片段：辣椒细胞质雄性不育叶绿体DNA在位点326～332、344～346、454～455、468～470、588、676～685、712～713和821～822为TGAGTAT、CTA、TG、CCT、T、TGATGCAGTG、CG和CG，而可育辣椒在上述对应位点分别为GTGTACG、TGT、GA、GAC、G、CCTGCAGACT、AC和GT。
检测结果为，9704A、PBC362A和Co4761A为细胞质雄性不育系。
上面所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的构思和范围进行限定。在不脱离本发明设计构思的前提下，本领域普通人员对本发明的技术方案做出的各种变型和改进，均应落入到本发明的保护范围，本发明请求保护的技术内容，已经全部记载在权利要求书中。

Claims (3)

1.一种检测叶绿体DNA鉴定辣椒细胞质雄性不育系的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：
第一步，制备完整叶绿体，采用差速离心和蔗糖密度梯度离心法制备辣椒叶片中完整叶绿体；
第二步，提取上述完整叶绿体中的DNA，采取CTAB法提取待测辣椒叶片叶绿体中的总DNA；
第三步，PCR扩增，用叶绿体引物C1和C2对上述总DNA进行PCR扩增；
第四步，对所得PCR扩增产物进行克隆测序；
第五步，将所得碱基序列与可育辣椒序列对比，确定辣椒细胞质雄性不育系的特征位点，进行细胞质雄性不育系鉴定。
2.根据权利要求1所述的检测叶绿体DNA鉴定辣椒细胞质雄性不育系的方法，其特征在于，
所述叶绿体引物C1：正向序列5～GTTATCCATTAACGTAATGCTC～3，反向序列5～CGCGCAAGGCGATTCACAATCC～3；
所述叶绿体引物C2：正向序列5～AGTCTTAGACAATCCGATAA～3，反向序列5～GTTGCAGAGCCATACCAC～3。
3.根据权利要求1或2所述的检测叶绿体DNA鉴定辣椒细胞质雄性不育系的方法，其特征在于，所述辣椒细胞质雄性不育系的特征位点的DNA分子指纹如下：
C1片段：辣椒细胞质雄性不育叶绿体DNA在位点15和29～32分别为T和ATTC，而可育辣椒在上述对应位点分别为C和TGGA；
C2片段：辣椒细胞质雄性不育叶绿体DNA在位点326～332、344～346、454～455、468～470、588、676～685、712～713和821～822为TGAGTAT、CTA、TG、CCT、T、TGATGCAGTG、CG和CG，而可育辣椒在上述对应位点分别为GTGTACG、TGT、GA、GAC、G、CCTGCAGACT、AC和GT。
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