CN104004853A - 叶绿体dna的snp标记鉴定大豆雄性不育细胞质方法 - Google Patents
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Abstract
发明提供了一种叶绿体DNA的SNP标记鉴定大豆雄性不育细胞质方法，该方法也可应用于区分大豆细胞质雄性不育系和含有正常细胞质的保持系。该方法包括如下步骤，提取大豆细胞质雄性不育系和其配套的保持系种子基因组DNA作为扩增模板，选用4对叶绿体DNA的SNPs标记，在4对SNPs的侧翼序列分别设计1对引物进行PCR扩增。扩增的PCR产物利用限制性内切酶酶切，通过不育系和保持系酶切产物长度不同进行鉴定。上述方法可以快速、准确地鉴定大豆细胞质雄性不育细胞质和正常可育细胞质；也可用于检测不育系（含有不育细胞质）繁殖过程中，混杂的保持系（含有可育细胞质），为保证大豆不育系种子生产过程中纯度要求提供保障。
Description
技术领域
本发明提供了一种叶绿体DNA的SNP标记鉴定大豆雄性不育细胞质方法，用于鉴定大豆雄性不育细胞质和正常可育细胞质，也可应用于区分大豆细胞质雄性不育系制种过程中不育系（含有不育细胞质）里混入的父本保持系（含有可育细胞质），属于分子标记检测技术领域。
背景技术
大豆细胞质雄性不育（cytoplasmic male sterility，CMS）“三系”由不育系、保持系和恢复系组成，雄性不育细胞质的载体是不育系，而雄性可育细胞质的载体是保持系。吉林省农业科学院首先育成了大豆CMS“三系”。CMS被广泛应用于农作物杂种优势利用，其最大的优点是可以在制种时母本行获得100%不育株，雄性不育系可以免除人工去雄，节约人力，降低种子成本，还可保证种子的纯度。
尽管杂交大豆能大幅度提高产量，但是大豆杂交制种技术还没有大范围推广，除种子的繁殖量受限外，还存在些其他问题。其中需要拓宽配套的不育和可育的种质资源，但是找到和不育细胞质配套的保持系可育细胞质需要较长时间。此外在大豆杂交种创制过程中，除以不育系作母本同恢复系为父本进行杂交可获得杂交种外，制种还需要繁殖CMS“三系”。其中保持系和恢复系由于自身可育，种子可由自交繁殖获得；而不育系自身不育，种子只能通过其作为母本与同型保持系父本杂交获得，而不育系与同型保持系除育性外，其他农艺性状完全相同，在繁殖的过程中常常由于田间种植、收获脱粒等环节造成不育系中混杂保持系，制种者利用不纯的不育系种子与恢复系杂交生产杂交种时，必然导致混入的保持系给不育系授粉，使不育系上结出的种子仍然为不育系而非杂交种。这样的种子在生产上种植，必将导致生产田中出现不育株而减产。
目前鉴定大豆雄性不育细胞质的分子标记方法是基于碱基缺失（indel）的PCR扩增片段大小差异区分大豆RN型细胞质不育系和保持系，而其扩增的片段在不育系中和保持系中的大小差异只有12bp，必须通过高浓度的3%琼脂糖凝胶电泳进行区分，实际操作中可能不易分辨，而且单一的标记，可能会影响大豆雄性不育细胞质和正常可育细胞质的鉴定的准确性，继而影响大豆CMS商业化育种工作。
发明内容
本发明提供一种叶绿体DNA的SNP标记鉴定大豆雄性不育细胞质方法，利用叶绿体DNA的SNP标记来区别雄性不育细胞质和可育细胞质，更可以区分不育系（含有不育细胞质）和保持系（含有可育细胞质），将为拓宽大豆CMS种质资源和应用于区分大豆细胞质雄性不育系制种过程中混入的父本保持系提供一种快速，准确和可靠的分子生物学实验检测技术和手段。
本发明提供的一种叶绿体DNA的SNP标记鉴定大豆雄性不育细胞质方法，解决方案如下：
1）提取含有雄性不育细胞质的大豆不育系和其配套的含有可育细胞质的保持系种子基因组DNA，选用两者间的4对叶绿体DNA的SNPs为标记，SNPs名称代号分别为SNP1、SNP2、SNP3和SNP4。
其中SNP1对应的部分侧翼序列为：
ACGGTAGTATTAGGAGCTAC[C/T]（[不育细胞质/可育细胞质]）TTAGCTATTGCTCAACAAGA；
其中SNP2对应的部分侧翼序列为：
AGATAGATATCTATAGTTAT[A/C]（[不育细胞质/可育细胞质]）AATTTTTGTTTGTTGTCCCC；
其中SNP3对应的部分侧翼序列为：
ACAATTAGATTAGACAATTA[T/G]（[不育细胞质/可育细胞质]）AAAAAAATATTGAGACAATT；
其中SNP4对应的部分侧翼序列为：
TAAATTTCTATATTAGAATT[C/A]（[不育细胞质/可育细胞质]）TATTTTTTTTAGAAAGCCTC。
在4对SNPs的侧翼序列分别设计1对引物进行PCR扩增，引物序列如下：
其中SNP1对应的上游引物序列为：
5’-TTGTGGCTCAGTCGCTAAATC-3’，
下游引物序列为5’-TGTTAAACCGCCCATAAGAAC-3’；
其中SNP2对应的上游引物序列为：
5’-TCTTTATCCTTGGGCAATGAGTT-3’，
下游引物序列为5’-ATATTTAGGTTCGGGCATTTGT-3’；
其中SNP3对应的上游引物序列为：
5’-AGTACGGTTCTAAGGAAAGGA-3’，
下游引物序列为5’-TTGTGCAGCCTAATCTAATGT-3’；
其中SNP4对应的上游引物序列为：
5’-GGGGATCCTTTATTAAATTAA-3’，
下游引物序列为5’- AATATGAAAATAAGAGCCTCC-3’。
2）扩增后的PCR产物在不育细胞质和可育细胞质中长度是一致的，利用限制性内切酶酶切PCR产物，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，不育系和保持系通过获得不同长度大小的条带进行准确区分。4对叶绿体DNA的SNPs位点对应的PCR扩增的引物大小、相应的限制性内切酶和酶切后的片段大小等特征如下所述：
其中SNP1对应的PCR扩增的产物为463bp，PCR产物利用限制性内切酶Bpu10Ⅰ酶切，可育细胞质（保持系）的酶切片段长度为463bp，不育细胞质（不育系）的酶切片段为两个，长度分别为255bp和208bp；
其中SNP2对应的PCR扩增的产物为489bp，PCR产物利用限制性内切酶psiⅠ酶切，可育细胞质（保持系）的酶切片段长度为489bp，不育细胞质（不育系）的酶切片段为两个，长度分别为323bp和166bp；
其中SNP3对应的PCR扩增的产物为490bp，PCR产物利用限制性内切酶psiⅠ酶切，可育细胞质（保持系）的酶切片段长度为490bp，不育细胞质（不育系）的酶切片段为两个，长度分别为288bp和192bp；
其中SNP4对应的PCR扩增的产物为399bp，PCR产物利用限制性内切酶EcoRⅠ酶切，可育细胞质（保持系）的酶切片段长度为399bp，不育细胞质（不育系）的酶切片段为两个，长度分别为247bp和152bp。
利用发明所述的方法也可应用于区分大豆细胞质雄性不育系制种过程中不育系混入的父本保持系。
本发明提供的叶绿体DNA分子标记鉴定大豆雄性不育细胞质和正常可育细胞质的方法包括以下步骤：
提取雄性不育细胞质的大豆不育系和其配套的保持系种子的基因组DNA作为扩增模板，选用两者间的4对叶绿体DNA的SNPs标记，在跨4对SNPs的侧翼序列分别设计1对引物进行PCR扩增。扩增的PCR产物因为长度相同，利用限制性内切酶酶切，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，不育系和保持系通过获得不同长度大小的条带进行准确区分。
大豆材料的DNA提取过程如下：利用CTAB法提取大豆基因组DNA，此DNA作为扩增模板。
PCR扩增反应：利用跨4对SNPs的侧翼序列分别设计1对引物进行PCR扩增。
酶切过程：扩增的PCR产物利用限制性内切酶酶切，37℃孵育1h。
琼脂糖凝胶电泳过程：酶切产物在琼脂糖凝胶电泳后，成像记录，观察细胞质不育材料（不育系）和细胞质可育材料（保持系）的酶切片段大小。
本发明与传统的鉴定细胞质育性及区分不育系和保持系的方法具有以下优点和效果：
由于细胞质雄性不育是通过细胞质遗传的，而叶绿体DNA属于细胞质遗传，本发明中的叶绿体DNA的SNP标记稳定，一个或者多个SNP可以分别或者同时使用，增加可靠性，含有SNP的PCR产物在酶切后产生的片段不育系中和保持系中的大小差异至少在152bp以上，通过低浓度1%的琼脂糖电泳就可以明显区分出来。
大豆种子随时可以提取DNA进行检测，避免了传统方法需要进行田间种植在开花期再检测花粉育性所浪费的时间。
检测快速耗时少，从提取DNA到酶切电泳，1个工作日可以完成。
检测准确，因为酶切条带区分明显，利用低浓度的琼脂糖凝胶电泳即可在紫外灯或者蓝光灯下观察鉴别。
检测所用的仪器和药品为常规的分子生物学实验室具备。
检测过程没有复杂的操作技术，普通的实验室技术人员即可完成。
本发明的积极效果在于：
利用叶绿体DNA的SNP标记来区别雄性不育细胞质和可育细胞质，更可以区分不育系和保持系，将为拓宽大豆CMS种质资源和区分不育系中的保持系提供方便快捷的途径。从不育系和保持系中发现存在的4对差异SNPs，在跨SNPs的区域侧翼序列设计引物进行PCR扩增，扩增的产物片段大小通过限制性内切酶酶切可以将不育系和保持系区分出来，条带清晰，重复性好，可靠性强，这种应用基于SNPs和内切酶结合的标记可以鉴定出育种过程中繁育不育系（含有不育细胞质）时的混杂的父本保持系（含有可育细胞质），为种子生产过程中纯度要求提供保障。
本发明中的叶绿体DNA的SNP标记稳定，一个或者多个SNP可以分别或者同时使用，增加可靠性，含有SNP的PCR产物在酶切后产生的片段不育系中和保持系中的大小差异至少在152bp以上，通过低浓度1%的琼脂糖电泳就可以明显区分出来。
附图说明
图1为利用4对跨SNPs侧翼序列的引物进行PCR扩增产物电泳图；
图2为利用限制性内切酶酶切PCR扩增产物的电泳图。
具体实施方式：
下面通过基于PCR结合限制性内切酶酶切分析SNPs区域的分子生物学方法进行鉴定的实验进一步举例说明
实施例1
选用的4对叶绿体DNA的SNPs标记，名称代号分别为SNP1、SNP2、SNP3和SNP4。
其中SNP1对应的部分侧翼序列为：
ACGGTAGTATTAGGAGCTAC[C/T]（[不育细胞质/可育细胞质]）TTAGCTATTGCTCAACAAGA；
其中SNP2对应的部分侧翼序列为：
AGATAGATATCTATAGTTAT[A/C]（[不育细胞质/可育细胞质]）AATTTTTGTTTGTTGTCCCC；
其中SNP3对应的部分侧翼序列为：
ACAATTAGATTAGACAATTA[T/G]（[不育细胞质/可育细胞质]）AAAAAAATATTGAGACAATT；
其中SNP4对应的部分侧翼序列为：
TAAATTTCTATATTAGAATT[C/A]（[不育细胞质/可育细胞质]）TATTTTTTTTAGAAAGCCTC。
鉴定材料为大豆细胞质的雄性不育系（含有雄性不育细胞质）和其配套的保持系（含有雄性可育细胞质）（吉林省农业科学院大豆所提供并保存），见表1。
表1：鉴定材料为RN型大豆雄性不育细胞质的大豆不育系和其配套的保持系材料
| 材料代号 | 来源 | 细胞质（F：可育细胞质/保持系；S：不育细胞质/不育系） |
| JLCMS171A | 美国 | S |
| JLCMS171B | 美国 | F |
| JLCMS87A | 美国 | S |
| JLCMS87B | 美国 | F |
| JLCMS9A | 中国吉林地区 | S |
| JLCMS9B | 中国吉林地区 | F |
| JLCMS84A | 中国黑龙江地区 | S |
| JLCMS84B | 中国黑龙江地区 | F |
实验方法：提取上述材料的基因组DNA。采用CTAB法提取大豆基因组DNA提取步骤：
1.将大豆种子放入研钵，液氮冷却后利用研磨棒磨成细末。将细末收集到预冷的1.5ml预冷的离心管里。
2.向装有细末的离心管中加入65℃预热的600 μL 2×CTAB提取液（100mM Tris-Cl pH8.0，1.4M NaCl，20 mM EDTA pH8.0，2% CTAB，0.2%巯基乙醇），放入65℃水浴30分钟。
3.水浴后，向离心管中加入600 μL的氯仿：异戊醇抽提液 (24:1)，轻轻混匀，室温静置5 min。
4.然后13000 rpm / min，离心10 min。吸取上清液，转入新的1.5 mL离心管中，加入0.6倍体积预冷的异丙醇。-20℃醇沉1 h。
5.13000 rpm / min，离心15 min。弃掉上清，用1mL的75%无水乙醇冲洗沉淀两次。
6.将离心管放入超净工作台，吹干沉淀。加入50 μL ddH2O溶解。加入5μL Rnase A，37℃保温1 h。
7.吸取2 μL DNA，1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，观察提取浓度。
PCR扩增反应：PCR反应体系为25μL，其中2×PCR MIX 12.5μL， 上下游引物各1μL（10μM /μL），模板DNA (10～20 ng/μL) 4μL，无菌去离子水6.5μL。PCR循环条件为94℃预变性3 min；94℃变性30 s，56℃复性 30 s，72℃延伸 40 s，35个循环；72℃延伸5 min。
其中SNP1对应的上游引物序列为：
5’-TTGTGGCTCAGTCGCTAAATC-3’，
下游引物序列为5’-TGTTAAACCGCCCATAAGAAC-3’；
SNP2对应的上游引物序列为：
5’-TCTTTATCCTTGGGCAATGAGTT-3’，
下游引物序列为：
5’-ATATTTAGGTTCGGGCATTTGT-3’；
SNP3对应的上游引物序列为：
5’-AGTACGGTTCTAAGGAAAGGA-3’，
下游引物序列为：
5’-TTGTGCAGCCTAATCTAATGT-3’；
SNP4对应的上游引物序列为：
5’-GGGGATCCTTTATTAAATTAA-3’，
下游引物序列为：
5’- AATATGAAAATAAGAGCCTCC-3’。
PCR 扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测(见图1，1，2泳道DNA模板为不育系；3，4泳道DNA模板为保持系)。其中SNP1对应的PCR扩增的产物均为463bp，其中SNP2对应的PCR扩增的产物均为489bp，其中SNP3对应的PCR扩增的产物均为490bp，其中SNP4对应的PCR扩增的产物均为399bp。
酶切过程：酶切体系为20μL，其中10×内切酶缓冲液为2μL，PCR产物为5μL，限制性内切酶为1μL(所用内切酶名称见表1)，无菌去离子水12μL。37℃孵育1h。其中SNP1对应的PCR产物利用限制性内切酶Bpu10Ⅰ酶切，其中SNP2对应的PCR产物利用限制性内切酶psiⅠ酶切，其中SNP3对应的PCR产物利用限制性内切酶psiⅠ酶切，其中SNP4对应的PCR产物利用限制性内切酶EcoRⅠ酶切。
琼脂糖凝胶电泳过程：将酶切产物10μL混入2μL的10×溴酚蓝上样缓冲液，然后在配制浓度为1%的琼脂糖凝胶电泳，100V电压，电泳时间为40min。在凝胶成像仪上记录并分析电泳结果。电泳结果如图1（1，2泳道DNA模板为不育系；3，4泳道DNA模板为保持系），可见不育细胞质均可以被切成2条小片段，而可育细胞质则为一条相对更大些的片段，见图2，a为Bpu10Ⅰ酶切的SNP1位置；b为psiⅠ酶切的SNP2位置；c为psiⅠ酶切的SNP3位置；d为EcoRⅠ酶切的SNP4位置。
其中SNP1对应的PCR产物利用限制性内切酶Bpu10Ⅰ酶切，可育细胞质（保持系）的酶切片段长度为463bp，不育细胞质（不育系）的酶切片段为两个，长度分别为255bp和208bp；
其中SNP2对应PCR产物利用限制性内切酶psiⅠ酶切，可育细胞质（保持系）的酶切片段长度为489bp，不育细胞质（不育系）的酶切片段为两个，长度分别为323bp和166bp；
其中SNP3对应的PCR产物利用限制性内切酶psiⅠ酶切，可育细胞质（保持系）的酶切片段长度为490bp，不育细胞质（不育系）的酶切片段为两个，长度分别为288bp和192bp；
其中SNP4对应的PCR产物利用限制性内切酶EcoRⅠ酶切，可育细胞质（保持系）的酶切片段长度为399bp，不育细胞质（不育系）的酶切片段为两个，长度分别为247bp和152bp。
综上所述，利用在不育细胞质和可育细胞质中的4对叶绿体SNPs，结合PCR扩增和限制性内切酶酶切技术，根据酶切后的电泳片段的大小不同可以准确的鉴定大豆雄性不育细胞质和正常可育细胞质，也可应用于区分大豆细胞质雄性不育系制种过程中不育系混入的父本保持系。
SEQ No.1
<110> 吉林省农业科学院
<120> 叶绿体DNA的SNP标记鉴定大豆雄性不育细胞质方法
<140>
<160> 8
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 引物
<400> 1
Ttgtggctcagtcgctaaatc
SEQ No.2
<110> 吉林省农业科学院
<120>叶绿体DNA的SNP标记鉴定大豆雄性不育细胞质方法
<140>
<160> 8
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213>人工序列
<223> 引物
<400> 2
tgttaaaccgcccataagaac
SEQ No.3
<110> 吉林省农业科学院
<120> 叶绿体DNA的SNP标记鉴定大豆雄性不育细胞质方法
<140>
<160> 8
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213>人工序列
<223> 引物
<400> 3
tctttatccttgggcaatgagtt
SEQ No.4
<110> 吉林省农业科学院
<120> 叶绿体DNA的SNP标记鉴定大豆雄性不育细胞质方法
<140>
<160> 8
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213>人工序列
<223> 引物
<400> 4
atatttaggttcgggcatttgt
SEQ No.5
<110> 吉林省农业科学院
<120> 叶绿体DNA的SNP标记鉴定大豆雄性不育细胞质方法
<140>
<160> 8
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213>人工序列
<223> 引物
<400> 5
agtacggttctaaggaaagga
SEQ No.6
<110> 吉林省农业科学院
<120> 叶绿体DNA的SNP标记鉴定大豆雄性不育细胞质方法
<140>
<160> 8
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213>人工序列
<223> 引物
<400> 6
ttgtgcagcctaatctaatgt
SEQ No.7
<110> 吉林省农业科学院
<120> 叶绿体DNA的SNP标记鉴定大豆雄性不育细胞质方法
<140>
<160> 8
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213>人工序列
<223> 引物
<400> 7
ggggatcctttattaaattaa
SEQ No.8
<110> 吉林省农业科学院
<120> 叶绿体DNA的SNP标记鉴定大豆雄性不育细胞质方法
<140>
<160> 8
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213>人工序列
<223> 引物
<400> 8
aatatgaaaataagagcctcc
Claims (3)
1. 一种叶绿体DNA的SNP标记鉴定大豆雄性不育细胞质的方法，包括以下步骤：
提取含有雄性不育细胞质的大豆不育系和含有可育细胞质的保持系种子基因组DNA作为PCR扩增模板；选用4对叶绿体DNA的SNPs标记，SNPs名称代号分别为SNP1、SNP2、SNP3和SNP4；在4对SNPs的侧翼序列分别设计1对引物进行PCR扩增，所述的引物如下：
其中SNP1对应的上游引物序列为5’-TTGTGGCTCAGTCGCTAAATC-3’，
下游引物序列为5’-TGTTAAACCGCCCATAAGAAC-3’；
其中SNP2对应的上游引物序列为5’-TCTTTATCCTTGGGCAATGAGTT-3’，
下游引物序列为5’-ATATTTAGGTTCGGGCATTTGT-3’；
其中SNP3对应的上游引物序列为5’-AGTACGGTTCTAAGGAAAGGA-3’，
下游引物序列为5’-TTGTGCAGCCTAATCTAATGT-3’；
其中SNP4对应的上游引物序列为5’-GGGGATCCTTTATTAAATTAA-3’，
下游引物序列为5’- AATATGAAAATAAGAGCCTCC-3’；
扩增后的PCR产物利用限制性内切酶进行酶切，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据酶切片段长度鉴定是否为大豆雄性不育细胞质。
2. 权利要求1所述的一种叶绿体DNA的SNPs标记鉴定大豆雄性细胞质的方法，其特征在于：4对叶绿体DNA的SNPs标记对应的位点、对应的侧翼序列的位置、PCR扩增的引物大小、相应的限制性内切酶和酶切后的片段大小等如下所述：
其中SNP1对应的部分侧翼序列为ACGGTAGTATTAGGAGCTAC[C/T]（[不育细胞质可育细胞质]）TTAGCTATTGCTCAACAAGA；利用权利要求1所述引物进行PCR扩增的产物为463bp，PCR产物利用限制性内切酶Bpu10Ⅰ酶切，可育细胞质（保持系）的酶切片段长度为463bp，不育细胞质（不育系）的酶切片段为两个，长度分别为255bp和208bp；
其中SNP2对应的部分侧翼序列为AGATAGATATCTATAGTTAT[A/C]（[不育细胞质/可育细胞质]）AATTTTTGTTTGTTGTCCCC；利用权利要求1所述引物进行PCR扩增的产物为489bp，PCR产物利用限制性内切酶psiⅠ酶切，可育细胞质（保持系）的酶切片段长度为489bp，不育细胞质（不育系）的酶切片段为两个，长度分别为323bp和166bp；
其中SNP3对应的部分侧翼序列为ACAATTAGATTAGACAATTA[T/G]（[不育细胞质/可育细胞质]）AAAAAAATATTGAGACAATT；利用权利要求1所述引物进行PCR扩增的产物为490bp，PCR产物利用限制性内切酶psiⅠ酶切，可育细胞质（保持系）的酶切片段长度为490bp，不育细胞质（不育系）的酶切片段为两个，长度分别为288bp和192bp；
其中SNP4对应的部分侧翼序列为TAAATTTCTATATTAGAATT[C/A]（[不育细胞质/可育细胞质]）TATTTTTTTTAGAAAGCCTC；利用权利要求1所述引物进行的PCR扩增的产物为399bp，PCR产物利用限制性内切酶EcoRⅠ酶切，可育细胞质（保持系）的酶切片段长度为399bp，不育细胞质（不育系）的酶切片段为两个，长度分别为247bp和152bp。
3. 利用权利要求1所述的方法应用于区分大豆细胞质雄性不育系（含有不育细胞质）制种过程中不育系混入的父本保持系（含有可育细胞质）。
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