CN103160599A - 一种分子标记鉴定大豆细胞质雄性不育系种子纯度的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种分子标记鉴定大豆RN型细胞质雄性不育系种子纯度的方法，包括以下步骤：提取RN型细胞质雄性不育系种子的基因组DNA；以基因组DNA为模版，利用引物InDel-cms1进行PCR扩增，对扩增产物进行凝胶电泳分析；其中，扩增后的不育系片段长度为200bp，保持系扩增后的片段长度为212bp；通过片段长度差异可以将不育系和保持系准确区分，所有扩增片段与不育系扩增片段不同的均为伪不育系种子，检测得到的不育系特有长度片段个数占被检测所有种子的百分数即为RN型细胞质雄性不育系种子的纯度。可快速、准确、可靠地通过分子生物学实验手段鉴定RN型大豆细胞质雄性不育系中混入的保持系，保证不育系种子纯度。

Description

一种分子标记鉴定大豆细胞质雄性不育系种子纯度的方法

技术领域：

本发明涉及分子标记检测技术领域，涉及一种分子标记鉴定大豆细胞质雄性不育系种子纯度的方法，适用于大豆RN型细胞质雄性不育系种子纯度的鉴定。

背景技术：

大豆细胞质雄性不育“三系”由不育系、保持系和恢复系构成。不育系做母本与恢复系父本杂交，即可获得杂交种。这其中保持系和恢复系由于自身可育，种子可由自交繁殖获得；而不育系自身不育，种子只能通过其作为母本与同型保持系父本杂交获得，而不育系与同型保持系除育性外，其他农艺性状完全相同，在繁殖的过程中常常由于田间种植、收获脱粒等环节造成不育系中混杂保持系的后果。制种者利用不纯的不育系种子与恢复系杂交生产杂交种时，必然导致混入的保持系给不育系授粉，使不育系上结出的种子仍然为不育系而非杂交种。这样收获的杂交种中因混入不育系而导致不纯。这样的种子在生产上种植，必将导致生产田中出现不育株而减产，降低农民的种植积极性，种子销售公司也承担很大的违约风险。因此，保证大豆杂交种的纯度，必须从源头抓起，其中不育系种子纯度鉴定就显得非常重要。

由于不育系和保持系形态上完全一致，无法通过传统的形态学鉴定法在田间种植鉴定。近些年来随着分子标记的广泛应用，借助分子标记进行种子纯度鉴定可以克服上述方法的缺点。

发明内容：

本发明的目的是在于提供一种分子标记鉴定大豆细胞质雄性不育系种子纯度的方法，可快速、准确、可靠地通过分子生物学实验手段鉴定RN型大豆细胞质雄性不育系中混入的保持系，保证不育系种子纯度。

为实现本发明述目的，其技术解决方案如下：

（1）提取大豆RN型细胞质雄性不育系和配套保持系种子基因组DNA，以基因组DNA为模版，选用1对InDel标记，命名为“InDel-cms1”进行扩增，其引物序列为

上游引物：5’-TGGACTGACGCTTATGCTGGCGTGG-3’

下游引物：5’-GATGACTGCTGGTGCTGAAGTCACT-3’

（2）对扩增产物进行凝胶电泳，对电泳结果进行分析，其中：

InDel-cms1引物扩增后的不育系片段长度为200bp，保持系扩增后的片段长度为212bp。通过扩增片段长度差异可以将不育系和保持系准确区分。

本发明提供的分子标记鉴定大豆RN型细胞质雄性不育系种子纯度的方法，包括以下步骤： 

提取大豆RN型细胞质雄性不育系和配套保持系种子的基因组DNA；以基因组DNA为模版，利用引物InDel-cms1进行PCR扩增，对扩增产物进行凝胶电泳分析；其中，扩增后的不育系片段长度为200bp，保持系扩增后的片段长度为212bp；通过片段长度差异可以将不育系和保持系准确区分，所有扩增片段与不育系扩增片段不同的均为伪不育系种子，检测得到的不育系特有长度片段个数占被检测所有种子的百分数即为不育系种子的纯度。

其中，大规模微量基因组DNA的提取，其流程是：

取一粒不育系或保持系种子，在种脐背部切取直径为2.0mm，深1.5mm小块，放入1.5mL离心管加入液氮研磨成粉末，采用改进型SDS法提取基因组DNA，提取完成后置于-20℃冰箱保存备用。

PCR扩增反应： PCR反应体系为15μl，其中包括基因组DNA 30 ng，2×Taq Mix 7.5μl，引物0.2μmol·L^-1，其余部分用ddH₂O补齐。PCR反应程序：首先94℃ 4min；然后94℃ 30s，50℃ 30s，72℃ 30s，共32个循环；最后72℃ 5 min。PCR扩增反应在基因扩增仪上进行。

凝胶电泳：扩增产物在浓度为3%的琼脂糖凝胶电泳上进行检测，100V电压电泳50min后，在凝胶成像仪上照相记录结果。

本发明与传统不育系纯度鉴定方法相比具有以下优点和效果：

（1）DNA提取方法新颖，不伤害种子，取样后的种子仍可种植。

（2）DNA提取及电泳检测快速、准确，仅需一个工作日即可完成。

（3）操作方法简单，普通实验室技术人员就可完成。

（4）所需设备为普通分子生物学实验室常用设备。

（5）没有季节和时间限制，任何时间皆可进行检测。

（6）解决了因不育系和保持系表型相同，二者无法通过传统田间种植鉴定法鉴定的问题。

本发明的积极效果在于：从不育系和保持系DNA片段测序结果中发现，不育系序列中存在一段12bp的序列缺失，利用此缺失序列设计InDel标记能够在不育系和保持系中扩增长度不同的特异条带，而且带型清晰、重复性好、可靠性强。应用InDel标记根据不育系和保持系扩增片段长度不同，鉴定不育系的种子纯度，这有利于不育系种子的质量控制。

附图说明

图1 为分子标记InDel-cms1对15对不育系和保持系的PCR扩增电泳图； 

图2 为利用InDel-cms1标记鉴定大豆RN型细胞质雄性不育系JLCMS9A和混入配套保持系JLCMS9B的电泳图。

具体实施方式

下面通过基于PCR技术的InDel标记分析实施例进一步说明本发明。

实施例1

实验材料为大豆RN型细胞质雄性不育系JLCMS1A～JLCMS15A和配套保持系JLCMS1B～JLCMS15B种子。

实验方法为提取上述实验材料的基因组DNA，采用InDel-cms1标记引物进行PCR扩增，将扩增产物进行凝胶电泳，统计结果观察片段长度差异。

1、不育系样品基因组DNA提取

各取0.05 mg左右液氮研磨后的大豆RN型细胞质雄性不育系JLCMS1A～JLCMS15A和配套保持系JLCMS1B～JLCMS15B种子粉末于1.5 mL离心管中，加入200 μL 65℃预热的改进型SDS提取缓冲液，涡旋振荡1 min，在65℃下水浴15 min，静置冷却到室温，加入预冷的5 mol·L^-1的KAC 50 μL混匀，放入-20℃冰箱中10 min，12000 r/min离心10 min，取上清到新的离心管中，加入等体积酚-氯仿-异戊醇（25:24:1）轻轻混匀5 min，12000 r/min离心5 min，此步重复一次，取上清加入2/3体积预冷异丙醇，混匀，出现沉淀，12000 r/min离心5 min，弃上清，加入1 mL 75%的酒精悬浮漂洗2次，晾干，加20 μL TE，0.5 μL RNase 37℃溶解，-20℃保存备用。

2、分子标记分析

PCR反应体系为15μl，，其中包括基因组DNA 30 ng，2×Taq Mix 7.5μl，InDel-cms1上下游引物各0.2μmol·L^-1，其余部分用ddH₂O补齐。PCR反应程序：首先94℃ 4min；然后94℃ 30s，50℃ 30s，72℃ 30s，共32个循环；最后72℃ 5 min。PCR扩增反应在基因扩增仪上进行。

引物序列为

上游引物：5’-TGGACTGACGCTTATGCTGGCGTGG-3’

下游引物：5’-GATGACTGCTGGTGCTGAAGTCACT-3’；

扩增产物在浓度为3%的琼脂糖凝胶电泳上进行检测，100V电压电泳50min后，在凝胶成像仪上照相记录结果，如图1所示；其中，1A～15A分别代表不育系JLCMS1A～JLCMS15A，1B～15B分别代表保持系JLCMS1B～JLCMS15B，M为100bp DNA Maker；InDel-cms1引物扩增后的不育系JLCMS1A～JLCMS15A片段长度为200bp，保持系JLCMS1B～JLCMS15B扩增后的片段长度为212bp。通过片段长度差异可以将不育系和保持系准确区分。

试验例1

验证实施例鉴定大豆RN型细胞质性性不育系JLCMS9A种子纯度

（1）大豆RN型细胞质性性不育系JLCMS9A种子基因组DNA提取

取0.05 mg左右液氮研磨后的大豆种子粉末于1.5 mL离心管中，加入200 μL 65℃预热的改进型SDS提取缓冲液（含100 mmol·L^-1 Tris-HCl pH 8.5，50 mmol·L^-1 EDTA pH 8.0，550 mmol·L^-1 NaCl，2% SDS，2% Tween-20，0.5% β-巯基乙醇），涡旋振荡1 min，在65℃下水浴15 min，静置冷却到室温，加入预冷的5 mol·L^-1的KAC 50 μL混匀，放入-20℃冰箱中10 min，12000 r/min离心10 min，取上清到新的离心管中，加入等体积酚-氯仿-异戊醇（25:24:1）轻轻混匀5 min，12000 r/min离心5 min，此步重复一次，取上清加入2/3体积预冷异丙醇，混匀，出现沉淀，12000 r/min离心5 min，弃上清，加入1 mL 75%的酒精悬浮漂洗2次，晾干，加20 μL TE，0.5 μL RNase 37℃溶解，-20℃保存备用。

（2）分子标记分析

PCR反应体系为15μl，，其中包括基因组DNA 30 ng，2×Taq Mix 7.5μl，InDel-cms1上下游引物各0.2μmol·L^-1，其余部分用ddH₂O补齐。PCR反应程序：首先94℃ 4min；然后94℃ 30s，50℃ 30s，72℃ 30s，共32个循环；最后72℃ 5 min。PCR扩增反应在基因扩增仪上进行。

扩增产物在浓度为3%的琼脂糖凝胶电泳上进行检测，100V电压电泳50min后，在凝胶成像仪上照相记录结果。其中：InDel-cms1引物扩增后的不育系片段长度为200bp，保持系扩增后的片段长度为212bp。通过片段长度差异可以将不育系和保持系准确区分。

（3）不育系种子纯度计算

本试验例共选取25粒混有4粒保持系的不育系种子进行纯度鉴定，结果见图2，其中，1～25为预混不育系种子，其中箭头所指为被鉴定出的伪不育系种子。通过对种子基因组DNA扩增带型进行分析，21粒种子DNA扩增片段大小为200bp，认定为真不育系；4粒种子DNA扩增片段大小为212bp，认定为伪不育系。计算检测结果得出，本试验例中不育系种子纯度为84%，其与常规田间检测预混不育系样品植株在开花期利用显微镜观察到的花粉不育植株占总观察植株百分比数据一致，见表1。

表1　25株预混不育系植株育性观察结果

样品名称	植株总数	花粉可育单株数	花粉不育单株数	真不育系单株比例(%)
					JLCMS9A预混不育系样品	25	4	21	84%

Claims (3)

1. 一种分子标记鉴定大豆RN型细胞质雄性不育系种子纯度的方法，包括以下步骤： 

提取RN型细胞质雄性不育系种子的基因组DNA；以基因组DNA为模版，利用引物InDel-cms1进行PCR扩增，对扩增产物进行凝胶电泳分析；其中，扩增后的不育系片段长度为200bp，保持系扩增后的片段长度为212bp；通过片段长度差异可以将不育系和保持系准确区分，所有扩增片段与不育系扩增片段不同的均为伪不育系种子，检测得到的不育系特有长度片段个数占被检测所有种子的百分数即为RN型细胞质雄性不育系种子的纯度。

2. 权利要求1所述的分子标记鉴定大豆RN型细胞质雄性不育系种子纯度的方法，其特征在于引物序列为：

上游引物：5’-TGGACTGACGCTTATGCTGGCGTGG-3’

下游引物：5’-GATGACTGCTGGTGCTGAAGTCACT-3’。

3.权利要求1所述的分子标记鉴定大豆RN型细胞质雄性不育系种子纯度的方法，其特征在于大规模微量基因组DNA的提取方法如下：

取一粒不育系或保持系种子，在种脐背部切取直径为2.0mm，深1.5mm小块，放入1.5mL离心管加入液氮研磨成粉末，采用改进型SDS法提取基因组DNA，提取完成后置于-20℃冰箱保存备用；

PCR扩增反应： PCR反应体系为15μl，其中包括基因组DNA 30 ng，2×Taq Mix 7.5μl，引物0.2μmol·L^-1，其余部分用ddH₂O补齐；PCR反应程序：首先94℃ 4min；然后94℃ 30s，50℃ 30s，72℃ 30s，共32个循环；最后72℃ 5 min；

PCR扩增反应在基因扩增仪上进行；

凝胶电泳：扩增产物在浓度为3%的琼脂糖凝胶电泳上进行检测，100V电压电泳50min后，在凝胶成像仪上照相记录结果。

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